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ViroSeq™
HIV-1 Genotyping System v2.0
Para utilizar con los ABI PRISM ® 3100/3100-Avant Genetic Analyzers
(Analizadores genéticos ABI PRISM ® 3100/3100-Avant) y el
ViroSeq® HIV-1 Genotyping System Software v2.8
Instrucciones de uso
0197
4J94-36
Celera
1401 Harbor Bay Parkway DRAFT ABBOTT
Max-Planck-Ring 2
Alameda, CA 94502 August 21, 2008 3:56 pm, 5001504_cover_es.fm 65205 Wiesbaden
USA *+H3764J94360X* Germany
+ 49-6122-580
Contenido
Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1
Indicaciones de uso . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
Campo de aplicación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
Resumen y explicación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
Principios del procedimiento. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
Para realizar pedidos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
Leyenda de los símbolos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
Bibliografía . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .64
Referencias citadas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64
9. PELIGRO DE LÁSER. La exposición a luz láser directa o ViroSeq™ HIV-1 8E5 Conservar entre • Cinco viales de cada control de
reflejada a 40 mW durante 0,1 segundos puede quemar la retina y dejar Control Module • –15 °C y –25 °C plasma (positivo y negativo).
• En un congelador de • Descongele un vial de control
escotomas permanentes. No mire nunca directamente al haz del láser ni descongelación manual de plasma positivo y otro de
permita que el reflejo del haz entre en los ojos. Siga las recomendaciones del designado como «sin control de plasma negativo.
fabricante sobre el uso de ropa y protección ocular apropiada cuando utilice amplicones» • Utilícelos en cada análisis de
el ABI PRISM ® 3100 o el ABI PRISM ® 3100-Avant Genetic Analyzers muestras.
• No los vuelva a congelar.
(Analizadores genéticos ABI PRISM® 3100/3100-Avant).
ViroSeq™ HIV-1 Conservar en la zona de Estos materiales son
Sequencing Module posamplificación entre: sensibles a la luz.
• entre –15 °C y –25 °C Evite la exposición
10. RIESGOS BIOLÓGICOS. Las muestras biológicas, como • En un congelador de prolongada a la luz.
los tejidos y la sangre, pueden transmitir enfermedades infecciosas. descongelación manual
Manipule todas las muestras extraídas como si fueran infecciosas. Utilice designado para ADN
amplificado únicamente
procedimientos de laboratorio seguros, como los que se describen en
el documento Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories22
(Seguridad biológica en laboratorios biomédicos y microbiológicos) y en
el documento M29-T del NCCLS.23 Pack 2 (paquete 2)
C. Conservación de las muestras extraídas GeneAmp® PCR System 9600 Thermal Cycler N801-0001
(Termociclador 9600 del sistema de PCR GeneAmp®) ó
Conserve las muestras de plasma a una temperatura entre –65 °C y –80 °C. No las o N805-0001
congele durante más de 6 meses. No congele y descongele el plasma más de dos GeneAmp® PCR System 9700 Thermal Cycler (Termociclador
veces. 9700 del sistema de PCR GeneAmp®)
ViroSeq™ HIV-1 Genotyping System v2.0, Pack 1 con: 4J94-20 Base de placa de 96 pocillos 4317237
• ViroSeq™ HIV-1 Sample Preparation Module
• ViroSeq™ HIV-1 RT-PCR Module
• ViroSeq™ HIV-1 Sequencing Module Retenedor de placa de 96 pocillos 4317241
• ViroSeq™ HIV-1 8E5 Control Module
Separadores de placa de 96 pocillos 4315933
ViroSeq™ HIV-1 Genotyping System v2.0, Pack 2 con: 4J94-21
• YM-100 Microconcentrators (microconcentradores YM-100)
• MicroAmp® Optical 96-Well Reaction Plates with Covers (placas MicroAmp® Optical 96-Well Reaction Plate (placa óptica de 96 N801-0560
ópticas de 96 pocillos para reacción MicroAmp® con tapa) pocillos para reacción MicroAmp®)
• MicroAmp® Reaction Tubes with Caps (tubos de reacción
MicroAmp® con tapón) Jeringa de vidrio para llenado de la matriz, 250 μL 4304470
• KCl (200 mM)
ABI PRISM ®
3100-Avant Capillary Array (matriz de capilares 4333466
®
ABI PRISM 3100-Avant), 50 cm Formamida Hi-Di™, 25 mL 4311320
ABI PRISM ® 3100 Genetic ABI PRISM ® 3100 Genetic 3100-01 Contiene formamida.
Analyzer (Analizador genético Analyzer (Analizador genético ¡IMPORTANTE! No debe
ABI PRISM® 3100) con: ABI PRISM® 3100) con: descargarse software de Internet R 61 Riesgo durante el embarazo de efectos adversos para
• Data Collection Software • Data Collection Software para este uso específico. el feto.
v.1.0.1 (software de v.1.1 (software de
recogida de datos v.1.0.1) recogida de datos v.1.1) R 36/38 Irrita los ojos y la piel.
• Versión del firmware • Versión del firmware S 53 Evítese la exposición – recábense instrucciones especiales
6286100-04 6286150-01 antes del uso.
• PC con: • PC con: S 24/25 Evítese el contacto con los ojos y la piel.
– Microsoft® Windows – Microsoft® Windows S 35 Elimínense los residuos del producto y sus recipientes con
NT® v.4.0 NT® v.4.0, Service todas las precauciones posibles.
– Procesador Intel® Pack 5 o 6a S 36/37/39 Úsense indumentaria y guantes adecuados, y
Pentium® III a – Procesador Intel® protección para los ojos/la cara.
550 MHz Pentium® IV a 2 GHz S 45 En caso de accidente o malestar, acúdase inmediatamente
– 256 MB de RAM – 1 GB de RAM al médico (si es posible, muéstresele la etiqueta).
– Disco duro de – 2 x discos duros de
18 GB 36 GB
• Kit de limpieza del bloque • Kit de limpieza del bloque BigDye® Terminator v1.1 Sequencing Standard (patrón de 4336791
de polímero de polímero secuenciación BigDye® Terminator v1.1)
Las diferentes partes del procedimiento del ViroSeq HIV-1 Genotyping System C. PCR Entre –15 °C y –25 °C 2 semanas
deben llevarse a cabo en distintas zonas de trabajo. Cada zona de trabajo debe tener D. Secuenciación cíclica Entre –15 °C y –25 °C 3 días
pipetas, equipos y suministros específicos para que el ensayo resulte satisfactorio
habitualmente. Se sugieren tres zonas de trabajo: E. Secuencias purificadas Entre –15 °C y –25 °C 1 semana
A1. Preparación
PELIGRO QUÍMICO. El etanol líquido y sus vapores son
inflamables. La exposición puede causar irritación en los ojos, la piel
1. Enfríe una centrífuga con refrigeración y el rotor entre 2 °C y 8 °C, siguiendo y las vías respiratorias altas. El contacto prolongado o reiterado puede
las instrucciones del fabricante. secar la piel. La exposición puede causar la depresión del sistema
nervioso central y lesiones hepáticas. Conservar alejado del calor,
2. Descongele las muestras de plasma y un tubo de cada control (positivo y chispas y llamas. Úsense gafas, indumentaria y guantes de protección
negativo) hasta que alcancen la temperatura ambiente (entre 15 °C y 25 °C). adecuados. Consulte la Ficha de datos de seguridad del fabricante
para obtener más información.
3. Mantenga únicamente un reactivo o tubo de muestra abierto a la vez.
9. Extraiga los tubos en cuanto se detenga el rotor.
A2. Aislamiento del ARN viral del VIH-1 10. Extraiga con cuidado el sobrenadante de los tubos, con ayuda de una pipeta
de transferencia de punta fina. No desprenda el sedimento (que en algunos
casos no está visible).
1. Agite las muestras de plasma en el vórtex durante 3 a 5 segundos para
mezclarlas. RECOMENDACIÓN: Al aspirar, empiece con la punta de la pipeta de
transferencia justo debajo de la línea del menisco y vaya bajando la punta
por la pared opuesta a la marca de orientación a medida que aspira. Extraiga
2. Centrifúguelas durante 1 ó 2 segundos a 2.000 x g para acumular el la mayor cantidad de sobrenadante posible sin desprender el sedimento.
contenido en el fondo del tubo.
11. Añada 600 μL de Viral Lysis Buffer (tampón de lisado viral) a cada
3. Etiquete los tubos de acuerdo con el protocolo del laboratorio y a sedimento.
continuación, añada 0,5 mL del plasma a un tubo con tapón de rosca nuevo
sin RNasa ni DNasa.
12. Agite en el vórtex durante 3 a 5 segundos para mezclar.
4. Prepare un control con un bajo contenido de ARN viral.
13. Centrifugue durante 1 ó 2 segundos a 2.000 x g para acumular el contenido
Combine en un tubo de microcentrífuga:
en el fondo del tubo.
– 50 μL de HIV-1 8E5 Positive Control (control positivo de VIH-1 de
8E5)
– 450 μL de HIV-1 8E5 Negative Control (control negativo de VIH-1 14. Deje reposar las muestras a temperatura ambiente (entre 15 °C y 25 °C)
de 8E5) (plasma negativo) durante 10 minutos para garantizar el lisado completo del virus.
y etiquételo según corresponda.
15. Añada 600 μL de isopropanol a temperatura ambiente (entre 15 °C y 25 °C)
a cada muestra.
5. Coloque una marca de orientación en un lateral del tubo y ciérrelo.
22. Introduzca los tubos en el rotor con las marcas de orientación dirigidas hacia 5. Extraiga el RNase Inhibitor (inhibidor de la RNasa) y la MuLV Reverse
el borde exterior del rotor. Transcriptase (transcriptasa inversa del MuLV) del kit.
23. Centrifugue a 12.500 a 15.000 x g a temperatura ambiente durante 5 min. 6. Centrifugue todos los tubos de reactivo y las muestras durante 1 a
2 segundos a 2.000 x g para acumular el contenido en el fondo.
24. Extraiga con cuidado el sobrenadante con una pipeta de transferencia de
punta fina. No desprenda el sedimento (que ahora debe ser visible). 7. Conserve todos los reactivos y las muestras a una temperatura entre 2 °C y
Elimine la mayor cantidad posible del etanol. 8 °C o en hielo hasta el momento de utilizarlos.
Temperatura (°C) Tiempo Proceso HIV PCR Mix (mezcla para 29,5 147,5 442,5
PCR del VIH)
65 30 segundos Relaja la estructura secundaria del ARN AmpliTaq Gold DNA 0,5 2,5 7,5
42 5 minutos Se enfría a la temperatura óptima para la actividad Polymerase (ADN
enzimática polimerasa AmpliTaq Gold)
Realizar una pausa de forma manual, realizar el paso 6 y pulsar Resume (Reanudar) AmpErase UNG (uracil-N- 1 5 15
glicosilasa AmpErase)
42 60 minutos Transcripción inversa
Volumen final 31 155 465
99 5 minutos Inactiva la MuLV Reverse Transcriptase
(transcriptasa inversa del MuLV)
4 Mantener Detiene el proceso hasta que esté listo para Nota. Prepare un volumen suficiente para 1 reacción más a fin de compensar
(> 10 minutos) continuar las pérdidas debidas al pipeteo.
Nota. Cuando el sistema se lo indique, establezca el volumen del
termociclador en 20 μL. 2. Agite la mezcla maestra de PCR en el vórtex durante 3 a 5 segundos para
mezclarla.
¡IMPORTANTE! Los instrumentos GeneAmp® 9600 y 9700 solo se
mantienen en pausa durante 10 minutos. El paso 6 debe llevarse a cabo antes
de que transcurran 10 minutos. 3. Centrifugue durante 1 ó 2 segundos a 2.000 x g para acumular el contenido
en el fondo del tubo.
6. Mientras el instrumento está en pausa, realice lo siguiente:
4. Añada 30 μL de la mezcla maestra de PCR a cada tubo de reacción de TI que
a. Extraiga de inmediato las muestras de ARN del termociclador. contenga ADNc del VIH-1.
b. Añada 10 μL de la mezcla maestra de TI a temperatura ambiente a cada
tubo de reacción y tape los tubos. El volumen final es ahora igual a 50 μL.
c. Agite en el vórtex la bandeja con las muestras durante 3 a 5 segundos para
mezclarlas. 5. Lleve las muestras al termociclador en la zona 3.
d. Centrifugue la bandeja de muestras durante 1 a 2 segundos a 2.000 x g No vuelva a la zona 2 durante el resto del día.
para acumular el contenido en el fondo.
6. Nota. Utilice únicamente el termociclador GeneAmp® 9600 ó 9700 situado
7. Devuelva las muestras al termociclador y pulse Resume (Reanudar). en la zona de trabajo 3.
Nota. Consulte las instrucciones de programación detalladas en el manual de
8. Al finalizar el programa de la TI, deje las muestras en el termociclador funcionamiento del termociclador.
durante al menos 10 minutos a 4 °C, pero no más de 18 horas. Configure el programa del termociclador de la siguiente forma:
C. PCR 66 3 min
72 10 min 1
4 Mantener —
C1. Preparación
¡IMPORTANTE! Este procedimiento se lleva a cabo en la zona de
preamplificación 2. Nota. Cuando el sistema se lo indique, establezca el volumen del
termociclador en 50 μL.
