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Cromatografia em Camada Delgada Discentes: Daniely de Godoy Silva Germano Blaquez Junior Gislaine Ap. da
Cromatografia em Camada Delgada Discentes: Daniely de Godoy Silva Germano Blaquez Junior Gislaine Ap. da

Cromatografia em Camada Delgada

Discentes: Daniely de Godoy Silva Germano Blaquez Junior Gislaine Ap. da Cunha Docentes: Profº. Drº José Eduardo de Oliveira Profª Amanda Coelho Danuello

Histórico da Cromatografia em Camada Delgada

BEYERINCK em 1889 usou sólidos em camada delgada sobre vidro, para o desenvolvimento circular de misturas de sais inorgânicos.

Em 1938 IZMAILOV e SCHRAIBER reintroduziram a Cromatografia em Camada Delgada, para análise de produtos farmacêuticos, mas não foi muito usada até o desenvolvimento, por KIRCHNER do método de aderir os sólidos ao suporte.

Em 1956 atingiu grande desenvolvimento, pelo método de preparar as placas com reprodutibilidade por STAHL.

Cromatografia :

Método físico-químico de separação dos componentes de uma mistura, realizada através da distribuição destes componentes entre duas fases, que estão em contato íntimo.Uma das fases permanece estacionária enquanto a outra move-se através dela.

duas fases, que estão em contato íntimo.Uma das fases permanece estacionária enquanto a outra move-se através

Técnicas cromatográficas

Cromatografia planar: Fase estacionária permanece em um plano

planar: Fase esta cionária permanece em um plano Cromatografia em coluna: Fase estacionária permanece num

Cromatografia em coluna:

Fase estacionária permanece num tubo

planar: Fase esta cionária permanece em um plano Cromatografia em coluna: Fase estacionária permanece num tubo

Critério de classificação

Cromatografia

Coluna
Coluna

Planar

Técnica

Líquido

Fluido Gás Líquido supercrítico Fase Líquido Sólido Líquido Sólido ligada Fase ligada CGL CGS CS
Fluido
Gás
Líquido
supercrítico
Fase
Líquido
Sólido
Líquido
Sólido
ligada
Fase
ligada
CGL
CGS
CS
CLL
CLS
CE CLFLCTI CB

Fase Móvel

Sólido CCD
Sólido
CCD

Fase

Estacionária

Líquido

Tipo de cromatografia

CP

Outra Classificação

Fase Normal Polaridade: FE > FM FE utilizada : Sílica G

Normal Polaridade: FE > FM FE utilizada : Sílica G Fase Reversa Polaridade: FE < FM
Normal Polaridade: FE > FM FE utilizada : Sílica G Fase Reversa Polaridade: FE < FM
Normal Polaridade: FE > FM FE utilizada : Sílica G Fase Reversa Polaridade: FE < FM

Fase Reversa Polaridade: FE < FM FE utilizada: Sílica C 18

Polaridade: FE < FM FE utilizada: Sílica C 1 8 > polaridade < polaridade < polaridade
Polaridade: FE < FM FE utilizada: Sílica C 1 8 > polaridade < polaridade < polaridade
Polaridade: FE < FM FE utilizada: Sílica C 1 8 > polaridade < polaridade < polaridade

> polaridade

< polaridade

< polaridade

> polaridade

Adsorção

Líquido/gás

sólido

Adsorção Líquido/gás sólido Troca Iônica Líquido sólido + + - + - Mecanismos Partição Líquido/gás

Troca Iônica

Líquido

sólido

+
+

+ -

+
+
-
-

Mecanismos

Partição

Líquido/gás líquido
Líquido/gás
líquido

Exclusão

Líquido/gás

gel/sólido

Líquido sólido + + - + - Mecanismos Partição Líquido/gás líquido Exclusão Líquido/gás gel/sólido

MECANISMO DE AÇÃO

MECANISMO DE AÇÃO ABSORÇÃO ADSORÇÃO
MECANISMO DE AÇÃO ABSORÇÃO ADSORÇÃO

ABSORÇÃO

ADSORÇÃO

FORÇAS INTERMOLECULARES

MOLÉCULAS APOLARES

Ex: Hidrocarbonetos

FORÇAS DE DISPERSÃO DE LONDON

Molécula Molécula apolar apolar Dipolo instantâneo
Molécula
Molécula
apolar
apolar
Dipolo
instantâneo

Afastadas

atração

=

Não

existe

Aproximação = Indução

Atração

Dipolo - Dipolo

Molécula polar sem H ligado a F, ou O ou N Moléculas Polares Ligação de
Molécula polar sem H ligado a
F, ou O ou N
Moléculas Polares
Ligação de Hidrogênio
H ligado a F, ou O, ou N
Molécula polar sem H ligado a F, ou O ou N Moléculas Polares Ligação de Hidrogênio

Cromatografia emem CamadaCamada DelgadaDelgada

Consiste na separação dos componentes de uma mistura através da migração diferencial sobre uma camada delgada de adsorvente retido sobre uma superfície plana.

mistura através da migração diferencial sobre uma camada delgada de adsorvente retido sobre uma superfície plana.

