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DANIEL CARDOSO DE CARVALHO

CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA DE INVASÕES BIOLÓGICAS: O CASO DO


TUCUNARÉ (Cichla spp.) EM MINAS GERAIS, BRASIL

Tese apresentada à Escola de Veterinária da


Universidade Federal de Minas Gerais como
requisito parcial para obtenção do grau de
Doutor em Zootecnia, área Melhoramento
Animal. Orientadora: Profa Denise
Aparecida Andrade de Oliveira

Belo Horizonte
Escola de Veterinária – UFMG
2009
3
AGRADECIMENTOS

Agradeço à Professora Denise por todo o apoio e por acreditar neste projeto desde o
início.

Aos professores Iracilda Sampaio e Luciano Beheregaray pela grande ajuda e


colaboração.

À minha namorada Mariana pelo carinho, compreensão e pelas ótimas revisões.

A toda minha família, mãe, pai e Lucas pelo apoio e por me aturar esses anos todos...

A todos os alunos e funcionários dos laboratórios de genética da UFMG-VET, UFPA e


MELMU (Macquarie University), onde partes deste trabalho foram executadas, pela
amizade, ajudas e momentos divertidos.

Aos colegas Claudia Salviano, Peter Teske, Gabriel Yazbeck e Juliana Araripe pelas
sugestões nos manuscritos da tese e artigos.

Ao Arno, Alexandre, Paulo Faria e Daniel Crepaldi pela ajuda nas coletas.

Aos Professores Iracilda Sampaio e Aldney Andrade por cederem amostras de


tucunarés.

Aos co-orientadores José Enemir dos Santos e Alexandre Benvindo por toda a ajuda
nesses quatro anos.

Ao Mattias e à Anna por me proporcionarem momentos tão agradáveis em terras


australianas.

Ao CNPq pela bolsa de estudos concedida.

À Capes pela bolsa “sanduíche” concedida para realização de parte deste trabalho na
Austrália.

À FEP-MVZ e à FAPEMIG (APQ3950-3) pelo apoio financeiro a este projeto.

4
SUMÁRIO
RESUMO GERAL................................................................................................................. 7
ABSTRACT........................................................................................................................... 7
INTRODUÇÃO GERAL....................................................................................................... 8
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................................................... 11

CAPÍTULOS

1-Análise filogenética das espécies do peixe tucunaré (Cichla): investigando


populações introduzidas e nativas
RESUMO............................................................................................................................... 14
ABSTRACT........................................................................................................................... 14
INTRODUÇÃO...................................................................................................................... 14
METODOLOGIA.................................................................................................................. 16
Descrição da amostra........................................................................................................... 16
Sequenciamento do DNA.................................................................................................... 17
Análise das Sequências........................................................................................................ 17
RESULTADOS...................................................................................................................... 18
Análise da região mitocondrial 16S.................................................................................... 18
Análise da Região Controle (CR) mitocondrial.................................................................. 19
DISCUSSÃO.......................................................................................................................... 20
CONCLUSÕES...................................................................................................................... 22
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................................................... 22
ANEXOS................................................................................................................................ 28

2- Desenvolvimento e caracterização de marcadores nucleares microssatélites para a


espécie de tucunaré Cichla piquiti
RESUMO............................................................................................................................... 30
ABSTRACT........................................................................................................................... 30
INTRODUÇÃO...................................................................................................................... 30
Marcadores nucleares - microssatélites............................................................................... 31
METODOLOGIA................................................................................................................... 31
Descrição da amostra........................................................................................................... 31
Desenvolvimento de microssatélites................................................................................... 31
Genotipagem ...................................................................................................................... 32
RESULTADOS...................................................................................................................... 33
DISCUSSÃO.......................................................................................................................... 34
CONCLUSÕES...................................................................................................................... 35
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................................................... 35
ANEXOS................................................................................................................................ 40
Tabela 2............................................................................................................................... 40

3- Caracterização genética de populações nativas e introduzidas do peixe tucunaré


utilizando marcadores microssatélites e mitocondrial
RESUMO............................................................................................................................... 40
ABSTRACT........................................................................................................................... 40
INTRODUÇÃO...................................................................................................................... 41
METODOLOGIA................................................................................................................... 42
Descrição da amostra........................................................................................................... 42
Genotipagem........................................................................................................................ 43
Análises com DNA mitocondrial (mtDNA) ....................................................................... 43
Análises em genética de populações................................................................................... 44

5
Análises de hibridação......................................................................................................... 44
RESULTADOS...................................................................................................................... 44
Cichla piquiti....................................................................................................................... 44
Cichla kelberi...................................................................................................................... 47
Análises de Hibridação........................................................................................................ 49
DISCUSSÃO.......................................................................................................................... 50
CONCLUSÕES...................................................................................................................... 55
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................................................... 55
ANEXOS............................................................................................................................... 61
Tabela 5.............................................................................................................................. 61
CONCLUSÕES GERAIS...................................................................................................... 62

6
Resumo geral
Este estudo buscou o entendimento do processo de colonização do peixe amazônico
tucunaré no sudeste do Brasil por meio da caracterização genética de suas populações.
Visto que essa é uma espécie invasora, a determinação inequívoca da população fonte e
a rota de invasão são informações vitais na avaliação do seu sucesso adaptativo em
áreas introduzidas e determinantes na elaboração de planos de manejo e controle. Foram
propostas análises genéticas de populações introduzidas nas principais bacias
hidrográficas do estado de Minas Gerais (São Francisco, Grande, Paranaíba e Doce).
Sequências do DNA de duas regiões mitocondriais de indivíduos das populações
introduzidas foram obtidas e comparadas com os estoques nativos da Amazônia para a
identificação da origem dos estoques. Apenas haplótipos das espécies Cichla piquiti e
C. kelberi, endêmicas da bacia do Araguaia-Tocantins, foram detectados nos sítios
analisados. Posteriormente, dez (10) loci de microssatélites para a espécie invasora C.
piquiti (testados com eficiência para C. kelberi) foram desenvolvidos para análise da
estrutura e diversidade genética de suas populações. Os resultados indicam efeito
fundador nas populações introduzidas, as quais apresentaram redução na riqueza alélica
e heterozigose esperada quando comparada com a população nativa. A análise
Bayesiana de atribuição detectou espécimes híbridos apenas na população nativa.
Apesar de sua baixa diversidade genética, o tucunaré mostrou sinais evidentes de que se
estabeleceu com sucesso no ambiente receptor, sendo ele um ambiente impactado ou
não, demonstrando que o “efeito de propágulo” não é importante para o processo de
invasão do tucunaré. Padrões genéticos e de distribuição geográfica sugerem, ainda, que
C. kelberi e C. piquiti apresentam processos introdutórios distintos nas principais bacias
no Estado de Minas Gerais.

Abstract
This study aimed to understand the colonization process of the Amazonian fish
introduced in southeast Brazil using molecular markers. In the invasive biology studies,
the unequivocal characterization of the source population and the invasive route, are
vital information not only in the evaluation on its adaptative success in invaded areas
but also in its management and control. Genetic analyses were carried out on the
introduced populations at the major river basis in the Minas Gerais State (São Francisco,
Grande, Paranaíba and Doce). DNA sequences of two mitochondrial regions from
specimens of the introduced species were obtained and compared with the natives
stocks from the Amazon basin in order to detect the source population. Only mtDNA
haplotypes from the species C. piquiti and C. kelberi, endemic from the Araguaia-
Tocantins, the eastern limit of the Amazon basin, were recovered in the introduced
populations. Furthermore, ten (10) microsatellites loci were developed for the invasive
species C. piquiti (successfully tested for C. kelberi) in order to analyze the genetic
structure and diversity of the introduced populations. The results have shown a founder
effect in the introduced populations, with reduction in the allelic richness and expected
heterozigosity, when they were compared with the native population. The Bayesian
analysis of attribution detected possible hybrids specimens only in the native
population. The tucunaré, apart from its low genetic diversity, is well established in the
invasive areas showing that the “propagule effect” is not an important matter in its

7
invasive process. Genetic and geographic distribution patterns suggest that C. kelberi
and C. piquiti showed different introductory process in the major river basins in the
Minas Gerais State.

Introdução Geral (Cichla sp) foi introduzido na região


Em 1998, o “Atlas da Nordeste do Brasil no final dos anos 40
Biodiversidade do Estado de Minas por agências governamentais
Gerais” - primeira publicação com (Fontenele, 1948; Fontenele e Peixoto,
dados gerais sobre a biodiversidade do 1979) e posteriormente transferido para
Estado - relatava 24 espécies exóticas o sudeste, onde se propagou
de peixes encontradas nos rios de Minas rapidamente pelos reservatórios do Alto
Gerais (Costa et al., 1998). Sabe-se que Paraná - local em que se encontra bem
hoje existem pelo menos 63 espécies estabelecido (Agostinho e Júlio Jr,
introduzidas no Estado (Alves et al., 1996). Por ser altamente prolífico e se
2007). A bacia com maior grau de adaptar muito bem a condições lênticas,
contaminação é a do Paraíba do Sul (41 suas populações se expandiram
espécies exóticas), seguida pela do rio rapidamente em reservatórios,
Doce (30) e a do Alto Paraná – reproduzindo nos meses quentes,
Paranaíba e Grande (20). O motivo começando em outubro e novembro,
provável do alto grau de contaminação com o surgimento dos alevinos no verão
do rio Paraíba do Sul deve estar (Pelicice e Agostinho, 2008). Espécie
relacionado ao pólo de criação de peixes apreciada na pesca esportiva e na
ornamentais (Vidal e Costa, 2000). A culinária, o tucunaré (figura 1) continua
introdução de espécies exóticas no a ser introduzido em diversas bacias do
estado de Minas Gerais é uma ameaça Brasil (Agostinho et al., 2007; Pelicice
real à diversidade de peixes, sendo e Agostinho, 2008), embora sua
comum em todas as drenagens no introdução seja proibida por lei (art. 34
estado (Drummond et al., 2005). do Decreto-Lei 221/67 - Código de
Natural da bacia Amazônica Pesca).
(Kullander e Ferreira, 2006), o tucunaré O tucunaré ocorre em todos os

Figura 1. Exemplar da espécie de tucunaré amarelo (Cichla


kelberi) coletado na represa de Três Marias.

8
reservatórios da bacia do rio Paranaíba tucunarés é predominantemente
(triângulo mineiro), incluindo o piscívora, com elevado índice de
reservatório da Usina Hidrelétrica canibalismo (Gomiero e Braga, 2004
(UHE) de Itumbiara, onde foi registrado B).
pela primeira vez em 1980, quatro anos
após o fechamento das comportas. Em Impacto ecológico e manejo do
Itumbiara, o tucunaré é a espécie mais tucunaré
pescada na pesca esportiva (Paulo A análise de três lagoas
Formágio, comunicação pessoal). marginais no São Francisco realizada
Na represa de Três Marias (rio por Pompeu e Godinho (2003)
São Francisco), o tucunaré foi identificou a presença do tucunaré em
encontrado pela primeira vez em 1984 apenas uma delas. Essa lagoa possuía
(Sato e Godinho, 1988). grande parte da ictiofauna constituída
Aparentemente, sua disseminação foi de espécies de médio porte e uma
gradativa, em um período de cerca de menor abundância relativa quando
quatro anos, no sentido montante para comparada às outras duas lagoas (que
jusante. Uma vez que instituições que não apresentavam o tucunaré). Pompeu
atuavam nas áreas de pesca e e Godinho (2003) argumentam que as
piscicultura na região não utilizavam diferenças observadas na lagoa com
essa espécie em seus programas de tucunaré em relação às demais sugerem
“peixamento”, a introdução do tucunaré que sua presença pode ser a causa de
no São Francisco teria ocorrido pelo profundas modificações na comunidade
escape (acidental ou não) de indivíduos de peixes e que pode, ainda, refletir
dos viveiros, lagos e açudes localizados diretamente no recrutamento das
no próprio rio São Francisco e no rio espécies nativas, incluindo as de
Paraopeba (Sato e Godinho, 1988). piracema.
Entre os anos de 1981 e 1983 o Godinho et al. (1994), ao estudar
monitoramento da ictiofauna da represa lagoas do médio rio Doce (Parque
de Três Marias ainda não havia Estadual do Rio Doce-MG) submetidas
detectado o tucunaré. Em 1984, um à introdução do tucunaré e da piranha
único exemplar foi coletado. Entre julho (Pygocentrus nattereri), também
de 1985 e junho de 1986, 63 exemplares demonstroram que as lagoas
foram capturados e entre julho de 1986 contaminadas possuíam menor riqueza
e junho de 1987 esse número subiu para e menor abundância de espécies e de
209 peixes, o que significa um aumento indivíduos de pequeno porte quando,
médio de 555% no número de peixes comparadas a lagoas sem ocorrência
capturados por 100m2 de rede em um desses peixes exóticos.
período de seis anos (Sato e Godinho, Espécies invasoras, como o
1988). tucunaré, ameaçam as populações
No reservatório de Volta Grande nativas, podendo levá-las à extinção
(rio Grande), duas espécies de tucunaré completa. O efeito da “armadilha
foram detectadas e identificadas como evolutiva” (evolucionary trap) cunhado
Cichla monoculus e Cichla cf. ocellaris por Schlaepfer et al. (2002) apresenta-se
(Gomiero e Braga, 2004 A). Nesse como uma explicação evolutiva ao fato
reservatório, a alimentação dos de espécies nativas serem vulneráveis a

9
espécies invasoras. Segundo essa genética de suas populações, é uma
hipótese, a falta de resposta defensiva importante etapa para o entendimento
nas populações nativas seria uma do processo de colonização dessa
“armadilha” que evoluiu em decorrência espécie. A determinação inequívoca da
da ausência desse tipo de predador no população fonte, do número de
ambiente. Assim, a população nativa introduções e a rota de invasão são
não seria capaz de responder à predação informações vitais na avaliação do
em tempo hábil para resistir à predação sucesso ecológico em áreas introduzidas
e se manter. Schlaepfer (2002) indica, vs. nativas (Amsellem et al., 2000;
ainda, uma opção de manejo de longa Kang et al., 2007). Alguns estudos vêm
duração por meio da evolução ou da sendo realizados na bacia do Paraná e já
aprendizagem, na qual espécies nativas fornecem importantes informações
poderiam evoluir uma resposta à sobre a genética das populações de
predação por meio do manejo e tucunaré (Oliveira et al., 2006).
aprendizagem e, assim, co-existir com a Oliveira et al. (2006) utilizaram
espécie exótica. Essa opção poderia ser análises do DNA mitocondrial para
aplicada nas populações invasoras cuja mostrar que as populações de tucunaré
erradicação seja econômica ou introduzidas na bacia do rio Paraná
biologicamente inviável, como no caso (UHE Itaipu, Capivari, Promissão e rio
das populações do tucunaré Paranapanema) eram originárias
introduzidas no sudeste do Brasil. principalmente do rio Tocantins. Nesse
Uma das explicações para trabalho, haplótipos do rio Amazonas
invasões biológicas é a da hipótese de também foram encontrados nessas
nichos vagos, que propõe que populações, indicando a possibilidade
comunidades de ilhas ou ambientes de que tenham ocorrido múltiplas
impactados (e.g represas hidroelétricas) introduções de tucunaré na região.
cuja diversidade foi reduzida As principais bacias
naturalmente ou devido à atividade hidrográficas em Minas Gerais (São
antrópica não apresentariam resistência Francisco, Grande, Paranaíba e Doce) já
a espécies invasoras e/ou oportunistas. apresentam populações de tucunarés
Assim, haveria nichos “vagos” que bem estabelecidas. A partir dessa
poderiam ser ocupados (Hutchinson, constatação e da necessidade de estudo
1957; Elton, 1958). Outra hipótese, a da sobre os procedimentos introdutórios
“pressão de propágulo” (Lockwood et ocorridos no estado, surgem algumas
al., 2005) ou esforço de introdução, perguntas em relação a essas
sugere que o número de indivíduos populações: Seriam elas provenientes
introduzidos e o número de introduções de apenas um ato introdutório? Qual a
influenciariam o sucesso de uma origem geográfica/genética desses
invasão. peixes na bacia Amazônica? Temos
apenas uma espécie em cada local de
Caracterização genética de introdução? Houve redução da
populações exóticas - tucunaré diversidade genética nas populações
O estudo da invasão aos introduzidas?
ecossistemas do sudeste pelo tucunaré, No intuito de responder essas
por meio da caracterização da estrutura questões, algumas análises genéticas