1. Si las muestras están congeladas, descongélelas a temperatura ambiente
(entre 15 °C y 25 °C). 7. Transfiera los tubos al termociclador e inicie el programa.
2. Centrifugue la bandeja de muestras o los tubos durante 1 a 2 segundos a 8. Cuando finalice el programa:
2.000 x g para acumular el contenido en el fondo. • Continúe con los pasos de purificación o
• Detenga el procedimiento y conserve las muestras entre –15 °C y –25 °C.
3. Descongele la HIV PCR Mix (mezcla para PCR del VIH). ¡IMPORTANTE! No deje los tubos en el termociclador durante más de
24 horas. La actividad residual de la UNG podría destruir el ADN
4. Agite en el vórtex durante 3 a 5 segundos para mezclar. amplificado.
1. Monte el microconcentrador. 3. Prepare el gel de agarosa al 1% con TBE y 0,5 μg/mL de bromuro de etidio (o
a. Para cada muestra, etiquete bien, utilice un gel de agarosa al 1% comercial).
– Un tubo de recogida de 1,5 mL
– Una columna de centrifugación PELIGRO QUÍMICO. El bromuro de etidio causa irritación en los
b. Introduzca en cada tubo una columna de centrifugación etiquetada ojos, la piel y el aparato respiratorio, y es un mutágeno conocido (es decir,
adecuadamente, con la membrana blanca hacia arriba. puede provocar cambios en el material genético en las células vivas y puede
causar cáncer). Úsense gafas, indumentaria y guantes de protección
2. Pipetee con cuidado 300 μL de KCl (200 mM) en el depósito de cada adecuados. Consulte la Ficha de datos de seguridad del fabricante para
obtener más información.
microconcentrador. El KCl (200 mM) se suministra en el Pack 2 (paquete 2).
¡IMPORTANTE! No toque la membrana con la punta de la pipeta. 4. Prepare una solución tampón 1X de TBE en gel con 0,5 μg/mL de bromuro de
etidio.
3. Pipetee los 50 μL completos del producto para PCR de cada muestra en
el depósito del microconcentrador que contiene KCl y lleva la etiqueta
5. Coloque el gel preparado en la caja de gel.
correspondiente.
¡IMPORTANTE! No toque la membrana con la punta de la pipeta.
6. Añada suficiente solución tampón 1X de TBE en gel para cubrir el gel.
6. Destape los tubos y pipetee con cuidado 300 μL de agua desionizada estéril 8. Cargue la solución de DNA Mass Ladder (marcador de peso de ADN).
en el depósito de cada microconcentrador. a. 6 μL en la calle 1
¡IMPORTANTE! No toque la membrana con la punta de la pipeta. b. 3 μL en la calle 2
7. Tape firmemente cada tubo con el tapón correspondiente. Obtendrá los siguientes resultados:
Tercero 0,8 40 20
10. Vuelque el contenido de los microconcentradores en tubos de recogida
nuevos y etiquetados.
a. Retire los microconcentradores del tubo que contiene el filtrado.
b. Invierta el microconcentrador de cada muestra sobre un tubo 9. Cargue el resto de las calles con 10 μL de cada muestra.
de 1,5 mL nuevo y etiquetado según corresponda.
c. Deseche el tubo usado junto con el filtrado. ¡IMPORTANTE! No olvide anotar qué muestra cargó en cada calle.
11. Centrifugue los microconcentradores preparados entre 800 y 900 x g durante 10. Realice la electroforesis a 10 V/cm hasta que el azul de bromofenol haya
5 minutos. migrado al menos 5 cm en el gel.
12. Retire y deseche los microconcentradores, conservando las muestras en los 11. Examine el gel con luz UV.
tubos.
12. Fotografíe el gel utilizando un tiempo de exposición que no sature la película
13. Tape firmemente cada tubo con el tapón correspondiente y: y permita ver las diferencias de intensidad de los fragmentos marcadores de
• Proceda a correr el gel de agarosa o bien, peso.
• Detenga el procedimiento y conserve las muestras entre –15 °C y –25 °C
durante dos semanas como máximo.
4. Prepare una solución tampón 1X de TBE en gel con 0,5 μg/mL de bromuro
de etidio.
Bandas
Calle de 6 μL Calle de 3 μL
Nota. La banda del producto de la TI-PCR debe tener una intensidad igual (ng) (ng)
o mayor a la de la banda del marcador de 20 ng para garantizar una Posición Tamaño (kb)
secuenciación de alta calidad. 2,0 100 50
Superior
14. Tape y agite en el vórtex cada muestra sin diluir durante 3 a 5 minutos para Segundo 1,2 60 30
mezclarla.
Tercero 0,8 40 20
Opción 2: ExoSAP-IT® para la limpieza de productos de la PCR 10. Realice la electroforesis a 10 V/cm hasta que el azul de bromofenol haya
migrado al menos 5 cm en el gel.
Nota. La opción ExoSAP-IT requiere la cuantificación en gel de agarosa seguida
por el tratamiento con ExoSAP-IT y posteriormente, la dilución apropiada para la
secuenciación. 11. Examine el gel con luz UV.
Procesamiento del producto de PCR no purificado en el gel de agarosa para 12. Fotografíe el gel utilizando un tiempo de exposición que no sature la película
la opción ExoSAP-IT: y permita ver las diferencias de intensidad de los fragmentos marcadores de
peso.
1. Descongele el DNA Mass Ladder (marcador de peso de ADN) a
temperatura ambiente (entre 15 °C y 25 °C). Esto tardará al menos 30 13. Evalúe la cantidad de productos de la PCR que hay en cada muestra,
minutos. comparando la intensidad de cada banda con la intensidad de las bandas de
Antes de utilizarlo, agítelo en el vórtex durante 10 a 15 segundos para los DNA Mass Ladder (marcadores de peso de ADN).
mezclarlo. Nota. NO diluya en este paso.
2. Descongele el Agarose Gel Loading Buffer (solución tampón de carga de 14. Continúe con la purificación de los productos de la PCR con ExoSAP-IT en
gel de agarosa) hasta que alcance la temperatura ambiente. Esto tardará al las muestras que tengan una intensidad igual o mayor a la de la banda del
menos 30 minutos. marcador de peso de 20 ng.
Nota. Si se forman cristales, caliente la solución a 65 °C durante Nota. La banda del producto de la TI-PCR debe tener una intensidad igual
10 minutos. o mayor a la de la banda del marcador de 20 ng para garantizar una
Antes de utilizarlo, agítelo en el vórtex durante 10 a 15 segundos para secuenciación de alta calidad.
mezclarlo.
1. Pipetee con cuidado 3 µL de ExoSAP-IT® en cada tubo con 45 µL de D2. Preparación de la secuenciación cíclica
producto de la PCR que tenga una intensidad de banda superior o igual Nota. Utilice únicamente el termociclador GeneAmp® 9600 ó 9700 situado en la
a la de la banda de 20 ng/5 µL. zona de trabajo 3.
Nota. Programe el termociclador antes de preparar la reacción (consulte el paso 7).
2. a. Tape los tubos. Consulte las instrucciones de programación detalladas en el manual de
b. Agite los tubos o la bandeja de muestras en el vórtex durante 3 a funcionamiento del termociclador.
5 segundos para mezclarlas. Nota. No prepare las reacciones de secuenciación para el control negativo.
c. Centrifugue los tubos o la bandeja de muestras durante 1 a 2 segundos ¡IMPORTANTE! Las mezclas para secuenciación son sensibles a la luz. No las
a 2.000 x g para acumular el contenido en el fondo.
exponga a la luz durante periodos prolongados.
El volumen final es ahora de 48 µL.
1. Descongele las mezclas de VIH-1 para secuenciación a temperatura
3. Programe el termociclador con el siguiente programa: ambiente (entre 15 °C y 25 °C).
Si la intensidad de la
Haga lo siguiente… Una placa de reacción de 96 pocillos cargada con la muestra 1 (S1)
banda es…
empezando en la columna 1 de la placa de 96 pocillos, S2 en la columna 2,
Entre 20 y 40 ng ajuste el volumen de la muestra a 60 μL. etc. La fila H no se utiliza, a menos que desee procesar 13 muestras en la
Entre 40 y 60 ng diluya la muestra 1:2 con H2Odd misma placa.
(1 parte de muestra y 1 parte de agua). Nota. Si utiliza un 3100-Avant Genetic Analyzer (analizador genético
Entre 60 y 100 ng diluya la muestra 1:4 con H2Odd 3100-Avant) para el paso de detección automatizada de la secuencia, solo
(1 parte de muestra y 3 partes de agua). podrá analizar 7 columnas de muestras a la vez. Las columnas de muestras
> 100 ng diluya la muestra 1:10 con H2Odd restantes y 10 µL de cada pocillo que contenga control positivo deberán
(1 parte de muestra y 9 partes de agua). transferirse a una segunda placa. Consulte Preparación de reacciones de
secuenciación purificadas para el análisis en el 3100-Avant Genetic
Analyzer (analizador genético 3100-Avant).
Ilustración:
3. En cada tubo o pocillo, combine lo siguiente:
6. Transfiera las muestras al termociclador. 6. Centrifugue la bandeja o la placa entre 1.500 y 2.000 x g durante 45 minutos.
7. Configure el programa del termociclador de la siguiente forma: 7. En cuanto se detenga la centrífuga, quite con cuidado los tapones o la cinta
adhesiva sin desprender los sedimentos.
D3.a Purificación de las secuencias con isopropanol 1. Prepare la solución de acetato sódico/etanol combinando lo siguiente para
cada reacción:
1. Extraiga la bandeja MicroAmp® del termociclador y destape los tubos o 2 μL de acetato sódico 3,0 M, pH 5,2
la placa. 50 μL de etanol al 100%
3. Tape los tubos con las tiras correspondientes o cubra la placa con cinta 4. Mezcle por inversión (tres veces) o agite en el vórtex.
adhesiva de aluminio. ¡IMPORTANTE! Mezcle exhaustivamente en este paso. Esto es
fundamental para una precipitación eficaz.
4. Agite en el vórtex o invierta la bandeja varias veces para mezclar
el contenido. 5. Centrifugue a 2.000 x g durante 20 minutos.
11. Coloque de inmediato una servilleta de papel absorbente o un pañuelo de Control de calidad
papel que no suelte pelusa sobre la bandeja o placa, y déle la vuelta.
El ViroSeq™(8E5) Control Module, que contiene controles tanto positivos como
negativos, se incluye con el ViroSeq HIV-1 Genotyping System. Se debe utilizar
12. Centrifugue a 150 x g durante 1 minuto. un control positivo y uno negativo en cada análisis. Para controlar tanto el éxito de la
TI-PCR como el del genotipado se necesita el HIV-1 8E5 Positive Control (control
13. Cuando se detenga la centrífuga y finalice el secado, extraiga la bandeja o la positivo de VIH-1 de 8E5). El HIV-1 8E5 Negative Control (control negativo de
placa, tápela con las tiras o con la cinta adhesiva de aluminio, y consérvela VIH-1 de 8E5) solo se necesita para controlar el éxito de la TI-PCR.
en la oscuridad a una temperatura entre –15 °C y –25 °C. Analice las
muestras antes de una semana.
¡IMPORTANTE! Utilice una caja oscura para la conservación. Los Éxito de la TI-PCR
productos de las reacciones de secuenciación son sensibles a la luz.
El éxito de la TI-PCR se determina en la sección «D1. Purificación y cuantificación
de los productos de la PCR». Para garantizar una secuenciación de alta calidad, la
D3.c Purificación con placas de 96 pocillos CENTRI•SEP 96™ intensidad de la banda de TI-PCR debe ser igual o superior a la del marcador de
20 ng en el gel de agarosa. Las muestras de plasma con cargas virales superiores a
¡IMPORTANTE! Las placas CENTRI•SEP 96 son sensibles a la temperatura. No las 2.000 copias/mL deben proporcionar al menos 20 ng de producto de la TI-PCR
las conserve a temperaturas inferiores a 4 °C. Las placas deben estar a temperatura en este paso. A medida que la carga viral desciende por debajo de las 1.000
ambiente antes de utilizarlas. copias/mL, las probabilidades de éxito en la PCR disminuyen. Sin embargo,
cualquier muestra que tenga una cuantificación de ADN de 20 ng o más se puede
secuenciar para obtener un genotipo, independientemente de la concentración inicial
1. Asegúrese de que las placas CENTRI•SEP 96 estén a temperatura ambiente. en el plasma. El HIV-1 8E5 Positive Control (control positivo de VIH-1 de 8E5)
tiene una carga viral inicial de 50.000 a 100.000 copias/mL; el control positivo bajo
2. Desprenda la película adhesiva de aluminio de la parte inferior de la placa (dilución 1:10) tiene una carga viral de 5.000 a 10.000 copias/mL. El control
CENTRI•SEP 96 y a continuación, de la parte superior. negativo no tiene un nivel detectable de ARN del VIH-1.
