TECNICAS HISTOLOGICAS

La histología vegetal puede ser definida como el estudio de estructuras

microscópicas o de las características de las células y su organización en
tejidos u órganos. Varias técnicas histológicas son comúnmente utilizadas para
examinar los tejidos vegetales, cada una provee una cantidad de información
similar, pero difieren en la resolución de los detalles y en el medio que se usa
para preparar las muestras. Estas técnicas incluyen aquellas para microscopía
por fluorescencia o por campo brillante, para lo cual las muestras pueden ser
preparadas para ser cortadas en secciones finas (15-40 μm) tanto sin un medio
estabilizante (muestras frescas), en criofluídos (secciones congeladas) o en
inclusión en materiales como parfina o plástico. Las técnicas que emplean
microscopía electrónica no requieren una imbibición especial, como el
microscopio de barrido de electrones, o usan muestras incluídas en plástico
(microscopio de transmisión de electrones) que pueden ser cortadas en
secciones utltrafinas (65-100 nm).

En CTV, las técnicas histológicas proveen información esencial que puede

no ser evidente con una observación visual. La comprensión de los procesos de
desarrollo in vitro resultaron de investigaciones histológicas detalladas. Por
ejemplo, mediante el uso de técnicas histológicas y por el análisis de los
detalles anatómicos, las características de los embriones somáticos pueden ser
rápidamente observadas. Otro ejemplo es investigar el origen de estructuras
específicas, como brotes o raíces adventicias, embriones y su desarrollo en
cultivo. El desarrollo histológico puede ser estudiado a lo largo del tiempo
periódicamente mediante muestras de tejido, o el resultado final puede ser
examinado en estructuras maduras. Se debe tener en cuenta que el
crecimiento de los tejidos es dinámico y cambia de momento a momento, y que
las secciones histológicas son estáticas y fijas en el tiempo, por lo que
solamente presentan un reflejo de los procesos de desarrollo. Por lo tanto, el
origen de los tejidos y órganos deber ser inferido a partir de una serie de
observaciones de varias muestras y secciones.

Microtécnicas aplicadas al cultivo in vitro de plantas

Los métodos de cultivo de tejidos vegetales in vitro a veces son

aplicados para estudios básicos de morfología vegetal y desarrollo. Estos
estudios requieren familiaridad con técnicas histológicas para microscopía.
Existen dos métodos fundamentales para microscopía óptica. El primero, fue
desarrollado en los comienzos de este siglo (Johansen, 1940) envuelve la
inclusión en parafina. Es recomendado para una examinación rápida de las
paredes durante el desarrollo de tejidos u órganos pero no para estudios de la
estructura celular. La inclusión en parafina ofrece la posibilidad de usar piezas
de tejido vegetal a veces más grandes que 1 cm3 . También el material incluído
en parafina puede ser seccionado seriadamente para proveer una serie
continua de cortes de una muestra. Sin embargo, debido al daño que se produce
durante la infiltración, inclusión y seccionamiento, este método no es
recomendado para analizar detalles celulares de interés.

El segundo método, desarrollado durante los ‘60 (Feder an

O’Brien,1968), consiste en una fijación con aldehídos e inclusión en un plástico
duro, glicol metacrilato (GMA). Este método ofrece varias ventajas sobre el
convencional de inclusión en parafina. Durante la infiltración e inclusión con
GMA, existe un menor encogimiento de los tejidos. Una vez polimerizado el
plástico es más fuerte que la parafina y las secciones son de 1 μm o menos,
comparadas con los 8-15 μm para parafina, y son rutinariamente obtenidas con
poco o ningún daño. Por otro lado, como el plástico polimerizado es no
cristalino, homogéneo y transparente, no tiene que ser removido de las
secciones antes de la tinción, por lo que reduce la posibilidad de daño del
tejido. Finalmente, pueden ser utilizadas muchas de las tinciones
convencionales, porque el polímero de GMA es permeable a los colorantes
solubles en agua.