10
foram propostas e são aqui apresentadas ALVES, C.B.M.; VIEIRA, F.;
em três capítulos, organizados da MAGALHÃES, A.L.B; BRITO,
seguinte forma: M.F.G. Impacts of non-native fish
Capítulo 1: Análise filogenética species in Minas Gerais, Brazil:
das espécies do tucunaré (Cichla spp): present situation and prospects. In:
investigando populações introduzidas e BERT, T.M. (ed). Ecological and
nativas. Sequências do DNA de dois Genetic Implications of Aquaculture
genes mitocondriais de indivíduos das Activities, Springer, 2007. p. 291-
populações introduzidas foram obtidas e 314.
comparadas com os estoques nativos da
Amazônia para a identificação da AMSELLEM, L.; NOYER, J.L.; LE
origem dos estoques. BOURGEOIS, T.; HOSSAERT-
Capítulo 2: Desenvolvimento e MCKEY, M. Comparison of genetic
caracterização de marcadores nucleares diversity of the invasive weed
microssatélites para a espécie de Rubus alceifolius Poir (Rosaceae)
tucunaré Cichla piquiti. Marcadores in its native range and in areas of
microssatélites para a espécie invasora introduction, using amplified
C. piquiti (testados com eficiência para fragment length polymorphism
C. kelberi) foram desenvolvidos para (AFLP) markers. Mol Ecol, v. 9, p.
análise da estrutura e diversidade 443–455, 2000.
genética de suas populações.
Capítulo 3: Caracterização COSTA, M.R.C.; HERMANN, G.;
genética das populações nativas e MARTINS, C.M.; LINS, L.V. &
introduzidas do peixe tucunaré LAMAS, I.R. Biodiversidade em
utilizando marcadores microssatélites e MinasGerais: um Atlas para sua
mitocondrial A partir do conservação. Belo Horizonte:
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análise refinada de diversidade genética, DRUMMOND, G.M.; MARTINS, C.S.;
que forneceu dados sobre a estrutura MACHADO, A.B.M.; SEBAIO,
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13
Capítulo 1 – Análise filogenética das espécies de tucunaré (Cichla) em populações
introduzidas e nativas

Resumo
Para a caracterização da introdução das espécies de Cichla (tucunaré ou peacock bass)
no Brasil, foram realizadas análises filogenéticas em populações nativas e introduzidas
utilizando-se como base as regiões mitocondriais 16S ribossomal (rDNA) e Controle
(CR). Os haplótipos do DNA mitocondrial detectados nas populações introduzidas no
estado de Minas Gerais (sudeste do Brasil) foram agrupados exclusivamente com os
haplótipos das espécies nativas do rio Tocantins (Cichla piquiti e C. kelberi), sugerindo
um único ou poucos atos introdutórios nessa região, realizados com peixes de uma
mesma população fonte (rio Tocantins). Este estudo contribui para o entendimento da
introdução de Cichla em regiões do Brasil fora da bacia Amazônica e fornece novos
dados filogenéticos para as duas espécies de tucunarés recentemente descritas e
endêmicas da bacia do Tocantins-Araguaia.

Palavras-chave: mtDNA, Cichla, espécies invasoras, filogenia

Abstract
To characterize the introduction of Cichla (peacock bass or tucunaré) species in Brazil,
a molecular phylogenetic analysis based on mitochondrial 16S ribosomal DNA and
Control Region sequences from native and introduced populations was performed.
Mitochondrial DNA haplotypes found in introduced fish from Minas Gerais state
(southeast Brazil) clustered only with those from native species of the Tocantins River
(Cichla piquiti and C. kelberi), suggesting a single or few translocation acts into this
area, despite with fish from the same source population. Our study contributes to the
understanding of the introduction of Cichla in regions of Brazil outside the Amazon
basin and adds phylogenetic data to the recently described Cichla species endemic to
the Tocantins-Araguaia basin.

Keywords: mtDNA, Cichla, invasive species, phylogeny

Introdução
Espécies exóticas invasoras são financeiro (Wilcove et al., 1998;
organismos introduzidos fora da sua Pimentel et al., 2005).
área de distribuição natural e são A introdução de espécies
consideradas a segunda maior ameaça à exóticas pode trazer consequências
biodiversidade, perdendo apenas para a indesejáveis, tais como alteração
destruição de habitat (Simberloff, 2003; genética, introdução de patógenos,
Clavero e Gárcia-Berthou, 2005; extinção local de espécies nativas, entre
UNEP, 2005). Elas ameaçam outros (Welcomme, 1988).
ecossistemas e outras espécies nos Comunidades nativas podem ser
ambientes em que são inseridas, diretamente alteradas pela competição
provocando grande impacto ambiental e com essas espécies (Godinho et al.,
1994; Molina et al., 1996; Pelicice e

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Agostinho, 2008). No canal do Panamá, Apesar da grande preocupação
por exemplo, a introdução do tucunaré em evitar a introdução de espécies
(Cichla) causou acentuada queda na exóticas em todo o mundo (Simberloff,
ocorrência de quase todas as espécies de 2003), algumas introduções de peixes
peixes (Zaret e Paine, 1973). feitas no passado (sejam elas
Consequências econômicas também intencionais ou não) não podem ser
podem ser citadas. Nos Estados Unidos corrigidas. A obtenção de dados que
estima-se que houve introdução de pelo esclareçam esses eventos introdutórios e
menos 50.000 espécies exóticas, que definam, por exemplo, rotas
provocando perda econômica anual de introdutórias, quais foram as espécies
até 120 bilhões de dólares (Pimentel et introduzidas e número de introduções
al., 2005). ocorridas, são informações que podem
O tucunaré, peixe natural da ser aplicadas no direcionamento de
bacia Amazônica, apresenta pelo menos políticas públicas para o controle de
nove espécies descritas. Cichla kelberi e espécies invasoras nas bacias
C. piquiti são duas espécies hidrográficas brasileiras e para o melhor
consideradas endêmicas à sub-bacia do entendimento dos fatores biológicos
Araguaia-Tocantins e são também as para o sucesso de uma invasão.
espécies introduzidas em diversos No sudeste do Brasil, as
reservatórios no sudeste do Brasil principais bacias hidrográficas em
(Kullander e Ferreira, 2006). Minas Gerais (São Francisco, Grande,
O tucunaré foi introduzido na Paranaíba e Doce) já apresentam
região Nordeste do Brasil no final dos populações de tucunarés bem
anos 40 por agências governamentais estabelecidas (Godinho et al., 1994;
(Fontenele, 1948; Fontenele e Peixoto, Pompeu e Godinho, 2003; Gomiero e
1979) e posteriormente transferido para Braga, 2004). A partir dessa constatação
o sudeste, onde se propagou e da necessidade de estudo sobre os
rapidamente pelos reservatórios do Alto procedimentos introdutórios ocorridos
Paraná (Agostinho e Júlio Jr, 1996), rio no estado, surgem algumas perguntas
Grande (Gomiero e Braga, 2004), rio em relação a essas populações: Seriam
Doce (Godinho et al., 1994) e rio São elas provenientes de apenas um ato
Francisco (Pompeu e Godinho 2003). introdutório? Qual a origem
Por ser altamente prolífico e se adaptar geográfica/genética desses peixes na
muito bem a condições lênticas, suas bacia Amazônica? Temos apenas uma
populações se expandem rapidamente espécie em cada local de introdução?
em reservatórios, reproduzindo No intuito de responder essas
principalmente na época das chuvas questões, sequências do DNA de duas
(Zaret, 1980). Espécie apreciada na regiões mitocondriais (ribossomal 16S e
pesca esportiva e na culinária, o Controle) de indivíduos das populações
tucunaré continua a ser introduzido em introduzidas nas principais bacias
diversas bacias do Brasil por pescadores hidrográficas em Minas Gerais foram
amadores (Agostinho et al., 2007; analisadas e comparadas com os
Pelicice e Agostinho, 2008), embora sua estoques nativos da Amazônia. Os
introdução seja proibida por lei. resultados aqui apresentados
acrescentam novas informações

15
filogenéticas ao grupo Cichla e podem, de Morada Nova n=10 e Felixlândia
ainda, servir de subsídio para o n=10), Lagoa Marginal próxima ao
desenvolvimento de políticas públicas Município de São Francisco (rio São
para controle de espécies invasoras nas Francisco, n=12), represa de Itumbiara
bacias hidrográficas no sudeste (rio Paranaíba, n=37), represa de Furnas
brasileiro. (rio Grande, n=17) e Lago Dom
Helvécio (rio Doce, n=10). Sequências
Metodologia de DNA disponíveis no GenBank
Descrição da amostra (Tabela 2, ANEXO) foram incluídas na

Figura 1. Mapa mostrando os principais rios onde foram coletadas as amostras de peixes para
o presente trabalho: (1) Morada Nova e Felixlândia na represa de Três Marias (Bacia do São
Francisco); (2) Lago marginal do rio São Francisco (perto da cidade de São Francisco, Minas
Gerais); (3) Represa de Itumbiara, rio Paranaíba (Minas Gerais); (4) Lago Dom Helvécio no
Parque Estadual do Rio Doce (Minas Gerais); (5) Reservatório de Furnas (Bacia do rio
Grande, Minas Gerais); (6) Reservatório de Tucuruí, rio Tocantins (Pará); (7) Lago Catu,
Aquiraz (Ceará).

Amostras de tecido de tucunarés análise para comparar os dados obtidos


(gênero Cichla) foram coletadas e nesse trabalho com outros previamente
fixadas em etanol 90%. Foram realizados. As amostras da bacia do
coletadas amostras provenientes de Tocantins (Reservatório de Tucuruí,
cinco populações estabelecidas nas n=40) e do rio Solimões (n=1) foram
principais bacias hidrográficas em cedidas pela Profa. Iracilda Sampaio -
Minas Gerais, sendo elas: represa de UFPA (n=41). As amostras colhidas no
Três Marias (rio São Francisco, cidade Ceará (Lago Catu, Aquiraz; n=5), foram

16
cedidas pelo Prof. Aldeney Andrade sequenciamento. Utilizou-se o
(UECE). Todos os espécimes foram protocolo do Kit Big Dye Terminator
identificados segundo Kullander e Mix, seguido de análise das reações
Ferreira (2006). A figura 1 apresenta o pelo sequenciador automático ABI 310
mapa com a localização dos rios (Perkin Elmer™). As regiões foram
brasileiros onde foram coletadas as sequenciadas nas direções 5’-3’e 3’-5’.
amostras. As sequências obtidas neste trabalho
para a região 16S e região CR foram
Sequenciamento do DNA depositadas no GenBank
O DNA total foi extraído de (www.ncbi.nlm.nhih.gov) com os
nadadeiras utilizando-se o método números de acesso: DQ779579-
fenol-clorofórmio (Sambrook et al., DQ779586, FJ904286-FJ904291 (16S)

Tabela 1. Primers utilizados nas amplificações das regiões mitocondriais 16S e


CR e referências dos trabalhos em que foram publicados.

1989). Para isolar parte das regiões e FJ890799-FJ890816 (CR).


mitocondriais 16S ribossomal (rDNA) e
Controle (CR) foi utilizada a técnica da Análise das Sequências
PCR (Reação em Cadeia da Polimerase) Os cromatogramas foram
com os iniciadores (primers) conferidos e as sequências alinhadas no
específicos para essas regiões (Tabela software ClustalW (Thompson et al.,
1). 1997) implementado no programa
O produto da PCR obtido com o BioEdit (Hall, 1999). As árvores
primer 16S apresentou filogenéticas foram geradas no software
aproximadamente 500 pares de bases MRBAYES (Huelsenbeck et al., 2001,
(pb), enquanto o produto da Região 2002) utilizando análise Bayesiana. O
Controle (CR) apresentou cerca de 460 grau de confiança em cada nó foi
pb. Após a reação da PCR (16S - 94oC, verificado pela probabilidade posterior
3min, 30X, 94oC, 1min, 55oC 1min, Bayesiana (PP) no MRBAYES. Para a
72oC 3min, extensão de 72oC por 7 min; análise de parcimônia, o programa
CR - 94ºC, 4 min, 50ºC 30s, 72ºC 2 PAUP4* versão 4.0b10 para Unix
min, 30 ciclos de 94ºC por 15s, 56ºC também foi utilizado (Swofford, 2003).
por 30 s, 72ºC por 2 min e passo final As regiões 16S e CR foram analisadas
de 72ºC, 10 min) foram utilizados de 1 separadamente, no sentido de incorporar
a 2 µL da reação de PCR total no o máximo de informação de outros

17
estudos. em Furnas (rio Grande, local 5). As
Os principais haplótipos espécies coletadas no lago Catu (local
descritos por Oliveira et al., (2006), 7) não puderam ser identificadas
Renno et al., (2006), Willis et al., inequivocamente por meio de caracteres
(2007) e outros haplótipos obtidos no morfológicos (Kullander, comunicação
banco de dados GenBank pessoal).
(www.ncbi.nlm.nih.gov) foram Após edição e alinhamento das
utilizados para determinar a origem sequências de DNA, 410 pares de bases
genética e as espécies de cada (pb) e 359 pb foram obtidos,
população introduzida, como também a respectivamente, para as regiões 16S e
distinção da população de Tocantins, Controle. A Região Controle (CR) foi
como sugerido por Kullander e Ferreira mais variável do que a 16S, com 157
(2006) (Tabela 2). Geophagus sítios variáveis, dos quais 102 foram
brasiliensis foi utilizado como grupo informativos na análise de parcimônia.
externo em todas as análises. Já para a região 16S, 17 sítios foram
informativos. Como a topologia e a
Resultados confiança nos ramos da parcimônia
Cichla kelberi e C. piquiti foram máxima foram muito similares à análise
coletados em simpatria nas represas de Bayesiana, apenas essa última será
Tucuruí e Itumbiara (Fig. 1: local 3 e 6), apresentada neste trabalho.
enquanto apenas C. kelberi foi coletado Apesar do menor número de
em Três Marias (Fig. 1: local 1) e rio espécies analisados para 16S em relação
Doce (Fig. 1: local 4). C. piquiti foi a a CR, os cladogramas da análise
única espécie detectada na lagoa Bayesiana para os dois marcadores
marginal (rio São Francisco, local 2) e apresentam congruência.

