UNIVERSIDAD DE CUENCA

FACULTAD DE CIENCIAS MÉDICAS

LABORATORIO CLINICO

NOMBRES:

NIXON HIDALGO

DANIELA JIMENES H.

PROFESOR:

LIC. MAURICIO BACULIMA

ASIGNATURA:

BIOLOGÍA CELULAR

TEMA:

TÉCNICAS DE OBSERVACIÓN EN MICROSCOPIA

SEPTIEMBRE 2018 – FEBRERO 2019

 LABORATORIO DE BIOLOGÍA CELULAR

PRACTICA N°4

TÍTULO: Técnicas de observación en microscopia: Obtención y fijación de

muestras; Clasificación de las técnicas de observación

INTRODUCCIÓN: Hoy en día, la tecnología avanza rápidamente, por ejemplo,

podríamos hablar del microscopio, que es una herramienta que revolucionó la

manera de ver el mundo. Sin embargo, este útil instrumento no siempre nos

mostró las propiedades que realmente tiene un microorganismo, por ello se

emplea técnicas de observación de microscopia, las cuales, al ser aplicadas en

un material biológico, ayudaran a una mejor visualización de las propiedades

físicas y químicas de dicho material. En esta práctica se demostrará la utilidad

de este tipo de procesos, mediante la observación en el microscopio de varios

materiales biológicos y comunes, todas las técnicas que veremos a continuación,

serán estudiadas y llevadas a la práctica, con el fin de informar cómo se puede

realizar de mejor manera la observación de microorganismos y así, dar un mejor

diagnostico en nuestra futura vida profesional.

OBJETIVO GENERAL

Describir las distintas técnicas de observación en microscopía, para su correcta

aplicación a la práctica.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

 Describir cada una de las técnicas de observación en microscopia, para

luego llevarlas a la práctica.

 Explicar cómo se realiza cada técnica para lograr una mejor visualización

de las características de los microrganismos que serán objeto de nuestro

estudio.

 Observar las placas realizadas con las diferentes técnicas.

 MARCO TEÓRICO

El microscopio es un gran instrumento de investigación óptica, el cual nos facilita

la observación de microorganismos, sin embargo, no todas las veces esos

organismos no logran que su contraste sea bueno o sea compatible con el medio

que los rodea. Por ello se han llegado a usar técnicas que ilustren mejor las

propiedades que posee.

TÉCNICA DE OBSERVACIÓN:

Es un conjunto de procesos o mecanismos que se aplica a diversos materiales

biológicos que serán objeto de nuestro estudio.

Su objetivo es acondicionar y disponer las condiciones óptimas para dicho

organismo biológico para poder analizarlo, estudiar su anatomía y fisiología, y

demás componentes a través de un mejor manejo del microscopio.

Sus procedimientos son:

1. Obtención de las muestras

2. Técnica de observación
 Simple
 Frotis  Tipos de colorante según
el PH
 En fresco
 Compuesta o combinada
 Por tinción y fijación

3. Técnicas especiales

 Tinción Gram

 Tinción de Papanicolaou

 Tinción de Ziehl Neelsen

 1. OBTENCIÓN DE LA MUESTRTRA:

 Biopsia: Es un procedimiento, en el cual se extirpa, ya sea células o tejidos

del cuerpo. El patólogo es quien examina las muestras biológicas

tomadas, en la mayoría de los casos, se realiza este examen para

detectar algún tipo de cáncer. Además, las biopsias se pueden extraer de

cualquier parte del cuerpo. (1)

 Necropsia: Este estudio se lo realiza específicamente en cadáveres, con

el principal objetivo de indagar y descubrir su causa de muerte, este tipo

de obtención de muestras se usa en la rama de criminalística. (2)

 Muestras de fluidos biológicos: Los fluidos bilógicos comprenden: la orina,

heces, sangre, líquido sinovial, líquido pleural; el estudio de las muestras

de estos líquidos nos permitirá saber cuál es el estado de salud de un

paciente.

NORMAS DE SEGURIDAD E HIGIENE AL MOMENTO DE TOMAR UNA

MUESTRA

 Debemos tener en cuenta que todas las muestras bilógicas que serán

extraídas son infecciosas, por ello siempre debemos usar guantes y lavar

nuestras manos antes y después de tomar la muestra.

 Manejar cuidadosamente los objetos corto punzantes que hayamos

utilizado en la obtención de la muestra, y desecharlos correctamente.

  Eliminar los residuos de la muestra tal como hemos aprendido en las

normas de bioseguridad.

