Mutagénesis

Ingeniería Genética
Mutagénesis en genes y genomas
Mariano N. Belaich, Vanina A. Rodríguez, Facundo Temprana

Universidad Nacional de Quilmes
Evolución biológica
¿Qué entendemos por evolución?

La evolución es el conjunto de cambios que se

acumulan en el acervo genético de las distintas
poblaciones de entidades biológicas a lo largo del
tiempo

tiempo
Cambios en los genomas
ENTIDADES BIOLÓGICAS
Los organismos Objetos de

evolución
biológica
Las organelas
Los virus
ENTIDADES BIOLÓGICAS
Contenedoras de información
heredable en las moléculas
genómicas
Información heredable
GENES
GENES
Sintaxis
Secuencias funcionales con capacidad de expresar un fenotipo

Los genomas pueden sufrir cambios en sus secuencias.
Estos cambios son denominados mutaciones.
Las mutaciones pueden ser, ya sea puntuales o

microestructurales, o impactar en el número de segmentos o en
modificaciones macroestructurales.
Cambios en los genomas: mutaciones puntuales
Las mutaciones puntuales implican el cambio de un nucleótido por

otro.
Cuando una purina es reemplazada por otra purina, o cuando una

pirimidina es reemplazada por otra pirimidina, hablamos de
transiciones.
Cuando una purina es reemplazada por una pirimidina, o cuando una

pirimidina es reemplazada por una purina, hablamos de
transversiones.
Las mutaciones microestructurales implican la deleción o inserción

de pocos nucleótidos en una secuencia.
¿Por qué se introducen las mutaciones

puntuales o microestructurales en los
genomas?
La replicación de los genomas es semiconservativa
Las polimerasas implicadas en la replicación de los genomas requieren de

molde para la síntesis de polinucleótidos
La replicación de los genomas es semiconservativa
Hebra nueva
DNA polimerasa
ssDNA Binding Proteins

Hebra líder
DNA Helicasa
Hebra retrasada
primer
Hebras parentales
DNA primasa
DNA polimerasa Fragmentos de

Okasaki
Proteínas asociadas en la
replicación de un genoma de
dsDNA
Al replicar, las polimerasas pueden cometer errores
Actuó la actividad correctora de

pruebas!
ó
Error!!
Se incorporó el cambio!
Molécula madre Molécula madre Moléculas hijas

replicando
Los sistemas de reparación de errores pueden actuar
Se incorporó el cambio!
ó
Molécula con una mala
incorporación
Se corrigió el cambio!
Actúa la maquinaria de
reparación
Molécula con el Sustrato de Molécula

cambio reparación reparada
En conclusión, los cambios puntuales en los genomas son producidos por

errores de la maquinaria de replicación/reparación.
Los cambios introducidos pueden suceder en cualquier parte de la molécula

genómica.
Todas las maquinarias de replicación/reparación poseen una tasa basal de

incorporación de mutaciones.
Existen factores exógenos, tanto físicos como químicos, que pueden elevar
la tasa basal o frecuencia de incorporación de mutaciones puntuales.
Factores exógenos que afectan los genomas
Radiaciones ionizantes Producen formación y

FACTORES rotura de enlaces
FÍSCOS Radiaciones no ionizantes covalentes
Agentes alquilantes Producen

FACTORES (etilen nitroso urea) modificaciones
QUÍMICOS químicas en las bases
Agentes desaminizantes nucleotídicas
(ácido nitroso)
Factores exógenos que afectan los genomas
FACTORES
FÍSICOS
FACTORES
QUÍMICOS
Impacto fenotípico de los cambios puntuales
En las entidades pluricelulares deben diferenciarse las mutaciones germinales de las somáticas
Cambios en los genomas: mutaciones numéricas y estructurales
Además de las mutaciones puntuales o microestructurales, existen

otros cambios que alteran la arquitectura de un genoma.
Estos cambios pueden implicar la alteración del número de

segmentos genómicos (alteraciones numéricas), o la modificación
en la estructura de cada uno de ellos (alteraciones estructurales).
En cualquiera de los dos casos, estos cambios genotípicos poseen un

mayor impacto que las mutaciones puntuales.
Cambios en los genomas: mutaciones numéricas

numéricas?
Primera
división
Replicación
meiótica del genoma
Durante la meiosis, los
cromosomas pueden ser
mal segregados en las
células hijas.
Segunda
división
meiótica
Variantes de mutaciones numéricas
Poliploidías La célula posee juegos completos de

cromosomas adicionales
La célula posee algún cromosoma extra

Aneuploidía
o carece de un cromosoma
Nulisomía (falta de 1 par cromosomas homólogos)
Monosomía (falta de 1 de los cromosomas del par)
Polisomía (más de 1 par de cromosomas homólogos)