Figura 2. Árvore filogenética das seqüências mitocondriais 16S de Cichla, baseadas em


haplótipos do rio Tocantins, populações introduzidas e haplótipos selecionados do GeneBank
de diferentes espécies e locais da bacia Amazônica (Tabela 2). Os números acima dos ramos
são probabilidades Bayesianas posteriores (PP). As estrelas indicam populações introduzidas
(não-nativas).
18
em conjunto com tucunarés de
Análise da região mitocondrial 16S Itumbiara, Furnas, lagoa marginal e do
As espécies nativas do rio reservatório Lajeado (PP=1.0 – Oliveira
Tocantins formaram dois agrupamentos et al., 2006). Curiosamente, C. temensis
distintos: C. piquiti e C. kelberi, do rio Negro, que não foi agrupado pela
significativamente apoiados pela análise da região 16S, apresentou-se
probabilidade posterior (PP) Bayesiana como grupo irmão de C. piquiti
de 0,95 e 0,99, respectivamente. Todos (PP=0.97). Os dados da CR também
os tucunarés da Lagoa Marginal do São sugerem uma relação estreita entre C.
Francisco e dos reservatórios e Furnas intermedia do Orinoco, Cichla sp. de
(Fig. 1, locais: 2, 3, 5) estão incluídos Mamoré, um grupo formado por Cichla
no clado de C. piquiti. sp do Amazonas e Xingu (duas espécies
Os dados também indicam que não identificadas taxonomicamente) e
os tucunarés de Itumbiara (C. kelberi), Cichla sp. farm. Essa última espécie
Dom Helvécio e represa de Três Marias (Cichla sp. farm), que está fortemente
(Fig.1: locais: 1, 3 e 4, respectivamente) conectada (PP=1.0) às espécies nativas
são fortemente associados (PP=0,92) a de tucunarés do Xingu e Amazonas, foi
C. kelberi do rio Tocantins. Além disso, denominada como C. temensis por
o grupo de C. kelberi é fortemente Oliveira et al., (2006). A espécie não
conectado às espécies nativas Cichla sp. identificada do rio Mamoré é basal
do lago Catu (nordeste do Brasil) como nesse grupo. C. ocellares e C.
também a algumas linhagens cujas orinocensis aparecem como linhagens
relações filogenéticas não foram não resolvidas.
resolvidas, como C. monoculus do rio Os espécimes de C. kelberi são
Negro e Solimões e C. ocellaris e C. fortemente agrupados (PP=0.98),
orinocensis (PP=0.92). C. temensis do incluindo tucunarés não-nativos como
rio Negro não foi associado a nenhum os de Três Marias (Felixlândia e
grupo, aparecendo como uma linhagem Morada Nova; Fig. 1: local 1), rio Doce
nativa independente. A figura 2 (Lago Dom Helvécio) (Fig. 1: local 4) e
apresenta a árvore filogenética Itumbiara (Fig. 1: local 3). Na maior
resultante da análise da região 16S para parte das populações introduzidas foi
as amostras de Cichla. detectado apenas um haplótipo. A única
exceção foi a população de Itumbiara,
Análise da Região Controle (CR) em que três haplótipos distintos para a
mitocondrial Região Controle de C. kelberi foram
A análise da região controle do detectados (Fig. 3).
DNA mitocondrial também apresentou Os espécimes do Ceará (Lago
as espécies nativas do rio Tocantins Catu) agruparam com os haplótipos de
separada em dois agrupamentos C. monoculus do rio Madeira e
distintos - C. piquiti e C. kelberi, Amazonas, com elevadas
apoiados por altas probabilidades probabilidades posteriores (PP=0.96). A
posteriores de 1.0 e 0.98, figura 3 apresenta a árvore filogenética
respectivamente. Espécies do clado de resultante da análise da Região Controle
C. piquiti foram novamente agrupadas para as amostras de Cichla.

19
Figura 3. Árvore filogenética das sequências mitocondriais da região Controle de
Cichla, baseadas em haplótipos do rio Tocantins, populações introduzidas e haplótipos
selecionados do GeneBank de diferentes espécies e locais da bacia Amazônica (Tabela
2). Os números acima dos ramos são probabilidades Bayesianas posteriores (PP). As
estrelas indicam populações introduzidas (não-nativas).

Fontenele (1948) e Fontenele e


Discussão Peixoto (1979) relataram que agências
Os resultados filogenéticos desse governamentais realizaram translo-
estudo confirmam que as populações cações de peixes amazônicos para o
introduzidas nas principais bacias de nordeste brasileiro no sentido de
Minas Gerais são originárias do rio enriquecer a pobre ictiofauna dessa
Tocantins. Também foi confirmada a região e que esses estoques foram
identificação morfo/taxonômica das posteriormente transferidos para o alto
duas espécies endêmicas do rio rio Paraná (MG). Os dados genéticos
Tocantins (C. piquiti e C. kelberi), uma presentes neste trabalho trazem
vez que foi detectada distinção genética informações complementares sobre os
em relação às outras espécies da bacia atos introdutórios ocorridos no nordeste
Amazônica. do país, pois os haplótipos das

20
populações introduzidas no Lago Catu que essas espécies não estão migrando
(Ceará) foram agrupados com amostras intensamente na bacia do São Francisco
provenientes dos rios Amazonas e e que as populações desses locais são
Madeira (Fig. 3) e não apresentaram provenientes de introduções distintas,
correspondência com os haplótipos realizadas com um pequeno número de
detectados em Minas Gerais. Além indivíduos fundadores.
disso, Rocha et al., 2008 detectaram O sucesso das espécies invasoras
haplótipos de rRNA 16S da espécie C. tem sido geralmente atribuído à sua
kelberi (espécie originária do Tocantins) capacidade de adaptação a novos
em três populações no estado do Piauí. ambientes (Stockwell et al., 2003;
Esses dados, associados aos do presente Alcaraz et al., 2005). A invasão do
trabalho, indicam a ocorrência de pelo tucunaré no lago natural Dom Helvécio
menos dois eventos introdutórios para o na bacia do rio Doce é um exemplo de
nordeste. Tomando-se como base os adaptação em ambientes não
dados genéticos, a espécie do Ceará é impactados. Atualmente, pescadores da
provavelmente Cichla monoculus (Fig. região preferem utilizar iscas como o
3). camarão em substituição à técnica
Fontenele (1948) e Fontenele e tradicional com isca artificial,
Peixoto (1979) também citam o alto rio amplamente utilizada na captura dessa
Paraná como local das primeiras espécie em outros locais. A mudança na
introduções do tucunaré no sudeste. Os técnica de pesca pode ser explicada pela
resultados genéticos demonstram mudança de comportamento alimentar,
concordância com esses dados, pois no decorrente da plasticidade fenotípica do
reservatório de Itumbiara (alto rio tucunaré: após a extinção de pequenos
Paraná) foi detectada a maior peixes nativos devido à introdução do
diversidade genética (3 haplótipos para próprio tucunaré e da piranha na década
C. kelberi - Fig. 3) e esse foi, ainda, o de 60 (Godinho et al., 1994). Assim,
único local onde as espécies C. kelberi e pode ter ocorrido uma adaptação da
C. piquiti ocorreram em simpatria alimentação a presas abundantes no
(Tabela 2). Assim, é provável que o alto lago, como o camarão de água doce. Tal
rio Paraná seja o local onde foi mudança comportamental do tucunaré
realizado o maior número de refletiu, portanto, na técnica de pesca
introduções ou onde foram introduzidos utilizada na região. Experimentos em
um grande número de espécimes no laboratório são necessários para checar
estado de Minas Gerais. Posteriormente, se essa adaptação comportamental é
é possível que o alto rio Paraná tenha mantida mesmo em situações em que
servido de fonte introdutória para outras sejam fornecidas várias opções de presa
bacias hidrográficas (onde foram (camarões e pequenos peixes).
encontrados apenas uma espécie/ Apesar da baixa variabilidade
haplótipo por localidade). genética detectada nas populações
Surpreendentemente, as espécies introduzidas (com exceção de
C. kelberi e C. piquiti foram detectadas Itumbiara), a plasticidade fenotípica
no rio São Francisco, mas não em encontrada no tucunaré (exemplo no rio
simpatria (C. kelberi – Três Marias, C. Doce) pode explicar sua grande
piquiti – Lagoa marginal). Isso sugere capacidade invasora. Invasões

21
biológicas bem sucedidas vêm sendo Conclusões
reportadas, mesmo com severa perda de Os haplótipos do DNA
diversidade genética (Zayed et al., mitocondrial detectados nas populações
2007; Chandler et al., 2008), introduzidas no estado de Minas Gerais
demonstrando que um pequeno número (sudeste do Brasil) foram agrupados
de indivíduos pode ser capaz de invadir exclusivamente com os haplótipos das
e se estabelecer em um novo ambiente, espécies nativas do rio Tocantins,
independentemente de sua diversidade sugerindo único ou poucos atos
genética. introdutórios nessa região.
Com exceção do trabalho de Os dados filogenéticos
Kullander e Ferreira (2006), no qual apresentados contribuíram para o
foram descritas as espécies endêmicas entendimento da introdução de Cichla
do Tocantins (C. kelberi e C. piquiti), o em regiões do Brasil fora da bacia
tucunaré introduzido em Minas Gerais Amazônica.
tem sido comumente confundido com .
C. temensis, C. ocellaris e C. Referências Bibliográficas
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presente estudo, nenhuma dessas PETRERE, M.J.R. Itaipu Reservoir
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agruparam com os haplótipos do rio Publications, 1994. p. 171-184.
Tocantins ou com as populações
introduzidas em Minas Gerais. Isso AGOSTINHO, A.A.; JÚLIO JR. H.F.
indica que a população do Tocantins Peixes de outras águas. Ciência
representa um estoque isolado e reforça Hoje, v. 21, p. 36-44, 1996.
a distinção taxonômica das espécies
endêmicas dessa bacia. AGOSTINHO, A.A.; GOMES, L.C.;
No presente estudo, a análise de PELICICE, F.M. Ecologia e manejo
dois marcadores mitocondriais mostra de recursos pesqueiros em
que as duas espécies de Cichla reservatórios do Brasil. Maringá:
endêmicas do rio Tocantins (Kullander EDUEM, 2007. 501 p.
e Ferreira, 2006) foram extensivamente
translocadas para diversas bacias no ALCARAZ, C.; VILA-GISPERT, A.;
sudeste do Brasil. O estudo também GARCÍA-BERTHOU, E. Profiling
revela novas informações filogenéticas - invasive fish species: the
pois no trabalho de Willis et al. (2007) importance of phylogeny and
não foram analisadas as espécies do human use. Diversity and Distrib.,
Tocantins - e ainda elucida alguns v. 11, p. 289-298, 2005.
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27
ANEXO

Tabela 2. Resumo das espécies e locais amostrados, incluindo informações sobre a


espécie ser nativa (N) ou não (I) em uma região em particular e o número de haplótipos
da região 16S rDNA e da região Controle (CR) detectadas em cada localidade.
Referências dos haplótipos previamente publicadas obtidas no GenBank são fornecidas.
Espécie Código Local / Estado I/N 16S/CR* Referência –
Genebank
C. kelberi Tocantins Reservatório de Tucuruí, Rio N 1/3 (20) Este trabalho
Tocantins (PA)

C. monoculus Amazonas1 Rio Amazonas (AM) N 0/1 Oliveira et al., 2006


(AY836748)

C. monoculus Amazonas2 Rio Amazonas (AM) N 0/1 Willis et al., 2007


(DQ841899)

C. monoculus Madeira Rio Madeira (AM) N 0/1 Renno et al., 2006


(DQ778669)

C. monoculus Solimões Rio Solimões (AM) N 1/0 (1) Este trabalho

C. monoculus Negro Rio Negro (AM) N 1/0 Farias et al., 1999


(AF049017)

C. piquiti Tocantins Reservatório de Tucuruí, Rio N 1/6 (20) Este trabalho


Tocantins (PA)

C. temensis Negro Rio Negro (AM) N 1/1 Farias et al., 1999


(AF049019)
Willis et al., 2007
(DQ841929)

C. ocellaris - ? N 1/2 Sparks 2004


(AY263831)
Renno et al., 2006
(DQ778665)
Willis et al., 2007
(DQ841871)

C. orinocensis - ? N 1/1 Willis et al., 2007


(DQ841866)
Farias et al., 1999
(AF049018)

C. intermedia Orinoco Rio Orinoco, Venezuela N 0/1 Willis et al., 2007


(DQ841833)

Cichla sp. Mamore Rio Mamoré, Bacia N 0/1 Willis et al., 2007
Amazonica, Bolivia (DQ841908)

28
Cichla sp. Xingu Rio Xingú (PA) N 0/1 Willis et al., 2007
(DQ841946)

Cichla sp. Amazonas Rio Amazonas (AM) N 0/1 Willis et al., 2007
(DQ841937)

Cichla sp. Lajeado Reservatório Lajeado, Rio N 0/2 Oliveira et al., 2006
Tocantins (TO) (AY836743-44)

C. kelberi Itumbiara Reservatório de Itumbiara Rio I 1/3 (18) Este trabalho


Paranaíba (MG)

C. kelberi Morada Reservatório Três Marias, I 1/1 (12) Este trabalho


Nova Distrito de Morada Nova,
Rio São Francisco (MG)

C. kelberi Helvécio Lago Dom Helvécio, Rio Doce I 1/1 (10) Este trabalho
(MG)

C. kelberi Felixlândia Reservatório Três Marias, I 0/1 (10) Este trabalho


Cidade Felixlândia, Rio São
Francisco (MG)

C. piquiti Itumbiara Reservatório Itumbiara, Rio I 1/1 (19) Este trabalho


Paranaíba (MG)

C. piquiti Furnas Reservatório Furnas, Rio I 1/1 (17) Este trabalho


Grande (MG)

C. cf. monoculus Paraná Rio Paraná (PR) I 0/4 Oliveira et al., 2006
(AY836717-20)

C. cf. monoculus Capivari Reservatório Capivari, Rio I 0/1 Oliveira et al., 2006
Paranapanema (PR) (AY836730)

C. cf. monoculus Itaipú Reservatório Itaipú, Rio I 0/1 Oliveira et al., 2006
Paraná (PR) (AY836739)

C. cf. monoculus Lajeado Reservatório Lajeado, Rio I 0/1 Oliveira et al., 2006
Tocantins (TO) (AY836746)

C. piquiti Marginal Lago Marginal, Rio São I 1/1 (12) Este trabalho
Francisco (MG)

Cichla sp.** Farm Estoque cultivado (MT) I 0/1 Oliveira et al., 2006
(AY836740)

Cichla sp. Catu Lago Catu (CE) I 1/1 (5) Este trabalho
* Números em parêntesis representam o número total de amostras analisadas para cada local;
** Identificado por Oliveira et al., (2006) como C. temensis.

29
Capítulo 2 – Desenvolvimento e caracterização de marcadores nucleares
microssatélites para a espécie de tucunaré Cichla piquiti

Resumo
Um conjunto de primers foi desenvolvido para 10 loci de microssatélites para a espécie
de peixe neotropical Cichla piquiti, um dos maiores ciclídeos amazônicos (tucunaré).
Esses loci foram utilizados para genotipar indivíduos de duas populações: uma nativa do
rio Tocantins e a outra introduzida no sudeste brasileiro (alto do rio Paraná). A
amplificação cruzada foi realizada com sucesso para outra espécie simpátrica de
tucunaré: C. kelberi. Uma média de 4.4 alelos por locus (2 a 9 alelos) foi detectada.
Esses marcadores serão úteis na caracterização da estrutura genética de populações
nativas e também no estudo de invasões biológicas, uma vez que espécies de Cichla têm
sido introduzidas em diversas bacias hidrográficas fora de sua distribuição natural.

Palavras-chave: microssatélites, espécie invasora, Cichla piquiti, tucunaré.

Abstract
A set of 10 microsatellite loci was developed for the Neotropical fish Cichla piquiti one
of the biggest cichlid in the Amazon Basin. These loci were tested on 34 individuals
from two populations, one from the Tocantins River (n=20) and another from an
introduced population in southeast Brazil, Upper Paraná River (n=14). Cross
amplification were also successfully tested for the sympatric species Cichla kelberi. An
average of 4.4 alleles per locus (2-9 alleles) was detected. These markers will be useful
for the characterization of genetic structure of native populations, and also on invasive
biology studies, since these fish are the most translocated species of Cichla in Brazil.

Keywords: microsatellites, invasive species, Cichla piquiti, peacock bass.