Los resultados de TI/PCR esperados para los controles ViroSeq son:
3. Prepare la placa CENTRI•SEP 96.
a. Apile la placa CENTRI•SEP 96 sobre una MicroAmp® Optical 96-Well Control positivo/positivo bajo Control negativo
Reaction Plate (placa óptica de 96 pocillos para reacción MicroAmp®)
Valor esperado > 40 ng/5 μL (control Valor esperado 0 ng
y una las dos placas y una base con cinta adhesiva. positivo sin diluir)
b. Centrifugue la placa a 700 x g durante 2 minutos para empacar la > 20 ng/5 μL (control
columna. positivo bajo)
c. Retire la cinta adhesiva y separe las placas. Si… Haga lo siguiente… Si… Haga lo siguiente…
d. Deseche el líquido sobrante en la placa de lavado agitándola la intensidad de la el análisis no es válido. hay cualquier banda se ha producido
enérgicamente. banda es: Repita la prueba. presente en el gel de contaminación entre las
e. Lave la MicroAmp® Optical 96-Well Reaction Plate (placa óptica de • Control positivo agarosa muestras.
96 pocillos para reacción MicroAmp®) y guárdela para utilizarla como sin diluir: • Ninguno de los
placa de lavado. < 40 ng resultados de las
• Control positivo muestras es válido
bajo: • Repita desde «A.
< 20 ng Preparación de las
4. Coloque una placa de recogida de 96 pocillos en una base de 96 pocillos muestras» hasta
y apile sobre ella la placa CENTRI•SEP 96. «D1. Purificación
y cuantificación
de los productos
5. Una las placas a la base de 96 pocillos con cinta adhesiva, asegurándose de de la PCR».
alinear los índices alfanuméricos de todas las placas. todas las demás se ha producido un fallo
reacciones de las del sistema.
muestras han fallado • Repita todas las
6. Cargue las reacciones de secuenciación. Con una pipeta multicanal, (menos de 20 ng/5 μL). muestras y los
transfiera los 20 μL de las reacciones de secuenciación a cada pocillo de la controles
placa CENTRI•SEP 96.
se ha repetido el fallo póngase en contacto con
• Coloque con cuidado todas las muestras en el centro de los lechos de gel. el servicio técnico de
No coloque las muestras en el lateral de los pocillos. Abbott Molecular
• No toque el lecho de gel con las puntas de la pipeta.
de series analíticas A
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
C
F
RI
D
O
L
3100-Avant Genetic
W
A
S E
S
F
Analyzers (Analizadores
G
: Una serie
Runanalítica en el 3100-Avant Genetic Analyzer
: Una serie
Single Runanalítica
on 3100enGenetic
el 3100Analyzer
Genetic Analyzer
(16 capillary array)
(Analizador genético 3100) con matriz de 16 capilares
3100 y 3100-Avant) • Asegúrese de que el instrumento esté calibrado antes de proceder con
el análisis. Consulte la sección 6: Mantenimiento y calibración de los
analizadores ABI PRISM ® 3100 y 3100-Avant Genetic Analyzers
Contenido: (Analizadores genéticos ABI PRISM® 3100 y 3100-Avant).
Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16 • Si desea ver las ilustraciones y diagramas que explican cómo llevar a cabo una
tarea específica en el ABI PRISM ® 3100 Genetic Analyzer (Analizador genético
Material necesario . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16 ABI PRISM® 3100), consulte el ABI PRISM ® 3100 Genetic Analyzer User Guide
Protocolo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17 (Guía del usuario del analizador genético ABI PRISM® 3100), (PN 4334785).
• Si desea ver las ilustraciones y diagramas que explican cómo llevar a cabo una
tarea específica en el ABI PRISM ® 3100-Avant Genetic Analyzer (Analizador
genético ABI PRISM® 3100-Avant), consulte el ABI PRISM ® 3100-Avant Genetic
Introducción Analyzer User Guide (Guía del usuario del analizador genético ABI PRISM®
3100-Avant), (PN 4333549).
El ViroSeq™ HIV-1 Genotyping System v2.0 está aprobado para uso diagnóstico
in vitro con el programa ViroSeq® HIV-1 Genotyping System Software v2.8
en los analizadores ABI PRISM ® 3100 Genetic Analyzer (Analizador genético
ABI PRISM® 3100) y ABI PRISM ® 3100-Avant Genetic Analyzer (Analizador Material necesario
genético ABI PRISM® 3100-Avant). Ambos instrumentos son plataformas de
electroforesis capilar con fluorescencia, totalmente automatizadas, que analizan
simultáneamente las muestras de un mismo análisis. Tal como se resume a Artículo ABI
continuación, las diferencias principales entre las dos plataformas son el número
de placas de 96 pocillos que es posible cargar en el instrumento y el número de ®
ABI PRISM 3100 Genetic ®
ABI PRISM 3100 Genetic 3100-01
capilares de la matriz de capilares. Analyzer (Analizador genético Analyzer (Analizador genético ¡IMPORTANTE! No debe
ABI PRISM® 3100) con: ABI PRISM® 3100) con: descargarse software de Internet
Nota. El número de capilares en la matriz de capilares del instrumento determina • Data Collection Software • Data Collection Software para este uso específico.
el tamaño del análisis. v.1.0.1 (software de v.1.1 (software de recogida
recogida de datos v.1.0.1) de datos v.1.1)
3100-Avant Genetic Analyzer 3100 Genetic Analyzer • Versión del firmware • Versión del firmware
Parámetro (Analizador genético (Analizador genético 6286100-04 6286150-01
3100-Avant) 3100) • PC con: • PC con:
– Microsoft® Windows – Microsoft® Windows
Número de placas de 96 pocillos 1 2 NT® v.4.0 NT® v.4.0, Service
– Procesador Intel® Pack 5 o 6a
Número de capilares en la matriz 4 16 Pentium® III a – Procesador Intel®
550 MHz Pentium® IV a 2 GHz
Número de series analíticas por placa 24 6 – 256 MB de RAM – 1 GB de RAM
de 96 pocillos – Disco duro de 18 GB – 2 x discos duros de
• Kit de limpieza del bloque 36 GB
de polímero • Kit de limpieza del bloque
de polímero
Juntos, estos parámetros definen el rendimiento del instrumento y permiten a cada
centro determinar la configuración del sistema más adecuada para el volumen de ABI PRISM ® 3100-Avant Genetic Analyzer (Analizador genético 3100-AVANT
secuenciación actual y futuro. ABI PRISM® 3100-Avant) con: ¡IMPORTANTE! No debe
• Data Collection Software v.1.0 (software de recogida de descargarse software de Internet
datos v.1.0) para este uso específico.
Mapa de la placa de 96 pocillos •
•
Versión del firmware 6278000-01 ó 6278050-01
PC con:
– Microsoft® Windows NT® v.4.0, Service Pack 6 o 6a
En el 3100 Genetic Analyzer (Analizador genético 3100), cada serie analítica está – Procesador Intel® Pentium® IV a 2 GHz
compuesta por las inyecciones de los 16 pocillos de dos columnas consecutivas de – 1 GB de RAM
la placa, empezando con la columna que contiene el pocillo A1 (es decir, del pocillo – 2 x discos duros de 36 GB
A1 hasta el H2, del pocillo A3 hasta el H4, etc.). Esto significa que para una placa • Kit de limpieza del bloque de polímero
completa, se necesitan seis series analíticas para inyectar los 96 pocillos. ABI PRISM ® Sequencing Analysis Software v.3.7 para el 4317380
En el 3100-Avant Genetic Analyzer (Analizador genético 3100-Avant), cada serie ordenador con Windows NT® Si necesita licencias adicionales,
utilice 4310990 y especifique la
analítica está compuesta por las inyecciones de 4 pocillos consecutivos de una v.3.7
columna de la placa, comenzando por la columna que contiene el pocillo A1 (es ¡IMPORTANTE! No descargue
decir, del pocillo A1 hasta el D1, del E1 hasta el H1, del A2 hasta el D2, etc.). Es software de Internet para este uso
decir, se necesitan cuatro series analíticas para inyectar 16 pocillos y 24 series para específico.
inyectar una placa completa de 96 pocillos.
4. Asegúrese de que la luz verde de estado esté encendida y sin parpadear antes
Protocolo de continuar.
Nota. Si no se enciende la luz verde, inicie el software de recogida de datos
y consulte el registro de sucesos. La ruta de acceso al registro de sucesos es:
Preparación para la detección de secuencias D:\AppliedBio\3100\Data Collection
o
automatizada D:\AppliedBio\3100-Avant\Data Collection
PELIGRO QUÍMICO. El polímero POP-6 causa irritación en los 3. Haga clic en OK (Aceptar). Haga clic en OK (Aceptar).
ojos, la piel y el aparato respiratorio. Utilice protección ocular, guantes y
ropa protectora apropiados. 4. Seleccione la ficha Plate View (Vista Seleccione la ficha Plate View (Vista
de la placa) y haga clic en New de la placa) y haga clic en New
2. Asegúrese de que hay suficiente polímero POP-6 para el análisis (1,5 mL (Nuevo), o seleccione Tools > Plate (Nuevo), o seleccione Tools > Plate
para una placa de 96 pocillos) y añada polímero si es necesario. Editor (Herramientas > Editor de Editor (Herramientas > Editor de
placas). placas).
Nota. Cambie el polímero si lleva en el instrumento más de 7 días. No
utilice un polímero que haya caducado o que contenga precipitaciones.
5. En el cuadro de diálogo Plate Editor En el cuadro de diálogo Plate Editor
(Editor de placas) que se abre: (Editor de placas) que se abre:
3. Rellene o cambie los depósitos de tampón y de agua antes de cada análisis. • Escriba el nombre de la placa • Escriba el nombre de la placa
• Depósito del ánodo. Llene hasta la línea de llenado con una nueva • Especifique la aplicación • Especifique la aplicación
solución tampón 1X con EDTA del analizador genético (9 mL). Sequencing (Secuenciación) Sequencing (Secuenciación)
• Depósito del cátodo. Llene hasta la línea de llenado con una nueva • Especifique el tipo de placa de • Especifique el tipo de placa
solución tampón 1X con EDTA del analizador genético (16 mL). 96-Well (96 pocillos) 96-Well (96 pocillos)
• Depósitos de agua. Llene hasta la línea de llenado con agua fresca
desionizada (16 mL cada uno). ¡IMPORTANTE! Utilice ¡IMPORTANTE! Utilice
únicamente letras y números, o los únicamente letras y números, o los
símbolos que se indican a símbolos que se indican a
4. Compruebe que no haya burbujas en los canales del bloque de polímero. continuación. No utilice espacios. continuación. No utilice espacios.
Si hay burbujas, presione la jeringa hasta eliminarlas. -_(){}#.+ -_(){}#.+
Contiene formamida.
Nota. Para facilitar la introducción de texto, seleccione la configuración
apropiada para la primera muestra y, a continuación, haga clic en el R 61 Riesgo durante el embarazo de efectos adversos para el feto.
encabezado de la columna para seleccionar toda la columna. Después, en R 36/38 Irrita los ojos y la piel.
el menú Edit (Edición), utilice el comando Fill Down (Rellenar) o pulse S 53 Evítese la exposición – recábense instrucciones especiales antes del uso.
Ctrl + D. S 24/25 Evítese el contacto con los ojos y la piel.
S 35 Elimínense los residuos del producto y sus recipientes con todas las
3. Compruebe que el registro de la placa sea correcto y haga clic en OK precauciones posibles.
(Aceptar) para volver al menú principal. S 36/37/39 Úsense indumentaria y guantes adecuados, y protección para los
ojos/la cara.
S 45 En caso de accidente o malestar, acúdase inmediatamente al médico
Preparación de reacciones de secuenciación (si es posible, muéstresele la etiqueta).
Nota. Las muestras resuspendidas en formamida Hi-Di son estables a
purificadas para el análisis en el 3100 Genetic temperatura ambiente durante un máximo de 35 horas. No deje estas
Analyzer (Analizador genético 3100) muestras a temperatura ambiente durante más tiempo.
Nota. Las instrucciones para preparar reacciones de secuenciación purificadas para 3. Agite en el vórtex durante 10 a 15 segundos.
el análisis en el 3100-Avant Genetic Analyzer (Analizador genético 3100-Avant) se
describen en la siguiente sección.
12. Centrifugue la placa entre 30 y 40 segundos a 2.000 x g para que el líquido se No finalizado Volverá a la tabla Pending Plate Records (Registros de placa
acumule en el fondo de la placa. pendientes) y el color del indicador de posición de la placa
cambiará de nuevo a amarillo.
Nota. No es necesario desnaturalizar las muestras con calor.
1. Seleccione Edit > Preferences > Sample Manager Defaults (Edición > 6. Haga clic en Start (Inicio).
Preferencias > Configuración predeterminada del administrador de muestras).
7. Después del análisis, compruebe si aparece un cuadro verde para cada
2. Seleccione el Basecaller (Identificador de bases) apropiado en la lista muestra en la columna A.
desplegable Basecaller (Identificador de bases):
¡IMPORTANTE! Si alguna muestra tiene un cuadro rojo, revise la
Para el programa 3100 Data Collection software v.1.0.1 (software de recogida configuración y analice de nuevo los datos.
de datos del analizador 3100 v.1.0.1), seleccione: 3100SR
Para el programa 3100 Data Collection software v.1.1 (software de recogida de
datos del analizador 3100 v.1.1), seleccione: 3100POP6SR Adición de los archivos de muestras
Para el programa 3100-Avant Data Collection software v.1.0 (software
de recogida de datos del analizador 3100-Avant v.1.0), seleccione:
3100APOP6SR 1. Haga clic en Add files (Añadir archivos) en la ventana Sample Manager
(Administrador de muestras) o seleccione Manager > Add Files
(Administrador > Añadir archivos).
