Transferencia horizontal de DNA:

Transformación y reacción en cadena de la

polimerasa (PCR)
Licenciatura en Biología Experimental
Laboratorio de genética
Mtra. Vianey Olmedo

Integrantes:
Diana Karina Rangel Salazar
Karla Lugo Delgado
Elizabeth Aguilar Serna

Fecha de entrega: 14 de Noviembre de

2018

Práctica no. 8
1 OBJETIVO
Comprender que el entorno puede afectar a los microorganismos y que pueden adquirir información genética
nueva por mecanismos naturales que no incluyen la reproducción sexual.

2 INTRODUCCIÓN
La transformación es un proceso por el cual las células
captan DNA libre presente en el medio. Es un fenómeno
que ocurre de forma natural en muchas bacterias, pero
la eficacia del proceso varía enormemente de unas
especies a otras. Para que la transformación tenga
lugar, la bacteria tiene que encontrarse en el llamado
estado de competencia, que ocurre en determinadas
condiciones fisiológicas; en este estado, la bacteria
presenta alteraciones en su pared y membrana
celulares, que permiten la entrada de ácidos nucleicos
en la célula.
En la naturaleza el ADN es trasferido entre bacterias utilizando 2 métodos: transformación y conjugación. En la
transformación, una bacteria adquiere DNA exógeno del ambiente. En contraste, la conjugación requiere el contacto
directo entre dos bacterias, un trozo de ADN es copiado en una célula (donante) y luego es transferido a otra célula
(receptor). En ambos casos, la bacteria adquiere nueva información genética que es estable y heredable.
Muchas bacterias poseen genes no esenciales en pequeñas piezas circulares de doble cadena de ADN, además de
su ADN cromosómico. Estas piezas de ADN, llamadas plásmidos, permiten a las bacterias intercambiar beneficios.
En el laboratorio se ha conseguido poner a punto técnicas que inducen el estado de competencia en bacterias que
no lo presentan de forma natural, como es el caso de E. coli. Estas técnicas se basan en diversos tratamientos químicos
o físicos que producen microporos en la célula, lo que permite la introducción del DNA exógeno (transformación) de
modo bastante eficiente
Eficiencia de transformación
En la práctica la transformación es altamente ineficiente, sólo una de cada 10.000 células incorpora con éxito el
ADN plasmídico. Si las bacterias son transformadas con un plásmido que contiene un marcador selectivo y sembradas
en placas de agar con un medio selectivo y no-selectivo, se observan diferentes resultados. Las placas de agar con
un medio no selectivo permiten crecer a las bacterias transformadas y las bacterias no transfomadas. Por el
contrario, en las placas de agar con el medio selectivo sólo crecerán las bacterias que expresan el marcador
selectivo. Puesto que cada colonia se origina a partir de una única célula transformada, nosotros podemos calcular
la eficiencia de transformación, o el número de células transformadas por microgramo (g) de ADN plasmídico.
El medio LB (Luria- Bertani) es un medio rico para
Escherichia coli, utilizado para el crecimiento de
únicamente bacterias.
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) fue
desarrollada por Kary Mullis de los años 80. Con esta
metodología se pueden producir en el laboratorio
múltiples copias de un fragmento de DNA específico,
incluso en presencia de millones de moléculas de DNA. Se basa en la actividad de la enzima DNA polimerasa que
es capaz de fabricar una cadena de DNA complementaria a otra ya existente. Sus únicos requerimientos es que
existan nucleótidos en el medio (adenina, citosina y guanina), que son los componentes de la cadena de DNA, y una
pequeña cadena de DNA (oligonucleótidos) que pueda unirse a la molécula que queremos copiar para que sirva
como cebador.
La PCR se desarrolla en tres pasos. El primer es la separación de las dos cadenas que forman la molécula de DNa
que se requiere amplificar, para lo cual se debe calentar el DNA a una temperatura de 95-96°C. Cada una de
estas cadenas actuará como molde para fabricar su complementaria. A continuación se baja la temperatura para
conseguir que cada cebador se una a su región complementaria dentro de la cadena de DNA. El último paso consiste
en la generación de la cadena de DNA complementaria, por acción de la DNA polimerasa. El problema con el que
se encontraron los científicos que idearon esta técnica es que resulta preciso aumentar la temperatura de la mezcla
de reacción hasta valores por encima de los 70°C para que las dos cadenas de DNA se mantengan separadas. A
estas temperaturas tan elevadas, la DNA polimerasa se inactivaba y era preciso añadirla de nuevo en cada ciclo.
Esto fue así hasta que se descubrió la bacteria Thermus aquaticus que vive en aguas termales y cuya DNA polimerasa
(Taq polimerasa) es capaz de trabajar a temperaturas superiores a los 70°C. De esta manera sólo hay que añadir
la enzima al inicio del proceso de reacción y llevar a cabo tantos ciclos como sea necesario.
Cada una de estas moléculas de DNA hijas pueden volver a entrar al proceso y servir como molde para fabricar
más copias. Se consigue una amplificación de 2n, siendo n el número de ciclos de reacción.
Al aplicar un campo eléctrico a una solución de moléculas con carga neta, éstas se desplazarán hacia el polo
contrario a su carga. En este principio, se basa la técnica denominada electroforesis y el desplazamiento de la
molécula en cuestión depende de dos factores: la carga y el tamaño.
La electroforesis en gel es una técnica muy utilizada para separar moléculas o fragmentos de moléculas de ácidos
nucleicos. La electroforesis se comporta como un tamiz molecular y permite separar moléculas cargadas basándose
en su tamaño y su forma. Así una mezcla de moléculas de DNA de diferente tamaño, que pueden resultar de una
reacción con enzimas de restricción, se separará en función de aquel. Es importante el empleo de un marcador de
tamaño conocido porque permite calcular la masa molecular de las bandas de DNA.
Para comprobar que las colonias transformantes elegidas tienen el plásmido recombinante que queremos, se
analizan los insertos de los plásmidos aislados mediante PCR.
3 MATERIALES REACTIVOS SUJETO DE ESTUDIO
1. Asa de nicromo 1. Etanol
2. Mechero de Bunsen 2. Plasmidos Escherichia coli.
3. Micropipeta 3. Medio LB
4. Puntas estériles 4. Medio LB- Ampicilina
5. Tubos eppendorf 5. Hielo
6. Incubador/Termoblock a 42°C