ESTUDIOS HISTOLOGICOS DE MORFOGENESIS IN VITRO

Los métodos histológicos contribuyen significativamente a la

comprensión de los sistemas de cultivo de tejidos in vitro. Un buen análisis
histológico basado en los cambios anatómicos e histoquímicos provee
información que permitirá comprender en mayor medida los procesos de
histogénesis que se producen en un sistema de cultivo de tejidos, lo que
ayudará a tomar las decisiones adecuadas para optimizar un protocolo de
propagación o proponer hipótesis para subsecuentes investigaciones.

Es importante remarcar que los diferentes materiales pueden requerir

modificaciones en los procedimientos existentes. La fijación, procesamiento y
coloración deberán ser optimizados para cada necesidad.
METODOLOGIA

Materiales

‰ Microscopio óptico
‰ Lupa binocular
‰ Cámara fotográfica
‰ Cámara de video
‰ Cubre y porta objetos
‰ Fijadores y reactivos para tinción
‰ Pinzas de punta fina
‰ Aguja histológica
‰ Pincel
‰ Lentes de reloj
‰ Cajas de Petri

Técnicas

1. Tinción con Safranina.

a. Realizar cortes a mano alzada del material vegetal utilizando una hoja de
afeitar tan delgados como sea posible.
b. Diafanizar el material con hipoclorito de sodio al 50% hasta que el material
este totalmente transparente.
c. Realizar tres enjuagues con agua destilada.
d. Colocar el material en alcohol 700 durante 10 min.
e. Pasarlo a solución de Safranina diluida hasta que estén coloreados.
f. Quitar el exceso de colorante con agua destilada.
g. Montar

(las paredes secundarias lignificadas se tiñen de color rojo intenso y el

parénquima de rosado)

2. Visualización de pro-embriones somáticos.

a. Utilizar los callos obtenidos en el medio de inducción de embriones
somáticos.
b. A una pequeña cantidad de material adicionar gotas de azul de Evans
durante 2 a 3 minutos, con calor.
c. Agregar unas gotas de agua destilada y retirar con un papel absorbente el
exceso de azul de Evans.
d. Adicionar carmín acético de la misma manera y por el mismo período.
e. Agregar unas gotas de agua destilada y retirar con un papel absorbente el
exceso de carmín acético.
f. Montar.

(el material embriogénico se tiñe de rojo y el no embriogénico de azul)

3. Visualización de almidón en las células pro-embrionarias.

a. Colocar pequeña cantidad de material embrigénico en un vidrio de reloj.

b. Adicionar gotas de Lugol en cantidad suficiente como para cubrir el
material.
c. Dejar en reposo por 35-40 minutos.
d. Retirar con un papel absorbente el exceso de colorante.
e. Montar.

(los granos de almidón se colorean de negro-azulado)

4. Visualización de lípidos en las células pro-embrionarias.

a. Colocar pequeña cantidad de material embrigénico en un vidrio de reloj.

b. Adicionar alcohol etílico (50%) por 1 minuto.
c. Retirar el alcohol y adicionar Sudan III en cantidad suficiente para cubrir
el material.
d. Dejar en reposo por 45 minutos.
e. Retirar con un papel absorbente el exceso de colorante.
f. Montar.

(los cuerpos lipídicos se colorean de naranja oscuro)

GUIA PARA EL CONTROL MICROSCOPICO.

♦ Material:
♦ Especie:
♦ Fecha de inicio del cultivo:
♦ Medio de cultivo:
♦ Condiciones de cultivo:

Análisis macroscópico

- Friabilidad:
- Compactación:
- Estructuras diferenciadas:
- Coloración:
- Tamaño promedio:
- Textura:
- Peso fresco:
- Peso seco:

Análisis microscópico

- Tipos celulares:

- Presencia de meristemoides:

- Presencia de células pro-embriogénicas:

- Histogénesis (Organización tisular):

- Organogénesis:
Fotografías
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