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ESTUDIO DEL BOMBEO DE PROTONES POR LEVADURA, EFECTO DE LOS INHIBIDORES DE

LA CADENA DE TRANSPORTE DE ELECTRONES Y DE LOS DESACOPLANTES


Cubas, Sharon1 Montenegro, Andrés2 Morales, Marín3
Universidad Autónoma de Chiriquí, Facultad de Ciencias Naturales y Exactas, Escuela de Química,
Bioquímica (código: Qm 382), Ciudad universitaria-El cabrero, David, Chiriquí, Panamá, ID: 4-782-
20721, 4-742-9122, 4-748-11363; E-mail: sharyanc.18@gmail.com1, andy42_1987@hotmail.com2,
m2marinmorales31@gmail.com3
Resumen:
La fosforilación oxidativa puede ser desacoplada por ciertas sustancias como el 2,4-Diitrofenol, de tal
modo que el transporte de electrones continúe, pero no así la fosforilación del ADP, en estas
condiciones se activa el proceso respiratorio, de igual forma que sustancias como la azida de sodio
inhiben el transporte de electrones y con esto la fosforilación del ADP, provocando que se detenga el
proceso respiratorio; los cuales se pudieron observar con la no liberación de protones H+ al medio,
por ende el PH no disminuiría , verificando de esta forma la teoría se logró observar que el 2,4-DNP
presentó la liberación de protones H+ al medio mientras que para la azida de sodio no ocurrió lo
mismo por ende hubo un aumento del pH del medio, tal como se observa en el cuadro 3. Con los
resultados obtenidos podemos decir que los agentes Los agentes químicos inhibidores del transporte
electrónico interrumpen el flujo de e-, por combinarse con alguno de los portadores en los complejos,
interrumpen el bombeo de H+ y en consecuencia tampoco se produce ATP y que las sustancias
desacoplantes destruyen el gradiente electroquímico y, por lo tanto, no hay energía disponible para
impulsar la síntesis de ATP.
Palabras claves: Desacoplante, inhibidor, PH, que se realiza en el citoplasma, consiste en la
cadena de transporte de electrones. degradación de polisacáridos, lípidos y
proteínas hasta piruvato, ácidos grasos y
Objetivos: aminoácidos, respectivamente. En la matriz
 Analizar el cambio en la curva de pH mitocondrial se realiza la segunda etapa que
comprende el ciclo de Krebs durante el cual se
producido en la cadena de transporte de
oxida la molécula de acetil-CoA a CO2, y se
electrones en presencia y ausencia de
transfieren electrones a los transportadores
inhibidores y desacoplantes. NAD+ y FAD, que se integra a la tercera etapa
 Interpretar el efecto de los inhibidores y los conocida como cadena respiratoria o
desacoplantes sobre la transferencia de transporte de electrones, la cual se efectúa en
protones. la membrana interna de la mitocondria y
acoplada a ella se encuentra la fosforilación
Marco teórico:
del ADP para formar ATP (Mathews & Holde,
Las células requieren energía para llevar al 2002).
cabo sus funciones vitales, el proceso
En un sentido muy amplio, los compuestos
fundamental mediante el cual la obtienen es la
químicos que interfieren con la síntesis de ATP
respiración; que se realiza en la mitocondria.
mitocondrial se pueden asociar en cuatro
En dicho organelo se presenta un sistema
grupos, según se recoge en el siguiente
complejo de enzimas que catalizan la
esquema:
oxidación de moléculas orgánicas, durante
este proceso se sintetizan moléculas I.- Inhibidores del metabolismo oxidativo.
energéticas como ATP, GTP (De Robertis & II.- Inhibidores del transporte electrónico.
De Robertis, 1986).
III.- Inhibidores de la liberación de O2 a la
En condiciones aerobias el proceso cadena de transporte de electrones.
respiratorio consta de tres etapas: la primera
IV.- Inhibidores de la fosforilación oxidativa
(McKee, T, 2003).
Materiales y reactivos: Luego de 5 min determinamos el pH 4 veces
cada 5 min y luego 2 veces cada 10 min.
Cuadro 1. Materiales
Repetimos el experimento con la azida.
Instrumento Capacidad Cantidad
Micropipetas 100-1000 µL 2 Resultados:
Puntillas 100-1000 µL 6
Cuadro 3. Variación del pH con respecto al
tiempo.
-10 mL
Probetas 1 pH
Tiempo
- 50mL
( min) Glucosa
Vasos químicos - 250 mL 5 Dinitrofenol Azida
control
Potenciómetro - 1 0 5.13 5.16 5.00
5 4.42 4.78 5.22
Cuadro 2. Reactivos. 10 3.81 4.70 5.20
Reactivo Toxicidad 15 3.68 4.64 5.28
Azida de sodio Es toxica y puede de ser 20 3.54 4.57 5.31
NaN3 absorbida a través de la piel,
30 3.41 4.56 5.34
irrita ojos, causa tos,
insuficiencia respiratoria 40 3.36 4.54 5.15
dolor de cabeza
Dinitrofenol Enrojecimiento y manchas
C6H4N2O5 en la piel produce vómitos,
náuseas mareos, sudoración
y pérdida de peso.
Glucosa C6H12O6 En niveles normales, no
presenta daños.