Introdução
O tucunaré é um dos maiores tucunaré provocou drástica redução da
ciclídeos da bacia amazônica. É uma ictiofauna nos lagos do Parque Estadual
espécie de peixe agressiva, sendo muito do Rio Doce (Godinho, 1994) e de
apreciada na pesca esportiva e na espécies de pequeno porte em lagoas
culinária (Kullander e Ferreira, 2006). marginais do rio São Francisco
Dentro e fora do Brasil, o tucunaré foi (Pompeu, 2003).
introduzido em diversas bacias Cichla piquiti e C. kelberi são
hidrográficas onde não ocorria espécies de tucunaré endêmicas da
naturalmente (Zaret e Paine, 1973; bacia do Tocantins-Araguaia e são
Oliveira et al., 2006). Nesses locais, ele frequentemente encontradas em
frequentemente se torna uma ameaça às simpatria. Elas têm sido as espécies do
espécies nativas. No lago Gatum, por gênero Cichla mais translocadas para o
exemplo, (Panamá) foi descrita a sudeste do Brasil (Kullander e Ferreira,
extinção local de pelo menos nove 2006, Oliveira et al., 2006; Capítulo 1
espécies de peixes após sua introdução deste trabalho). Apesar do grande
(Zaret e Paine, 1973). No Brasil, o impacto ambiental provocado por

30
espécies invasoras, introduções recentes Amostras de tecido (músculo) de
podem fornecer dados importantes para tucunarés (gênero Cichla) foram
estudos de evolução, ecologia e coletadas de espécies nativas do rio
biogeografia na região Neotropical Tocantins (represa de Tucuruí (n=20)) e
(Vellend et al., 2005). de espécies introduzidas (represa de
Itumbiara, rio Paranaíba (n=12) e
Marcadores moleculares - fixadas em etanol 90%.
microssatélites
Marcadores nucleares Desenvolvimento de microssatélites
microssatélites são repetições de Os marcadores microssatélites
sequência simples (SSR), ou seja, foram isolados do genoma da espécie
repetições em tandem de pequenos Cichla piquiti utilizando-se a
motivos de nucleotídeos, que abordagem de biblioteca genômica de
tipicamente apresentam entre 1 a 5 DNA enriquecida para microssatélites
pares de bases (Tautz, 1989). A maior (modificada como descrito em
limitação para a utilização de Beheregaray et al., 2004). O DNA total
microssatélites é o isolamento e a foi extraído de tecido muscular,
caracterização dos loci (Zane et al., utilizando-se o método Fenol-
2002). Para cada espécie de interesse é clorofórmio (Sambrook et al., 1989).
necessário o desenvolvimento de novos Posteriormente, o DNA genômico foi
primers específicos, sendo que, em digerido com as enzimas de restrição
alguns casos, esses primers podem ser RsaI e HaeIII, sendo os fragmentos
utilizados em espécies próximas ligados a oligonucleotídeos adaptadores
(primers heterólogos). (A: CTC TTG CTT ACG CGT GGA
Microssatélites vêm sendo CTA; B: TAG TCC ACG CGT AAG
utilizados em muitos trabalhos desde CAA GAG CAC A). Duas sondas
sua descrição (Litt e Luty, 1989; Tautz, marcadas com biotina (dGA10 e dCA10
1989) e têm sido úteis na caracterização – dAGAT8, dAACT8, dACAT8) foram
de populações de peixes introduzidas e hibridizadas no DNA digerido e
nativas para detecção de estrutura seletivamente retidas utilizando
genética populacional, fluxo gênico, partículas magnéticas de streptavidina
efeito gargalo, efeito fundador, (Promega). A PCR foi realizada no
populações fonte, entre outros (e.g. eluído enriquecido em microssatélites,
Brown et al., 2009). Sua elevada utilizando-se um o oligo-adaptador A
variabilidade os torna marcadores como primer. A biblioteca enriquecida
moleculares muito robustos (Zane et al., foi, então, purificada utilizando o kit
2002). “gene clean” (Qbiogene), ligada no
Neste trabalho, foi realizado o vetor pcR 2.1 – TOPO (Invitrogen) e
isolamento e a caracterização de 10 posteriormente transformada em células
novos marcadores microssatélites para a TOP 10. O plasmídeo foi amplificando
espécie de tucunaré C. piquiti e sua diretamente das colônias bacterianas,
amplificação cruzada em C. kelberi. utilizando primers M13 direto (-20) e
reverso (-40), sendo os produtos de
Metodologia PCR analisados em gel de agarose e
Descrição da amostra purificados do gel utilizando o kit

31
Qbiogene. As sequências de DNA Genotipagem
foram obtidas por meio do As amplificações foram
sequenciamento do produto de PCR, realizadas segundo o método descrito
realizado pela empresa Macrogen por Schuelke (2000), no qual o produto
(Coréia). de PCR é marcado com fluorescência
Os primers foram desenhados por meio da inclusão de um terceiro
utilizando-se o programa on-line primer fluorescente (M13). As reações
PRIMER3 (Rozen & Skaletsky, 1997). foram realizadas em um volume final de
Um apêndice com a sequência do 10 µl contendo 1X Flexi Buffer GoTaq
primer M13 (5’-TGT AAA ACG ACG (Promega), 2.5 mM MgCl2, 0.2 mM
GCC AGT) foi adicionado na dNTPs, 0.2 U Go-Taq Flexi DNA
terminação 5’ de cada primer direto polimerase (Promega), BSA (0.1%),
para facilitar a subsequente marcação 0.05 µM primer direto, 0.2 µ M primer
fluorescente (Schuelke, 2000). Os loci reverso e 0.2 µ M primer M13
desenvolvidos foram depositados no fluorescente (FAM, NED, VIC ou
Genebank (www.ncbi.nlm.nih.gov) com ROX). O programa de amplificação
os números de acesso fornecidos na consistiu em um passo inicial de 94oC
tabela 2. por 3 min, seguido por 32 ciclos
touchdown (94 °C por 20 s; 63 °C a 55
°C até o quinto ciclo por 45 s; 72 °C por
1 2 60 s) e 72 °C por 4 min.
Di Tetra Os produtos de PCR foram
detectados no aparelho ABI 3130
(Applied Biosystems) nas instalações da
2000 pb Universidade Macquarie (Sydney,
Austrália). Os perfis dos microssatélites
1000 pb obtidos foram examinados no software
GENEMAPPER 4.0 (Applied
500 pb Biosystems), sendo a genotipagem
realizada manualmente. O software
250 pb GENEPOP v3.3 (Raymond & Rousset
1995) foi utilizado para estimar as
100 pb heterozigoses esperada (He) e
observada (Ho), número de alelos (Na),
o desequilíbrio de ligação e as
Figura 1. Gel de agarose mostrando o proporções de Hardy-Weinberg.
resultado da PCR realizada no eluído Correções de Bonferroni foram
enriquecido em microssatélites, aplicadas quando conduzidos testes
utilizando o oligo-adaptador A como estatísticos múltiplos (Rice 1989).
primer. Na coluna 1 foram utilizadas
sondas di-nucleotídicas, e na coluna 2 Resultados
sondas tetra-nucleotídicas. O desenvolvimento de novos
marcadores microssatélites foi
executado com sucesso para a espécie
C. piquiti. A técnica de biblioteca

32
Tabela 1 Sequência de primers de 10 loci de microssatélite isolados para Cichla
piquiti e suas características. Número de alelos (NA) e faixa de peso molecular
observado são baseados em 34 indivíduos de 2 populações. Os valores de heterozigose
observada (Ho) e esperada (HE) foram calculados baseados em 20 amostras da
população nativa.

†Desvio significativo do equilíbrio de Hardy–Weinberg, P < 0.05.


*Primers forward foram marcados com a sequência 5′M13 universal (5′-
TGT AAA ACG ACG GCC AGT -3′).
‡O peso molecular exclui a sequência 5′M13.

genômica enriquecida para resultado foi positivo (figura 1 –


microssatélites foi eficaz, pois foi canaleta 1). Entretanto, para sonda com
possível obter um grande número de tetra-nucleotídeos, não se obteve o
loci de microssatélites do genoma da resultado esperado (figura 1 – canaleta
espécie alvo. Nessa etapa, crucial para o 2), visto que foram observadas bandas
sucesso da técnica, espera-se observar intensas ao invés do rastro homogêneo
no gel de agarose da amplificação do esperado.
eluído enriquecido, um rastro de DNA Dos 120 clones positivos
(sem bandas evidentes). Com a sonda sequenciados, 20 apresentaram
de biotina com di-nucleotídeos, esse sequências de microssatélites com

33
regiões flanqueadoras suficientes para o Discussão
desenho de primers (Tabela 2, A utilização dos marcadores
ANEXO). Dos 20 pares de primers nucleares microssatélites é limitada pela
testados, 10 amplificaram necessidade de desenvolvimento de
consistentemente e foram selecionados novo desses marcadores para cada
para serem utilizados na genotipagem espécie objeto de estudo (Zane et al.,
dos peixes (Tabela 1). Para os loci que 2002).
apresentaram mais de uma região A clonagem de microssatélites
repetitiva, foram desenhados diferentes pela técnica por biblioteca enriquecida
conjuntos de primers (Tuc 4 e 5 – foi eficiente, apesar de apenas 50% dos
Tabela 1). Nas análises genéticas não marcadores desenvolvidos apresentarem
foram utilizados, entretanto, locus em bons resultados na PCR e, assim, serem
uma mesma sequência, devido ao úteis na genotipagem dos espécimes.
desequilíbrio de ligação. A clonagem dos microssatélites
Todos os loci foram apresentou maior eficiência para a
polimórficos para C. piquiti, espécie quando foram utilizadas sondas
apresentando média de 4.4 alelos por dinucleotídeas na hibridação (figura 1).
locus (entre 2 e 9 alelos por locus). Isso pode estar relacionado à
Apesar de alguns loci apresentarem abundância de sequências di-
baixa variação na amostragem de 34 nucleotídeas no genoma do peixe ou a
indivíduos (e.g Tuc4, Tuc10, Tuc11 e algum artifício da técnica, como, por
Tuc12, todos com 2 alelos por locus), exemplo, maior especificidade e força
aparentemente, alguns apresentaram de ligação das sondas di-nucleotídicas
alelos espécie-específicos, que podem quando comparadas com as sondas com
ser úteis para estudos de hibridação em tetra-nucleotídeos.
Cichla. É interessante notar que Tuc 4 Os microssatélites aqui
foi monomórfico para as populações desenvolvidos para a caracterização
nativas, mas um alelo distinto foi genética das populações nativas de C.
detectado nas populações introduzidas. piquiti também amplificaram amostras
A maior parte dos loci estava em de C. kelberi. Essas duas espécies
equilíbrio de Hardy-Weinberg nas endêmicas do rio Tocantins e
populações nativas, exceto Tuc18, que recentemente descritas por Kullander e
apresentou excesso de homozigotos Ferreira (2006) são as principais
mesmo após aplicação do ajuste de espécies introduzidas no sudeste
Bonferroni, provavelmente devido a brasileiro. Assim, esses marcadores
alelos nulos. Nenhuma evidência de poderão servir como ferramentas
desequilíbrio de ligação foi detectada na importantes na melhor compreensão do
comparação par a par entre locus e processo de colonização dessas espécies
populações. Todos os pares de primers no sudeste brasileiro.
amplificaram com sucesso amostras de
C. kelberi, sugerindo que esses Conclusões
marcadores também podem ser úteis na Foram identificados vinte loci de
caracterização genética de suas microssatélites para a espécie de peixe
populações. tucunaré (C. piquiti). Desses, dez
marcadores tiveram sua PCR otimizada

34
com sucesso, sendo todos os loci American cichlid genus Cichla, with
polimórficos, apresentando média de descriptions of nine new species
4.4 alelos por locus (entre 2 e 9 alelos (Teleostei: Cichlidae). Ichthyol.
por locus). Entre os loci identificados, Explor. Freshwat., v. 17, p. 289-
apenas Tuc 18 não estava em equilíbrio 398, 2006.
de Hardy-Weinberg. Os pares de
primers desenvolvidos para C. piquiti LITT, M.; LUTTY, J.A. A
também amplificaram com sucesso nas hypervariable microsatellite
amostras de C. kelberi. Se utilizados em revealed by in vitro amplification of
conjunto com marcadores mitocondriais a dinucleotide repeat within the
(Cap. 1), esses marcadores nucleares cardiac muscle actin gene. Am. J.
microssatélites poderão ser aplicados Hum. Genet., v. 44, p. 397-401,
em estudos que visem uma melhor 1989.
compreensão do processo de
colonização dessas espécies no sudeste OLIVEIRA, A.V.; PRIOLI, A.J.;
brasileiro, contribuindo com novas PRIOLI ,S.M.A.P.; BIGNOTTO,
informações sobre o processo que T.S.; JÚLIO, H.F.; CARRER, H.;
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36
ANEXO

Tabela 2. Sequências dos 20 loci de microssatélite isolados para Cichla piquiti e suas características.
Nome Loci Motivo Ppcr Primers (TAG M13 em negrito) Resultados
TUC1 CCTTTCTCAATCTGGTGCTTGATGGCTTGGAACAGTTTGTGCAAGGGCTCGCCTGCA CA18 A= 131 pb A
GAGTCCTGTTACACACACACACACACACACACACACACACACACACAGACCTTTTGA F TGTAAAACGACGGCCAGTGCTTGATGGCTTGGAACAGT
AGTGAGTGCTGCAACAAACCCTCATGCCAAGACTCCCATTTTAGGCGGAGAATGATA B= 156 pb Falha na
TGCAGGAATTGGTGCTTGTCTGTGTGTATAATTCCACAGCTGTACCTGTCACTCTCC
R GTCTTGGCATGAGGGTTTGT PCR
TGGAGGAAACATACACATGCTGTCTGTGTGCTACATGACCCCAAATATTTTAGGACT
GGATGCAGTAGTTATGGATGTTGGTAGCTGGGTGTTTGTGAATGTTTAAGTTCTGCA B
GCAAATAAAGTACCCTATGGAAAT F TGTAAAACGACGGCCAGTCTCAATCTGGTGCTTGATGG
R CGCCTAAAATGGGAGTCTTG
TUC2 TCATTTCTAATTCTGTCTATTCTGGTCACTCCCAATGAAAATCTTAACATCTTCAAC GTTTT5 287 pb
TCTGCCACCCCCAGCTTAGCCTTCTGGGTTTTTTTTTGTTTTGTTTTGTTTTGTTTT F TGTAAAACGACGGCCAGTTGGTCACTCCCAATGAAAATC
GTTTTGTTTGTGCCACCGTATCCATATCATATATCATAGCAGTTCTCACTACCATCT CATA3 Monomórfico
CTTimper R GCTCAACCATCCAAAGGAATAG
TGTAAACCTCCCCTTTCACTTTTACTGCCATCCTTCTGTCACAAATCAACCCTGACA
CTCATCTCCACCCACTCCACCCTGCCNGCACTCTCTTCTTCACTTCTCTTGTTCACT
GTCTATTCCTTTGGATGGTTGAGCCCAAGTATTTAAACTCATCTACTGCTGCCATCT
CTACTCCTTGCATATTCACCTTTCCAATTGTCTCCCTCTCATTCACACACATGCATT
CAATTAAAATCAATGTTATTTATCCATCCATCCATCCATTTTCCTCCGCTTTAT

TUC3 CTTTTCATGCGGAAAAATAGCACTAATTCATTTCCCACACAGTAAGTCCTCTTGTTT GT22G14 287 pb


GCAATATTCATGTCACCTGGAACAATGAAAGGAGGACAACCCCTGTTACTTGTGTAG F TGTAAAACGACGGCCAGTTTTCATGCGGAAAAATAGCAC
TGCTAAGAATAGATGTAGCCCCCTTTAGTGTGTGTTTGTGTGTATGTGTGTGTGTGT Polimórfico
R CCCTCCAGACTTCAGCTTTC
GTGTGTGTGTGTGTGTGCGTGTGTGGGGGGGGGGGGGGTAAATAAAGAAAAAGCTGA
GAAGAAACTCCACTCGCAAACTGACCCAGATAACAACAACAGAAAGCTGAAGTCTGG
AGGGGCAAA