4 PROCEDIMIENTO
Parte A) Transformación horizontal

Parte B) PCR
Parte C) Gel de poliacrilamida

5 OBSERVACIONES
Medio LB.
Medio LB con ampicilina
Se puede ver el crecimiento de la colonia de E.
Podemos apreciar un crecimiento de las
coli, la cual crece uniformemente en toda la
bacterias distinto al medio control,
placa.
apreciando que se aglomeran en especies
de satélites.

Figura 1. Escherichia coli, crecimiento Figura 2. Escherichia coli, crecimiento

uniforme. aglomerado, los puntos marcados son los
“satélites” que se encontraron.
 Figura 3. Colonias de Escherichia coli transformantes con
cherry.
Todas las colonias que se muestran de color rosa son aquellas
que son resistentes a ampicilina.
Figura 4. Colonias de Escherichia coli transformantes con GFP.
Todas las colonias que se muestran de color verde son aquellas que
son resistentes a ampicilina.

Electroforesis

En la imagen se puede ver una electroforesis en gel de

poliacrilamida en donde se muestran 7 carriles, los cuales
fueron cargados con el plásmido (resistente a ampicilina)
el cual tenía el gen reportero cherry.
En el carril A se encuentra el marcador de referencia y en
los demás carriles se encuentra una muestra de las
amplificaciones que se realizaron en PCR.

Figura 5. Electroforesis de células de E. coli transformadas

En el carril B, C, G, A´, B´ Y C´ se pueden apreciar los plásmidos que flourecen

bajo luz UV.

