EXPERIMENTO DE CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA

Diego de Assunção Justo​1​​ ​, Fernanda D. R. de Quadros​1​​ ​, Vitória Durães

Chlusewicz1

Resumo

A cromatografia é uma técnica de separação comumente utilizada em

laboratórios com a finalidade de separar ou identificar substâncias através de seu
grau de polaridade. Deste modo, pôde-se identificar o grau de polaridade de
algumas substâncias através do método de cromatografia em camada delgada.

Palavras-chave: ​Cromatografia, Polaridade, Camada Delgada.

INTRODUÇÃO

Atualmente a cromatografia está entre uma das técnicas mais modernas e

elaboradas para separar misturas que os químicos e bioquímicos podem utilizar,
desempenhando um papel muito importante também na caracterização e na análise
de substâncias componentes de uma mistura. A cromatografia baseia-se na
separação das substâncias de uma mistura formada por dois ou mais compostos ou
íons, separando-a em duas fases, a fase estacionária e a fase móvel.​1
A fase estacionária pode ser tanto um sólido quanto um líquido disposto em
um suporte sólido de grande área superficial, e é responsável por adsorver a
mistura, ou seja, algumas substâncias ficam retidas na superfície do sólido em
virtude de determinadas interações químicas. Em contrapartida, a fase móvel pode
ser gasosa, líquida ou até mesmo um fluído supercrítico, e é responsável por
transpor a fase estacionária, deslocando consigo diversas substâncias da mistura.​2
De acordo com as variadas possibilidades de escolha da fase fixa e da fase
móvel, pode-se observar as substâncias sendo arrastadas com a fase móvel de
forma ordenada. Substâncias que possuem uma maior interação com a fase
estacionária ficam retidas ao passo que as substâncias de pouca interação são
arrastadas facilmente pela fase móvel, devido a diversas forças intermoleculares.​3

1 Graduando de Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia pela Universidade Tecnológica Federal do Paraná (UTFPR), Toledo, Paraná. E-mail:
diego.twd@outlook.com.br
 Todos os métodos cromatográficos funcionam aproximadamente com o
mesmo princípio, porém, devido a variedade da natureza das duas fases envolvidas
faz-se necessário diferentes tipos de cromatografia, por exemplo: cromatografia em
coluna, cromatografia gasosa e cromatografia em camada delgada.​1
A cromatografia em coluna baseia-se na separação líquido-sólido utilizando
propriedades de adsorção e solubilidade. O sólido pode ser qualquer material desde
que não se solubilize na fase líquida, porém, geralmente utiliza-se sílica gel e
alumina. O princípio da cromatografia em coluna é utilizar eluentes com variados
graus de polaridade, sendo adicionado aos poucos, esses eluentes acabam
arrastando as substâncias da mistura de acordo com sua afinidade relativa pelo
eluente e pelo adsorvente. Ao final do processo, cada componente da mistura fica
separado na coluna cromatográfica de acordo com seu grau de polaridade.​1
. A cromatografia gasosa é utilizada para a separação e análise de compostos
orgânicos que se vaporizam sem decomposição. Os princípios são basicamente os
mesmos da cromatografia em coluna, mas diferem-se em devido a três motivos.
Primeiramente, os processos de separação são feitos entre uma fase gás móvel é
uma fase líquida estacionária. Segundo, a temperatura do gás pode ser controlada,
uma vez que, a coluna é mantida em um forno isolado. E por fim, a concentração do
composto na fase gasosa é em função de sua pressão de vapor.​1
A cromatografia em camada delgada, também conhecida como CCD, é uma
técnica relativamente simples e de rápida execução, utilizada como uma ferramenta
eficaz de análise qualitativa para avaliação da pureza de uma amostra simples,
avaliação do número de componentes de uma mistura, identificação de uma ou
mais substâncias presentes em uma mistura por comparação com padrões, entre
diversas outras aplicações.​4
Na cromatografia em camada delgada, utiliza-se como fase estacionária uma
camada fina formada por um sólido granulado sobre uma placa de vidro ou outro
suporte inerte. A solução a ser analisada é adicionada à placa com o sólido
granulado, em forma de pequenas gotas, e posteriormente colocada em um
recipiente contendo o solvente, que corresponderá à fase móvel. Deste modo, o
solvente começa a subir a placa, por capilaridade, e acaba arrastando consigo
substâncias de polaridade similares à sua. Dependendo da substância a ser
analisada, faz-se necessário ainda a utilização de um composto reativo de cor para
a revelação da placa.​2

PARTE EXPERIMENTAL

Amostras e diluentes

Utilizou-se amostras de sílica gel e diclorometano para preparar a suspensão.