Fase Experimental:

Control

Grafico 1. Variacion de pH con repecto al


Diluimos 5mL de levadura con 40mL de agua tiempo
destilada. Determinamos el pH de la solución 3
Discusión:
veces cada 3 min para obtener línea basal.
En la respiración celular, existe un transporte
de protones que está acoplado a una corriente
de electrones, crea un gradiente tanto en pH
Adicionamos 5mL de glucosa al 10% agitamos
y medimos pH. Determinamos el pH de la como en carga eléctrica y establece un
solución 4 veces cada 5 min, luego cada 10 potencial electroquímico que actúa como una
min 2 veces mas batería o reserva de energía para la célula. Las
sustancias desacoplantes destruyen el
gradiente electroquímico comúnmente
Experimentos presente a través de la membrana interna de la
mitocondria y, por lo tanto, no hay energía
disponible para impulsar la síntesis de ATP
Diluimos 5mL de la levadura con 40mL de (Murray, Granner, Mayes & Rodwel, 1988).
agua destilada. Añadimos 0.2 mL de
El 2,4-dinitrofenol como se observa en el
dinitrofenol 40M, determinamos el pH y
repetimos la medición 2 veces cada 3 minutos.
cuadro 3, presenta una disminución del pH en
medio, al ser un agente desacoplante, es decir, bombea afuera de la célula y por lo tanto se
desacopla la cadena de transporte de observó una disminución en el pH del medio.
electrones de la fosforilación oxidativa, ya que Conclusiones:
revierte tanto la concentración del gradiente de
hidrógeno como el gradiente de voltaje que se  Se logró comprobar que el proceso
produce a través de la membrana. metabólico está relacionado con la
producción de H+ a nivel de la cadena
El desacoplamiento se produce ya que el 2,4-
transportadora de electrones, por tanto, un
dinitrofenol hace permeable a los protones de
descenso en el pH es indicativo que
la membrana interna mitocondrial deshaciendo
trabajando con levaduras se está
la relación obligada entre la cadena
metabolizando glucosa.
respiratoria y la fosforilación oxidativa. La
 Los agentes químicos inhibidores del
función de este desacoplante es la inhibición
transporte electrónico interrumpen el flujo
de la producción de ATP al impedir el objetivo
de e-, por combinarse con alguno de los
del gradiente de pH, pero no así que la cadena
portadores en los complejos, interrumpen el
transportadora de electrones deje de funcionar
bombeo de H+ y en consecuencia tampoco
(Stranyer, L. 2005).
se produce ATP.
Por otra parte, los inhibidores del transporte  Las sustancias desacoplantes destruyen el
electrónico interrumpen el flujo de e-, por gradiente electroquímico y, por lo tanto, no
combinarse con alguno de los portadores en hay energía disponible para impulsar la
los complejos, estos actúan sobre los síntesis de ATP.
complejos provocando un descenso del
potencial de membrana, ya que interrumpen el Bibliografía:
bombeo de H+ y en consecuencia tampoco se -De Robertis E. & De Robertis, E. (1986).
produce ATP. La azida se unen al Cu del Biología celular y molecular. Undécima edición.
complejo IV, inhibe el paso final de los e- hacia Argentina: El ateneo.
el O2 reacciona con la forma oxidada del Fe3+
-Mathews, C. & Holde, V. (2002). Bioquímica.
(grupo Hem) del cit a3. Como resultado de la
3ª Edición. España: Pearson.
acción de cualquier inhibidor, se detienen las
reacciones redox de la cadena respiratoria, no -McKee, T. (2003). Bioquímica: La base
se libera energía, las bombas de protones no molecular de la vida. España. McGraw-Hill