La parte superior del cuadro de diálogo que se abre es similar a un cuadro
Nota. El analizador 3100 o 3100-Avant Genetic Analyzer (Analizador genético de diálogo de directorio típico, pero solo muestra los nombres de las
3100 o 3100-Avant) está listo para iniciar el análisis de la secuencia.
carpetas y los archivos de muestras.
Uso de la ventana Sample Manager (Administrador 2. En el cuadro de lista superior, localice y abra la carpeta que contiene los
de muestras) archivos que desea añadir a Sample Manager (Administrador de
muestras).
La ventana Sample Manager (Administrador de muestras) permite seleccionar una
lista de los archivos de muestras que procesará el programa Sequencing Analysis
(Análisis de la secuenciación) y elegir los valores de varios parámetros del análisis. 3. Añada los archivos que desee de Sample Manager (Administrador de
muestras) a la lista Sample Files (Archivos de muestras) de la parte
inferior del cuadro de diálogo.
1. Para abrir la ventana, seleccione Window > Show Sample Manager
(Ventana > Mostrar administrador de muestras). Para añadir… Entonces…
2. Para cerrar la ventana, seleccione Window > Hide Sample Manager Un solo archivo a la lista Seleccione el archivo y haga clic en Add (Añadir),
(Ventana > Ocultar administrador de muestras). o haga doble clic en el nombre del archivo.
Todos los archivos a la lista Haga clic en Add All (Añadir todos).
Uso del programa Sequencing Analysis (Análisis de
la secuenciación) Algunos archivos a la lista Añádalos individualmente o bien, haga clic en
Add All (Añadir todos) y utilice después el botón
Remove (Eliminar) para quitar los archivos que no
desee añadir a la lista.
1. Cuando finalice el análisis, inicie el programa Sequencing Analysis
(Análisis de la secuenciación).
2. Añada todos los archivos de las carpetas Run (Análisis) a Sample Manager 4. Cuando todos los archivos deseados estén en las listas de la parte inferior,
(Administrador de muestras). haga clic en Finish (Finalizar) para cerrar el cuadro de diálogo y añadir
los archivos a Sample Manager (Administrador de muestras).
3. Seleccione la configuración siguiente para cada muestra:
Puede eliminar un archivo de muestras de la ventana Sample Manager
Para el programa 3100 Data Collection
software v.1.0.1 (software de recogida de (Administrador de muestras) en cualquier momento, excepto cuando el programa
datos del analizador 3100 v.1.0.1): esté procesando ese archivo. También puede cambiar el orden en el que aparecen los
Basecaller-3100SR archivos de muestras en la ventana Sample Manager (Administrador de muestras).
Para el programa 3100 Data Collection
Basecaller (Identificador de bases) software v.1.1 (software de recogida de datos
del analizador 3100 v.1.1): Eliminación de un archivo
Basecaller-3100POP6SR
Para el programa 3100-Avant Data Collection
software v.1.0 (software de recogida de datos 1. Haga clic en el nombre del archivo en la columna Sample File Name
del analizador 3100-Avant v.1.0):
Basecaller-3100APOP6SR (Nombre del archivo de muestras).
Aparecerá resaltada la fila completa.
Spacing (Separación) Definido por el instrumento
Basecaller Setting (Configuración del HIV580 2. Pulse la tecla Supr o bien, haga clic en Remove (Eliminar) en la parte
identificador de bases)
superior de la ventana o seleccione Manager > Remove Files
Peak 1 Location (Ubicación del pico 1) Establecido por el software (Administrador > Eliminar archivos).
Start Point (Punto de inicio) Establecido por el software
El programa Sequencing Analysis (Análisis de la secuenciación) eliminará
el archivo de la lista.
Stop Point (Punto de parada) Establecido por el software
DyeSet/Primer (Conjunto de DT3100POP6{BD}v2
colorantes/Cebador)
Factura settings (Configuración de Esta función no se utiliza con el ensayo
factura) ViroSeq
Reordenación de archivos Revise o corrija los Stop Compruebe que los Stop Points (Puntos de parada) para un
Points (Puntos de parada) subconjunto de muestras estén en el punto de 580 bases.
En caso contrario, asegúrese de seleccionar HIV580.
1. Haga clic en el nombre del archivo en la columna Sample File Name
(Nombre del archivo de muestras). Nombres de las muestras Compruebe que los nombres de los archivos de muestras sean
correctos. Utilice el mismo nombre de muestra para todas las
Aparecerá resaltada la fila completa. muestras de un proyecto. El nombre de los archivos de
muestras:
• Debe tener menos de 59 caracteres
2. Mientras mantiene pulsada la tecla Alt, arrastre el nombre del archivo a una • Debe incluir toda la información necesaria para identificar
nueva ubicación en la columna Sample File Name (Nombre del archivo de una muestra.
muestras). • Debe tener dos subrayados consecutivos para separar el
nombre de la muestra y el cebador de la secuencia.
El software ViroSeq necesita este doble subrayado para
compilar y crear proyectos.
Impresión de los datos de un análisis ¡IMPORTANTE! La información que aparece a la izquierda
del doble subrayado debe ser idéntica para las seis o siete
secuencias de una muestra. La información que aparece a la
derecha del doble subrayado es exclusiva de cada secuencia y
1. Si desea cambiar temporalmente la orientación de la página, el tipo de papel, debe incluir la letra del cebador.
el número de paneles/página, etc., seleccione File > Print Setup (Archivo >
Configuración de impresión) para abrir un cuadro de diálogo Print Setup Archivo DyeSet/Primer El archivo DyeSet/Primer (Conjunto de colorantes/Cebador)
(Configuración de impresión) especial. (Conjunto de correcto para el análisis.
colorantes/Cebador)
2. Ajuste la configuración según sea necesario. Después, haga clic en OK Intensidad suficiente de Revise las cifras de intensidad de la señal para cada base.
(Aceptar) para cerrar el cuadro de diálogo. la señal Si el valor total de intensidad de la señal del A, C, G y T es
inferior a 400, inspeccione los datos sin procesar y los datos
analizados, y deseche los datos con ruido.
3. Abra el archivo que desee imprimir.
¡IMPORTANTE! Es necesario que se hayan secuenciado correctamente seis de los
4. Seleccione File > Print (Archivo > Imprimir) para abrir el cuadro de diálogo siete segmentos para poder continuar con el análisis en el software ViroSeq. Uno de
Printing Options (Opciones de impresión). los segmentos faltantes puede ser A o D.
con el ViroSeq® HIV-1 Secuencia de referencia La secuencia fija que se utiliza para todas las comparaciones. La
secuencia de referencia del ViroSeq se basa en el HXB-2 (GenBank
K03455).
Archivo de la muestra Un archivo que contiene todos los datos de secuencia de una muestra,
ASCII Acrónimo de American Standard Code for Information Interchange Requisitos del sistema Requisitos del sistema Requisitos del sistema
(código normalizado estadounidense para el intercambio de operativo: operativo: operativo:
información). Un formato de texto simple que muchas plataformas
y ordenadores reconocen. • Microsoft® Windows® • Microsoft® Windows® XP, • Microsoft® Windows® XP,
Identificación de bases La identidad del nucleótido asignado a un pico de señal de un 2000, Service Pack 4 Service Pack 2 Service Pack 2
electroferograma.
Plataforma: Plataforma: Plataforma:
Secuencia consensuada Una secuencia obtenida a partir de varias secuencias ya alineadas.
• Procesador Intel® • Procesador Intel® • Procesador Intel® Core™
Cursor de edición Un elemento gráfico que resalta un solo nucleótido de la secuencia Pentium® IV (un solo Pentium® M (un solo 2 Duo (doble núcleo)
consensuada y que se convierte en la diana de la operación de edición. núcleo) núcleo)
Electroferograma Las señales procesadas de la fluorescencia de los colorantes de
secuenciación, calculadas por el software de recogida y análisis de datos • 2,0 GHz o más • 1,86 GHz o más • 2,4 GHz o más
suministrado con el instrumento de secuenciación. • 1 GB de RAM o más • 512 MB de RAM o más • 2 GB de RAM o más
FASTA Un archivo de texto con formato ASCII que contiene información del
nombre del archivo y una secuencia. • Disco duro de 40 GB o más • Disco duro de 40 GB o más • Disco duro de 40 GB o más
IUB International Union of Biochemists (Unión internacional de • Teclado, ratón • Teclado, ratón • Teclado, ratón
bioquímicos)
• Monitor que admita una • Monitor que admita una • Monitor que admita una
Java Un lenguaje de programación diseñado para generar aplicaciones que resolución de pantalla de resolución de pantalla de resolución de pantalla de
puedan ejecutarse en sistemas operativos distintos sin necesidad de 1.280 x 1.024 1.280 x 1.024 1.440 x 900
modificaciones.
Barra de navegación Elemento gráfico que muestra las posiciones de interés (POI) y permite
desplazarse a los datos correspondientes.
POI Acrónimo de Position of Interest (posición de interés). La posición de un
nucleótido que debe ser investigado por el usuario.
Identificación del cebador La correspondencia de una secuencia con un cebador conocido.
Proyecto La entidad de software que comprende los datos, el historial de
ediciones, las posiciones de recorte, las secuencias ensambladas, etc.,
asociadas al procesamiento de los segmentos de secuencias de una sola
muestra de VIH-1.
Antes de instalar o desinstalar el ViroSeq® software v2.8, debe iniciar una sesión en 1. Haga doble clic en el icono de ViroSeq v2.8 en el escritorio.
Windows utilizando una cuenta con privilegios de administrador. No intente instalar
o desinstalar el software ViroSeq desde una cuenta de usuario estándar o restringido. ADVERTENCIA: No abra más de una copia de la aplicación ViroSeq
software v2.8 a la vez.
Para instalar el software en un ordenador con 2. Inicie el software ViroSeq desde el menú Start (Inicio).
Windows 2000 o XP a. Haga clic en el menú Start (Inicio).
b. Seleccione Programs > ViroSeq v2.8 > ViroSeq v2.8 (Programas >
ViroSeq v2.8 > ViroSeq v2.8).
Se necesitan privilegios de administrador para que la instalación se ejecute
correctamente.
3. Inicie el software desde C:\ViroSeq v2.8.
1. Cierre todas las demás aplicaciones del escritorio. a. Haga clic en el directorio C:\ViroSeq v2.8.
b. Haga doble clic en el icono de ViroSeq.
2. Introduzca el ViroSeq software v2.8 CD (CD del software ViroSeq v.2.8) en
la unidad de CD.
Inicio de una sesión en el software
3. El instalador debe iniciarse automáticamente. Si no lo hace, haga lo
siguiente: Por motivos de seguridad, el programa requiere que cada usuario inicie una sesión.
a. Haga doble clic en My Computer (Mi PC) en el escritorio. Al arrancar el programa aparece la ventana de diálogo User Login (Inicio de sesión
b. Con el botón derecho del ratón, seleccione la unidad que contenga el CD. de usuario). Introduzca un nombre de usuario y una contraseña válidos y a
c. Seleccione Explore (Explorar). continuación haga clic en OK (Aceptar). El nombre de usuario, al igual que la fecha
d. En Windows Explorer (Explorador de Windows), abra la carpeta del y la hora del sistema, se registran en la ventana History (Historial). Consulte
Software Error Messages (Mensajes de error del software).
software ViroSeq. Haga doble clic en Setup.exe.
Si va a iniciar una sesión por primera vez, el nombre de usuario predeterminado
es Admin y la contraseña es hiv1.
4. Acepte las condiciones del License Agreement (Contrato de licencia).
2. En el panel User Information (Información del usuario), escriba el nuevo 3. Seleccione un archivo de datos de secuencia y haga clic en Open (Abrir).
nombre de usuario que desee añadir en el cuadro User Name (Nombre de El software ensambla y alinea los datos para generar una secuencia
usuario). consensuada a partir de los archivos .ab1 encontrados en la carpeta QA10.
Se abrirán las ventanas Navigation (Navegación) y View*Edit
3. En el cuadro Employee ID (ID del empleado), escriba el nombre o el (Ver*Edición), que muestran el proyecto compilado final para QA10.
número de identificación del empleado.
4. Seleccione File > Generate Resistance Report (Archivo > Generar informe
4. Escriba una contraseña en el cuadro New Password (Contraseña nueva) sobre resistencia) para obtener una vista preliminar de las mutaciones de
y en el cuadro Re-Enter Password (Reintroducir contraseña). resistencia farmacológica detalladas en la página 1 del informe Antiretroviral
Drug Resistance Report (Informe sobre resistencia a antirretrovirales).
5. Haga clic en Add User (Añadir usuario).
El nuevo usuario aparecerá en el panel Registered Users (Usuarios Compruebe que las mutaciones de resistencia farmacológica resultantes coincidan
registrados). con la información de la tabla siguiente:
En raras ocasiones, el segmento D puede estar alineado en una 6 Casilla de verificación Si está seleccionada, hace que se pase automáticamente
Auto jump on edits a la siguiente POI después de cada edición.
posición incorrecta. Después de compilar el proyecto, compruebe la posición del (Saltar automáticamente
segmento D. Debe cubrir por completo el gen de la proteasa y el principio del después de la edición)
gen de la TI. Si el segmento D no está colocado de la forma especificada, vuelva
a compilar el proyecto sin el segmento D. 7 Casilla de verificación Se utiliza después de editar la posición actual; pasa a la
Reverse jump siguiente POI hacia la izquierda.