TUC4 CTTCATTTCTCTACTCCACTTTATACCCATCTCCCTCTGCATGCATGTGTGTATATA AT4GT28 A= 189 pb


TGTGTATGTGTGTGCGTGCGTGTGTGTGTCTGTGTGTGTGTTTGTGTGTGTGGAAGC A (Primeiro micro)
TGGAAGCTTGTGGTTATTTTTCAGGCAGCAGCCCAGAAGATTGGACTGTCATAATCT /CTimper B= 262 pb Polimórfico
F TGTAAAACGACGGCCAGTATACCCATCTCCCTCTGCAT ( (primer a)
ATGGTCCTGAGTTATAAGTGTTTCTAACCCAAACTGGGGGACAGGACCATTTTTTCT
TTCTTCCTCTTCTCCACCAACACCATCTCCTCCTCTCTCTTTCTCTTTCCCTCCCTC R CCCCCAGTTTGGGTTAGAAA
CCCTCTGTTCTCTCCTCTCCCATCATCTCTCACTCTTCCTCCCTTTCTCTTGTCACT
ATGCATTGCCATTTATTTTCTGCACTGATGGGAATCCAAGCTCTTGCTATTGATCAC B (segundo micro)
CACCCACCACATGTCATCTCTCATGCACTAAATTTGGAGTTTACCATTAGTGATGTT F TGTAAAACGACGGCCAGTTGGTTATTTTTCAGGCAGCAG
TCGGAGTTCGATTGGACAGTGACTTCATATTGTTAAGATTGTTAATCTGATCTAATT R AGAGCTTGGATTCCCATCAG
CTCAACTATTTGGTGGGGCACATTTTGAGCCTTAATAGAAACATAAGTTGTAGTGAG
CCTGACTGAGCCATTTCTATCATTTGATTGCAGTATGTTAATGTTAGTGATTTTAAA
TTTTTTTTGCCAGCTTCTCATCATGATCCATCCATCCATCCATCCACTTATCCAATT
CAGGGCCATAGGGTTG
TUC5 ACGCTTTAAATGTAAACATCGGCAAAAGCCAAACTTATTCAATTCACATCAGTGAAG GT23/CA A= 241 pb A
CAAAGTGATTGTTGATTTAAGCTCCCCAAATAGAAAGCTCATTTCAAGAAAGATTTC F TGTAAAACGACGGCCAGTGGGGTTCACACAAACACTGC
CCATGCAGAGCGGAATTTGCATATTCCTAAAAAACCATTCTCTGCTTTTTTTGCTCT 9 B= 299 pb Polimórfico
C= 232 pb R TCTACTTTTAGGCTGCACTCACC
CCGGGGTTCACACAAACACTGCCTTCATTTGAATGGTAACTCGAATTGTCTCACTAG
CTAGCTAGCTGCTTTGTCACTTGAGATGCAAATGTATTGGGCAGGCGTGGTTGTGTG
TGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTAAGACAGGAATA B
CAAATAGCTTTTATCACAAAATAGAATAGCACTCGCAGCTTGTTGTGCTGGTGAGTG F TGTAAAACGACGGCCAGTCAAGAAAGATTTCCCATGCAG
CAGCCTAAAAGTAGATATTTTCCTACACCTGATCTTGTTCATCAAACTTCTCTGATC R GCACTCACCAGCACAACAAG
AATTAAATAGCTTTTCTGTCTCAGACTACAGTCATATTTGTATGTTTAATTGAAAAC
AAAAATAATGGCACTTTGGCATCTTTTTACTGGTTACACTTACAGGTTCATGCTGAC C (2 micro do lócus)
ACACACACACACACACAAAAACAAAGGCTACTTAGAGTGTT
F TGTAAAACGACGGCCAGTGCTTGTTGTGCTGGTGAGTG
R AACACTCTAAGTAGCCTTTGTTTTTG
37

TUC6 CAGTGGTTTGTGCTGATGTTCAATTTCAGTGCACAGCCAACTTGATGGTTACTTATT CA8 197 pb F TGTAAAACGACGGCCAGTAAGGAGAAGCATGACAAGGTG Monomórfico


TTCTCTGAACACATTTTATGAGAATAGGCTTTAGCCTAGATAGAGCTTTATGTGTAT R TTGATGGCTGAGTTCAAGGT
GCCTCGAGGACATACTGTATTTGTGTGTGCGTGCACAAGAGAGCAAGGAGAAGCATG CAAA1
ACAAGGTGCGTGCTTGCCATTTTCAAAATGACTTCTCAAAATAAGTTGCACTCTCAC TA1
TCAAACTGTGAATCTATTCCTCACACAAACACATACACACACATATGCATTTATGTA
TGGGTATAACTATGAGGTTATTCACATATATAATCCATTACTAGCCACTTACCTTGA
ACTCAGCCATCAATACTAA

TUC7 TGGGCAACACGGGAGTTTAATCATTTCCTGAGGGGAGCTGTAGTGTAAACACCAGTA GT13imper A= 155 pb A Falha na


GTCCAGTCATTACGCAGGAGGAGTGTGGGGCTGTTCATATGTGTGTGTCTGAGTGAG F
TCGGTGTGTGTGTGTGTATTTTCATTCACTCATCCATAAACGTGAGAACATATTTAG B= 213 pb PCR
TGTAAAACGACGGCCAGTCAACACGGGAGTTTAATCATTTC
CTTTAGTGTTAACAGTAGGAGTCACACAACAGGGATTTCAGC
R TCACGTTTATGGATGAGTGAATG

B
F TGTAAAACGACGGCCAGTTCCTGAGGGGAGCTGTAGTG
R GCTGAAATCCCTGTTGTGTG

TUC8 AGAGAGAGAGAAAGAGAGAGAGAGGGTGTGTTGGAAAGAGGCAAAAACGGGAAAGAA GT3CAA3 165 pb F TGTAAAACGACGGCCAGTAAGAGGCAAAAACGGGAAAG Monomórfco


AACAAAAGAAAGTACATACGTTAGAGGACATCCGAGGAGCAGTGTCACAACATCCTT R CCATGCTCCTGCTTGTGTAG
GTGTGTACAACAATAACAATATCATCATATCATCAGTAGCAAGCAAGCAGCAGTCTG CAT3
ACACAAGTACTACACAAGCAGGAGCATGGTGCCTACTGGAGCTACTAGCTAACAAGC
ATTCATATGTTCATTATATTGGACTGTTAGCTCTGTACTATTAAGGCTGGCTAAATG
CAACATAAGCAAGCATTAACTATTAAAACAATAAGGCTGCTAACATGTGGTGTAACA
GGTAAGAAGCACAGAGAAAAGGGAGGCTGCACTGCTAGCTCCATGATAAACTGTGTA
AGCATGTTTAAGTGATGGTTCACTCGCAGACAAATGTCAAAAATGGT
TUC9 TAGGTTTCCTGAGTCTTTCTCTGTCTGTCTCTGGCTCTGAGGGTCGCTGTTGCAGCT CA10GA1 215 pb F TGTAAAACGACGGCCAGTTCGCTGTTGCAGCTTATCAC Polimórfico
TATCACCCTCATTATCAAGTACATCTCATGACAAACACACACAGACAATCACACACA R GACTGAAAGGGGGTGGAGAG
CACATGCGCACACAAAAGTAACAGAATAAGGAAGTGTATTTGTTGGTTGCTCGTTAG CAAT1
TTTTTTTTTTCTGTGTGTATCTTCTGTCACAGATGCAGCAGTCGGTGTANACCCCCC
CACCCCCCTTCTCTCCACCCCCTTTCAGTCCCTTCCCACCTGTCAGTTCCGGTACTG
T
TUC10 CAAATGCCACTGTTGTTTACTGTTTGACTGCAGTGAACTGTAATGGATTTCTCCCTT CA3Gt4 184 pb F TGTAAAACGACGGCCAGTTCTCCCTGACCTTCAACCAG Polimórfico
GTCATAGCTCCATGTGGTGGGAACCTGACAGGTCCTAGTGGGCTGATTCTGTCTCCA R TGCTTAGATGAGCTGCAAGG
GACTATCCTGAACCGTATCCTCATGGAAGAGAGTGCGACTGGACAGTTACTGTCACA
CAGGACTATGTCATCTCCCTGACCTTCAACCAGTAAGCTTCAGTAGTTAAAAAGAAA
AAAAAATGGCTACTGGGGGTGGGTGTGTGTGGGTGGGCTATGGATTAAGTTGATCTT
TGATCATTATCCTTTTCAGAATTTAATTTCTAAATTATGCTAGCAAATCTTTCCTTG
TTGTTACCTTGCAGCTCATCTAAGCAGCAGCTATATGATTACTTTTTAATGTCATTT
TCTGTAACCAGGTTCAGTTTGGAGCCAAGTTATGACTTCTTGCATATCTATGACGGA
CCGGACTCCCTTAGTCCCTTGTTGGGTAGTTTTTATGGCACAGATGTTCCAGATCGC
ATTGAGAGCAGCTCCAACACGCTCTTCTTGGCTTTCCGCAGCGATGCCTCCCTCANC
AGCAATGGATTTGTGCTGCAGTCCATTTCTCTCCATTTTC
TUC11 CTGAATCTTAAAGTCTGCAAGCAAAACAACAGAGGCAATGAGAGGAGATTGAAAGAG GT13 165 pb F TGTAAAACGACGGCCAGTAAGAGGCAAAAACGGGAAAG Polimórfico
ACAGAGAGGACTTATTGTACCAGTGTTAGCAGATGTACAGCAGTGGGATGTGTGACC R CCATGCTCCTGCTTGTGTAG
AAAGCTCTGTCAAGCCTGCGGGTATCAACACAATGGGGACAGACTGTCATCCCCCCT
GGCTATTAATATTACATTACTGCCACTTCAGACCAATCTCCCAGTTAAAGAGTCCTA
TGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGGGAGCGGTGGTGTATGAGTGAGTAGAAAA
ATACTCAAATCTACGGCTAAACCCAGAATATTCTTTGATCCATTATGCAAGAAGGTA
GGAGCCAG
TUC12 TTAGCTTGGAACGACCTGCGCTAGATCATCATTCTTACACACAAACATGCACACTAA GT7 239 pb F TGTAAAACGACGGCCAGTCCTGCGCTAGATCATCATTC Polimórfico
CACACATGGTGAAATGAAGACAGACAAATGAAGCTCATTTGTTTAGCTGATGAATAA R TCCTTTCGATCTCCCAAATG
AGAGAAGTTGCCCAATTGTCTGACTGTTAAACCATGGAATGGACTTTGTATTTGCTC
TGTGTGTGAGTGTGTGTCCCATCACTATCCCACACAGCTCATTAAGCTACACTGCTG
TAATTCATTTGGGAGATCGAAAGGACAGTCAAGCAGGCAAACTAACCATATTTTTTT
TTGTTTGTTTTTTTTCTCTTGTGTTGTCACTGTAACTTTCCGTGTCCTTCTTAGCTG
TCACACAGTATCTTTCTTCAACAAAGAAGGCTGTATGTATGTGTTTCTATGCACCGA
AACAAATGCAGAAACTCACTTCAAAACCATGAAAAGTTCCTGTACAGGTTCATGGAG
GTGACATATGGCATGACGAATT
TUC13 CATACTGAGTGAACGATTGGGTTAGAAGAGCCAAAGAGTAATTTGATCACCCACATA CA17GA1 235 pb F TGTAAAACGACGGCCAGTCGAAAAGACAGCATGTCAGC Polimórfico
TGTGCAATAAAACCTCATACGAAAAGACAGCATGTCAGCTGTGTGTCAGTGGAAAAA R CCCATATTGACCCACTGATTC
CTCCTGTTACACATGTAAGTTGAGAAAGGAGCACTGATAGCTGAATAGCGTGTATGG
38

CTACATGATCAGGACTATAACGACAGCCTTTAATTGTTCAGAAGACACTCACACAGA
CACACACACACACACACACACACACACGGACGCAAAAATAATGAGCGTATCAGTGTC

38
NCTTTGAATCAGTGGGTCAATATGGGCAAAAAATAGGGCTGCCTTTTATGTCACACA
AGTGGATGAAAGAAGAAGAC
TUC14 ACAATTAATCTGAGGGAGGCATGCTTCATTCAAACGCACAGCTGCTTGAGACTGTAA GT9 196 pb F TGTAAAACGACGGCCAGTTGCTTCATTCAAACGCACAG Falha na
GCCCATTATACTGCCTTTTGTGTGTGTGTTTGTGTGTGTGCACGCGTGTGTGCATCC R TGCTAACACTGAGCCACAC
AAGGGTGTGCACTTAGTTGAAGTGAAGGGAGTGTGTCTCTGCTCTGCTCTTCTCATA PCR
CTGGGACTCTAATTAAATGTTTAAATCGTGTGGCTCAGTGTTAGCAGCACTAATAGC
GAATTGTTCCATGACATGTTGAAAAGACTCACGTATTGTCATGATTTTATTCATAGA
AAAGTAGCACAGACACTGCAGGATAGGTATATCAGCAGCTAATTTCACTATTACTTT
TAGACTTTGCTTTTTAAATTANTTTTCCTGCAATGTGAAA
TUC15 CTGAAATCCCTGTTGTGTGACTCCTACTGTTAACACTAAAGCTAAATATGTTCTCAC AC7CA5 153 pb F TGTAAAACGACGGCCAGTTGAAATCCCTGTTGTGTGACTC Falha na
ATTTATGGATGAATGAATGAAAATACACACACACACACCGACTCACTCAGACACACA R TCCAGTCATTACACAGGAGGAG
CATATGAACAGCCCTACACTCCTCCTGTGTAATGACTGGACTACTGGTGTTTACACT PCR
ACAGCTCCCCTCANGAAATGATTAAACTCCCNTGTTGCC
TUC16 GGCTGGGCCCTCAGCTGCAGATCTTCTGTGGGGAGGAGGTTTGCAACTCTCCACTTT AC7 180 pb F TGTAAAACGACGGCCAGTAGATCTTCTGTGGGGAGGAG Polimórfico
CACTTTACACACACACACACAGTTACCTTACTTTACTGGTATTTACTGGTATTTCAG R AAAAACAACACCATGGCAAG
TGTGTCAGTAGATATTTGGATTGTTTCACATTAAGAGGGAGCCAGCAGGAGCCAAAG
CATTTCCCTTGCCATGGTGTTGTTTTTACAAAACCCCACATGACTCTACCAGAGTAG
CTTTGCATGAATCATAGTTCAAAAATAATCCTTATTAATCTGAAT
TUC17 TTGTTCTCTTTGTCTCTCTTCTTGCTTTCTCTTTCTTTTTTCTCAGGCATACACTCA TC8 129 pb F Falha na
CTATATCTTTCTCTCTCTGTCTCTCTCTGTAGTGTGTTGGGATAATAGGCTTCAGCT TGTAAAACGACGGCCAGTTGTTCTCTTTGTCTCTCTTCTTGC
ATGAACAGTGGTCCAATTTTAATTCCTTTTATT IMPER PCR
R TTGGACCACTGTTCATAGCTG

TUC18 ATTCGTGACGGAGAGATAGATGTGTGTGTGTGTGTGTGTCTGTGTGTCTGTGTGTCT TG20 100 pb F TGTAAAACGACGGCCAGTATTCGTGACGGAGAGATAGA Polimórfico


GTGTGTGTGCCTGTGTTGCTGGTTTGTGGGGCAGTATTATTGATTC R TCAATAATACTGCCCCACAAA
IMPER

Tuc19 TGTGGGCTTCTCTTTCTGGGTGCTGGTGCTGCCTGGGTAGGACTGGGCTGTGCTGTC CA35 222 pb F TGTAAAACGACGGCCAGTGACGCTGGTGATTCTGGTG Falha na


TTGCCTCTGCTGGGTCTTGCCTAGTGTCCCACTCACTGGTAGAGATCTTCCTTCATG R CAGGTGCCCTGATCCTGTAG
TTTCTGGCTCGGTATGCAGGTATACACTGCTTCTTGGTCTTTGTTGTAGGTAGTGCT PCR
TATGTGGGTTCTCGTCACCACTCTGTGTTACGATGTCTGGACGCTGGTGATTCTGGT
GACTTTTGCGCATGCACACACACAGACACACACACAGACACACACACACACACACAC
ACACACACACACACACACACACACACAAAAGAAAGGGCTAATGATGTATCAAAAGAA
TACCAGGTGACAGGTATCTCAACCTGCAGCTGATGGCACATATGGTATCTCAGCTTC
CTACCTGTTCCATCTACAGGATCAGGGCACCTGTCAATATTTTCC
Tuc20 ACAGACACATGCACACACAGTGAAAAGAGTCTCACCAGGGTAGAAAACAGTGCTTGT GA24GAA 232 pb F TGTAAAACGACGGCCAGTTTGTCTGCAAACTGCCTGAC Falha na
CTGCAAACTGCCTGACAGGCAGAAAATAGCCCTGGCTAAGGAGGTGTGAGGGGAGAG R TTTTCATGCTCCCCCTACAC
AAGAGGAGAGGAGTGAGAAGGAGAAGGGAAGAGAAGAGAAGAGAAGAGAAGAGAAGA 19IMPER PCR
GAAGAGAAGAGAAGAGAAGAGAAGAGAAGAGAAGAGAAGAGAAGAGAANAGGCTGGA
AGATGAAGAGAGACAGGAGCAGCAGTGTGAGAAAACAGTGTAGGGGGAGCATGAAAA
TATTAATGCGCACATTCAAAGCACCGCCC
Na tabela são fornecidos o nome do microssatélite (coluna 1), a sequência do locus (coluna 2), o motivo de repetição do microssatélite (coluna 3), o peso molecular esperado
do produto de PCR (Ppcr), com a sequencia anexa M13 em negrito (coluna3), a sequência dos primers obtidas no software PRIMER3, com a sequência M13 anexada a
extremidade 5´ (coluna 4) e o resultado obtido para cada microssatélite (coluna 5). O motivo de repetição foi grifado para facilitar a visualização do microssatélite na
sequência de DNA. Em alguns loci foram desenhados mais de uma combinação de primers, quando a primeira combinação não foi eficiente na PCR (Tuc1, 5 e 7). Em
outros loci, onde foram detectadas mais de uma sequência repetitiva, testamos a PCR para cada microssatélite separadamente (Tuc 4 e 5).
39