Em relação às amostras a serem analisadas, utilizou-se extrato de espinafre, extrato
de cenoura, p-nitrofenol, p-nitroanilina e benzofenona. Em relação às substâncias
eluentes, utilizou-se hexano, acetato de etila e éter de petróleo. Além disso, para a
visualização dos resultados nas placas, utilizou-se uma cuba de iodo.

Procedimento

Inicialmente, preparou-se a suspensão a ser utilizada, com sílica gel G e

diclorometano, mexendo-a com o auxílio de um bastão de vidro para a
homogeneização. Após a preparação da suspensão, mergulhou-se uma placa de
vidro no mesmo, retirando-a lentamente e aguardou-se alguns segundos até a
formação de um sólido granulado sobre a placa. Após este procedimento, aplicou-se
uma gota de extrato de espinafre e uma gota de extrato de cenoura no sólido da
placa, de modo a manter 1 cm de distância entre as gotas e a base da placa.
Preparou-se em um béquer de 250 mL, uma solução de 20 mL de acetato de
etila e 30 mL de éter de petróleo, de modo a formar uma solução com proporção de
2:3. Posteriormente, colocou-se a placa na solução, de forma a deixá-la em pé, com
apenas 1 cm da placa mergulhada na solução. Aguardou-se alguns minutos,
retirou-se a placa do béquer e anotou-se os resultados para posteriores discussões.
Em relação ao segundo experimento, preparou-se quatro béqueres de
eluentes com diferentes concentrações, sendo o primeiro constituído por 5 mL de
hexano puro, o segundo por 5 mL de hexano e 0,5 mL acetato de etila, o terceiro
por 4 mL de hexano e 1,0 mL de acetato de etila e o quarto por 3 mL de hexano e
2,0 mL de acetato de etila. Mergulhou-se quatro placas de vidro no silicato, e
aguardou-se a formação do sólido granulado, em seguida adicionou-se uma gota de
nitrofenol, 1 gota de nitroanilina e 1 gota de benzofenona em cada placa.
Posteriormente, mergulhou-se cada placa em béqueres, contendo eluentes em
diferentes proporções, de forma a deixá-la em pé, com apenas 1 cm da placa
mergulhada na solução. Aguardou-se alguns minutos, retirou-se as placas dos
béqueres e levou-se as mesmas para a cuba de iodo, após isso, anotou-se os
resultados para posteriores discussões.

RESULTADOS E DISCUSSÕES

Separação do ß-caroteno, clorofila A e clorofila B

O princípio da cromatografia delgada baseia-se na interação entre as

substâncias a serem analisadas e o adsorvente da placa, bem como o eluente. Para
a separação do ß-caroteno do extrato de cenoura, e da clorofila A e clorofila B do
extrato de espinafre, utilizou-se a sílica como adsorvente polar, para garantir uma
afinidade por substâncias polares, deixando-as retidas na fase estacionária, ou seja,
não a deslocando. A utilização da mistura de éter de petróleo, um hidrocarboneto
insolúvel em água, ou seja, uma substância apolar, com acetato de etila,
moderadamente polar como eluente para este processo, explica-se pelo fato de
garantir a utilização de um eluente apolar, responsável por carregar consigo as
substâncias apolares.
A clorofila A está presente em todos os organismos que realizam fotossíntese
oxigênica, exceto algumas bactérias, e é responsável pelo primeiro estágio da
fotossíntese, além de garantir coloração verde às plantas, porém, outras
substâncias também são responsáveis por garantir coloração as plantas,
denominadas pigmentos acessórios, como por exemplo a clorofila B. A clorofila A e
a clorofila B diferenciam-se entre si devido à um grupo funcional distinto, ou seja,
enquanto a clorofila B possui um grupo aldeído em sua estrutura, a clorofila A
possui um grupo metil, como pode ser observado na Figura 1. 5​
 Figura 1 - ​Fórmula estrutural da Clorofila A e B

Fonte: STREIT, 2005​5

O ß-caroteno é um carotenóide, ou seja, uma substância de pigmento

encontrada na natureza, como por exemplo na cenoura. A principal característica
dos carotenóides, além de sua coloração, é sua extensa cadeia de carbonos com
duplas ligações conjugadas, o que lhes garante uma baixíssima polaridade. O
ß-caroteno, além das duplas ligações conjugadas, possui uma estrutura bicíclica,
como pode ser observado pela Figura 2.

