UNIVERSIDAD DE LAS FUERZAS ARMADAS “ESPE”

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA

INGENIERIA EN BIOTECNOLOGIA

INFORME DE LABORATORIO

Integrantes: Castro Joselyn Jarrín Nicole Materia: Enzimología

Criollo Víctor Zurita Massiel Práctica N°: 03
Guasumba Yadira Fecha: 05/enero/2018
NRC: 3288
1. TEMA
Hidrólisis de la sacarosa con sacarasa.

2. OBJETIVOS

2.1. General

Determinar los diferentes parámetros cinéticos en la hidrólisis de la sacarosa con

sacarasa.

2.2. Específicos
 Obtener sacarasa a partir de levadura (Saccharomyces cerevisiae).
 Realizar una curva de calibración a partir de soluciones estándares.
 Cuantificar la sacarosa presente luego de la hidrólisis con sacarasa
comparando con la curva de calibración obtenida.

3. INTRODUCCIÓN

Una de las propiedades fundamentales de las enzimas en relación con su actividad

catalítica es su especificidad. Esta es una consecuencia de la afinidad de la enzima por
su sustrato, que resulta en la acomodación del mismo sitio activo. En efecto, dada esta
situación, es lógico esperar que no cualquier sustancia que se encuentre en presencia
de la enzima va a poder entrar al sitio activo. Esta propiedad de actuar sólo sobre su
sustrato es a la que nos referimos cuando hablamos de especificidad de las enzimas.
Podemos concluir entonces que la apoenzima (proteína) es la parte del sistema
enzimático responsable de su especificidad (Peña, 2004).
La invertasa cataliza la hidrólisis de restos terminales no reductores D-
fructofuranosídicos de fructofuranósidos. Entre los sustratos sobre los que actúa el más
significativo es, sin duda, la sacarosa, de ahí que la enzima se designe con el nombre
de sacarasa. La denominación trivial de invertasa con la que también se conoce, hace
referencia al hecho de que los productos de la reacción son conocidos como “azúcar
invertido” ya que mientras la sacarosa es dextrorrotatoria, la mezcla equimolecular de
glucosa y fructosa que resulta de su hidrólisis es levorrotatoria, por lo que en el proceso
se origina un cambio de signo (de positivo a negativo) del valor de rotación óptica (Tena
& Jorrín, s.f).

El siguiente gráfico esquematiza lo antes mencionado:

Ilustración 1. Hidrólisis de sacarosa.

4. MATERIALES Y MÉTODOS:

4.1. Materiales
Insumos: Morteros, vasos de precipitación, tubos de ensayo, pipetas, peras,
micropipetas, gradilla.
Equipos: Espectrofotómetro, Celdas para espectrofotómetro, centrífuga, planta de
calentamiento.
Muestras: Levadura.
Reactivos: Sacarosa, sacarasa, agua destilada, Biuret.

4.2. Metodología
Curva de calibración:
En cinco balones de 25 mL se vertió 10 mL de agua destilada, se añadió
concentraciones de azúcar (0.01 M, 0.06 M, 0.2 M y 0.7 M). Se agregó 2 gotas de Biuret
y se midió las concentraciones de sacarosa en el espectrofotómetro.

Obtención de sacarasa:
Se pesó 60 g de levadura, se colocó en un mortero y se mezcló con 120 mL de agua
destilada hasta obtener una mezcla homogénea. Se llevó a centrifugación por 15
minutos a 3500 rpm. Se separó el sobrenadante con una micropipeta y se colocó en un
tubo.

Análisis de muestras:
Se realizó cuatro disoluciones de azúcar a 0.01 M, 0.06 M, 0.2 M y 0.7 M. Se colocó 1
mL de sacarasa en 5 vasos de precipitación de 60 mL etiquetados como a, b, c, d, e. El
vaso de precipitación a fue el blanco. Adicionalmente se colocó 10 mL de cada
concentración de sacarosa y 2 gotas de Biuret, se empezó a tomar el tiempo (5 s, 10 s,
1 min, 15 min, 40 min). Finalmente se midió la absorbancia para cada una de las
muestras.