39
Capítulo 3 – Caracterização genética de populações nativas e introduzidas do peixe
tucunaré utilizando marcadores microssatélites e mitocondrial

Resumo
Espécies exóticas invasoras são uma grande ameaça à biodiversidade, à economia e à
saúde humana. Conhecer o número de atos introdutórios, o número de espécies
introduzidas e a rota introdutória desses organismos é de grande importância para a
caracterização de invasões biológicas. Neste trabalho, foram utilizados nove marcadores
genéticos (microssatélites) para a caracterização da estrutura populacional de espécies
do peixe Neotropical tucunaré (Cichla spp) introduzidas nas principais bacias do estado
de Minas Gerais, sudeste do Brasil. Os dados genéticos indicam que o alto rio Paraná
foi o local que recebeu o maior número de espécimes de tucunaré, sendo possivelmente
a fonte das demais introduções no estado de Minas Gerais. O elevado índice de
diferenciação genética (Fst) entre as populações introduzidas sugere baixo fluxo gênico,
mostrando que novos atos introdutórios não têm sido realizados continuamente. Baixos
valores para riqueza alélica (Na) e heterozigose esperada (He) nas populações do rio
São Francisco e Doce indicaram que essas populações foram fundadas com número
reduzido de espécimes. Espécies híbridas foram detectadas apenas na população nativa.
Esses resultados genéticos são úteis no entendimento do processo de invasão biológica e
no desenvolvimento de estratégias de manejo e controle de espécies invasoras.

Palavras-chave: microssatélites, caracterização genética, populações introduzidas,


tucunaré, Minas Gerais

Abstract
Invasive exotic species are a great threat to biodiversity, economy and human heath.
Inferring the number of introduction acts, the number of introduced species and the
introduction route of these organisms is an important step into the characterization of a
biology invasion. In this work, we apply nine molecular markers (microsatellites) for
the genetic structure characterization of the Neotropical fish tucunaré (Cichla)
introduced in Minas Gerais State (Brazil) major river basins. The genetic data showed
that the Upper Paraná River has received a greater number of tucunaré ´s specimens,
and it was the possible source for other introductions in Minas Gerais. The high Rst
values among the introduced populations suggest a low genetic flow, leading to the
conclusion that new introduced acts have not been conducted continually at these sites.
Reduced genetic richness (Na) and expected heterozygosity (He) values in most
introduced populations showed that these populations have been founded by a small
number of specimens. Hybrids were detected only in the native populations. These
genetic results are useful not only in invasive biology studies but also in the
development of strategies for invasive species control and management.

Keywords: microsatellites, genetic characterization, introduced populations, peacock


bass, Minas Gerais

40
Introdução espécies invasoras (Dlugosh e Parker,
A introdução de espécies, seja 2008).
casual ou intencional, tem produzido Em geral, quando uma espécie é
desde consequências muito pequenas a introduzida, apenas uma pequena
mudanças catastróficas no ambiente amostra de indivíduos da população
receptor (Welcomme, 1988). Espécies original chega ao local receptor (Sakai
invasoras são organismos que, et al., 2001). Esses indivíduos não
introduzidos fora da sua área de devem, portanto, representar toda a
distribuição natural, ameaçam variabilidade genética mantida na
ecossistemas, habitats ou outras população fonte. Esse fenômeno é
espécies e são considerados a segunda denominado “efeito fundador” (Hartl e
maior causa de extinção de espécies no Clark, 1997). Caso uma nova amostra
planeta, afetando diretamente a desses indivíduos introduzidos seja
biodiversidade, a economia e a saúde transportada para outro local receptor,
humana (Fuller et al., 1999; Simberloff, deverá ocorrer redução secundária da
2003; IMARNR-MMA, 2006). Nos diversidade genética na nova população
Estados Unidos, por exemplo, estima-se introduzida. O decréscimo nessa
que houve introdução de pelo menos variação genética pode ser
50.000 espécies exóticas, provocando acompanhado em conjunto com a
perda econômica anual de até 120 assinatura genética de cada população.
bilhões de dólares (Pimentel et al., Podemos, então, deduzir o caminho
2005). No Brasil, ainda não existem percorrido na invasão biológica
estimativas de perdas econômicas (Muirhead et al., 2008) e, assim, inferir
provocadas pelo impacto de espécies possíveis modos de colonização (Sved
invasoras. et al., 2008).
Invasões biológicas são iniciadas Uma vez que a diversidade
quando ocorre uma ou mais introduções genética é elemento básico necessário
de uma espécie em uma nova área e para a evolução adaptativa, tem sido
podem suceder com muitos ou apenas proposto que múltiplas introduções de
alguns indivíduos (Sakai et al., 2001; espécies exóticas sejam responsáveis
Gaskin et al., 2005). Os números de pela transformação dessas em espécies
introduções e de indivíduos invasoras especialmente problemáticas,
introduzidos durante cada evento capazes de acelerar a resposta evolutiva
exercem amplo efeito no sucesso de à pressão de seleção (Kolar e Lodge,
determinada espécie em se tornar 2001; Dlugosch e Parker, 2008). Nesse
invasora (Dlugosh e Parker, 2008; sentido, a hipótese da “pressão de
Marrs et al., 2008). O entendimento propágulo” (Lockwood et al., 2005) ou
sobre a conexão entre fatores como esforço de introdução sugere que o
múltiplas introduções, número de número de indivíduos introduzidos e o
indivíduos e efeitos genéticos (gargalo, número de introduções influenciariam o
fundador, seleção e deriva) no resultado sucesso da invasão. Outras hipóteses
de invasões biológicas é aspecto poderiam explicar a vulnerabilidade de
importante a ser considerado nas determinado local à invasão, como a do
estratégias de manejo e controle de nicho vago em ambientes impactados
(e.g represas de usinas hidrelétricas) e a

41
de ambientes com diversidade de para acessar a diversidade genética e a
espécies reduzida (Hutchinson, 1957; estruturação de populações nativas e
Elton, 1958). introduzidas do peixe neotropical
O conhecimento sobre a biologia tucunaré nas seguintes bacias do
de potenciais invasores, especialmente sudeste: eco-regiões dos rios São
em relação à capacidade de dispersão, é Francisco, alto Paraná, Doce e Grande.
fator importante para que sejam
desenvolvidas medidas para prevenir Metodologia
sua disseminação – normalmente mais Descrição da amostra
viável do que o controle de grandes Amostras de tecido (nadadeira)
populações invasoras já estabelecidas de tucunarés (gênero Cichla) foram
(Goodell et al., 2000). Características coletadas de espécies nativas
genéticas e evolutivas podem ser (provenientes da bacia Amazônica,
decisivas na determinação de quando e n=38) e introduzidas (não Amazônicas,
quais espécies se tornam invasoras n=80) e fixadas em etanol 90%. As
(Sakai et al., 2001). Desse modo, o amostras eram provenientes de cinco
entendimento dos fatores que populações introduzidas nas principais
influenciam o sucesso de invasões bacias hidrográficas em Minas Gerais,
biológicas danosas ecológica e sendo elas: represa de Três Marias (rio
economicamente é de importância São Francisco, n=16), Lagoa Marginal
primordial para obtermos sucesso no próxima ao Município de São Francisco
seu controle. (rio São Francisco, n=11), represa de
Resultados genéticos obtidos a Itumbiara (rio Paranaíba, n=38), represa
partir da análise do mtDNA mostraram de Furnas (rio Grande, n=10) e Lago
que as espécies de tucunaré introduzidas Dom Helvécio (rio Doce, n=15). Os
em Minas Gerais são provenientes do peixes da bacia Amazônica foram
rio Tocantins (Cap. 1). Assim, coletados no reservatório de Tucuruí,
marcadores de alta resolução, os rio Tocantins– fronteira leste da
microssatélites, foram desenvolvidos distribuição nativa de Cichla (amostras
para a espécie endêmica do Tocantins, cedidas pela Profa. Iracilda Sampaio -
C. piquiti, e testados com sucesso para UFPA). O DNA total foi extraído de
C. kelberi (Carvalho et al., 2009). Os nadadeiras por meio do método Fenol-
microssatélites são marcadores clorofórmio (Sambrook et al., 1989).
moleculares úteis na caracterização Todos os espécimes foram identificados
genética da estrutura populacional, segundo Kullander e Ferreira (2006).
inclusive em espécies invasoras Entretanto, alguns espécimes na
(Lindholm et al., 2005; Therriault et al., população nativa apresentaram padrão
2005; Zayed et al., 2007; Marrs et al., morfológico duvidoso, o que dificultou
2008), sendo utilizados também na sua identificação utilizando apenas
detecção de hibridações entre espécies caracteres morfológicos. Identificados
de peixes simpátricas (e.g. Schwartz e como C. kelberi, esses indivíduos
Beheregaray, 2008). (espécimes 59, 63, 71, 130, 131, 132,
No presente trabalho, foram 133, 144, 146, 147, 148, 150) foram
utilizados marcadores microssatélites mantidos na amostra para posterior
(Carvalho et al., 2009) e mitocondrial análise de hibridação.

42
1) por serem considerados possíveis
Genotipagem híbridos, tiveram seus haplótipos
As genotipagens foram comparados e alinhados com as
realizadas com os primers espécies de tucunaré referência para C.
desenvolvidos para Cichla piquiti kelberi e C. piquiti. Sequências de DNA
(Carvalho et al., 2009) utilizando-se o mitocondrial são marcadores utilizados
método descrito por Schuelke (2000), para identificação molecular de espécies
no qual o produto de PCR é marcado (Barcode genético), mas não são ideais
com fluorescência por meio da inclusão para detecção de híbridos devido à
de um terceiro primer fluorescente herança dominante (sem heterozigose) e
(M13). As reações foram realizadas em por serem uni-parentais (herança
um volume final de 10 µl contendo 1X materna). Podem ser aplicadas,
Flexi Buffer GoTaq (Promega), 2.5 mM entretanto, em conjunto com
MgCl2, 0.2 mM dNTPs, 0.2 U Go-Taq marcadores nucleares, como os
Flexi DNA polimerase (Promega), BSA microssatélites, no sentido de
(0.1%), 0.05 µM primer direto, 0.2 µ M complementar a análise genética de
primer reverso e 0.2 µ M primer M13 hibridação.
fluorescente. O programa de Para isolar parte da região
amplificação consistiu em um passo mitocondrial Controle (CR) foi utilizada
inicial de 94oC por 3 min, seguido por a técnica da PCR (Reação em Cadeia da
32 ciclos touchdown (94 °C por 20 s; 63 Polimerase) com os iniciadores
°C a 55 °C até o quinto ciclo por 45 s; (primers) específicos para essa região
72 °C por 60 s) e 72 °C por 4 min. (CR L 5’-AGA GCG TCG GTC TTG
Os produtos da PCR foram TAA ACC-3’ - Cronin et al., 1993; CR
detectados no aparelho ABI 3130 H16498 5’-CCT GAA GTA GGA ACC
(Applied Biosystems), nas instalações AGA TG-3’ - Meyer et al., 1990). O
da Universidade Macquarie (Sydney, produto da PCR obtido apresentou
Austrália). Os perfis dos microssatélites aproximadamente 460 pares de bases
obtidos foram examinados no software (pb). Após a reação da PCR (CR - 94ºC
GENEMAPPER 4.0 (Applied por 4 min, 50ºC por 30s, 72ºC por 2
Biosystems), sendo o resultado da min, 30 ciclos de 94ºC por 15s, 56ºC
genotipagem conferido manualmente. O por 30 s, 72ºC por 2 min e passo final
programa MICRO-CHECKER (Van de 72ºC por 10 min) foram utilizados de
Oosterhout et al., 2004) foi utilizado 1 a 2 µL da reação de PCR total no
para detectar déficit de heterozigotos, sequenciamento. Utilizou-se o
erros de scoring e alelos nulos nos protocolo do Kit Big Dye Terminator
microssatélites. Mix, seguido de análise das reações
pelo sequenciador automático ABI 310
Análises com DNA mitocondrial (Perkin Elmer™). As regiões foram
(mtDNA) sequenciadas nas direções 5’-3’e 3’-5’.
No sentido de complementar a Os cromatogramas foram conferidos e
análise com os marcadores as sequências alinhadas no software
microssatélites, os espécimes que ClustalW (Thompson et al., 1997)
apresentaram morfologia duvidosa, implementado no programa BioEdit
excluídos da análise filogenética (Cap.

43
(Hall, 1999) utilizando os parâmetros al., 2000), que estima qual proporção do
defaut. genótipo de um indivíduo se origina
potencialmente de hibridação. Os peixes
Análises em genética de populações genotipados foram designados a dois
Para quantificar a diversidade grupos de espécies (k=2; i.e C. kelberi e
genética foram utilizadas as médias da C. piquiti) utilizando cinco corridas
heterozigosidade esperada (He), além independentes para cada K, com
do número alélico efetivo (Ne= 1/1-He), 1.000.000 de repetições de MCMC
número de alelos exclusivos e riqueza (Markov Chain Monte Carlo) após
alélica (Na). Os índices genéticos (He, burn-in de 500.000. A análise resulta
Na, Ne e alelos exclusivos), as em um valor q para cada indivíduo que
frequências alélicas e os índices de varia de 0 a 1 e representa a média da
endogamia Fis e Rst foram estimados probabilidade posterior de
utilizando-se a o programa GENALEX ancestralidade (i.e, a proporção do
(Peakall e Smouse, 2006). A genoma do peixe que apresenta
estruturação populacional foi estimada ancestralidade de C. piquiti ou C.
utilizando-se a análise molecular de kelberi). Neste estudo considerou-se um
variância (AMOVA) (Excoffier, 1995) ponto de corte (threshold) de 0.05 nas
e o Rst (Slatkin, 1995). O Rst é um duas bordas (i.e. q ≥ 0.95 como C.
índice análogo ao Fst (Wright, 1921). piquiti puro e ≤ 0.05 como C. kelberi
Enquanto Fst leva em conta o modelo puro) como descrito em Schwartz e
de alelos infinitos (IAM), o Rst assume Beheregaray (2008).
o modelo de mutação stepwise (SMM),
que caracteriza muitos loci de Resultados
microssatélites. Sua significância foi
testada por 10000 permutações. O Cichla piquiti
número de migrantes histórico (Nm) foi Os loci de microssatélites
estimado utilizando-se a fórmula: apresentaram entre 3 e 10 alelos por
Nm=[1/Rst-1]/4. locus. O locus Tuc4, apesar de fixado
A significância estatística dos na população nativa, apresentou
índices genéticos intrapopulacionais He, polimorfismo nas populações
Na, Ne e alelos exclusivos foi testada introduzidas, sendo assim mantido na
utilizando o teste estatístico não análise. Os loci que apresentaram maior
paramétrico de Kruskal-Wallis (α=0.05) variação foram Tuc13 e Tuc18, com 10
com posterior teste múltiplo de alelos distintos cada. O locus Tuc11 foi
comparações de Dunn, e a análise descartado da análise devido ao excesso
pareada de Wilcoxon (α=0.05, uni- de falhas na genotipagem,
modal), implementados no programa provavelmente provocado por alelos
Instat v.3.06. nulos.
A espécie de tucunaré Cichla
Análises de hibridação piquiti (tucunaré azul) foi detectada em
Para a detecção de hibridação Minas Gerais na Represa de Itumbiara,
foi utilizada a análise Bayesiana de em uma lagoa marginal do rio São
agrupamento e atribuição implementada Francisco e na Represa de Furnas.
no programa STRUCTURE (Pritchard et Todos os índices genéticos estimados -

44
riqueza alélica (Na), número de alelos 0.027 e He Furnas= 0.209), assim como
exclusivos, número alélico efetivo (Ne) a riqueza alélica (Na), o número efetivo
e heterozigosidade esperada (He) - de alelos (Ne) e alelos exclusivos (Fig.
foram maiores para a população nativa 1 e Tab. 1).
do rio Tocantins (Represa de Tucuruí). Na população de Furnas foi
A heterozigosidade média esperada detectado o maior valor de He entre as
(índice também chamado de diversidade populações introduzidas. A análise
gênica) foi expressivamente menor nas estatística (teste de Kruskal-Wallis) dos
populações introduzidas quando índices genéticos detectou diferença
comparadas com a população nativa de significativa apenas entre Tocantins e
Tocantins (He Tocantins= 0.429; He Itumbiara (P<0.05) e entre Tocantins e
Itumbiara= 0.063, He São Francisco= Lagoa Marginal rio São Francisco
Figura 1. – Índices genéticos analisados nas populações de Cichla piquiti.
Foram analisados riqueza alélica (Na), número alélico efetivo (Ne), número
de alelos exclusivos e heterozigose esperada (He).

