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FUNDAMENTOS TEÓRICOS
Figura 2. Estrategias que muestras las técnicas de Amplificación enzimática del ADN
por Reacción en cadena de la Polimerasa (PCR) y clonación de un gen.
Generalmente el primer paso que deben seguir los científicos para poder estudiar el
genoma, es la extracción del ADN de las células, proceso que puede ser realizado de
manera manual en el laboratorio o automatizada, utilizando sistemas robóticos. Una vez
el ADN es obtenido puede ser utilizado para múltiples propósitos, como el diagnóstico
clínico o mejoramiento vegetal, de microorganismos o producción de fármacos o
vacunas recombinantes.
Para el estudio y la manipulación de los ácidos nucleicos, estos deben ser aislados de la
célula en condiciones adecuadas, para que conserven su integridad y propiedades
inherentes (tamaño, secuencia, etc.). El aislamiento de los ácidos nucleicos se realiza
mediante la ruptura de las membranas celular y nuclear, liberándolos en el lisado
celular, para su posterior limpieza y precipitación. La lisis celular se consigue mediante
choque osmótico (ej; NaCl 3M), homogenización mecánica, digestión enzimática (ej;
proteinasa K) o tratamiento con detergentes (ej; SDS) o ácidos (ej; HCl). Después de
centrifugar para descartar las células intactas, organelas y restos de membranas, el
sobrenadante que contiene los ácidos nucleicos solubles, es tratado con agentes como
fenol, mezclas de cloroformo-alcohol isoamílico o una solución concentrada de sales
(ej: cloruro de sodio 5M o acetato de amonio 8M) que permiten separar las proteínas al
desnaturalizarlas. El ADN soluble en la fase acuosa se precipita después de la adición de
un alcohol y a través de centrifugación es recogido y concentrado formando un pequeño
botón. La preparación de ADN puede ser de mayor concentración y pureza al adicionar
etanol frío que es capaz de retirar el exceso de sales. Después de ser secado y disuelto
en un buffer apropiado, el ADN puede ser visualizado en un gel de agarosa, como un
compuesto que emite fluorescencia bajo luz ultravioleta, en asociación con el
compuesto Bromuro de etídio (EB). La intensidad de la fluorescencia de color naranja
del EB, es proporcional a la cantidad de ADN presente en la muestra. Aunque este
método de tinción ha sido la mejor opción de escogencia para la cualificación de ácidos
nucleicos, por su bajo costo y alta especificidad, su alto poder mutagénico ha generado
polémicas y la necesidad de desarrollar nuevos compuestos que permitan una
visualización. Recientemente las casas comerciales que producen compuestos para
biotecnología, han desarrollado varios compuestos con capacidad de colorear el ADN,
que presentan propiedades menos tóxicas que el EB.
OBJETIVOS GENERALES
CONSULTAS PREVIAS:
DIAGNÓSTICO MOLECULAR
PRÁCTICAS VIRTUALES:
Extracción de ADN
Electroforesis en gel
Extracción de ADN:
http://learn.genetics.utah.edu/content/labs/extraction/
PROCEDIMIENTO
Extracción de ADN:
Para colectar las células de la mucosa oral enjuague la boca, por uno o dos minutos, con
la solución de extracción o lisis que se encuentra en el tubo de ensayo marcado para tal
fin. Para optimizar la recolección de células, frote la lengua en las paredes de la boca
varias veces durante el enjuague.
Vierta la solución en el Beaker y añada una gota de detergente líquido. Mezcle con la
varilla de vidrio para homogenizar el detergente, se debe mezclar suavemente con el fin
de evitar formación de espuma. En este paso los varios cientos de células del tejido
epitelial de la mucosa bucal existentes se romperán y se liberará el ADN del núcleo.
Con la pipeta Pasteur transfiera 2 ml de la solución del lisado celular, al tubo de ensayo
que contenía la solución de extracción. Cierre muy bien la tapa y agite con ayuda del
Vortex por 30 segundos. Deje reposar la solución por 5 minutos sobre la mesa a
temperatura ambiente, para permitir que complete la lisis nuclear.
Con el tubo del lisado celular inclinado en un ángulo 45º y utilizando una pipeta
graduada y una propipeta, vierta lentamente y por las paredes del tubo 4 ml de Etanol
96% frío. (El metanol o isopropanol al 96%, también serviría).
El Etanol se debe de verter de forma que vaya resbalando por las paredes del tubo.
Observe cuidadosamente como se forman dos fases o capas. Determine el punto en que
se juntan las dos capas. Quizás vea cómo se forman hilos de ADN, como filamentos
nubosos que se estiran hacia la capa superior (etanol). El ADN no es soluble en etanol,
por lo que cuando el etanol se encuentra con la solución de ADN empieza a precipitar (a
formar una sal de ADN). Se observa que aparece una hilera de burbujas más pequeñas
que las de champán, unidas por un hilillo casi imperceptible, esponjoso, blanquecino.
¡Ahí está el ADN!
Sumerja el ADN extraído (que tiene apariencia viscosa y color blanquecino) en un tubo
eppendorf con 500 l de etanol al 70% para retirar el exceso de sales.
Observe una pequeña fracción de la solución de ADN (10 L) con 2- 3 L de colorante
fluorescente (SYBR, Green o Red u otro equivalente) en un gel de agarosa al 0.8%.
k
HOJA DE RESPUESTAS:
3. Con relación a la separación del ADN por electroforesis: Responda las siguientes
preguntas:
En qué posición se esperaría que migrara el ADN genómico que acaba de extraer en un
gel de agarosa al 2%? Por qué?
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Cuál es la característica de los ácidos nucleicos que permite la dirección de
desplazamiento hacia en ánodo en la electroforesis?
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Bibliografía:
Nature (http://www.nature.com/nature/dna50
platea.pntic.mec.es/~cmarti3/bio/ADN/adn3/ppal.htm