​Figura 2 - ​Fórmula estrutural do ß-caroteno

Fonte: PEREIRA, 2012​6

 Deste modo, como pode ser observado pela Figura 3, pôde-se observar que
o ß-caroteno e a clorofila A sofreram relativamente a mesma ação do eluente, ou
seja, as duas substâncias possuem um grau de polaridade muito próximo. Sabe-se
que se trata da clorofila A, devido ao fato de a clorofila A ser mais apolar do que à
clorofila B, em função de seu grupo aldeído que gera um momento dipolar diferente
na estrutura. Embora a presença da clorofila B na placa seja de difícil visualização
devido a erros de manipulação, e possível observar uma pequena mancha
esverdeada próxima a 1,5 cm.

Figura 3 -​​ ​Resultado da separação de ß-caroteno, clorofila A e clorofila B.

Fonte: Do autor.

Um parâmetro muito utilizado relacionado à cromatografia, é o Rf, “índice de

retenção” ou “fator de atraso”, que refere-se à um valor constante para um dado
composto e corresponde a uma propriedade física dessa substância. O valor de Rf
pode ser tabelado para diversas substâncias quando submetidas às mesmas
condições, o que facilita a identificação de substâncias desconhecidas, porém,
como todo método de análise de identificação, não deve ser utilizado como método
exclusivo, uma vez que diferentes substâncias podem possuir Rf iguais. Para
calcular o valor de Rf (Equação 1) para uma substância, deve-se dividir a distância
percorrida pela substância, pela distância percorrida pelo eluente, sendo que estas
medidas devem ser feitas em relação ao centro do círculo em que a mancha da
substância ocupa na placa.

Rf = dc / ds (1)

Em que Rf corresponde ao índice de retenção, dc corresponde à distância

percorrida pela substância é ds corresponde à distância percorrida pelo eluente.
De acordo com os dados da Figura 3 e a partir da Equação 1, pôde-se
calcular os índices de retenção para o ß-caroteno, para a clorofila A e para a
clorofila B, sendo de: 0,98 para o ß-caroteno, pois a distância percorrida pelo
mesmo e pelo eluente foram praticamente as mesmas, o que demonstra uma forte
interação entre essas substâncias, 0,9 para a clorofila A e aproximadamente 0,37
para a clorofila B, o que indica que esta substância possui maior interação com as
moléculas da fase estacionária, no caso, a sílica.
Comparando-se os resultados obtidos com a literatura​7 , tem-se que o valor
obtido para o ß-caroteno foi extremamente próximo, sendo o encontrado de 0,98 e o
valor da literatura de 0,97, essa variação se deve ao fato de nem sempre ser
possível duplicar exatamente as mesmas condições de medida de que outro
pesquisador usou. Em relação às clorofilas, não encontrou-se valores tabelados na
literatura, mas pôde-se diferenciá-las entre si devido à polaridade.

Efeito do solvente no valor de Rf

O p-nitrofenol é uma substância composta por um anel aromático e duas

ramificações de grupo nitro, além de uma ramificação com uma hidroxila, devido à
isso, é uma substância pouco apolar, apresentando uma certa solubilidade em
água. A p-nitroanilina, refere-se à uma anilina com uma ramificação nitro, e é
insolúvel em água. A benzofenona trata-se de uma cetona aromática é e insolúvel
em água, com um baixíssimo grau de polaridade, consequência de sua simetria na
fórmula estrutural, como pode ser observado pela Figura 4.
 Figura 4 - Fórmula estrutural do p-nitrofenol, da p-nitroanilina é da
benzofenona (respectivamente)

Fonte: Do autor (ChemScketch).

Em relação às quatro lâminas de mesma composição, com as substâncias a

serem analisadas de acordo com os eluentes, a amostra 1 refere-se ao composto
p-nitrofenol, a 2 à p-nitroanilina, e a 3 à benzofenona. A lâmina I foi submetida a
cromatografia utilizando como eluente apenas o hexano, ou seja, um hidrocarboneto
(fortemente apolar). As outras lâminas foram submetidas à diferentes eluentes, com
um aumento gradual de acetato de etila, sendo para a lâmina II, 5 mL de hexano e
0,5 mL de acetato de etila. A proporção de solvente para a lâmina III foi de 4 mL de
hexano e 1 mL de acetato de etila, e para a lâmina IV, 3 mL de hexano e 2 mL de
acetato de etila. O motivo de adicionar-se acetato de etila gradualmente ao hexano,
é que como essa substância é moderadamente polar, o eluente vai aumentando sua
interação com a substância polar, no caso o nitrofenol.
Nas lâminas, a altura do solvente variou entre 3,6 e 4,3 cm, devido ao
tempo que cada um ficou em contato com o solvente. Os resultados são mostrados
na Figura 5, sendo a lâmina branco, a lâmina antes da cromatografia.
 Figura 5 -​​ ​Resultado da cromatografia delgada para as 4 placas.