8,000 0,600
7,000 0,500

Heterozigosidade
6,000
0,400 Na
5,000
Média

Ne
4,000 0,300
No. alelos exclusivos
3,000 0,200 He
2,000
1,000 0,100
0,000 0,000
Tocantins Itumbiara L. Marginal Furnas
(SF)
Populações

Tabela 1. Valores médios e erros padrão dos índices genéticos analisados nas
populações de Cichla piquiti: riqueza alélica (Na), número alélico efetivo (Ne),
número de alelos exclusivos e heterozigose esperada (He).

Médias seguidas de letras distintas indicam diferença significativa


pelo teste Kruskal-Wallis (P<0,05).

45
(P<0.01), não detectando diferença significativos (P<0.05). Entre Tocantins
significativa entre Tocantins e Furnas e Itumbiara foi observado o maior valor
(Tabela 1). de Rst (0.524) e entre Itumbiara e
Quando comparadas a Furnas o menor valor (0.086) (Tabela
heterozigosidade esperada de todas 2). Dessa maneira, foi detectada
populações introduzidas agrupadas estruturação genética entre as
(He=0.180), com a população nativa populações de C. piquiti, considerando
(He=0.429), foi detectada diferença que valores acima de 0.05 já indicaria
estatísticamente significativa (Teste de estruturação genética entre as
Wilcoxon, P=0.0273), indicando que as populações (Hartl e Clark, 1997). O
populações introduzidas apresentam índice de fixação Fst também foi
redução de diversidade genética. estimado, mas não houve diferença em
A análise de variância molecular relação ao Rst quando foram realizadas
(AMOVA) estimou que 49% da comparações entre populações nativas e
Tabela 2. Comparação par a par do índice de diferenciação genética Rst e número de
migrantes (Nm) entre as populações de C. piquiti. Os valores de P foram estimados
por 10000 permutações.

*Lagoa Marginal do rio São Francisco

variação ocorre entre populações e 51% introduzidas. O Fst, entretanto,


dentro das populações, mostrando uma superestimou a diferenciação genética
forte estruturação populacional quando entre as populações nativas (dado não
as populações foram comparadas entre apresentado).
si. Entretanto, quando a população Para uma parte dos loci
nativa foi excluída, a AMOVA estimou analisados, o déficit de heterozigotos
que 9 % da variação é encontrada entre (Fis) foi elevado nas populações nativas
as populações introduzidas e 91% (Tabela 5 - ANEXO). Os valores de Fis
dentro dessas populações. variam de -1 a +1, sendo que valores
A diferenciação genética par a positivos indicam que há déficit de
par entre as populações, detectada pelo heterozigotos e valores negativos
Rst, foi elevada apenas na correlação indicam excesso de heterozigotos. Os
entre populações nativas e introduzidas loci Tuc5, Tuc13, Tuc16 e Tuc18
(0.504 em média) e foi moderada entre apresentaram valores acima de 0.2.
as populações introduzidas (0.093 em Valores de Fis em populações naturais
média), sendo todos os valores são tipicamente próximos de zero (Hartl

46
e Clark, 1997). Dentro de populações alelo de 204pb, apresentou alelo distinto
muito pequenas, onde podem ocorrer nas populações de C.piquiti (206pb) .
cruzamentos entre parentes, o Fis pode Entretanto, em apenas um indivíduo
aumentar devido à endogamia. (espécime 152) das populações de
O fluxo gênico histórico (Nm), C.piquiti foi detectado o alelo de 204pb
medido a partir do Rst, foi maior entre em homozigose, indicando que esse
as populações introduzidas (média de indivíduo pode ser híbrido ou um C.
2.43) e menor quando comparadas kelberi identificado erroneamente.
populações nativa e introduzidas (média Assim, Tuc10 pode ser considerado um
de 0.246) (Tabela 2). locus espécie-específico (alelo 204
Analisando apenas as específico para C. kelberi e alelo 206
populações nativas, o programa MICRO- específico para C. piquiti), sendo útil na
CHECKER identificou que o déficit de identificação de híbridos.
heterozigotos nos loci Tuc13 e Tuc18 A espécie de tucunaré Cichla
ocorre, possivelmente, devido à kelberi (tucunaré amarelo) foi detectada
presença de alelos nulos. Apenas o em Minas Gerais nas Represas de
locus Tuc18 apresentou desvio do Itumbiara e Três Marias e na Lagoa
equilíbrio de Hardy-Weinberg após Dom Helvécio no rio Doce. Todos os
correção sequencial de Bonferroni índices genéticos estimados (Na, Ne, He
(Tabela 5 - ANEXO). e alelos exclusivos) para as populações
foram maiores na população nativa do
Cichla kelberi rio Tocantins (Represa de Tucuruí)
Os loci de microssatélites (Fig. 2). Entretanto, o teste estatístico
apresentaram entre 1 e 12 alelos por não paramétrico Kruskal-Wallis não
locus . O locus Tuc10, apesar de detectou diferenças significativas entre
monomórfico nas populações nativas e os índices genéticos analisados (Tabela
introduzidas de C. kelberi com apenas o 3). O gráfico da figura 2 mostra queda

Figura 2 – Índices genéticos analisados nas populações de Cichla kelberi. Foram


analisados riqueza alélica (Na), número alélico efetivo (Ne), número de alelos
exclusivos e heterozigose esperada (He). Valores numéricos e estatística descritos na
tabela 4 (ANEXO).

8,000 0,700
7,000 0,600
Heterozigosidade

6,000 0,500 Na
5,000
Média

0,400 Ne
4,000
0,300 No. alelos exclusivos
3,000
0,200 He
2,000
1,000 0,100
0,000 0,000
Tocantins Itumbiara Três Marias Rio Doce
Populações

47
Tabela 3. Valores médios e erros padrão dos índices genéticos analisados nas
populações – Cichla kelberi: riqueza alélica (Na), número alélico efetivo (Ne),
número de alelos exclusivos e heterozigose esperada (He).

Médias seguidas de letras distintas indicam diferença significativa pelo teste Kruskal-Wallis
(P<0,05).

progressiva dos valores médios da Wilcoxon, P=0.0977). Indicando que


riqueza alélica (Na), heterozigose (He) e não houve perda de diversidade
número alélico efetivo (Ne) da genética na introdução dessa espécie.
população nativa (Tocantins) em A análise de variância molecular
direção às populações introduzidas. (AMOVA) estimou que 46% da
Quando comparadas a variação ocorre entre populações e 54%
heterozigosidade esperada de todas dentro das populações, mostrando uma
populações introduzidas agrupadas forte estruturação populacional.
(He=0.48) com a população nativa Entretanto, quando a população nativa
(He=0.527), não detectamos diferenças foi excluída, a AMOVA estimou que
estatísticas significativas (Teste de 41% da variação é encontrada entre as
Tabela 4. Comparação par a par do índice de diferenciação genética Rst e número de
migrantes (Nm) entre as populações de C.kelberi. Os valores de P foram estimados por
10000 permutações.

48
populações introduzidas e 59% está Bonferroni. A única exceção foi o locus
dentro dessas populações. Tuc12 (Tabela 5 - ANEXO).
Quando estimado o índice Rst, a
diferenciação genética entre as Análises de Hibridação
populações foi elevada não apenas entre A análise de designação
a população nativa e as introduzidas realizada no programa STRUCTURE foi
(0.486% em média), mas também entre eficiente na separação entre as espécies
as populações introduzidas (0.362% em C piquiti (Fig. 3, cor verde) e C kelberi
média). Entre as populações do (figura 3, cor vermelha), sendo possível
Tocantins e de Três Marias foi a detecção de dois híbridos entre as
detectada a maior diferença (Rst = espécies na população nativa (C. piquiti
0.646%) e entre a de Três Marias e do indivíduo 152 e C. kelberi indivíduo
rio Doce, a menor (Rst = 0.234%). 63). Nas populações introduzidas não
Dessa maneira, observamos uma forte foram detectados valores significativos
estrutura genética entre as populações de q (valor q ≥ 0.95 para C. piquiti e q ≤
de C. kelberi (Tabela 4). 0.05 para C. kelberi), indicando a
O fluxo gênico histórico (Nm), ausência de híbridos nessas populações.
estimado pelo Rst, foi pequeno entre Na população nativa de C.piquiti
populações introduzidas (média de o indivíduo 152 (Fig. 3) apresentou
0.297) e também entre nativa e moderado grau de hibridação (q=0.80),
introduzidas (média de 0.362) (Tabela já que um valor de q maior ou igual a
4). 0.95 significaria um indivíduo C. piquiti
A maioria dos loci apresentou puro. O haplótipo mitocondrial desse
déficit de heterozigotos na população indivíduo foi congruente a um haplótipo
nativa, sendo a única exceção o locus dessa espécie.
Tuc12. Os loci Tuc3, Tuc13 e Tuc16 Alguns indivíduos de C. kelberi
apresentaram valores acima de 0.4 apresentaram padrões morfológicos
(Tabela 5 - ANEXO). intermediários (entre C. piquiti e C.
Analisando apenas a população kelberi), indicando possível hibridação
nativa, o programa MICRO-CHECKER nas populações nativas. Entre esses
identificou a presença de alelos nulos possíveis híbridos, apenas o indivíduo
como motivo provável para o déficit de 63 de C. kelberi apresentou elevado
heterozigotos (Fis) nos loci Tuc3, Tuc9, valor de q (q=0.70, pois q ≤ 0.05
Tuc13, Tuc16 e Tuc18. Para o locus significaria C. kelberi), indicando
Tuc3, o MICRO-CHECKER também elevado grau de hibridação. Esse
identificou possíveis erros no scoring, indivíduo foi também o único entre os
provavelmente devido ao stutterring. Os possíveis híbridos que não apresentou
stutters são produtos de “deslizes” haplótipo mitocondrial congruente para
durante a amplificação da região C. kelberi, e sim para C. piquiti, o que
microssatélite, sendo comuns em loci pode explicar o elevado índice q
dinucleotídeos, como o locus Tuc3. detectado para ele ao utilizar os dados
A maior parte dos loci de microssatélites (Fig. 3). Não se pode
apresentou desvio do equilíbrio de excluir a possibilidade de erro na
Hardy-Weinberg, mesmo após o ajuste identificação taxonômica, já que esse
para comparações sequenciais de

49
espécime apresentou padrão n=48) quando comparada com a
morfológico duvidoso. população nativa (6 haplótipos, n=20)
(Cap. 1). Fica evidente, assim, um forte
Discussão efeito fundador nas populações
No presente trabalho, introduzidas dessa espécie.
marcadores moleculares microssatélites Nas populações de Cichla
desenvolvidos por Carvalho et al (2009) kelberi foi detectada redução nos
foram utilizados com sucesso na valores dos índices genéticos (He, Na,
caracterização da estrutura intra e Ne e alelos exclusivos – Fig. 2) nas
interpopulacional das espécies de populações introduzidas. Entretanto, os
tucunaré (C. piquiti e C. kelberi) valores não foram significativos quando
introduzidas em Minas Gerais e de sua testados pela estatística não paramétrica
população fonte (rio Tocantins). de Kruskal-Wallis (Tabela 3), mesmo
As populações introduzidas de quando foi observado redução de até
C. piquiti apresentaram reduzida 70% no valor de He (Tocantins com rio
diversidade genética quando Doce e Três Marias). Entre Tocantins e
comparadas com a população nativa do Itumbiara a redução na He foi menor,
rio Tocantins, para todos os índices apenas 36%, resultado congruente com
genéticos estimados (Fig. 1) com a análise do DNA mitocondrial da
valores estatisticamente significativos espécie C. kelberi nas populações
(Tabela 1). Esse resultado foi introduzidas (Cap. 1), que também
congruente com os dados obtidos com o indicou maior diversidade haplotípica
mtDNA, já que nas populações em Itumbiara (3 haplótipos, n=18)
introduzidas de C. piquiti também foi quando comparada com a de outras
detectada menor diversidade de populações introduzidas dessa mesma
haplótipos mitocondriais (1 haplótipo, espécie (1 haplótipo, n=32).

152

63

Figura 3. Gráfico de barras gerado no programa STRUCTURE, representando a


atribuição dos genótipos (q) para cada espécie em suas respectivas populações. As
populações analisadas foram numeradas de 1 a 8, sendo: 1 a 4 populações da espécie C
piquiti (1- Tocantins, 2- Itumbiara, 3- Lagoa Marginal São Francisco, 4 - Furnas) e 5 a
8 populações da espécie C kelberi (5- Tocantins, 6- Itumbiara, 7- Três Marias, 8- Rio
Doce). Os valores de q ≥ 0.95 (verde) indicam indivíduos com genótipos atribuídos a C.
piquiti e de q ≤ 0.05 a C. kelberi (vermelho). Os híbridos 152 e 63 foram destacados no
gráfico.