En el carril F y E´ se muestra un control negativo a la muestra y finalmente en

el carril E se aprecia una muestra de plásmido con GFP, el cual no tiene
flourece.
6 RESULTADOS

Gen reportero Gen de resistencia Medio de Cultivo Crecimiento Florescencia en luz

UVC.
mCHERRY pGal Ampicilina Positivo, en forma Positivo
de satélite
GFP pGal Ampicilina Positivo, en forma Positivo
de satélite
Tabla 1. Resultados de las transformaciones horizontales de E. coli
Eficiencia de la transformación:
(𝑐𝑜𝑙𝑜𝑛𝑖𝑎𝑠 𝑜𝑏𝑠𝑒𝑟𝑣𝑎𝑑𝑎𝑠 𝑒𝑛 𝑙𝑎 𝑝𝑙𝑎𝑐𝑎)(𝐹𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟 𝑑𝑒 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛)(𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 )
UFC = 𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑒𝑠𝑝𝑎𝑡𝑢𝑙𝑎𝑑𝑜 𝑒𝑛 𝑒𝑙 𝑚𝑒𝑑𝑖𝑜

𝟔𝟕𝟒 (𝟒𝟎)( 100 𝑚𝑖𝑐𝑟𝑜𝑙𝑖𝑡𝑟𝑜𝑠)

UFC= 𝟐𝟎 𝒎𝒊𝒄𝒓𝒐𝒍𝒊𝒕𝒓𝒐𝒔
= 134,800 ufc
𝟏34,800 u𝑓𝑐
Eficiencia de transformación = 𝟎,𝟎𝟒𝟓 𝑚𝑔
; 2.9x106 ufc/mg DNA

Electroforesis
Carril Plásmido + gen Resultado en electroforesis
reportero
A Marcador de ------
referencia
B Cherry Positivo
C Cherry Positivo
D ---- -----
E GFP Negativo
F Control Negativo
G Cherry Positivo
A´ Muestra de --------
referencia
B´ Cherry Positivo
C´ Cherry Positivo
D´ Control Negativo
Tabla 2. Resultados de la electroforesis. *La muestra del carril D no se inoculo

Ciclos que se utilizaron para la reacción: 235

Número de amplicones resultantes: 34, 359, 738,368 amplicones
7 DISCUSIÓN
En la práctica realizamos una transformación
horizontal a colonias de E. coli, a través de
plásmidos, los cuales tenían un gen de resistencia a
ampicilina, de modo que las células transformadas
pudieron crecer en presencia de éste antibiótico y
para ello se utilizaron dos tipos de marcadores, gen
reportero (GFP y mCherry), para poder visualizar la
expresión del gen.
Los marcadores que se utilizaron fueron: el gen de la proteína verde flourescente de la medusa Aqueora victoria
(GFP) y el gen de la proteína mCherry (la cual deriva de la proteína drFP583 o DsRed) aislada de la anemona de
mar Dicosoma.
El plásmido que utilizamos, como un medio para poder insertar un gen, proporcionaba a la bacteria resistencia al
medio con ampicilina. Dicho gen codifica para la - lactamasa, un enzima que proporciona resistencia a los
antibióticos. Es así como las células transformadas secretan -lactamasa en el medio, proporcionando resistencia al
antibiótico ampicilina y pudiendo crecer en este.
La ampicilina es un beta-lactámico de espectro moderado, el cual interfiere en las últimas fases de la síntesis del
peptidoglicano, componente esencial de la pared bacteriana. Es por la hidrolisis enzimática que E. coli obtiene
resistencia hacia las Beta-lactámicos: las beta-lactamasas hidrolizan el enlace amida del núcleo beta-lactámico,
inactivando al antibiótico y permitiendo así a E. coli crecer en el medio, sin que dañe su pared bacteriana. En la
tabla 2 se pueden apreciar los genes implicados que codifican para las betalactamasas.