Fonte: Autoria Própria

Com a equação 1, os valores de Rf foram calculados para as três

substâncias mostradas na Figura 4, e os valores apresentados na Tabela 1. Devido
ao hexano ser apolar, ao adicionar acetato de etila, a concentração do solvente
polar na solução foi aumentando, assim, as substâncias foram mais arrastadas,
tornando os valores de ​Rf maiores. Como pode ser observado na Figura 5, a
amostra 3 na lâmina IV representa que o solvente é muito polar, de acordo com
método de anéis concêntricos para testar solventes.​1
 Tabela 1:​​ Valores de Rf das substâncias em relação ao solvente.

Hexano 5 mL hexano + 4 mL hexano + 1,0 3 mL hexano + 2

100 % 0,5 mL acetato de mL acetato de mL acetato de
etila etila etila

Nitrofenol 0 0,1282 0,1163 0,8055

Nitroanilina 0,0526 0,0769 0,2325 0,6388

Benzofenona 0,4210 0,5128 0,5116 0,8333

Fonte:​​ Autoria Própria.

​ ode-se afirmar que o nitrofenol e a nitroanilina

A partir dos valores de ​Rf, p
tem alta polaridade, pois tendo como solvente o hexano (composto apolar), os
​ ão foram altos, somente havendo uma diferença maior quando a
valores de ​Rf n
quantidade de acetato de etila estava maior. Já a benzofenona apresenta um ​Rf
relativamente alto em comparação com as outras substâncias, quando em hexano
puro, assim podendo-se afirmar que é um composto com baixíssima polaridade, o
que se confirma com a literatura.
É importante ressaltar também, que para a visualização das placas, fez-se
necessário a utilização de iodo, devido às substâncias não serem facilmente
visíveis. O Iodo e usado para visualizar as placas pois reage com muitas moléculas
orgânicas para formar complexos amarelos ou castanhos.

CONCLUSÃO

Através deste trabalho foi possível observar a influência da polaridade de

uma substância quanto à sua separação e identificação, bem como a importância do
índice de retenção em técnicas cromatográficas, podendo fornecer uma propriedade
de certa substância para possível comparação com a literatura. Além disso, pôde-se
observar a influência do eluente no índice de retenção, uma vez que, mudanças no
mesmo resulta em alterações nas interações com a substância a ser analisada.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1 ​
PAVIA, D. L. , LAMPMAN, G. M. , KRIZ, G. S. e ENGEL, R. G., ​Química Orgânica
Experimental - Técnicas de escala pequena. ​2 ed. Porto Alegre- 2009.
2
PERES, Terezinha Bonanho. ​Noções Básicas de Cromatografia. Centro de
Pesquisa e Desenvolvimento de Proteção Ambiental-Instituto Biológico São Paulo -
SP. v.64, n.2, p.227-229, jul./dez., 2002.

3
EISING, Renato. ​Apostila de Química Orgânica Experimental Aplicada a
Bioprocessos​​. Universidade Tecnológica Federal do Paraná, Toledo 2018.

4
SILVA, R. S. , RIBEIRO, C. M . R. , BORGES, M. N. , BLOIS, G. S. O. , ​Óleo
essencial de limão no ensino da cromatografia em camada delgada.
Departamento de Química Orgânica, Instituto de Química, Universidade Federal
Fluminense, Campus do Valonguinho, Outeiro de S. João Batista. Niterói - RJ,
Brasil. 2009, Quim. Nova, Vol. 32, No. 8 Pg 2234.
5
STREIT, N. M. , CANTERLE, L. P. , CANTO, M. W. D. , HECKTHEUER, L. H. H.. ,
As Clorofilas, ​Ciência Rural, Santa Maria, v.35, p.748-755, 2005
6
PEREIRA, F. K. C. , FACCIO, M. T. , DUTRA, L. M. G. , LINHARES, N. P. , SILVA,
P. S. G. D., ​Extração líquido-líquido do β-caroteno e licopeno da polpa do
tomate é análise por CCD (Cromatografia de Camada Delgada). ​Universidade
Federal de Campina Grande, CES, Cuité-PB, 2012

7
COSTA, T. D. S. A. , WONDRACECK, D. C. , LOPES, R. M. , VIEIRA, R. F. ,
FERREIRA, F. R. Composição de Carotenoides em (Pouteria campechiana
(Kunth) Baehni) ​ Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, Brasília-DF, 2009.