5. RESULTADOS
 6. DISCUSIÓN
La sacarasa o beta fructofuranosidasa actúa únicamente sobre la sacarosa, no se unirá
a otros disacáridos, su centro activo se fija a la sacarosa de modo que el enlace
glicosídico se debilita y se adiciona fácilmente una molécula de agua, se origina dos
monosacáridos una glucosa y fructuosa (Macarulla, 2007). Las soluciones de sacarasa
son dextrorrotatorias, pero a medida que avanza la hidrólisis la rotación óptica disminuye
y se torna negativa cuando se completa la reacción (Cuamatzi, 2004).

A nivel industrial la sacarasa ésta se obtiene de cultivos de levadura de las cepas

Saccharomyces cerevisiae y Saccharomyces carsbergensis (Günter, 2016). Para la
práctica de laboratorio se utilizó una muestra levadura de la cepa Saccharomyces
cerevisiae y se realizó la hidrolisis catalizada con sacarasa.

Para el desarrollo de la práctica se utilzó el espectrofotómetro para medir la absorbancia

de la enzima sacarasa y encontrar su actividad. El espectrofotómetro es un instrumento
con el que se apoya la espectrofotometría para medir la cantidad de intensidad de luz
absorbida después de pasar a través de una solución muestra (Díaz, 2009), según
la Ley Beer-Lambert la absorción de una muestra es directamente proporcional a la
concentración de la especie (Arderiu, 2005); Beer estudió la influencia de la
concentración de la solución, del constituyente coloreado, en la transmisión y en la
absorción de la luz , descubrió que existe una relación directamente proporcional entre
la transmisión y la concentración, es decir, la intensidad de un haz de luz
monocromática disminuye exponencialmente al aumentar aritméticamente la
concentración de la sustancia absorbente de la misma manera ( Freifelder, 2002) . Ésta
ley se puede verificar en los resultados obtenidos en la práctica, ya que mientras
aumenta la concentración de la solución existe una mayor absorbancia.

Se usó el reactivo Biuret para valorar la absorbancia de la enzima sacarasa en el

espectrofotómetro, ya que éste reacciona con los enlaces peptídicos. El reactivo de
Biuret detecta la presencia de proteínas, péptidos cortos y otros compuestos con dos o
más enlaces peptídicos en sustancias de composición desconocida, se encuentra
dentro de las técnicas de valoración por espectrofotometría visible, la cual da resultados
confiables en muestras cuyos contenidos proteínicos, sean superiores al 5%
(Lozano,2007).

Los péptidos a partir de los tripéptidos y las proteínas reaccionan con el reactivo de
Biuret que contiene CuSO4 en solución acuosa alcalina (KOH), la reacción se basa en
la formación de un compuesto de color violeta, debido a la formación de un complejo de
coordinación entre los iones Cu2+ y los pares de electrones no compartidos del
nitrógeno, presente en los aminoácidos de las proteínas (Llerena, 2014), este complejo
muestra una absorción máxima de 540 nm (Rodger,1999); las proteínas disuelven el
hidróxido cúprico del reactivo y forman compuestos coloreados violeta, que depende de
la naturaleza de las proteínas (Cuamatzi, 2004). El producto es un complejo color
violeta, cuya intensidad de color depende de la cantidad de enlaces peptídicos
presentes (Guarnizo, 2004), los dipéptidos y aminoácidos dan esta prueba negativa
(Quesada, 2007), ya que se requieren dos enlaces peptídicos para la formación del
complejo de quelatos, los aminoácidos individuales sin enlaces peptídicos presentes y
dipéptidos con un enlace peptídico presente (BBS, 2016).

Las curvas de calibración obtenidas en cada tiempo cumple con la Ley de Beer-Lambert,
esta ley se aplica por medio de un gráfico calibrado, que se construye a partir de
medidas previas de las absorbancias de una serie de soluciones patrón, las cuales se
representan gráficamente en función de la concentración de estas (Roca, 2004).