El plásmido pGAL contiene el gen que codifica para la β-lactamasa

que inactiva la ampicilina. Las células de E. coli transformadas por
pGAL obtienen como producto del gen de resistencia a β-lactamasa,
una enzima que es excretada.
Una vez fuera de la célula, la enzima se difunde en el medio
circundante e inactiva la ampicilina. Es por este motivo que el
crecimiento en la placa es en forma de pequeñas colonias "satélite",
ya que las colonias que no son resistentes a la ampicilina o colonias
“alimentadoras” crecen alrededor de la colonia resistente la cual,
vista a la luz de fluorescencia, es del color del gen reportero.
Estas colonias alimentadoras están creciendo en una región de agar
donde la β-lactamasa se ha difundido e inactivado el antibiótico
ampicilina. El número de colonias satélites aumenta si la
concentración de ampicilina es baja o las placas se han incubado
durante tiempos más largos.
La razón por la que no todas las bacterias fueron competentes es por la existencia de un sistema de secreción tipo
IV que tienen las bacterias. Dicho sistema o canal de secreción especializado se encarga de secretar tóxinas y
además, es el único sistema que, aparte de transportar proteínas, es capaz de transportar DNA exógeno a la célula.
Es así como aquellas bacterias que tuvieron una transformación horizontal pudieron crecer en el medio con ampicilina,
pues tenían incorporado a su membrana dicho sistema.
Se realizó una amplificación por PCR de aquellas colonias que dieron positivas en la transformación, tanto con el
gen reportero de mCherry y el gen GFP, teniendo como punto de referencia a GFP ya que los oligonucleótidos
utilizados para PCR estaban destinados a producir amplicones únicamente de mCherry, por lo que GFP sirvió como
un control negativo.
En dicho proceso (PCR) fue muy importante el manejo de la temperatura ya primero se necesita una
desnaturalización, para que el DNA pueda abrirse y quedar de cadena sencilla. El calor disocia los puentes
hidrógeno. Después se baja la temperatura para volver a formar los puentes de hidrógeno pero únicamente con el
oligonucleótido de inicio y final para que se acoplen a la cadena de DNA. Y una vez ahí la reacción se eleva a
72°C para la síntesis en donde la DNA polimerasa (Taq polimerasa) lleva la amplificación.
Posterior a esto, con los amplicones obtenidos de la PCR, se realizó una electroforesis para identificar si el
producto obtenido era el esperado, es decir, que el plásmido pGal hubiera sido exitosamente incorporado a E.
coli. Y se encontró que efectivamente, los resultados obtenidos eran los esperados, ya que hallamos la presencia
de fluorescencia rosada en los carriles cargados con los amplicones de cherry, y así mismo no hayamos un
resultado positivo en el carril cargado con GFP.

8 CONCLUSIÓN
Las bacterias consiguen un nivel adecuado de diversidad genética empleando mecanismos de transferencia
horizontal de genes. El conocimiento de este proceso permite a los científicos generar técnicas para colocar genes
de diferentes orígenes en los plásmidos bacterianos para analizar su adaptación con este nuevo plásmido.
En esta práctica logramos que un gen, que contiene el gen que codifica para la β-lactamasa, se acoplara a células
de E. coli y pudiesen crecer en un medio con ampicilina y esto se pudo corroborar al añadir un marcador (GFP,
mCherry) para visualizar la expresión del gen.
El análisis de los genomas bacterianos nos da el gran número de genes que se han adquirido por transferencia
horizontal. A partir del análisis del genoma de E. coli, con herramientas moleculares como lo son PCR y su posterior
electroforesis, se pueden identificar y amplificar genes específicos para la sobrevivencia de la bacteria y, a partir
de esta información, "diseñar" nuevos antibióticos que inhiban el crecimiento bacteriano.