Luego de obtener correctamente la muestra, procederemos a analizarla con las

siguientes técnicas:

2. TÉCNICAS DE OBSERVACIÓN:

Frotis: Es el esparcimiento de la muestra, generalmente sangre, en un

portaobjetos, para distanciar a las células o a los microrganismos, y tener una

mejor visualización de sus composiciones químicas y físicas.

Procedimiento

o Consiste en colocar una gota de sangre en el borde del portaobjetos y

luego, con otro portaobjetos, se extiende la muestra por todo el borde.

o Es recomendable que el segundo portaobjetos este a unos 45º del

primero. (3)

En fresco: Es una técnica en la cual los microrganismos que serán objeto de

nuestro estudio, no sufrirán cambios en su estructura, forma o composición

química. Las muestras deben tener su propio contraste, y no hace falta alterarlo,

ya que con su contraste innato será suficiente para lograr una gran observación.

Una característica favorable de esta técnica es que es posible observar

organismo en movimiento.

Procedimiento:
 o Tomar la muestra de un cultivo bacteriano mediante un asa de siembra

o Coloque la muestra del cultivo de una bacteria sobre el porta objetos.

o Si la muestra es sólida, se homogeniza con una gota de suero fisiológico

con la ayuda de un mondadientes.

o Finalmente, puedes observar en el microscopio, preferiblemente con los

objetivos de 4x y 10x. (4)

Por fijación: este tipo de técnica nos ayuda a que la célula, tejidos u órganos;

mantengan sus propiedades casi intactas luego de que su proceso vital haya

llegado a su fin. Y para llegar a ello se debe tomar en cuenta varios procesos de

fijación o inmunidad, estos pueden ser:

Químicos Físicos Mecánicos

Fijador de cabello Congelación Presión mecánica

Formol Calor (squash)

Xilol Desecación

Lugol

Ácido acético

La estabilidad o inmovilización de las proteínas se da por coagulación o

precipitación de sus componentes, este tipo de inmovilizaciones es gracias a la

actuación de agentes fijadores que actúan sobre la sustancia, esto depende de

la finalidad que tengamos al momento de estudiar algún material biológico y de

la estructura del mismo.

La técnica más fácil es la de la presión mecánica, que consiste en fijar las

muestras presionando con los dedos.

Por Tinción: Esta técnica se caracteriza por usar otras sustancias que ayuden

a observar a la sustancia principal mediante tinciones o coloraciones que se le

colocará la muestra.

Este procedimiento consta de dos teorías que son:

 Teoría Física: Las partículas o moléculas de las sustancias colorantes que

están libres, penetran en los espacios intercelulares e intracelulares en

los que, por causa de la adhesión, se mantienes adheridas.

 Teoría química: Esta teoría explica cómo es que el colorante logra

comunicarse con la sustancia debido a las agrupaciones moleculares, que

pueden ser ácidas o básicas en los componentes celulares o de tejidos,

que se unen a los cromógenos.

TIPOS DE COLORANTE SEGÚN EL PH:

 Ácidos: Son sales en las que su parte básica no tiene color y el

componente básico si lo tiene. Las sustancias que cuentan con la

capacidad de atraer a los ácidos se denominan acidó filas.

 Básicos: son sales en las que su parte básica presenta color y su parte

ácida no tiene color. Posee una gran carga eléctrica negativa, tienen una

gran afinidad por los ácidos ribonucleicos, por eso se denominan

colorantes nucleares.
  Neutros: son sales cuyas partes ácidas y básicas presentan coloración.

Estos colorantes tienen la posibilidad de teñir de manera simultánea a los

componentes del núcleo y del citoplasma.

CLASIFICACIÓN DE LAS TINCIONES:

 Tinción simple: es un procedimiento que emplea un solo colorante, es

utilizado principalmente para determinar la organización y la morfología

de las células a observar en el microscopio.

Procedimiento:

o Se coloca la muestra que deseamos observar en el portaobjetos, en este

caso puede ser alguna secreción corporal.

o Se puede expandir la muestra mediante un hisopo.

o Se coloca el colorante que nos indique la práctica, pueden aplicarse los

siguientes colorantes: azul de metileno, violeta de cristal, verde malaquita

y fucsina básica; y lo cubrimos.

o Finalmente se observa en el microscopio, preferible con el objetivo de 4x

y 10x. (5)

 Tinciones combinadas: Esta técnica aplica dos o más tipos de

colorantes que contrasten en su intensidad y su color. Permite observar

dos tipos diferentes de respuesta en una misma muestra. Se presenta en

dos tipos:
  Sucesivas: Esto quiere decir que se aplicará sucesiones de varios tipos

de colorante en una muestra par que se tiñan en un orden específico.