En la en la curva de calibración correspondiente a 5 segundos se pudo observar

mínimas desviaciones, otras grandes en las gráficas de 15 y 30 minutos. Aunque las
gráficas en teoría deben ser rectilíneas (Pickering, 2008), las experiencias prácticas
resultan a menudo gráficos que son decididamente curvilíneas, estas desviaciones
“aparentes” se pueden atribuir a un cierto número de causas, las cuales pertenecen a
dos grandes grupos: causa químicas y causas instrumentales, además puede ocurrir
desplazamiento del equilibrio químico donde la concentración no cumple la
proporcionalidad de la ley (Brown, 2011).

7. CONCLUSIONES

 Se obtuvo sacarasa a partir de levadura (Saccharomyces cerevisiae).

 Se midió la absorbancia de la enzima sacarasa mediante el espectrofotómetro
 Se observó que ha mayor concentraciones de la solución existe una mayor
absorbancia
 Se realizó una curva de calibración a partir de soluciones estándares

8. RECOMENDACIONES
  No se deben utilizar el espectrofotómetro sin conocer perfectamente su
funcionamiento en caso de duda, preguntar al docente encargado.
 Se recomienda limpiar de manera adecuada las paredes de la cubeta
antes de colocarla en el espectrofotómetro
 El trabajo en laboratorio debe planificarse con el número de equipos
necesarios para el trabajo de los estudiantes evitando que exista
conglomeración al momento de usarlo.

9. BIBLIOGRAFÍA

Arderiu, X., Lacambra, M., Compañó, J. (2005). Bioquímica clínica y patología

molecular. Reverté. España.

BBS. (2016). Biuret test for proteins. 29/12/2017. Recuperado de:

http://brilliantbiologystudent.weebly.com/biuret-test-for-protein.html

Brown, G., Sallee, E. (2011). Química cuantitativa. Reverté. España

Cuamatzi, O. (2004). Bioquímica de los procesos metabólicos. Reverté. España.

Díaz, N. (2009). Espectros de absorción y cuantificación colorimétrica de biomoléculas.

29/12/2017. Recuperado de: https://es.slideshare.net/asaor/espectrofotometria-
presentation

Freifelder, D. (2002). Técnicas de bioquímica y biología molecular. Reverté. España

Guarnizo, A., Martínez, P. (2004). Experimentos de química orgánica. Elizcom. México

Günter, P. (2016). ¿Qué es la invertasa y para qué se utiliza en la industria alimentaria?.

29/12/2017. Recuperado de: https://curiosoando.com/invertasa-en-la-industria-
alimentaria

Llerena, L. (2014). Reacción de biuret. 29/12/2017. Recuperado

de:http://bioquimicamarzo-julio.blogspot.com/2014/07/reaccion-de-biuret.html

Letelier, E. (2013). Actividad enzimática: invertasa delevadura. 29/12/2017. Recuperado

de: https://es.scribd.com/doc/159752135/14-Invertasa-de-Levadura

Lozano. (2007). Valoración de proteínas totales por espectrofotometría visible en

muestras de origen animal y/ovegetal. 29/12/2017. Recuperado de:
http://avalon.utadeo.edu.co/comunidades/estudiantes/ciencias_basicas/bioquim
ica/guia_3_3.pdf

Macarulla, J., Goñi, F.(2007). Bioquímica humana. Reverté. España.

Orozco, J. (2013). Espectrofotometría. 29/12/2017. Recuperado de: https://es.slideshar-

e.net/juandavidjaramilloorozco1/laboratoriodeespectrofotom etra-1

Pickering, W. (2008). Química analítica moderna. Reverté. España

Quesada, S. (2007). Manual de experimentos de laboratorio para bioquímica. EUNED.
Costa Rica.

Rodger, A., Sanders, K. (1999). Biomacromolecular applications of UV-Visible

absorption spectroscopy. Elservier. United Kingdom

Roca, P., Rodríguez, A. (2004). Bioquímica: técnicas y métodos. Hélice. España

Peña, A., Arroyo, A., Gómez, A., & Tapia, R. (2004). Bioquímica. México : Editorial
Limusa.

Tena, M., & Jorrín, J. (s.f). Extracción y ensayo de la actividad invertasa de levadura de
panadería. Revista de la Universidad de Córdoba. Obtenido de
https://www.uco.es/dptos/bioquimica-biol-
mol/pdfs/31%20INVERTASA%20ENSAYO.pdf