9 CUESTIONARIO
¿Cuál es la función del detergente?
Desnaturaliza las proteínas, deshaciendo su estructura tridimensional y les confiere carga negativa, para hacerlas
correr a determinada carga.
¿Por qué desestabiliza la membrana?
Por la desnaturalizan de las proteínas de la membrana con las que interactúa el detergente.
¿Por qué es tóxico el Bromuro de etidio?
El bromuro de etidio es una sustancia fuertemente mutagénica, está clasificado como mutágeno de categoría 2 según
el Reglamento CLP (Reglamento 1272/2008), lo que significa que se sospecha que la exposición crónica a bromuro
de etidio puede provocar daños hereditarios y es irritante a los ojos, piel, mucosas y el tracto respiratorio.
¿Cómo se diseña un oligonucleótido?
Se recomienda que sea con una longitud de 18 a 24 bases ya que, con esta longitud, no es tan corto y se reduce la
posibilidad de hibridación en sitios secundarios en el vector; ni es tan largo como para aumentar la temperatura de
alineamiento a un punto crítico.
¿Cómo se pueden eliminar las inespecificidades?
Diseñando un oligonucleótido muy específico, de mínimo 18 nucleótidos y que no exceda la temperatura óptima a
la que trabaja la polimerasa.
1. Explica por qué la proteína verde fluorescente, fluoresce al iluminarla con la luz UVC.
Esta proteína fluoresce debido a que proviene de la medusa bioluminiscente Aequorea victoria. GFP conservaba su
propiedad fluorescente incluso dentro de organismos distintos al de la medusa, debido a ello es una herramienta
útil para la biología celular ya que es una proteína que tiene la propiedad de emitir luz verde y puede ser usada
como marcador. GFP, por sus siglas en inglés ha sido modificada para emitir colores en muchas y diversas longitudes
de onda.
A estas proteínas se les considera marcadores de
localización (genes reporteros) porque permiten el
monitoreo de los cambios bioquímicos dentro y entre
las células, o de cualquier otro fenómeno dinámico que
se desee observar sin necesidad de tinción o fijación
de la célula.
2. Explica porque las células fluorescentes también
son resistentes a la ampicilina.
Porque al gen reportero se coloca con el gen resistente
a la ampicilina en la misma construcción de ADN para
ser insertado al microorganismo.
3. ¿Cuáles son los blancos de la ampicilina y del
cloranfenicol en la célula?
Ampicilina. Es un antibiótico betalactámico con efecto inhibidor de la síntesis de la pared celular de la bacteria en
sus últimas dos etapas (3 y 4), uniéndose a las PBP (proteínas fijadoras de penicilinas), lo que lleva a la destrucción
de la pared y la consiguiente lisis celular.
Cloranfenicol. Actúa a nivel de la porción 50 S del ribosoma, inhibiendo la transpeptidasa, lo que impide que se
formen los péptidos.
4. ¿Por qué el gen presente en el plásmido utilizado confiere resistencia a la ampicilina?

Por que codifica para la - lactamasa, que es una enzima que proporciona resistencia a los antibióticos. Las células
transformadas secretan -lactamasa en el medio, proporcionando resistencia al antibiótico ampicilina y pudiendo
crecer.
5. Indica cuales son los otros dos mecanismos por los cuales las bacterias pueden adquirir información
además de la transformación.
Se debe generalmente a transferencia horizontal, donde los genes son adquiridos de otras bacterias. El hecho de
que cada vez haya un mayor número de bacterias patógenas con resistencia a antibióticos se debe a la eficiente
transferencia horizontal de genes de resistencia entre bacterias. Algunos de estos genes de resistencia se usan en la
construcción de organismos transgénicos.
10 REFERENCIAS
http://bioted.es/protocolos/TRANSFORMACION-BACTERIANA-pGAL.pdf
https://www.uco.es/dptos/bioquimica-biol
mol/pdfs/48%20TRANSFORMACION%20E%20COLI%20CON%20PLASMIDO%20RECOMBINANTE.pdf
http://www.fmed.uba.ar/depto/microbiologia/2015-
Gen%C3%83%C2%A9tica%20Bacteriana%20y%20THG.pdf
http://stp.insht.es/stp/basequim/012-electroforesis-en-gel-de-agarosa-exposici%C3%B3n-bromuro-de-etidio
https://www.smu.org.uy/dpmc/pracmed/temas/samr/info-resbact.html
http://www.redalyc.org/html/1792/179214945007/
http://www.iqb.es/cbasicas/farma/farma04/k001.htm
Dorado, G. (s/f). Amplificación de DNA mediante PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa). Departamento de
Bioquímica y Biología Molecular, Campus Universitario de Rabanales. Recuperado de:
https://www.uco.es/dptos/bioquimica-biol-mol/pdfs/44%20PCR.pdf