50
A comparação da ferramenta ideal para se deduzir a
hetereozigosidade esperada (He) entre a capacidade invasora de uma espécie.
população nativa e todas as populações Para uma parte dos loci
introduzidas agrupadas foi significativa analisados, o déficit de heterozigotos
apenas para a espécie C. piquiti, (Fis) foi elevado nas populações nativas
indicando maior efeito fundador para (Tabela 5 - ANEXO) do tucunaré.
esta espécie do que para C. kelberi. Diversos fatores podem levar as
A análise de variância molecular populações à deficiência de
(AMOVA) identificou maior heterozigotos, incluindo: endogamia,
similaridade genética entre as seleção contra heterozigotos, presença
populações introduzidas de C. piquiti de alelos nulos, erro na genotipagem
quando a população nativa foi excluída e/ou efeito Wahlund. Alelos nulos são
da análise (91% dentro e 9% entre alelos que não são amplificados -
populações). Já para a espécie C. usualmente devido à mutação na região
kelberi, foi detectada maior de ligação do primer, comumente
diferenciação genética entre as descrita em estudos de microssatélites
populações introduzidas (59% dentro e para explicar déficits de heterozigotos
41% entre populações). Entre as (Pemberton et al., 1995). O programa
populações introduzidas, Cichla kelberi MICRO-CHEKER detectou a presença de
apresentou maior riqueza alélica (Média alelos nulos para alguns loci analisados
= 2.41±0.94) em comparação com C. neste trabalho, o que pode ter levado ao
piquiti (Média = 1.48±0.28). Esses desvio do equilíbrio de Hardy-
resultados evidenciam maior efeito Weinberg na população nativa de C.
gargalo e deriva genética para as kelberi (seis entre os oito loci
populações de C. piquiti, provavelmente polimórficos). O fato dos
devido a um forte efeito fundador. microssatélites terem sido
Lindholm et al. (2005) desenvolvidos para a espécie C. piquiti
analisaram populações introduzidas do e serem utilizados como primers
peixe guppy (Poecilia reticulata) na heterólogos em C. kelberi pode ser a
Austrália e mostraram severa redução explicação para esse déficit.
na diversidade genética. A diversidade Segundo Hartl e Clark (1997),
alélica em dez loci de microssatélites foi valores de Fst (índice análogo ao Rst)
reduzida em 63% nas populações entre 0 e 0.05 indicam baixa
introduzidas e a heterozigose em 28%. estruturação genética; valores entre 0.05
O número de haplótipos mitocondriais e 0.15 indicam estruturação genética
(região controle) também foi reduzido moderada; valores entre 0.15 e 0.25
nas populações introduzidas quando estruturação alta e valores acima de
comparado ao número da população 0.25 indicam uma forte estruturação
fonte. Os autores sugerem que os dados genética. Os valores de Fst são
moleculares indicam efeito fundador geralmente inversamente relacionados à
e/ou efeito gargalo nas populações habilidade de dispersão. Baixas taxas de
introduzidas e que a identificação da fluxo gênico entre fragmentos, fazem
diversidade genética com marcadores com que as populações se diferenciem,
moleculares neutros pode não ser a tornando-se endogâmicas e fazendo
com que o Rst aumente. O índice de

51
diferenciação genética entre populações kelberi, C. piquiti e uma outra espécie
(Rst) indicou forte estruturação de tucunaré não identificada (Cap. 1).
populacional para C. piquiti (Rst médio Os autores detectaram introduções
de 0.299 ) e para C. kelberi (Rst médio múltiplas (bacia do Tocantins e
de 0.424). O número de migrantes por Amazonas), com elevada diversidade
geração (Nm), calculado utilizando-se haplotípica (pelo menos 8 haplótipos
os valores de Rst, indica que a migração para tucunaré amarelo e 6 para tucunaré
de tucunarés entre as populações azul) e também híbridos entre os
introduzidas dentro das bacias de Minas tucunarés introduzidos. Em contraste,
Gerais é baixa para C kelberi (Nm= nas bacias hidrográficas de Minas
0.362) e moderada para Cichla piquiti Gerais, foram detectados haplótipos de
(Nm= 2.43). tucunarés provenientes apenas da bacia
Também é interessante notar o do rio Tocantins (Cap. 1) e ainda não
fato de que as espécies C. kelberi e C. foram identificados híbridos nas
piquiti ocorrem em simpatria no rio populações introduzidas, sugerindo que
Tocantins, onde já foram descritas o número de atos introdutórios em
hibridações entre essas espécies Minas Gerais é inferior ao encontrado
(Andrade et al., 2001). Entre os para a bacia do Paraná, no sul do Brasil.
indivíduos da população nativa de C. Nas populações em Minas
kelberi com padrões morfológicos Gerais, foi detectado C. kelberi e C.
duvidosos, apenas o indivíduo 63 não piquiti em simpatria apenas em
apresentou congruência entre o Itumbiara, sem indícios de ocorrência
haplótipo mitocondrial e o morfotipo. de hibridação (Fig. 3). No rio São
Esse resultado foi também detectado na Francisco as duas espécies foram
análise com microssatélites (Fig. 3) e detectadas, mas não em simpatria (C.
reforça o poder da análise Bayesiana de kelberi na represa de Três Marias e C.
atribuição (STRUCTURE) na detecção de piquiti em uma lagoa marginal no
híbridos e/ou erro taxonômico médio São Francisco – distantes pelo
utilizando marcadores microssatélites. menos 500 km). A detecção de
Não podemos descartar erro de simpatria apenas em Itumbiara é mais
identificação morfológica dos tucunarés um indício de que esse local recebeu
na população de Tocantins, visto a maior número de peixes na formação de
dificuldade de identificação baseada sua população ou ocorreram múltiplas
apenas na morfologia e a identificação introduções com peixes provenientes
de apenas um indivíduo considerado exclusivamente do rio Tocantins,
híbrido nessa espécie. Análises reforçando os resultados genéticos
morfométricas detalhadas desse obtidos (mtDNA e microssatélites) que
indivíduo podem elucidar essa questão. mostram maior variabilidade genética
Oliveira et al., (2006) utilizaram em Itumbiara na espécie C. kelberi.
marcadores mitocondriais (região Gomiero e Braga (2004)
controle) e nucleares (RAPD) e também detectaram duas espécies de
analisaram populações introduzidas de tucunaré no reservatório de Volta
tucunaré nos rios Paranapanema, Tietê e Grande (rio Grande, alto rio Paraná). No
Paraná, no sul do Brasil. O mtDNA presente trabalho, não se analisou essa
dessas espécies correspondem a C. população, mas fatores como as

52
espécies presentes em simpatria em poderão levar a um aumento na
Volta Grande e a maior diversidade heterozigose ou a novas combinações
genética das populações introduzidas de alélicas na população da nova área
Itumbiara (rio Paranaíba) e Furnas (rio ocupada (Ellstrand e Schierenbeck,
Grande) (todas localizadas no alto rio 2000; Oliveira et al., 2006). Isso poderia
Paraná) são fortes indícios de que o alto aumentar a diversidade genética nas
rio Paraná foi alvo de atos introdutórios populações das áreas invadidas, um
mais intensos e possivelmente serviu de padrão observado para o lagarto
fonte intermediária para outras marrom Anolis sagrei (Kolbe et al.,
introduções em Minas Gerais. 2004), os moluscos Melanoides
Populações invasoras podem ser tuberculata (Falcon et al., 2008), o
fundadas múltiplas vezes com um capim Ambrosia artemisiifolia (Genton
grande número de indivíduos. Nesse et al., 2005) e para o próprio tucunaré
caso, a diversidade genética pode ser (Oliveira et al., 2006).
apenas levemente reduzida na área Quando um pequeno número de
invadida, como observado para a árvore indivíduos é introduzido e se estabelece
Schinus terebinthifolius introduzida nos em uma nova região, a diversidade
Estados Unidos (Williams et al., 2005) genética da espécie nas áreas invadidas
e para o mexilhão Dreissena pode ser drasticamente reduzida em
rostriformis bugensis (Therriault et al., comparação com a diversidade nas
2005), ou até mesmo ser maior do que áreas nativas. Esse fenômeno é
nas áreas nativas (e.g Allendorf e conhecido como efeito fundador (Hartl
Lundquist, 2003; Walker et al., 2003). e Clark, 1997). O efeito gargalo e a
Entretanto, populações invasoras deriva genética em pequenas
depauperadas geneticamente devido a populações são fenômenos que também
uma única introdução com número contribuem para a redução da variação
reduzido de propágulos, também foram genética (Nei et al., 1975; Husband e
observadas em espécies como o besouro Barret, 1991).
da batata (Leptinotarsa decemlineata, Se for considerado que as
Grapputo et al., 2005), o arbusto populações de tucunaré foram
Cledemia hirta (DeWalt e Hamrick, introduzidas nas bacias hidrográficas de
2004), a abelha solitária Lasioglossum Minas Gerais por meio de pequenos
leucozonium (Zayed et al., 2007) e o eventos fundadores adicionais, que por
molusco marinho Rapana venosa sua vez originaram diversos efeitos
(Chandler et al., 2008). gargalo em série, espera-se detectar uma
Mesmo que a população forte assinatura de deriva genética. Tal
fundadora seja pequena, a diversidade assinatura seria evidenciada por
genética pode ser mantida se o tamanho estrutura populacional significativa,
populacional se recuperar rapidamente isolamento por distância e redução
após a introdução, como observado para gradativa da diversidade genética do
o coelho europeu Oryctolagus cuniculus local de introdução inicial até o local de
(Zenger et al., 2003). Se introduções colonização (Hutchison e Templeton
múltiplas ocorrerem com linhagens da 1999; Ramachandran et al., 2005).
população nativa geneticamente Os dados genéticos das
diferente, cruzamentos interespecíficos populações introduzidas nas bacias

53
hidrográficas em Minas Gerais tornarem invasoras (Allendorf e
mostraram forte estruturação genética Lundquist, 2003; Frankham, 2005)?
(Rst), redução gradativa de diversidade Estudos teóricos e empíricos sugerem
(He e outros - Fig. 1 e 2) e forte efeito que o número de introduções é
fundador. Sugere-se, assim, um efeito frequentemente correlacionado
gargalo em série (devido ao efeito positivamente com o sucesso de invasão
fundador), com as introduções (Allendorf e Lundquist, 2003; Colautti
realizadas do alto rio Paranaíba et al., 2006), um conceito conhecido
(Itumbiara) e rio Grande (Furnas) como “pressão de propágulo”.
(locais que apresentaram maior Apesar de sua baixa diversidade
diversidade genética) em direção ao genética, principalmente na espécie C.
interior de Minas Gerais, na bacia do piquiti, o tucunaré mostrou sinais
São Francisco e rio Doce (locais com evidentes de que se estabeleceu com
menor diversidade genética). sucesso no ambiente receptor, sendo ele
Entretanto, para a espécie C. kelberi, a um ambiente impactado, como represas
redução da diversidade genética (He) hidroelétricas (e.g Itumbiara, Três
não foi estatisticamente significativa Marias e Furnas) ou lago natural (e.g.
quando comparamos populações nativas rio Doce). Esse dado contradiz a
vs. introduzidas, possivelmente hipótese de que uma elevada
indicando a introdução de maior diversidade genética ou introduções
número de propágulos, com efeito múltiplas com forte pressão de
fundador moderado. propágulo sejam necessárias para o
Dessa forma, foram observados sucesso de uma invasão biológica. Tal
diferentes padrões genéticos e de constatação deve dificultar a
distribuição geográfica para cada fiscalização e o controle eficaz do
espécie de tucunaré, sugerindo que C. tucunaré, visto que um pequeno número
kelberi e C. piquiti apresentam de espécimes pode ser capaz de
processos introdutórios distintos, mas colonizar e se tornar invasor em um
sem indícios de hibridação nas áreas novo habitat.
invadidas.
A perda da variação genética por
deriva e a endogamia em pequenas
populações são fatores que podem
contribuir para a extinção de populações
pequenas, como ocorre com algumas
espécies em risco de extinção
(Frankham e Ralls, 1998). Entretanto, o
sucesso de espécies à invasão de um
novo ambiente promove um paradoxo:
como essas populações fundadoras -
com diversidade genética reduzida e,
consequentemente adaptabilidade
também reduzida - apresentam a
capacidade de colonizar e dominar uma
grande área em um novo habitat e se

54
Conclusões Minas Gerais. Isso é um indício de que
Os microssatélites desen- foram realizadas translocações em
volvidos foram úteis para o estudo pequena escala e com poucos
genético populacional das espécies de indivíduos, típica translocação feita por
tucunaré introduzidas nas principais pescadores amadores.
bacias hidrográficas de Minas Gerais. A plasticidade adaptativa do
Foi detectada uma forte redução tucunaré não foi afetada pela reduzida
de diversidade genética para a espécie variabilidade genética, mesmo quando
C. piquiti nas áreas invadidas em comparamos populações de ambientes
relação à população nativa. impactados (represas) com populações
Há indícios de redução de de lagos naturais.
diversidade nas populações de C.
kelberi. Referências Bibliográficas
A redução na diversidade
genética e a forte estruturação ANDRADE, F.; SCHNEIDER, H.;
populacional (Rst) entre populações FARIAS, I.; FELDBERG, E.;
nativas e introduzidas indicam que SAMPAIO, I. Análise filogenética
houve efeito fundador para as duas de duas espécies simpátricas de
espécies. Para a espécie C. kelberi, tucunaré .Cichla, Perciformes., com
parece ter ocorrido uma introdução com registro de hibridização em
maior número de propágulos. diferentes pontos da bacia
A forte estruturação genética amazônica. Rev. Virt. Inic. Acad.
(Rst) na maioria das populações UFPA , v. 1, p. 1-11, 2001.
introduzidas indica que o fluxo gênico
deve ser restrito ou inexistente, sendo o ALLENDORF, F.W.; LUNDQUIST,
efeito fundador e a deriva genética os L.L. Introduction: Population
principais fatores responsáveis por essa biology, evolution, and control of
estruturação. invasive species. Conserv. Biol., v.
A análise de designação 17, p. 24–30, 2003.
detectou híbridos apenas nas
populações nativas. CARVALHO, D.C.; OLIVEIRA,
Os resultados mostram D.A.A.; SAMPAIO, I.;
assinatura genética de introduções do BEHEREGARAY, L.B.
tucunaré no sudeste brasileiro, com Microsatellite markers for the
maior intensidade na bacia do alto rio Amazon peacock bass (Cichla
Paraná (Paranaíba e Furnas). O tucunaré piquiti). Mol. Ecol. Resour., v. 9, p.
teria depois propagado para outras 239-241, 2009.
bacias (São Francisco, Doce e Grande)
por meio de pequenos eventos CHANDLER, E.A.; MCDOWELL,
fundadores adicionais. J.R.; GRAVES, J.E. Genetically
As espécies C. piquiti e C. monomorphic invasive populations
kelberi apresentam processo of rapa whelk, Rapana venosa. Mol.
introdutório distinto, não sendo Ecol., v.17, n.18, p. 4079-4091,
introduzidas concomitantemente nos 2008.
locais analisados dentro do estado de

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60
ANEXOS

Tabela 5. Loci de microssatélites analisados e seus índices: Fis (índice de endogamia),


Ho (heterozigose observada) e He (heterozigose esperada) para as populações nativas de
C. kelberi e C. piquiti.
Loci de Microssatélites/ C. kelberi (n=18) C. piquiti (n=20)
Espécie
Fis Ho He Fis Ho He
Tuc12 -0.091 0.833 0.764 -0.026 0.050 0.049
Tuc10 n/a 0.000 0.000 1.0 0.000 0.095
Tuc9 1.0 0.000* 0.215 0.22 0.250 0.320
Tuc3 0.497 0.389* 0.773 -0.03 0.650 0.631
Tuc13 0.772 0.176* 0.773 0.325 0.450 0.666
Tuc4 n/a 0.000 0.000 n/a 0.000 0.000
Tuc5 0.176 0.667* 0.809 0.263 0.500 0.679
Tuc16 0.427 0.333* 0.582 0.242 0.450 0.594
Tuc18 0.194 0.706* 0.875 0.36 0.526* 0.831
* indica os loci fora do equilíbrio de Hardy-Weinberg

61
Conclusões gerais Araguaia foram realizadas com maior
intensidade na bacia do Paraná. Poucos
Os haplótipos do DNA espécimes de tucunaré foram
mitocondrial detectados nas populações translocados para outras bacias no
introduzidas no estado de Minas Gerais estado de Minas Gerais.
(Sudeste do Brasil) foram agrupados Novas invasões do tucunaré
exclusivamente com os haplótipos das podem ocorrer mesmo quando
espécies nativas do rio Tocantins, introduzido um pequeno número de
sugerindo a ocorrência de um único ou espécimes, evidenciando-se uma
de poucos atos introdutórios nessa necessidade extrema de fiscalização e
região, realizados com peixes de uma controle para se evitar a propagação
mesma população fonte (rio Tocantins). desta espécie nas bacias do sudeste
Dos dez loci de microssatélites brasileiro.
desenvolvidos para a espécie invasora
C. piquiti (testados com eficiência para
C. kelberi), nove foram aplicados na
caracterização genética das populações
introduzidas e da população nativa do
rio Tocantins.
Os dados genéticos indicaram
que o alto rio Paraná foi o local que
recebeu o maior número de espécimes
de tucunaré, sendo possivelmente a
fonte das demais introduções no estado
de Minas Gerais.
Os baixos valores de riqueza
alélica (Na) e heterozigose esperada
(He) nas populações do rio São
Francisco e Doce indicaram que essas
populações foram fundadas com
número reduzido de espécimes.
A plasticidade adaptativa do
tucunaré não foi afetada pela reduzida
variabilidade genética, mesmo quando
comparamos populações de ambientes
impactados (represas) com populações
de lagos naturais.
Diversas evidências genéticas
sugerem que novos atos introdutórios
antrópicos não têm sido realizados
continuamente dentro do estado de
Minas Gerais.
Os resultados genéticos indicam
que introduções com tucunaré
proveniente da bacia do rio Tocantins-

62