Célula triploide
N=3
3N = 9
Célula diploide
N=3
2N = 6
Nulisomia Monosomía Polisomía

Las mutaciones derivadas de la mala disyunción de los cromosomas

durante las divisiones celulares alteran la dotación cromosómica de
las células hijas, y por ende, su dotación génica.
Estos cambios numéricos, cuando suceden en divisiones meióticas,

pueden comprometer la integridad genómica de los gametos.
Cuando dos gametos se unen para la formación de un cigoto, si

alguno de ellos poseía una dotación cromosómica alterada se
producirá entonces un nuevo individuo que porta aberraciones
cromosómicas numéricas.
Cambios en los genomas: mutaciones estructurales

estructurales no numéricas?
Variantes de mutaciones estructurales
Son todas aquellas alteraciones del orden génico de mayor longitud

que un cambio puntual, pero sin alterar el número de cromosomas
Transloca-
Inserciones Deleciones Inversiones
ciones
En los organismos existe actividad integrasa, la cual tiene la

capacidad de reordenar secuencias genéticas.
Las recombinasas son enzimas con la capacidad de generar

secuencias quiméricas al interactuar con fragmentos diferentes o
sectores distintos de una misma molécula.
Las transposasas son enzimas integrasas codificadas por los

elementos móviles (o transposones), siendo capaces de trasladar e
interrumpir secuencias genéticas.
Origen de mutaciones estructurales

X Recombinación
X Recombinación

X X Doble Recombinación
X X Doble Recombinación

X
Recombinación
X

X
X
Movilidad de transposones
transposón
transposón
Movilidad en cis
transposón
Movilidad en trans
Variantes de transposones
Ejemplo de
mecanismo de
movilidad
Impacto fenotípico de los cambios numéricos
Impacto fenotípico de los cambios estructurales
Impacto fenotípico de los cambios estructurales
Cambios en los genomas: resumen
Mutaciones numéricas : Alteran el número de segmentos genómicos
Mutaciones estructurales: Alteran la dotación génica de un segmento genómico
Mutaciones puntuales: Alteran la información de secuencia de un gen
Todas las mutaciones suceden al azar, por la acción de la maquinaria

de replicación/reparación, por la intervención de maquinaria
integrasa, y por problemas en la disyunción cromosómica durante
los eventos de división celular.

tiempo
Acumulación de Cambios en los genomas
Como antes se analizó, las mutaciones son cambios

nucleotídicos que suceden en los genomas de las entidades
biológicas, los cuales pueden tener un impacto fenotípico en función
del ambiente particular.
También, es importante resaltar que estos cambios pueden suceder

en células somáticas o germinales cuando se trata de organismos
pluricelulares.
La posibilidad que el cambio sea transferido verticalmente y

permanezca en la población depende de su impacto fenotípico.
La mutación tiene impacto fenotípico en un ambiente dado
GENOTIPO + AMBIENTE = FENOTIPO

Algún fenotipo tendrá una mayor aptitud, lo que

traducirá en un mayor éxito reproductivo
AMBIENTE
N generaciones
Población original Población actual

GENOTIPO prevalente
Las secuencias mayoritarias de la población se acumulan en

los genotipos que otorgan los fenotipos de mayor aptitud
La mutación no tiene impacto fenotípico en un ambiente dado

A pesar de los diferentes genotipos, todos los

fenotipos producen una aptitud similar
AMBIENTE
N generaciones
Población original Población actual
Para el genotipo en estudio, al no otorgar aptitudes

diferenciales el éxito reproductivo es similar entre todos los
integrantes de l apoblación
Los cambios genotípicos (numéricos, estructurales o puntuales) se

acumulan en el genotipo promedio de una población por SELECCIÓN
NATURAL.
La selección natural se ejerce sobre los fenotipos y condiciona el éxito o

supervivencia de los genotipos particulares debido a un éxito reproductivo
diferencial producto de una mayor aptitud para con el entorno.
Por otro lado, en los organismos con reproducción sexual puede existir
otra fuerza directriz de acumulación de cambios genotípicos: la SELECCIÓN
SEXUAL.
En tanto, la SELECCIÓN ARTIFICIAL es aquella conducida por el ser