(Retroceder) Esta casilla solo está activa cuando se selecciona la casilla
Acerca de la ventana View*Edit (Ver*Edición) de verificación Auto jump on edits (Saltar
automáticamente después de la edición).
11 Panel de etiquetas Etiqueta cada línea del panel de secuencias. También indica
el nombre del cebador y la dirección de la polimerización
para cada secuencia.
20 Cuadro de información de Explica por qué se ha identificado una posición como POI.
posición
Códigos IUB
Códigos IUB
Códigos de los aminoácidos Open Project (Abrir Ctrl+O Abre la ventana Project Status (Estado del
proyecto) proyecto).
Seleccione un proyecto de la lista o bien, haciendo
Aminoácido Código de tres letras Código de una letra clic en el botón Find (Buscar), puede seleccionar
y abrir un proyecto ViroSeq ya compilado.
Alanina Ala A
Save (Guardar) Ctrl+S Guarda el proyecto abierto con todas las ediciones
realizadas.
Arginina Arg R
Aspartato o ácido aspártico Asp D Generate Resistance Ctrl+G Permite ver e imprimir el informe sobre
Report (Generar informe resistencia.
sobre resistencia)
Cisteína Cys C
Leucina Leu L
Lisina Lys K
Metionina Met M
Opciones del menú Edit (Edición)
Fenilalanina Phe F
Método abreviado
Prolina Pro P Elemento de menú Descripción
de teclado
Serina Ser S Toggle Position Cursor Ctrl+T Activa o desactiva la línea de posición del cursor.
(Alternar cursor de
Treonina Thr T posición)
Triptófano Trp W Edit Report Information Ctrl+E Abre el cuadro de diálogo Edit Report
(Editar la información Information (Editar la información del informe)
del informe) donde se puede introducir la información del
Tirosina Tyr Y paciente, el laboratorio y el técnico para el
encabezado del informe final.
Valina Val V
Método abreviado
Elemento de menú Descripción
de teclado
Una vez que el software ViroSeq ha compilado un proyecto, es necesario
Change Passwords — Al iniciar una sesión como administrador, abre revisar y verificar las identificaciones de bases de las POI en la secuencia
(Cambiar contraseñas) el cuadro de diálogo Administrator Access consensuada. Se pueden aceptar o cambiar las identificaciones de bases en los
(Acceso de administrador) donde puede cambiar puntos en los que el software detecta diferencias entre la secuencia consensuada y la
las contraseñas y realizar otras funciones secuencia de referencia. El usuario decide si la identificación de bases propuesta está
administrativas.
justificada, analizando los electroferogramas. Por ejemplo, los blobs de colorante al
Al iniciar una sesión como usuario, abre el inicio de una secuencia o la repetición reiterada de la misma base pueden hacer que
cuadro de diálogo User Access (Acceso de el software interprete incorrectamente la secuencia y sugiera una variación cuando
usuario) donde el usuario puede cambiar su
contraseña. en realidad no existe ninguna.
Elemento de menú
Método abreviado
Descripción Códigos de color de las bases
de teclado
Base Color
History (Historial) — Abre el registro History (Historial).
Adenina Verde
Menú Help (Ayuda)
Citosina Azul
Guanina Negro
Timina Rojo
Opciones del menú Help (Ayuda)
Bases mixtas Rosa
Método abreviado
Elemento de menú Descripción
de teclado
Establecimiento de las opciones de navegación
About ViroSeq (Acerca — Muestra la información del producto.
de ViroSeq) La ventana Navigation Options (Opciones de navegación) se abre al hacer clic en el
botón Navigation Options en la ventana View*Edit (Ver*Edición).
Show saved edits (Mostrar ediciones Localiza las bases editadas manualmente y guardadas Edición de un proyecto
guardadas) en el proyecto.
Insertions (Inserciones) Localiza las bases adicionales que no forman parte de 1. Haga clic en Navigation Options (Opciones de navegación) para abrir la
la secuencia de referencia. ventana Navigation Options (Opciones de navegación).
Nota. Si desea obtener información sobre la forma en que
el software maneja las inserciones, consulte Mutaciones 2. Asegúrese de que estén seleccionadas todas las casillas de verificación de las
por inserción.
opciones de la ventana Navigation Options (Opciones de navegación).
Ejemplos
Ejemplo de datos de secuencia adecuados
El siguiente ejemplo muestra un nivel muy bajo de fondo y de picos secundarios. Para editar una identificación de bases en esta situación (la segunda posición del
codón 20), siga la directriz 1 para identificar la base de forma correcta, exacta y
coherente. La identificación correcta de la base en este ejemplo es W.
Inaceptable
A continuación se muestra un ejemplo de un pico de mezcla que está presente en
ambos sentidos, pero no se puede identificar porque es del mismo tamaño que los
picos del ruido de fondo próximos. Los propios picos son ruido.
Inaceptable
Inaceptable
A continuación se muestra un ejemplo de una mezcla (la primera posición del
codón 32) que no se puede identificar. Se trata de una mezcla falsa debida a un blob A continuación se muestra un ejemplo de una mezcla falsa (la tercera posición
del colorante al inicio del cebador B. del codón 254) debida al alto nivel de ruido de fondo continuo. La identificación
correcta de la base es C.
Secuencia
recortada
Ejemplo de recortado
1. Realice la modificación.
a. Haga clic en el botón de la paleta Editing (Edición) que corresponda
al tipo de mutación que desea editar o bien, introduzca la letra de
identificación de la base apropiada (código IUB) para la POI utilizando
el teclado.
b. Use la barra espaciadora para confirmar la edición.
Virus 1:
(sin inserción)
GAC AGT ACT AAA TGG AGA AAA Informe sobre resistencia
a antirretrovirales
Virus 2: GAC AGT GGG ACT AAA TGG AGA
(con inserción)
1. Seleccione Edit > Edit Report Information (Edición > Editar la Información del laboratorio y de la muestra
información del informe). Esta parte del informe está definida por el usuario. En el menú Edit (Edición),
la opción Edit Report Information (Editar la información del informe) abre un
2. En la ventana Edit Report Information (Editar la información del cuadro de diálogo en el que se puede introducir información.
informe), escriba la información que desea que aparezca como
predeterminada en todos los informes de resistencia.
Acerca de las mutaciones y la resistencia
3. Haga clic en Set As Default (Establecer como predeterminado) y Se sabe que la aparición de resistencia a un fármaco es un proceso continuo en el que
después, en OK (Aceptar) para cerrar el cuadro de diálogo. algunas mutaciones confieren resistencia de bajo nivel, otras confieren resistencia
Nota. Para modificar la información predeterminada, escriba los cambios de alto nivel y las combinaciones de las mismas producen efectos aditivos o
y haga clic en Set As Default (Establecer como predeterminado) y en OK sinérgicos.27,29
(Aceptar). La interacción entre las mutaciones que confieren resistencia a un fármaco está bien
definida para algunos fármacos, pero no para todos. Se necesitan más estudios para
dilucidar la aportación exacta de cada combinación de mutaciones en la aparición de
Introducción de la información específica de la muestra una resistencia de alto nivel. En los casos en los que los datos no indican claramente
una resistencia de alto nivel, las mutaciones detectadas pueden indicar una
resistencia potencial. Estas mutaciones se incluyen en el informe como marcadores
1. En el menú Edit (Edición), seleccione Edit Report Information (Editar la de Possible Resistance (Posible resistencia).
información del informe). En algunos casos, las mutaciones pueden causar una hipersensibilidad a un fármaco
determinado.
2. En la ventana Edit Report Information (Editar la información del informe),
escriba la información del técnico que realizó el ensayo, del paciente y de la
muestra, así como los comentarios pertinentes. Resistencia a antirretrovirales contra el VIH-1
Nota. Las entradas predeterminadas en la ventana Edit Report Information Se indica la resistencia a tres clases de fármacos antirretrovirales:
(Editar la información del informe) son una serie de cinco guiones. Si el
usuario no personaliza la ventana, se incluirá automáticamente esta serie de • Inhibidores nucleósidos de la transcriptasa inversa
guiones en el informe de resistencia farmacológica, el archivo FASTA y el • Inhibidores no nucleósidos de la transcriptasa inversa
archivo XML. • Inhibidores de la proteasa
Evidence of Resistance (las pruebas de la resistencia) se indican en la columna del
3. Haga clic en OK (Aceptar) para cerrar el cuadro de diálogo. extremo derecho de la página 1 del informe. Se indican las pruebas para cada
fármaco de una misma clase en función de las mutaciones encontradas en la muestra.
4. Haga clic en Save (Guardar) para guardar los cambios. La presencia de una mutación o combinación de mutaciones específica da lugar a
uno de los siguientes resultados:
• Resistance (Resistencia) indica que existen pruebas claras de resistencia.
Nota. Al modificar la información del informe, los cambios deben guardarse para • Possible Resistance (Posible resistencia) indica que existen indicios de que
que surtan efecto. podría existir resistencia. Se trata de mutaciones o combinaciones que no
cumplen los criterios necesarios para clasificarse como Resistance (Resistencia),
pero que podrían indicar resistencia.
Acceso al informe • None (Ninguna) indica que no hay pruebas suficientes que indiquen resistencia.
.
1. Seleccione File > Generate Resistance Report (Archivo > Generar Informe Grados de limitación de la responsabilidad
sobre resistencia).
Utilice los botones de la parte superior de la ventana para reducir o ampliar la Los niveles de Evidence of Resistance (Pruebas de la resistencia) se etiquetan con
vista, o para cambiar de página en un informe con varias páginas. ninguno, uno, dos o tres asteriscos. Los significados de estos asteriscos se describen
en la tabla siguiente:
2. Seleccione el icono Save (Guardar) para guardar el informe generado como
un archivo PDF (Portable Document Format). Etiqueta de Significado en términos
Limitación de la
limitación de la responsabilidad de los estudios analíticos
responsabilidad y clínicos
3. Se abrirá el cuadro de diálogo Save Report (Guardar informe). Seleccione el
directorio en el que se guardará el archivo PDF del informe resultante y haga
clic en Save (Guardar). (sin etiqueta) ninguna Todas las mutaciones presentes se
han verificado en estudios clínicos
y analíticos.
≥ 1,0 Resistencia
Notación de las mutaciones en las posiciones de
0,5 a < 1,0 Posible resistencia
esistencia
Las mutaciones se representan mediante convenciones de estilo, color y puntuación < 0,5 Ninguna
que indican su relevancia en la aparición de resistencia farmacológica.
• {llaves rojas en negrita}: mutaciones que confieren, por si mismas, resistencia
viral y dan lugar a un resultado de Resistance (Resistencia). Se utilizaron los siguientes criterios para asignar puntuaciones a mutaciones
• [corchetes azules en cursiva y negrita]: mutaciones que confieren, por si específicas:
mismas, la posibilidad de resistencia viral y dan lugar a un resultado de Possible • Se asignó la puntuación más alta (1,0) a las mutaciones que más contribuyen
Resistance (Posible resistencia). a la aparición de resistencia (por lo general, aquellas que confieren resistencia
• (paréntesis negros): mutaciones que menos contribuyen a la aparición de cuando están presentes como mutaciones únicas). De la misma forma, estas
resistencia. Se necesita más de una de estas mutaciones para un resultado de mutaciones se asociaron también a los mayores aumentos en la IC50
Possible Resistance (Posible resistencia). Esta mutación debe aparecer con (concentración que produce el 50% de inhibición) al introducirlas en cepas
al menos otra mutación para indicar la posibilidad de resistencia viral. naturales (WT) del VIH-1 y se asociaron claramente a la resistencia en varios
• <antilambdas verdes>: esta mutación contrarresta la resistencia. ensayos clínicos.
• Se asignó una puntuación intermedia a las mutaciones con efectos menos
pronunciados, que requieren la presencia de dos o más mutaciones para conferir
Mutaciones adicionales resistencia. Por ejemplo, al considerar la resistencia a la AZT, se asignó una
La sección Additional Mutations (Mutaciones adicionales) del informe identifica los puntuación de 0,625 a la mutación T215F/Y, una puntuación de 0,375 a la
aminoácidos que difieren respecto a la secuencia de referencia (HXB-2, número de mutación M41L y una puntuación de 0,25 a la mutación K70R. La sustitución
acceso K03455) en las posiciones de codón indicadas y que pueden ser útiles como T215F/Y aumenta de 12 a 16 veces la IC50 para la AZT, mientras que las
una determinación inicial del genotipo viral. No se ha establecido la actividad de mutaciones M41L o K70R producen un aumento de 3 a 5 veces. La combinación
estas mutaciones adicionales. Las mutaciones adicionales se especifican para el gen de M41L y K70R da como un resultado un aumento de 9 veces en la IC50.
de la proteasa o para el gen de la transcriptasa inversa. • Se asignaron puntuaciones bajas a las mutaciones con menor efecto en la
aparición de resistencia, pero que se han observado en pacientes tratados con
el fármaco y que tienen un efecto reducido sobre los valores de IC50 en cultivo.