funcionan, por lo que no hay protones que Interamericana.
regresen a través del complejo V, y la -Murray, R., Granner, D., Mayes, P. & Rodwel,
producción de ATP cesa (Giraldo et al, 2010). V. (1988). Bioquímica de Harper. 11va edición.
En la fase experimental se puede observar a D.F. México: El manual moderno S, A.
través de la gráfica 1, donde se observa la - Stranyer, L. (2005). Bioquímica, 2ª ed.
reacción al mezclar la levadura con la glucosa, España: Reverte.
ésta inicia su trabajo de reproducción,
alimentación y biosíntesis; en la muestra - Giraldo, G. & Chamorro, L. (2010).
control esta presenta una disminución del pH Laboratorio de bioquímica. Universidad de
lo cual indica la mayor concentración de Quindío, Colombia.
protones H+ en el medio, de esta manera se Cuestionario:
realizó el estudio del efecto producido del
inhibidor y el desacoplante en el cual, la azida 1. ¿Cuáles son las fuentes de carbono que
de sodio presenta un aumento mayor del pH usa la levadura?
del medio, en comparación con la muestra R. La fuente de carbono que utiliza la levadura
control, al adicionar el 2,4-dinitrofenol este es la glucosa.
bloqueó los medios para que la levadura
2. ¿Cuáles son las vías metabólicas que
continuara su función entonces los protones
catabolizan a los carbohidratos?
quedan en el citosol y la ATPasa tipo P los
R. Las vías que catabolizan carbohidratos son: continúe el transporte electrónico a lo largo de
glucólisis, cadena oxidativa o cadena de la cadena respiratoria hasta el O2.
transporte de electrones.
3. ¿En qué consisten la glucólisis y la
fosforilación oxidativa?
R. La glucólisis es la vía metabólica encargada
de oxidar o fermentar la glucosa y así obtener
energía para la célula. Ésta consiste de 10
reacciones enzimáticas que convierten a la
glucosa en dos moléculas de piruvato, la cual
es capaz de seguir otras vías metabólicas y así
continuar entregando energía al organismo.
La fosforilación oxidativa se realiza en
condiciones aerobias en los Oxisomas que
forman la cadena oxidativa ubicados en forma
de una cadena ininterrumpida en el lado
interno de las Crestas mitocondriales, a modo
general, los glúcidos son quemados o
combustionados biológicamente en presencia
del O2 en energía química almacenada en los
enlaces covalentes del ATP. Por cada mol de
glucosa se obtiene 6 CO2, 6 H20 y 38 ATP.
4. ¿Cuáles son los productos finales del
catabolismo de los carbohidratos en las
levaduras?
R. Dióxido de carbono agua y ATP.
5. ¿Cuáles son los inhibidores de la cadena
respiratoria de los sitios I, II, y III? Describa su
efecto sobre el consumo de O2 y la síntesis del
ATP.
R. los inhibidores que va actuar sobre el
complejo I son las rotenona y la piericidina A,
del complejo II se puede resaltar la antimicna y
por último, el cianuro, el monóxido de carbono
y el ácido sulfhídrico inhiben el complejo III de
la cadena respiratoria. Bloquean la síntesis de
ATP, al tiempo que permite que continúe el
transporte electrónico a lo largo de la cadena
respiratoria hasta el O2. Su principal función es
el inhibir el transporte en la cadena de la
respiración.
6. ¿cuál es el mecanismo por medio del cual
los protonóforos desacoplan la fosforilación
oxidativa? Describa su efecto sobre el
consumo de O2 y la síntesis del ATP.
R. La acción de esto consiste en disociar la
oxidación en la cadena respiratoria. Bloquean
la síntesis de ATP, al tiempo que permite que