humano, quien se transforma en el responsable de la reproducción
diferencial de las entidades en cuestión.
ENTIDAD BIOLÓGICA
Cambios Cambios genotípicos
genotípicos numéricos o
puntuales estructurales
No hay una alteración Hay una alteración

significativa de la significativa de la
dotación génica dotación génica
Variabilidad Variabilidad
intraespecífica interespecífica
MICROEVOLUCIÓN MACROEVOLUCIÓN
Aplicaciones biotecnológicas
¿Cómo pueden aplicarse los conceptos

de micro y macroevolución?
Aplicaciones biotecnológicas
El conocimiento de la evolución biológica en sus dos principales

expresiones le ha permitido al ser humano aplicarlo en el laboratorio
MUTAGÉNESIS GÉNICA MUTAGÉNESIS GENÓMICA

Aplicaciones biotecnológicas: Mutagénesis génica
MUTAGÉNESIS GÉNICA
La introducción de mutaciones en fragmentos de ácidos nucleicos

aislados se define como mutagénesis génica, la cual puede
clasificarse en dos grupos:
Mutagénesis génica al azar
Mutagénesis génica dirigida

Aplicaciones biotecnológicas: Mutagénesis génica al azar
al azar
La mutagénesis génica al azar, también llamada evolución in

vitro, implica la generación de mutaciones puntuales o
microestructurales en fragmentos aislados de dsDNA.
Dado que se intenta copiar los procesos naturales de la

microevolución, la introducción de mutaciones se realiza mediante
eventos de replicación in vitro.
Error Prone PCR
La PCR es una técnica que mimetiza la replicación genómica a lo

largo de N generaciones.
Dado que la maquinaria de replicación/reparación, con la posible

influencia de factores exógenos, es la responsable de la introducción de
mutaciones, la PCR se transforma en la mejor aproximación para
reproducir en condiciones de laboratorio a la microevolución.
Para ello, deben utilizarse DNA polimerasas sin actividad correctora

de pruebas y condiciones de reacción que disminuyan la fidelidad
de copia.
Error Prone PCR
Condiciones
Taq DNA pol
Mn2+
Desbalande de
los dNTPs
Molde
CICLO 1 CICLO 2
La DNA polimerasa comete errores al copiar y no puede corregirlos

DNA shuffling
Las recombinaciones son eventos habituales durante la

gametogénesis, generando variabilidad génica.
Es posible mimetizar dicho fenómeno en el laboratorio mezclando

ssDNAs homólogos entre sí pero con pequeñas variaciones
genotípicas, en combinación con una PCR.
Así, pueden generarse quimeras entre alelos naturales u otros

previamente obtenidos en el laboratorio.
DNA shuffling
Variantes alélicas para una Los fragmentos sufren

secuencia DNAsa 1 hidrólisis de enlaces
fosfodiéster
Bajas concentraciones
Tiempos cortos
Los distintos alelos para una secuencia pueden ser naturales u obtenerse por Error Prone PCR
DNA shuffling
Moldes para una PCR
Desnaturalización y Extensión
annealing
CICLO 1
Los distintos fragmentos pueden hibridar sobre otros alelos y así actuar como mega-primers enntre sí
Error Prone PCR + DNA shuffling
Situación de partida
Posibles productos de
amplificación
Con ambos procedimientos se incrementa fuertemente la capacidad mutagénica

Como hemos establecido, la selección natural actúa sobre los

fenotipos, provocando que aquellos más aptos tengan un mayor éxito
reproductivo.
En la mutagénesis génica de laboratorio, el conjunto de alelos

generado por los procedimientos descriptos debe ser transformado
en fenotipo para así poder aplicar selección artificial.
Para ello, es necesario clonar cada uno de estos fragmentos en

una plataforma adecuada para así expresar el fenotipo y seleccionar.
Imaginemos que el fragmento mutagenizado in vitro es un ORF
+
Secuencia Variantes alélicas
original generadas in vitro
Plataforma adecuada
para transformar el
genotipo en fenotipo
Imaginemos que el fragmento mutagenizado in vitro es un ORF
Clonado molecular del producto de PCR mutagénica en el vector de

expresión (bibiblioteca alélica)
Índucción y evaluación fenotípica de la actividad de cada proteína

recombinante
Selección de las variantes con mayor

actividad
Repetir rondas de evolución hasta actividad

deseada
Aplicaciones biotecnológicas: Mutagénesis génica dirigida
dirigida
La mutagénesis génica dirigida implica la generación de

mutaciones puntuales o microestructurales precisas en fragmentos
aislados de dsDNA.
En esta situación no se mimetiza ningún proceso natural dado que la

mutación se introduce sin azar.
Mediante PCR
La PCR requiere de oligonucleótidos cebadores para poder replicar i

vitro un fragmento deseado.
Los oligonucleótidos cebadores o primers terminan formando parte de

los extremos de todas las moléculas sintetizadas.
Basándonos en esta particularidad y en la técnica de SOE-PCR (Splicing

by Overlapping Extension PCR), es posible introducir cambios
puntuales dirigidos en secuencias de dsDNA
Secuencia original Secuencia deseada
Diseño y síntesis de primers