Clave de notación Algunas de estas mutaciones pueden potenciar los efectos de las mutaciones
principales. En algunos casos, la presencia de varias mutaciones en esta
Las páginas tres y cuatro del informe contienen la clave para los colores y la lista de
mutaciones de resistencia del VIH-1 que se utilizan en el algoritmo para determinar categoría, en combinación con mutaciones cuya puntuación es intermedia,
podría producir resistencia.
la resistencia farmacológica.
• Se asignó una puntuación negativa a las mutaciones que aumentan la
sensibilidad a fármacos en función del grado de sensibilidad.
Algoritmo Las tablas de las páginas siguientes muestran, para cada fármaco, las mutaciones
La interpretación se basa en un algoritmo patentado que determina el impacto relevantes para la resistencia al fármaco y la puntuación asignada a cada mutación.
relativo de las mutaciones en los marcos de lectura abiertos de la transcriptasa
inversa y de la proteasa en la aparición de resistencia a antirretrovirales. Las
mutaciones incluidas en el algoritmo se basaron en:
• Mutaciones definidas por la FDA como de utilidad clínica establecida.28
ABC TDF
3TC y FTC
V118I 0,0625
M184I/V −0,2
V179F 0,5
G48V 1,0
Mutación Puntuación
Y181C/I/V 0,5
I84A/C/V 0,5
V82A/F/M/S/T 0,5
L100I 0,25
L90M 0,5
I84A/C/V 0,5
K101E/P 0,25
I54A/L/M/S/T/V 0,25
L90M 0,5
E138K 0,25
G73A/C/S/T 0,25
V32I 0,25
Y188L 0,25
V82A/F/S/T 0,25
M46I/L 0,25
G190C/E/Q/S/T/V 0,25
L10F/I/R/V 0,125
I47A 0,25
M230L 0,25
L24I 0,125
G48V 0,25
A98G 0,125
M46I/L/V 0,125
I54A/L/M/S/T/V 0,25
K103H/N/S/T 0,125
F53L 0,125
N88S 0,25
V106A/M 0,125
A71I/T/V 0,125
L24I 0,125
V179D/E 0,125
I50L −0,125
M46V 0,125
Y188C/H 0,125
L76V −0,125
I47V 0,125
G190A 0,125
F53L 0,125
P225H 0,125
G73A/C/S/T 0,125
F227C/L 0,125
L76V 0,125
N88D/T 0,125
L10F/I/R/V 0,0625
A71I/T/V 0,0625
I50L −0,125
NFV LPV/r
APV/FOS
A71I/T/V 0,0625
V82A 0,0625
I50L/V −0,125
Selected file is invalid (El Se seleccionó un archivo de muestras (ab1) cuando el software
Mensaje Explicación archivo seleccionado no es esperaba un archivo de proyecto (vpr). [File > Open Project +
válido). Find (Archivo > Abrir proyecto + Buscar)]
O bien,
A unique non-blank user name Se hizo clic en el botón Add User (Añadir usuario) de la
must be used. Please select a ventana Administrator Access (Acceso de administrador) y se Se seleccionó un archivo de proyecto (vpr) cuando el software
different user name and try again. intentó crear un usuario que ya existía. esperaba un archivo de muestras (ab1). [File > New
(Debe utilizarse un nombre de Project/File > Open Project + New (Archivo >
Seleccione OK (Aceptar) y escriba un nombre de usuario único. Proyecto/Archivo nuevo > Abrir proyecto + Nuevo)]
usuario exclusivo sin dejar el
campo en blanco. Seleccione un O bien,
usuario diferente e inténtelo de
nuevo.) El tipo de archivo seleccionado en el cuadro de diálogo Open
(Abrir) es incorrecto.
Haga clic en OK (Aceptar) y seleccione el archivo correcto
Current Password incorrect. Se introdujo una contraseña incorrecta o se dejó en blanco el previsto.
Check ‘Caps Lock’ and try again. campo Current Password (Contraseña actual) en la ventana
(Contraseña actual incorrecta. User Access (Acceso de usuario).
Compruebe ‘Bloq mayús’ e Seleccione OK (Aceptar) y escriba correctamente la contraseña Sequence data does not cover Se intentó generar un informe de fármacos, un archivo FASTA
inténtelo de nuevo.) actual. critical portions of the reference y/o un informe XML con una secuencia de referencia que no
sequence. ViroSeq will not cubre la región situada entre el codón 9 de la proteasa y el
generate output. (Los datos de la codón 320 de la transcriptasa inversa. No se puede generar el
Default Password incorrect. La contraseña predeterminada que aparece en el cuadro de secuencia no cubren las partes informe si no se cubre la región situada entre el codón 9 de la
Check ‘Caps Lock’ and try again. diálogo Change Administrator Password (Cambiar cruciales de la secuencia de proteasa y el codón 320 de la transcriptasa inversa.
(Contraseña predeterminada contraseña del administrador) al iniciar el software por primera referencia. ViroSeq no generará
incorrecta. Compruebe ‘Bloq vez es incorrecta. un resultado.)
mayús’ e inténtelo de nuevo.) Seleccione «OK» (Aceptar) y escriba correctamente la
contraseña predeterminada (hiv1). The file is in use by another Se intentó guardar un informe nuevo con el nombre de un
application. You must close the archivo existente que está abierto en MS Word (o en cualquier
file in that application before otro programa que bloquee el archivo).
New passwords must be the Se introdujo una contraseña nueva válida en el cuadro de ViroSeq can output into that file.
same. Try entering the passwords dialogo Change Administrator Password (Cambiar Seleccione OK (Aceptar), cierre el archivo y después guárdelo
(El archivo está siendo utilizado de nuevo.
again. (Las contraseñas nuevas contraseña del administrador) o User Access (Acceso de por otra aplicación. Cierre el
deben ser iguales. Pruebe a usuario), pero la contraseña de confirmación no coincide. archivo en la otra aplicación para
introducirlas de nuevo.) Seleccione OK (Aceptar) y escriba como contraseña de que ViroSeq pueda guardar datos
confirmación la misma contraseña que introdujo en el campo en él.)
New password (Contraseña nueva).
Unable to assemble files in (No Se intentó crear un proyecto con menos de dos archivos de
Password length should be 6 to La contraseña nueva introducida en el cuadro de diálogo se pueden ensamblar los archivos segmentos con la misma ID de la muestra.
14 characters. Please choose a Change Administrator Password (Cambiar contraseña del de la carpeta): <carpeta> O bien,
longer password and try again. administrador), Administrator Access (Acceso de
(La contraseña debe tener una administrador) o User Access (Acceso de usuario) no tiene una Los archivos de muestras seleccionados en el cuadro de diálogo
longitud de entre 6 y 14 longitud suficiente. Open (Abrir) para ensamblarlos están dañados.
caracteres. Elija una contraseña Seleccione OK (Aceptar) y escriba una contraseña que tenga Seleccione OK (Aceptar) y compruebe que haya dos o más
más larga e inténtelo de nuevo.) entre 6 y 14 caracteres. archivos ab1 no dañados con la misma ID de la muestra en la
carpeta de trabajo.
The passwords entered were not Se introdujo una contraseña nueva válida en el cuadro de
the same. Please enter the exact diálogo Administrator Access (Acceso de administrador), pero Unable to load project (No se El sistema operativo de la plataforma no puede abrir el archivo
same password twice. (Las la contraseña de confirmación no coincide. puede cargar el proyecto): de proyecto (vpr) porque no tiene suficiente memoria o el disco
contraseñas introducidas no son <nombre del archivo> está dañado.
O bien,
iguales. Introduzca la misma O bien,
contraseña exacta dos veces.) Se hizo clic en el botón Add User (Añadir usuario) del cuadro
de diálogo Administrator Access (Acceso de administrador) Se intentó abrir un archivo de proyecto dañado o incompleto.
con un nuevo nombre de usuario válido y una contraseña de Seleccione OK (Aceptar) y compruebe que el archivo vpr no
confirmación que no coincide. esté dañado ni sea de solo lectura.
Seleccione OK (Aceptar) y escriba como contraseña de
confirmación la misma contraseña que introdujo en el campo
New password (Contraseña nueva). ViroSeq detected a deletion, Se intentó generar un informe de fármacos, un archivo FASTA
frame shifting insertion, and/or y/o un informe XML en una secuencia consensuada que tenía
multiple insertions. The software una eliminación, una inserción que desplazaba el marco de
User Name or password El nombre de usuario o la contraseña introducidos en el cuadro has not been validated for such lectura o varias inserciones.
incorrect. Check ‘Caps Lock’ de diálogo User Login (Inicio de sesión de usuario) no son mutations. Output will not be No se puede generar un informe de resistencia farmacológica,
and try again. (Nombre de válidos. created. (ViroSeq detectó una un archivo FASTA ni un informe XML cuando se detecta una
usuario o contraseña incorrectos. Seleccione OK (Aceptar) y escriba correctamente el nombre de eliminación, una inserción que eliminación, una inserción que desplaza el marco de lectura o
Compruebe ‘Bloq mayús’ e usuario y la contraseña. desplaza el marco de lectura y/o varias inserciones en la secuencia.
inténtelo de nuevo.) varias inserciones. El software no
está validado para esas
mutaciones. No se generará
Launch failed. A file is missing Falta un archivo o una carpeta del sistema ViroSeq, o está ningún resultado.)
or damaged. Please re-install the dañado.
software. If the problem persists, Seleccione OK (Aceptar) y vuelva a instalar el software
please contact technical support. ViroSeq. ViroSeq detected that an Se instaló una versión incorrecta de JRE.
(Error al iniciar. Falta un archivo incorrect version of Java Seleccione OK (Aceptar) y copie la carpeta correcta de JRE
o está dañado. Vuelva a instalar Runtime Environment [JRE] is del CD. Inicie el software ViroSeq.
el programa. Si el problema being used. Please refer to
persiste, póngase en contacto installation instructions for Plataforma Windows/versión de JRE
con el servicio de asistencia installing the appropriate JRE. Windows XP y 2000/JRE 1.4.2_10
técnica.) (ViroSeq detectó que se está
utilizando una versión incorrecta
de Java Runtime Environment
One or more “q” or “?”s were Se intentó generar un informe de fármacos, un archivo FASTA [JRE]. Consulte las instrucciones
detected in the consensus y/o un informe XML después de editar bases con «?» (con el de instalación para instalar la
sequence. ViroSeq will not teclado) o «q» (haciendo clic en la paleta Editing [Edición]). versión correcta de JRE.)
generate output. (Se detectó una No se puede generar el informe de resistencia farmacológica, el
o más «q» o «?» en la secuencia archivo FASTA ni el informe XML si se detecta una o más «q»
consensuada. ViroSeq no o «?» en la secuencia. ViroSeq software is not Se intentó instalar ViroSeq v2.8 en un sistema operativo
generará un resultado.) supported on Microsoft NT Windows NT.
operating system. (El sistema
operativo NT de Microsoft no
admite el software ViroSeq).
Gen Mutación
RT E44D, K65N, D67E/G, D67N, T69N, K70E, L74I, V75A/I/M/S/T, A98G, L100I,
K101E/P/Q, K103H/S/T/R, V106M, V108I, Y115F, E138K, Q151L, V179D/E/F,
Y181I/V, Y188H, G190A/C/E/Q/S/T/V, T215C/D/E/F/I/S/Y/V, K219N/R, P225H,
F227L/C, M230L, P236L, K238T, Y318F
Proteasa L10F/V, V11I, L23I, L24I, V32I, L33F, E35G, K43T, M46L/V, I47A/V, I50L, F53L,
I54A/L/M/S/T, Q58E, A71I/T, G73A/C/S/T, T74P, L76V, V82L, N83D, I84A/C,
N88D/S/T, L89V
Valor esperado • Se ensamblan los No utilice un control negativo para determinar el éxito
siete cebadores o el fracaso del genotipado. Los controles negativos,
• No hay mutaciones que no contienen ADN, pueden contribuir a que la
de resistencia muestra falle debido a los efectos eléctricos adversos
farmacológica que tienen los capilares vacíos sobre los instrumentos
• Dos mutaciones de secuenciación que utilizan capilares.
adicionales
– Proteasa V3I
– RT L214F
• No hay bases mixtas
La tabla 1 muestra una lista de mutaciones totalmente verificadas a una T69D* T69N K70E K70R* L74I L74V* V75A V75I
concentración de 2.000 copias de ARN/mL, de acuerdo con el documento Guidance
V75M V75S V75T F77L* A98G L100I K101E K101P
for Industry: Class II Special Controls Guidance Document: In Vitro HIV Drug
Resistance Genotype Assay (Guía para la industria: documento guía sobre controles K101Q K103N* K103H K103R K103S K103T V106A V106M
especiales de clase II: análisis de genotipos de resistencia farmacológica del VIH in
vitro) de la FDA. V108I Y115F F116Y* V118I* E138K Q151L Q151M* V179D
La tabla 2 muestra una lista de mutaciones plenamente verificadas a una V179E V179F Y181C* Y181I Y181V M184I M184V* Y188C
concentración de 1.000 copias de ARN/mL, de acuerdo con el documento Guidance Y188H Y188L G190A G190C G190E G190Q G190S G190T
for Industry: Class II Special Controls Guidance Document: In Vitro HIV Drug
Resistance Genotype Assay (Guía para la industria: documento guía sobre controles G190V L210W* T215C T215D T215E T215F* T215I T215S
especiales de clase II: análisis de genotipos de resistencia farmacológica del VIH in T215V T215Y* K219E* K219N K219R K219Q* P225H F227C
vitro) de la FDA.