 Simultánea: Es cuando se mezclan diversos colorantes en una misma

muestra. (6)

Cultivo de tejidos: Este tipo de técnica es la más utilizada para enfrentar

problemas de biología celular. Se pueden distinguir tres tipos de cultivos de

tejido:

 Cultivo primario: es posible obtenerlo de tejidos vegetales o animales, y

es posible que se puedan crear poblaciones celulares que se derivan de

una célula madre única.

 Cultivos secundarios: es posible conseguirlo mediante la acción de la

tripsina en un cultivo primario y un nuevo cultivo, esto se puede realizar

en una caja Petri.

 Cultivos de líneas celulares: estas células son prácticamente

corrientes, y su crecimiento es prolongado in vitro (7)

Procedimiento:

o Fijación: La fijación ayuda a preservar la estructura física y química de la

muestra que se tomara para su observación.

o Métodos de congelación, desecación: Preservan de mejor manera la

composición química de las células tomadas como muestra

o Cortes histológicos: nos darán como resultado pequeñas láminas tisulares

transparentes.

o Coloración: permite que se contrasten diferentes estructuras entre sí.

MATERIALES:

o Torundas con alcohol

o 20 Mondadientes

o 5 baja lenguas estériles

o Un frasco con 250 ml de solución salina

o 15 aplicadores estériles

o Alimento dañado con hongos

o Caja de cubreobjetos

MÉTODOS DE APRENDIZAJE:

Luego de identificar todas las técnicas de este informe, se llevará a cabo la

práctica correspondiente, para una mejor comprensión del tema tratado.

TINCIÓN DE GRAM

La tinción de gran es una técnica de estudio microbiológico de las bacterias, a

través de un análisis químico de laboratorio que nos permite identificar ciertos

tipos de bacterias, según se coloree su membrana, información útil para

realizar el tratamiento antibiótico, diseñada por Christian Gram, científico

danés, en el año 1884, con el objetivo de poder diferenciar diferentes grupos de

bacterias para su posterior clasificación y estudio (8).

La técnica consiste en aplicar una serie de colorantes a una muestra de

cualquier origen que contenga bacterias no identificadas, los colorantes tiñen la

pared de las bacterias de color morado, luego de unos minutos se lava la

muestra y si el color morado persiste en la pared bacteriana se trataría de

bacterias Gram positivas y si el color que se percibe es rosado se trataría de

Gram negativas estos 2 grupos abarcan a la mayoría de las bacterias (8).

LIMITACIONES

Algunas bacterias no poseen pared como por ejemplo las Chlamydias, los virus

no se pueden identificar por este método ya que no poseen pared celular en

estos casos la tinción no colorea ningún germen, tampoco se puede identificar

exactamente el tipo exacto de bacteria responsable de la infección (8).

COMO SE HACE UNA TINCIÓN DE GRAN

Este proceso se lo realiza en un laboratorio de análisis químico

1. Se coloca la muestra en un portaobjeto, se la extiende y se la deja secar

al aire.

2. Se aplica metanol a la muestra para que las bacterias queden fijadas en

la superficie.

3. Se coloca violeta de genciana un colorante que tiñe las bacterias de

color purpura, se deja actuar durante un minuto.

4. Posteriormente lavamos la muestra con agua y añadimos acetona para

desteñir las bacterias que se deben teñir con color violeta, luego

procedemos nuevamente a lavar con agua para eliminar el alcohol.

5. Luego se coloca fucsina, colorante que tiñe a las bacterias de rosa que

no se han teñido de violeta.

6. Se procede a observar la muestra con el microscopio para identificar las

bacterias teñidas.
TINCION POR PAPANICOLAU

Examen que se realiza para la detección de cáncer uterino o vaginal, la

muestra es tomada por raspado de la abertura del cuello uterino para esto se

utilizan varios tipos principales de colorantes, para una tinción nuclear y un

contraste citoplasmático (9).

PASOS PRINCIPALES PARA LA TINCIÓN

 Fijación de la muestra: Para detener procesos metabólicos con el fin

de conservar las células de la muestra.

 Tinción del núcleo con hematoxilina: colorante encargado de teñir el

núcleo, tiene afinidad por la cromatina, toma un color rojo vinoso, color el

cual toman los núcleos dado que estos contienen radicales ácidos. Se

utilizan dos métodos el progresivo que se utiliza la cantidad de colorante

deseada y el regresivo donde se remueve el exceso con ácido

clorhídrico diluido (9).

 Tinción del citoplasma con Orange: Penetra el citoplasma

rápidamente, y tiñe el epitelio maduro simple queratinizado, este

colorante es específico para teñir células queratinizadas (10).