PCR A PCR B
PCR C
Secuencia deseada
Aplicaciones biotecnológicas: Mutagénesis genómica
MUTAGÉNESIS GÉNOMICA
La introducción de mutaciones en genomas de entidades

biológicas se define como mutagénesis genómica, la cual puede
clasificarse en dos grupos:
Mutagénesis genómica al azar
Mutagénesis genómica dirigida
Estos organismos modificados deliberadamente por el ser

humano son denominados OGMs (Organismos Genéticamente
Modificados).
Aplicaciones biotecnológicas: Mutagénesis genómica al azar
MUTAGÉNESIS GENÓMICA
al azar
La mutagénesis genómica al azar, implica la generación de

mutaciones puntuales o estructurales en los genomas de entidades
biológicas, alterando la dotación génica.

microevolución y macroevolución, la introducción de mutaciones
se realiza elevando la tasa basal de mutaciones, o fomentando la
transferencia horizontal de secuencias genéticas.
La principal aplicación científica de la mutagénesis genómica al

azar es la generación de conocimiento para comprender el
funcionamiento de los genomas (genómica funcional).
Exposición a mutágenos
Las maquinarias de reparación/replicación introducen mutaciones en

los genomas.
Ciertos agentes químicos como el ENU (etilen-nitroso-urea) o las

radiaciones elevan la frecuencia de mutaciones.
La aplicación de estos tratamientos sobre entidades biológicas puede

producir una colección de organismos mutantes (ventana de
mutantes), cada uno de ellos presentando mutaciones puntuales o
microestructurales diferentes.
Estas mutaciones pueden tener impacto fenotípico, siendo así una

fuente para caracterizar la función génica.
Cultivo de bacterias Exposición a mutágeno

2
COMPLEMENTACIÓN SELECCIÓN POR VENTANA

Y SECUENCIACIÓN 4 AUSENCIA DE 3
DE MUTANTES
ACTIVIDAD
Siembra en medio sólido

En general, una vez seleccionados los organismos mutantes con

ausencia de alguna actividad particular, los mismos son
complementados transformándoles una biblioteca genómica
derivada del genoma silvestre.
El clon que recupere el fenotipo, será aquel que recibió una copia
silvestre del DNA afectado en el genoma.
Mediante su secuenciación, puede asociarse fenotipo a genotipo.

Genoma de organismo mutante, seleccionado por fenotipo negativo
Construcción genética conteniendo copia silvestre
Detección de secuencia afectada por complementación con copia silvestre

Transposones
Los transposones son elementos de DNA con capacidad de

movilidad.
Al trasladarse de una posición a otra, un transposón pueden interrumpir

un gen (Knock out).
La aplicación de transposones modificados sobre entidades

biológicas puede producir una colección de organismos mutantes
(ventana de mutantes), cada uno de ellos presentando mutaciones
Knock out en genes diferentes.
Estas mutaciones pueden tener impacto fenotípico, siendo así una

fuente para caracterizar la función génica.
Transposones
Gen de transposasa
Gen de resistencia a antibióticos

rodeado de brazos del transpsón
H Plásmido Helper (es suicida)

H D
1 D Plásmido Donor (es suicida)
Cultivo de bacterias Cotransformación 2
SECUENCIACIÓN DE SELECCIÓN POR VENTANA

REGIONES 4 AUSENCIA DE 3
DE MUTANTES
INTERRUMPIDAS ACTIVIDAD
Siembra en medio sólido más

antibiótico
Transposones
Interrupción (KO)
Genoma de organismo mutante, seleccionado por fenotipo negativo
Detección de secuencia afectada por secuenciación directa utilizando como

primers oligonucleótidos que hibridan sobre el casete del transposón
Aplicaciones biotecnológicas: Mutagénesis genómica dirigida
MUTAGÉNESIS GENÓMICA
dirigida
La mutagénesis genómica dirigida, implica la generación de

mutaciones estructurales precisas en los genomas de entidades
biológicas, alterando la dotación génica.