F227L M230L P236L K238T Y318F Mutación por inserción en el codón
La tabla 3 muestra una lista de mutaciones que se utilizan en el algoritmo basado 69 (inserción 69)
en reglas del ViroSeq System.
En la proteasa
La tabla 4 muestra una lista de fármacos para los que se evalúa la resistencia
farmacológica en el ViroSeq System Antiretroviral Drug Resistance Report L10F L10I* L10R L10V V11I L23I L24I D30N*
(Informe sobre resistencia a antirretrovirales del sistema ViroSeq).
V32I L33F E35G K43T M46I* M46L M46V I47A
I47V G48V* I50L I50V F53L I54A I54L I54M
Lista de mutaciones plenamente verificadas I54S I54T I54V* Q58E A71I A71T A71V* G73A
Tal como exige la FDA en el documento Guidance for Industry: Class II Special G73C G73S G73T T74P L76V V82A* V82F V82L
Controls Guidance Document: In Vitro HIV Drug Resistance Genotype Assay (Guía
para la industria: documento guía sobre controles especiales de clase II: análisis de V82M V82S V82T* N83D I84A I84C 184V* N88D
genotipos de resistencia farmacológica del VIH in vitro), a continuación se indican N88S N88T L89V L90M*
las mutaciones que cumplen la especificación de sensibilidad superior al 90% tanto
en los: * Mutaciones plenamente verificadas
Mutación en la Sensibilidad con Sensibilidad con Sensibilidad con Sensibilidad con LOD
LOD propuesto Mutación en
transcriptasa > 1.000 copias/mL > 2.000 copias/mL > 1.000 copias/mL > 2.000 copias/mL propuesto
(comentarios) la proteasa
inversa (n.º de positivos reales) (n.º de positivos reales) (n.º de positivos reales) (n.º de positivos reales) (comentarios)
En la transcriptasa inversa
Error estándar de la media 0,005 0,007
En la proteasa La concordancia entre el ensayo «casero» del estudio GART y el ViroSeq HIV-1
Genotyping System es bastante buena (> 95%), y alcanza el nivel necesario para
L10I L10R L10V K20M K20R L24I D30N M36I
confirmar la utilidad clínica del ViroSeq System. Asimismo, la mayoría de las
muestras se analizaron correctamente (149/153, o 97%), lo que permite aplicar las
conclusiones de utilidad clínica originales del análisis de los datos sin necesidad de
M36L M46I M46L G48V I54V L63P A71T A71V repetir el análisis.
Por lo tanto, el estudio anterior apoya la afirmación de Celera de que se ha
V77I V82A V82F V82T I84V N88D L90M
demostrado la utilidad clínica de las mutaciones detectadas e incluidas en el
estudio GART cuando la detección se lleva a cabo con el ViroSeq HIV-1
Genotyping System.
El estudio GART (Genotyping Antiretroviral Resistance Testing [pruebas de
genotipado de resistencia antirretroviral]) fue uno de los estudios de utilidad clínica
fundamentales. Se demostró que cuando los médicos tienen acceso a los datos de
genotipado antes de modificar el tratamiento, toman mejores decisiones respecto al
tratamiento, y la respuesta a corto plazo de los pacientes al tratamiento mejora.14
El estudio incluyó dos grupos: uno (GART) permitía al médico responsable del
tratamiento acceder a los resultados del genotipado y a las recomendaciones de
tratamiento del panel de expertos, mientras que el otro (sin GART) no permitía
acceder a esta información antes de prescribir el tratamiento. Se comparó la
disminución media de la carga viral a las 4, 8 y 12 semanas en estos dos grupos.
El grupo GART mostró una disminución significativa en la carga viral en
comparación con el grupo sin GART, en particular cuando los médicos siguieron
las recomendaciones de tratamiento de los expertos. Gracias a este protocolo y
a otros similares, las pruebas de resistencia se han convertido en procedimientos
de referencia a la hora de diseñar estrategias terapéuticas para los pacientes que
experimentan fracasos del tratamiento. Para demostrar que nuestro ensayo detecta
las mismas mutaciones de resistencia que el ensayo «casero» utilizado en el estudio
GART, solicitamos a los investigadores originales del estudio GART las 153
muestras de paciente utilizadas, así como los resultados de secuenciación originales
de este estudio. En la tabla 13 se puede observar que la comparación de los datos de
genotipado muestra una elevada concordancia.
3100 y 3100-Avant •
– 1 GB de RAM
– 2 x discos duros de 36 GB
Kit de limpieza del bloque de polímero
(Analizadores genéticos
Separadores de depósitos 4315932
Base de placa de 96 pocillos 4317237
Retenedor de placa de 96 pocillos 4317241
Avant)
96 pocillos para reacción MicroAmp®)
Jeringa de vidrio para llenado de la matriz, 250 μL 4304470
Jeringa de vidrio con polímero de reserva, 5,0 mL 628-3731
Juntas tóricas de jeringa 221102
Contenido:
ABI PRISM ® Sequencing Analysis Software v.3.7 para el 4317380
Material necesario . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53 ordenador con Windows NT® Si necesita licencias adicionales,
Cuidado de los analizadores 3100 y 3100-Avant Genetic Analyzers utilice 4310990 y especifique
(Analizadores genéticos 3100 y 3100-Avant) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53 la v.3.7
Matriz de capilares. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55 ¡IMPORTANTE! No
descargue software de Internet
Jeringas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57 para este uso específico.
Bloques de polímero . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58
Inyector automático . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59 3100 Performance Optimized Polymer 6 (POP-6™) 4316357
Unidades de placa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60 BigDye® Terminator Sequencing Standard v1.1 (patrón de 4336791
Mantenimiento del ordenador . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60 secuenciación BigDye® Terminator v1.1)
Calibración espacial y espectral. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61 Solución tampón 10X con EDTA del analizador genético 402824
Formamida Hi-Di™, 25 mL 4311320
Material necesario
Contiene formamida.
Si desea ver las ilustraciones y diagramas que explican cómo llevar a cabo una tarea
específica en el ABI PRISM ® 3100 Genetic Analyzer (Analizador genético ABI R 61 Riesgo durante el embarazo de efectos adversos para el feto.
PRISM® 3100), consulte el ABI PRISM ® 3100 Genetic Analyzer User Guide (Guía R 36/38 Irrita los ojos y la piel.
S 53 Evítese la exposición – recábense instrucciones especiales
del usuario del analizador genético ABI PRISM® 3100), (PN 4334785). antes del uso.
Si desea ver las ilustraciones y diagramas que explican cómo llevar a cabo una tarea S 24/25 Evítese el contacto con los ojos y la piel.
específica en el ABI PRISM ® 3100-Avant Genetic Analyzer (Analizador genético S 35 Elimínense los residuos del producto y sus recipientes con
ABI PRISM® 3100-Avant), consulte el ABI PRISM® 3100-Avant Genetic Analyzer todas las precauciones posibles.
S 36/37/39 Úsense indumentaria y guantes adecuados, y
User Guide (Guía del usuario del analizador genético ABI PRISM® 3100-Avant), protección para los ojos/la cara.
(PN 4333549). S 45 En caso de accidente o malestar, acúdase inmediatamente
al médico (si es posible, muéstresele la etiqueta).
Artículo
Compruebe que el bloque de polímero encaja firmemente en el instrumento. Reinicio con el botón Reiniciar
Limpie las superficies de los instrumentos.
1. Cierre las puertas del instrumento.
Compruebe si hay polímero seco alrededor del bloque y límpielo si fuera 2. Con un objeto largo y estrecho (por ejemplo, con un clip abierto), pulse el
necesario.
botón Reset (Reiniciar) situado en la parte frontal del instrumento.
3. Reinicie el ordenador.
Limpie las jeringas.
a. Seleccione Start > Shutdown (Inicio > Apagar).
b. En el cuadro de diálogo Shutdown Windows (Apagar Windows),
Limpie los bloques superior e inferior de polímero. seleccione Restart (Reiniciar) y haga clic en OK (Aceptar).
¡IMPORTANTE! Espere a que el ordenador se haya reiniciado
Cambie el polímero. completamente antes de continuar.
Compruebe el estado de conservación de las matrices usadas. 4. Encienda el instrumento y espere a que se encienda la luz verde continua.
Nota. Al apagar el instrumento, el firmware no se guarda. Al reiniciarlo, el
instrumento vuelve a cargar una copia del firmware y el archivo de
Tareas que hay que realizar siempre que sea necesario calibración del ordenador.
Más de una semana Apagado para periodos prolongados. 2. Siga las instrucciones del asistente para colocar el polímero nuevo en el
instrumento.
1. Llene la matriz de capilares con polímero recién preparado, utilizando el Matriz de capilares
asistente Change Polymer Wizard (Asistente para cambiar polímero) o los
comandos de control manual.
Instalación y retirada
2. Pulse el botón Tray (Bandeja) para mover el inyector automático hacia
adelante.
Cuándo cambiar la matriz de capilares
3. Llene el depósito de una nueva solución tampón casi por completo con
La matriz de capilares debe durar para aproximadamente 100 series analíticas.
solución tampón 1X con EDTA del analizador genético.
Es posible que se necesite una matriz de capilares nuevas si:
4. Fije un separador en el depósito y coloque el depósito en la posición 1 del • La precisión en la determinación del tamaño no es la adecuada
inyector automático. • La resolución y/o la intensidad de la señal disminuyen
5. Llene los demás depósitos con agua desionizada fresca, fije los separadores Antes de instalar una matriz de capilares usada
y coloque los depósitos en las posiciones restantes del inyector automático.
• Limpie la parte frontal de la célula de detección
6. Cierre las puertas del instrumento. • Compruebe que la barra del cátodo esté seca
El inyector automático se moverá a la posición 1 y dejará las puntas de los
capilares en el depósito de solución tampón. Limpieza de la célula de detección
Nota. Este procesamiento no es necesario para las matrices nuevas a menos que el
7. Apague el ordenador y el instrumento. usuario haya tocado accidentalmente la célula de detección.
4. Limpie el inyector automático y las bandejas de goteo con un pañuelo Comprobación de la barra del cátodo
desechable que no suelte pelusa y humedecido con agua.
Al volver a colocar una matriz usada en el instrumento, asegúrese de que la barra del
cátodo esté seca. Una barra húmeda podría arquearse.
5. Cierre las puertas del instrumento.
3. Siga las instrucciones del asistente para sustituir o instalar una matriz de
Almacenamiento de la matriz de capilares en
capilares. el instrumento
Nota. Debe introducir la información adecuada de la matriz de capilares (es Deje la matriz de capilares en el instrumento solo si va a permanecer sin utilizarse
decir, la longitud y el número de lote de la matriz de capilares). durante menos de una semana.
Para almacenar la matriz de capilares en el instrumento, siga el procedimiento de
4. Compruebe el cabezal del extremo de carga para asegurarse de que las puntas apagado para periodos cortos.
de los capilares no estén aplastadas o dañadas.
Almacenamiento de la matriz de capilares fuera
del instrumento
Mantenimiento Almacene la matriz de capilares fuera del instrumento si no se va a utilizar durante
más de una semana. Consérvela entre 15 °C y 25 °C.
Cuidado de la matriz de capilares ¡IMPORTANTE! Antes de almacenar la matriz de capilares durante periodos
prolongados, es conveniente llenar los capilares con polímero nuevo.
• Utilice guantes y manipule la matriz de capilares con cuidado.
• No toque la célula de detección. Si está sucia, consulte Limpieza de la célula
de detección. PELIGRO QUÍMICO. El polímero POP-6 causa irritación en los ojos, la
• Mantenga los extremos de la matriz de capilares mojados en todo momento. piel y el aparato respiratorio. Úsense gafas, indumentaria y guantes de protección
• Antes de extraer el bloque superior de polímero, afloje siempre la tuerca de la adecuados.
matriz de capilares.
• No apriete excesivamente la tuerca de la matriz de capilares. ¡IMPORTANTE! Utilice guantes para llevar a cabo el siguiente procedimiento y
siempre que manipule la matriz de capilares, las jeringas de vidrio, los separadores
o los depósitos de solución tampón.
Limpieza de la matriz de capilares
1. Llene la matriz de capilares con polímero recién preparado, utilizando el
asistente Change Polymer Wizard (Asistente para cambiar polímero) o
PELIGRO QUÍMICO. El polímero POP-6 causa irritación en los ojos, la los comandos de control manual.
piel y el aparato respiratorio. Úsense gafas, indumentaria y guantes de protección
adecuados.
2. Quite el protector de la jeringa.
1. Haga pasar polímero nuevo a través de la matriz de capilares, siguiendo las 3. Retire las dos jeringas del bloque superior de polímero y deseche
instrucciones que aparecen más adelante en la sección “Llenado de la matriz adecuadamente el polímero restante.
de capilares con polímero utilizando el control manual.”
4. Lave las jeringas.
2. Limpie cualquier acumulación de polímero (cristales) que pueda haber en el
instrumento, incluidos los electrodos y la placa de separación de los
capilares, con agua desionizada y un pañuelo que no suelte pelusa. 5. Retire la matriz de capilares del instrumento con ayuda del Install
Capillary Array Wizard (Asistente para instalar la matriz de capilares).