 Aclaramiento: es el paso final de la tinción, se usa xilol para el

aclaramiento.
TINCION DE ZIEHL NEELSEN

Es una tinción que se utiliza para detectar bacterias acido-alcohol resistentes

entre ellas (BAAR) se llaman así porque su envoltura es resistente a la tinción,

esto se correlaciona con su alto contenido en lípidos de su pared celular y

presencia de ácidos micólicos que aumentan su no afinidad al agua, ejemplos

de ellos son las micobacterias, para este proceso se utilizan distintos colorantes

y una fijación por calor, se utiliza este método para el diagnóstico de

enfermedades como la lepra y tuberculosis (11).

Procedimiento para la tinción

 Preparar el portaobjetos (lavar y limpiar)

 Colocar la muestra y hacer el esparcido en el portaobjeto dejando una

pequeña capa

 Cubrir la muestra con la colorante fucsina y acercar al mechero hasta que

se observe vapores blancos sin permitir que la muestra se seque o hierva,

realizar este proceso por 5 minutos y dejar enfriar y se lava con agua

corriente.

 Cubrir con decolorante para Ziehl-Neelsen.

 Realizar varios lavados con agua corriente hasta que el colorante no se

desprenda.

 Cubrir con azul de metileno y dejar 30 segundos.

 Lavar con agua corriente 30 segundos.

 Secar el extendido.

 Observar en el microscopio.
 CONCLUSIONES:

o En resumen, se podría decir que las técnicas de observación en

microscopia es un conjunto de métodos que utilizamos para visualizar de

mejor manera las propiedades físicas y químicas de microrganismo, que

pueden ser: hongos, bacterias, etc.

o Luego de realizar este informe, llegamos a la conclusión de que las

técnicas más frecuentes son: frotis, fijación, tinción y en fresco: ya que

cada una de ellas nos brinda diferentes resultados que nos servirán en

nuestro estudio.

o Por último, también logramos identificar los diferentes tipos de técnicas

especiales, que cumplen con un objetivo mucho más específico y

ayudaran a que nuestra observación y a nuestro estudio.

RECOMENDACIONES:

o Seguir con precaución todas las normas de bioseguridad, para evitar

cualquier accidente.

o Manipular con cuidado todos los materiales que usemos en la práctica, y

ser cuidadosa con las sustancias que estudiaremos.

BIBLIOGRAFÍAS:

1. Biopsia [Internet]. [cited 2018 Nov 7]. Available

from: https://medlineplus.gov/spanish/biopsy.html

2. Necropsia [Internet]. Concepto de - Definición de. 2014 [cited 2018 Nov

8]. Available from: https://conceptodefinicion.de/necropsia/

3. Frotis de sangre: Información en MedlinePlus sobre pruebas de

laboratorio [Internet]. [cited 2018 Nov 8]. Available from:

https://medlineplus.gov/spanish/pruebas-de-laboratorio/frotis-de-sangre/

4. Microbiología/Exámen microscópico de Bacterias - Wikilibros [Internet].

[cited 2018 Nov 8]. Available from:

https://es.wikibooks.org/wiki/Microbiolog%C3%ADa/Ex%C3%A1men_mi

crosc%C3%B3pico_de_Bacterias

5. Briceño K. ¿Qué es la Tinción Simple? Características Más Destacadas

[Internet]. Lifeder. 2017 [cited 2018 Nov 8]. Available from:

https://www.lifeder.com/tincion-simple/

6. Equipo 5. Microbiología: Métodos y Técnicas de Tinción [Internet].

Microbiología. 2014 [cited 2018 Nov 8]. Available from:

http://microbiologia3bequipo5.blogspot.com/2014/10/metodos-y-

tecnicas-de-tincion.html

7. Robertis E. Biología celular y molecular. 12va ed. Buenos Aires: El Ateneo;

1996.

8. 2. A-Z E, auxilios P, médicas P, Embarazo P, embarazada Q,

anticonceptivos M et al. Tinción de Gram [Internet]. Webconsultas.com.

2018 [cited 9 November 2018]. Available from:

https://www.webconsultas.com/pruebas-medicas/tincion-de-gram-13399
9. 3. cruz e. COLORACION PAPANICOLAU(real) [Internet]. Academia.edu.

2018 [cited 9 November 2018]. Available from:

http://www.academia.edu/30985080/COLORACION_PAPANICOLAU_re

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10. Conocimientos Basicos Para La Tincion de Papanicolaou i [Internet].

Scribd. 2018 [cited 9 November 2018]. Available from:

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11. Tinción ziehl-neelsen [Internet]. prezi.com. 2018 [cited 9 November 2018].

Available from: https://prezi.com/59zzfjp0dgzl/tincion-ziehl-neelsen/