macroevolución, la introducción de mutaciones se realiza mediante
procesos de recombinación homóloga.
La principal aplicación de la mutagénesis genómica dirigida es la

generación de conocimiento para comprender el funcionamiento de
los genomas (genómica funcional), la elaboración de modelos y la
generación de entidades biológicas superadoras a las
naturales.
Mutagénesis por recombinación homóloga
Los organismos cuentan con maquinaria integrasa endógena.
Las recombinasas son capaces de intercambiar fragmentos basadas

en la homología de secuencias.
Mediante procesos de recombinación homóloga es posible

incorporar de manera precisa nuevas secuencias dentro de un
genoma.
Estas nuevas secuencias pueden aportar fenotipos diferenciales

(Knock in), y a su vez, pueden interrumpir genes (Knock out) con la
consecuente anulación de ciertas actividades.
Mutagénesis dirigida
Transgen
Gen de resistencia a antibióticos
Regiones upstream y downstream

para dirccionar la recombinación
1
El plásmido es suicida
Cultivo de bacterias transformación 2
ESTUDIOS OGMs
GENOTÍPICOS Y 3
FENOTÍPICOS
Siembra en medio sólido más

antibiótico
Mutagénesis dirigida
x x
Plásmido suicida recombinando por las regiones idénticas

Genoma de organismo silvestre
Genoma de organismo mutante (Knock in)
Genoma de organismo mutante (Knock out)
transgen Gen selector de mutantes (ventaja)

Mutagénesis

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Mutagénesis en genes y genomas

Mariano N. Belaich, Vanina A. Rodríguez, Facundo Temprana

¿Qué entendemos por evolución?

La evolución es el conjunto de cambios que se

La evolución es el conjunto de cambios que se

Los organismos Objetos de

Secuencias funcionales con capacidad de expresar un fenotipo

Los genomas pueden sufrir cambios en sus secuencias.

Estos cambios son denominados mutaciones.

Las mutaciones pueden ser, ya sea puntuales o

Las mutaciones puntuales implican el cambio de un nucleótido por

Cuando una purina es reemplazada por otra purina, o cuando una

Cuando una purina es reemplazada por una pirimidina, o cuando una

Las mutaciones microestructurales implican la deleción o inserción

¿Por qué se introducen las mutaciones

La replicación de los genomas es semiconservativa

Las polimerasas implicadas en la replicación de los genomas requieren de

La replicación de los genomas es semiconservativa

ssDNA Binding Proteins

DNA polimerasa Fragmentos de

Al replicar, las polimerasas pueden cometer errores

Actuó la actividad correctora de

Molécula madre Molécula madre Moléculas hijas

Los sistemas de reparación de errores pueden actuar

Molécula con el Sustrato de Molécula

En conclusión, los cambios puntuales en los genomas son producidos por

Los cambios introducidos pueden suceder en cualquier parte de la molécula

Todas las maquinarias de replicación/reparación poseen una tasa basal de

Factores exógenos que afectan los genomas

Radiaciones ionizantes Producen formación y

Agentes alquilantes Producen

Factores exógenos que afectan los genomas

Impacto fenotípico de los cambios puntuales

Además de las mutaciones puntuales o microestructurales, existen

Estos cambios pueden implicar la alteración del número de

En cualquiera de los dos casos, estos cambios genotípicos poseen un

¿Por qué se introducen las mutaciones

Variantes de mutaciones numéricas

Poliploidías La célula posee juegos completos de

La célula posee algún cromosoma extra

Nulisomía (falta de 1 par cromosomas homólogos)

Monosomía (falta de 1 de los cromosomas del par)

Polisomía (más de 1 par de cromosomas homólogos)

Nulisomia Monosomía Polisomía

Las mutaciones derivadas de la mala disyunción de los cromosomas

Estos cambios numéricos, cuando suceden en divisiones meióticas,

Cuando dos gametos se unen para la formación de un cigoto, si

¿Por qué se introducen las mutaciones

Variantes de mutaciones estructurales

Son todas aquellas alteraciones del orden génico de mayor longitud

En los organismos existe actividad integrasa, la cual tiene la

Las recombinasas son enzimas con la capacidad de generar

Las transposasas son enzimas integrasas codificadas por los

Origen de mutaciones estructurales

Origen de mutaciones estructurales

Origen de mutaciones estructurales

Origen de mutaciones estructurales

Origen de mutaciones estructurales

Origen de mutaciones estructurales

Origen de mutaciones estructurales

Origen de mutaciones estructurales

Origen de mutaciones estructurales