Nota. Al limpiar los electrodos de los capilares, tenga cuidado de no
doblarlos ni moverlos de su posición. Consulte las instrucciones en Instalación o desinstalación de la matriz de
capilares con el asistente.
¡IMPORTANTE! Nunca utilice disolventes orgánicos para limpiar el
instrumento.
6. Vuelva a colocar la cubierta sobre la célula de detección.
3. Limpie la célula de detección.
7. Llene un depósito de solución tampón con solución tampón 1X con EDTA
del analizador genético recién preparada. Introduzca las puntas de los
capilares en la solución tampón.
Jeringas
PELIGRO QUÍMICO. El polímero POP-6 causa irritación en los ojos, la
piel y el aparato respiratorio. Úsense gafas, indumentaria y guantes de protección
adecuados.
Mantenimiento de las jeringas ¡IMPORTANTE! Utilice guantes para llevar a cabo el siguiente procedimiento y
siempre que manipule la matriz de capilares, las jeringas de vidrio, los separadores
o los depósitos de solución tampón.
Utilice únicamente las siguientes jeringas
• Jeringa de vidrio de 5,0 mL con polímero de reserva ( ABI 628-3731)
y 1. Introduzca aproximadamente 0,3 mL de polímero a temperatura ambiente
• Jeringa de vidrio de 250 μL para llenado de la matriz ( ABI 4304470) en una jeringa de polímero de reserva limpia.
2. Sujete la jeringa de polímero de reserva justo por encima del conector o por 1. Aclare todos los conectores con agua tibia y después, realice un último
la base (no por el cilindro de vidrio) y gírela en sentido antihorario. aclarado con agua desionizada. Ponga en remojo todos los conectores
¡IMPORTANTE! Tenga cuidado de no extraer el conector. Si lo hace, que estén cubiertos con polímero.
podrían salirse varias juntas y válvulas de comprobación. ¡IMPORTANTE! No utilice agua hirviendo para aclarar los conectores
ni el bloque de polímero.
3. Sujete la jeringa para llenado de la matriz y gírela en sentido antihorario.
2. Sostenga el bloque superior de polímero bajo agua tibia y termine con un
4. Deseche adecuadamente el polímero restante. aclarado con agua desionizada.
Retirada de los bloques de polímero 5. Con la jeringa, haga pasar varias cargas de agua tibia a través de cada
canal, tapando las aberturas con los dedos, y termine mediante un
aclarado con agua desionizada.
Bloque superior de polímero Nota. Haga pasar agua desionizada también a través de los tubos del
bloque de polímero.
1. Quite el protector de la jeringa.
6. Inspeccione visualmente si queda polímero seco (un residuo de color
2. Retire la jeringa. blanco) en los canales. Lave los canales parcialmente bloqueados con
agua tibia hasta eliminar el polímero seco y termine mediante un
aclarado con agua desionizada.
3. Desconecte la matriz de capilares del bloque de polímero:
¡IMPORTANTE! El agua tibia puede tardar bastante tiempo en
a. Pulse el botón Tray (Bandeja). eliminar la obstrucción. No utilice un instrumento punzante para limpiar
b. Abra las puertas del instrumento, de la estufa y del bloque de detección. el canal, aunque se encuentre completamente obstruido con polímero
c. Afloje la tuerca de la matriz de capilares. seco.
d. Extraiga parcialmente el bloque de polímero.
e. Retire la célula de detección del bloque de polímero.
f. Retire el manguito de la matriz de capilares del bloque de polímero.
Nota. Si va a volver a utilizar la matriz de capilares, guárdela
adecuadamente.
3. Extraiga el bloque inferior de polímero del instrumento. 5. Instale bandejas de goteo limpias si aún no están en el instrumento.
4. Aclare todos los conectores con agua desionizada. Remoje los conectores
que estén cubiertos con polímero y termine con un aclarado con agua
desionizada. Eliminación de las burbujas de aire del bloque
¡IMPORTANTE! No utilice agua hirviendo para aclarar los conectores ni superior de polímero
el bloque de polímero.
5. Sostenga el bloque inferior de polímero bajo agua desionizada. Con los 1. Presione hacia abajo la jeringa de polímero de reserva para hacer pasar las
dedos, mueva la válvula de aguja de la solución tampón del ánodo hacia burbujas a la parte inferior derecha del bloque.
abajo y hacia arriba para eliminar cualquier resto de polímero incrustado en Nota. Presione lentamente o dé unos golpecitos a la jeringa para reducir al
el canal guía, y termine con un aclarado con agua desionizada. mínimo la cantidad de polímero utilizado.
¡IMPORTANTE! No retire ningún componente del bloque inferior de
polímero. 2. Presione hacia abajo lentamente la jeringa para llenado de la matriz para
hacer pasar las burbujas por el canal. Las burbujas se acumularán en el punto
6. Acople el adaptador de jeringa de 6 mm a la jeringa de 20 mL sin silicona. donde se unen los canales.
10. Aclare el bloque inferior de polímero y todos los conectores a fondo con
agua desionizada.
Inyector automático
11. Elimine cualquier resto de agua del bloque inferior de polímero y de los
conectores para evitar que se diluya el polímero nuevo.
12. Con la jeringa sin silicona, inyecte aire a través de los canales hasta que estén
Calibración
secos.
Calibre el inyector automático si observa:
¡IMPORTANTE! No utilice la jeringa de vidrio de polímero de reserva de
5,0 mL para inyectar aire a través de los canales. Esto dañaría el émbolo de • Una inyección deficiente en un número reducido de capilares
la jeringa y podría causar fugas en la misma. • Una intensidad baja de la señal
• Ningún indicio de muestra
1. Fije un separador de placa limpio y seco a la placa de muestras. Archivo de muestras no analizado 100
¡IMPORTANTE! No utilice nunca placas que estén combadas.
¡IMPORTANTE! Asegúrese de que los separadores de placa estén en * Los valores indicados son solo estimaciones. El tamaño real del archivo depende del módulo
posición horizontal sobre la placa. Los orificios del retenedor de la placa de análisis seleccionado.
deben estar alineados con los orificios de los separadores; de lo contrario,
podrían dañarse las puntas de los capilares.
5. Si fuese necesario, libere espacio con alguno de los siguientes métodos:
• Copie los archivos de pacientes a un CD-RW o a otro volumen
2. Coloque la placa de muestras sobre la base de la placa. • Elimine los archivos originales de la unidad
4. Asegúrese de que los orificios del retenedor de la placa estén alineados con
Archivado de los datos
los orificios de la tira de separadores.
¡IMPORTANTE! Si el retenedor de la placa y los orificios de la tira de Instalación de un dispositivo de almacenamiento SCSI
separadores no están alineados correctamente, podrían producirse daños en
las puntas de la matriz. No se recomienda añadir un dispositivo de almacenamiento SCSI a la estación de
trabajo. No obstante, si necesita instalar uno temporalmente, siga el procedimiento
que se describe a continuación.
Colocación de la placa en el inyector automático ¡IMPORTANTE! No instale un dispositivo SCSI en la estación de trabajo antes
de instalar el 3100 o 3100-Avant Genetic Analyzer (Analizador genético 3100 o
3100-Avant) con el 3100 o 3100-Avant Data Collection software (software de
1. Pulse el botón Tray (Bandeja). recogida de datos del analizador 3100 o 3100-Avant). La instalación de un
dispositivo SCSI antes del analizador genético cambiará las asignaciones de letras
2. Coloque la unidad de placa en el inyector automático. Utilice las posiciones de las unidades y no podrá instalar correctamente el instrumento ni el software.
A o B para el 3100 Genetic Analyzer (Analizador genético 3100) o la
posición B para el 3100-Avant Genetic Analyzer (Analizador genético
3100-Avant). 1. Apague la estación de trabajo.
Nota. La placa solo tiene una orientación posible, con el extremo con
muescas de la base de la placa orientado en sentido opuesto al usuario. 2. Conecte el dispositivo al puerto de SCSI externo.
¡IMPORTANTE! Asegúrese de que la unidad de placa queda horizontal en
el inyector automático. De lo contrario, las puntas de los capilares podrían 3. Vuelva a encender el ordenador.
levantar la unidad de placa y desplazarla del inyector automático.
4. Compruebe que las asignaciones de letras de las unidades no hayan
3. Cuando la placa esté colocada correctamente, el indicador de posición de la cambiado.
placa de la página Plate View (Vista de la placa) cambiará de color gris a
amarillo.
Compruebe que esto sea así antes de continuar. Nota. Antes de un análisis o de un lote de análisis, el software de recogida de datos
comprueba automáticamente el espacio disponible para confirmar que hay espacio
4. Cierre las puertas del instrumento. suficiente para almacenar los datos que se van a crear.
Nota. Al cerrar las puertas, el inyector automático volverá a la posición Si la base de datos no tiene suficiente espacio (está llena en un 75%
inicial y las puntas de los capilares se introducirán en la solución tampón. aproximadamente), emplee la utilidad Cleanup Database (Limpiar base de datos)
para eliminar los datos y los registros de las placas.
1. Haga doble clic en el icono My Computer (Mi PC) del escritorio para ver 1. Asegúrese de que se esté ejecutando OrbixWeb™ Daemon.
las unidades.
2. Cierre el software de recogida de datos.
2. Desde My Computer (Mi PC), haga clic con el botón derecho del ratón en la
unidad D y seleccione Properties (Propiedades). 3. Con Windows NT Explorer, vaya a:
D:\AppliedBio\3100\Bin
3. Utilice el cuadro de diálogo Properties (Propiedades) para ver el espacio o
utilizado y el espacio libre. D:\AppliedBio\3100-Avant\Bin
Cómo realizarla
Si la calibración falla
1. Seleccione Tools > Perform Spatial Calibration (Herramientas > Realizar
calibración espacial). • Repita la calibración.
• Llene los capilares con polímero y repita la calibración.
2. En el cuadro de diálogo Perform Spatial Calibration (Realizar calibración • Limpie la célula de detección y a continuación repita la calibración.
espacial), seleccione Fill capillaries (Llenar capilares) únicamente si los • Vuelva a colocar la ventana de la matriz en la célula de detección y después
capilares no tienen polímero. repita la calibración.
• Pruebe con otra matriz de capilares.
No es necesario llenar los capilares cada vez que se lleva a cabo una
calibración espacial.
1. Seleccione File > Override Spatial Calibration (Archivo > Sustituir Contiene formamida.
calibración espacial). R 61 Riesgo durante el embarazo de efectos adversos para el feto.
R 36/38 Irrita los ojos y la piel.
2. Seleccione el archivo de calibración espacial que desee utilizar y haga clic en S 53 Evítese la exposición – recábense instrucciones especiales antes del
OK (Aceptar). uso.
S 24/25 Evítese el contacto con los ojos y la piel.
3. Vea el perfil espacial y acéptelo o rechácelo. S 35 Elimínense los residuos del producto y sus recipientes con todas las
precauciones posibles.
Si el perfil es… Haga clic en… S 36/37/39 Úsense indumentaria y guantes adecuados, y protección para los
Aceptable OK (Correcto)
ojos/la cara.
S 45 En caso de accidente o malestar, acúdase inmediatamente al médico
Inaceptable Cancel (Cancelar) (si es posible, muéstresele la etiqueta).
Repita los pasos 1 y 2.
Cuadro de resultados de la calibración espectral 3. En la lista desplegable, seleccione el análisis que desea ver y haga clic en
OK (Aceptar).
Un capilar aprobado se representa con un punto «.». Un capilar rechazado se
representa con una equis «X». 4. En el archivo del espectro, utilice la barra deslizante para examinar cada
Para aceptar la calibración finalizada, haga clic en OK (Aceptar). capilar.
¡IMPORTANTE! Revise y evalúe el perfil de calibración espectral de cada capilar,
aunque el cuadro Spectral Calibration Results (Resultados de la calibración 5. Cuando termine de examinar los datos, haga clic en Cancel (Cancelar).
espectral) indique que están todos aprobados.
Si un capilar falla
A un capilar que no supere la calibración, se le asigna automáticamente el perfil
espectral del capilar más cercano de la izquierda que la haya pasado. Si no hay
capilares válidos hacia la izquierda, se le asignará el perfil del capilar más cercano
hacia la derecha. Estos capilares aparecen marcados de color amarillo en vez de
verde en la Array View (Vista de la matriz).
¡IMPORTANTE! Para el análisis realizado por ViroSeq, en el que los picos
ascendentes y descendentes ocasionan errores críticos, repita la calibración espectral
y utilice un espectro único para cada capilar.
Si la calibración falla
Pruebe uno o más de los procedimientos siguientes:
• Verifique que se hayan seleccionado el archivo de parámetros y módulo de
análisis correctos. Si no es así, hágalo y repita el análisis.
• Verifique que los reactivos utilizados sean recientes. Si los reactivos son
antiguos, se han conservado inadecuadamente o han caducado, prepare reactivos
nuevos y repita el análisis.
• Compruebe que se hayan detectado todos los picos. Un sistema lento puede
hacer que el pico de color azul aparezca cortado total o parcialmente. Aumente el
tiempo del análisis o cambie los reactivos, si parecen sospechosos, y repita el
análisis.
DRAFT
March 14, 2007 4:54 pm, ViroSeq IFU Back.fm
Celera
1401 Harbor Bay Parkway
Alameda, CA 94502 USA
CELERA
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