Aplicações:

Estudos preliminares da complexidade dos componentes de um extrato orgânico;

Investigação de: Casos de envenenamento; ingestão de estimulantes por atletas;

de envenenamento; ingestão de estimulantes por atletas; Estudos de reações : presença de intermediários

Estudos de reações : presença de intermediários estáveis;

Análise da pureza de compostos;

Análise da eficiência de: destilação e cristalização

Vantagens da Cromatografia em Camada Delgada

a. Simplicidade;

b. Baixo custo;

c. Facilidade de remover por raspagem a camada, com espátula fina ou com uma lâmina para microscopia, para recuperar, por eluição, o conteúdo de uma mancha ou de uma banda;

fina ou com uma lâmina para microscopia, para recuperar, por eluição, o conteúdo de uma mancha

Processo de separação varia em função da quantidade de água presente no adsorvente:

Ausência de água

=

Presença de água = Partição

Exemplos de adsorventes:

Sílica-Gel ou àcido Silícico;

Óxido de alumínio ou alumina;

Celulose;

Kieselgur;

Poliamida;

ou àcido Silícico; Óxido de alumínio ou alumina; Celulose; Kieselgur; Poliamida; Kieselgur Alumina Sílica gel

Kieselgur

ou àcido Silícico; Óxido de alumínio ou alumina; Celulose; Kieselgur; Poliamida; Kieselgur Alumina Sílica gel

Alumina

ou àcido Silícico; Óxido de alumínio ou alumina; Celulose; Kieselgur; Poliamida; Kieselgur Alumina Sílica gel

Sílica gel

Sílica gel ou Ácido silícico

 

O

O

O

Si

O

Si

OH

 

O

O

Mais usada na CCD

Substância porosa e amorfa.

Apresenta caráter ácido.

Possui característica polar, devido à presença de grupos hidroxilas denominados silanóis. Deve apresentar número de hidroxilas razoável para ser seletivo na separação de substâncias de diferentes polaridades

Mecanismo de adsorção:

-Si-OH: Interações polares por ligação de hidrogênio, como doador ou aceptor de H. -Si-OH e –Si-O-Si-: dipolo/dipolo

Tratamento térmico eliminação de água ( temperatura recomendada para a sua ativação de 105 a 110ºC)

Caracterização do tipo básico de sílica gel :

G: adição de sulfato de cálcio, gipsita, (aglutinante); H: indica ausência de aglutinante; F: indica adição de substâncias fluorescentes; P: indica adsorvente para uso preparativo; R: indica adsorvente de alto grau de pureza;

Preparação: 30g de sílica com 60-70 mLde água = 5 placas de 20x20cm com espessura de 0,3

mm

CUIDADO! A aspiração da sílica causa silicose, um tipo de inflamação pulmonar crônica!

cm com espessura de 0,3 mm CUIDADO! A aspiração da sílica causa silicose, um tipo de

Sílica C 18

CH 3 CH 3 H C 3 CH 3 Si HO H C 3 O
CH 3
CH 3
H C
3
CH 3
Si
HO
H C
3
O
Si
O Si
H C
3
O
OH
Si
O
O CH 3
CH 3

Usada em cromatografia de fase reversa, em que a fase estacionária é menos polar que a fase móvel

Alumina ou Óxido de Alumínio

Segundo adsorvente mais empregado em CCD;

Há três grupos deste adsorvente:

 

Cl

Al

Cl

 
 

O

Al

Cl

 

O

Al

 

CH

3

ÁCIDA

pH 4,0

ONa BÁSICA Al ONa pH 9,0 O Al ONa O Al
ONa
BÁSICA
Al
ONa
pH 9,0
O
Al
ONa
O
Al

CH 3

H C

3

Al

O

O

Al

O

NEUTRA

pH 7,0

H C

3

H C

3

Al 2+

Mecanismo de adsorção:

Al 3+ : campo positivo favorece interação com moléculas polarizáveis ( sistemas conjugados)

O 2- : sítios básicos favorecem a interação com doadores de H +

A ativação da alumina faz-se,após secagem ao ar durante cerca de 2 h, pelo

aquecimento em estufa a 120ºC por 60 min.

A alumina é caracterizada pelo diâmetro dos poros dos grânulos.

Tipo E: apresenta superfície específica de 120 – 180 m 2 . g -1 .

Tipo T: apresenta superfície específica de 60 – 90 m 2 . g -1 .

Preparação: 5 placas de 20x20 cm e espessura de 0,3 mm, recomenda-se a utilização de uma suspensão de 30 g de alumina em 40 mL de água destilada.

Mecanismo: Partição ou troca iônica. Celulose Existem dois tipos de celulose empregadas em CCD: a

Mecanismo: Partição ou troca iônica.

Celulose

Existem dois tipos de celulose empregadas em CCD: a nativa ( celulose fibrosa) e a celulose microcristalina.

Existem ainda as celuloses quimicamente tratadas aplicadas na CCD:

Kieselgur ou terra de diatomáceas

É um tipo de ácido silícico oriundo de carapaças de diatomáceas fósseis.

Comparado a sílica e alumina é menos adsorvente e com menor poder de resolução.

Poliamida

Separação de fenóis e ácidos carboxílicos

A separação depende da intesindade das forças decorrentes das ligações de hidrogênio com o analito.

Baixa aderência ao vidro: dificuldade de preparação da placas

decorrentes das ligações de hidrogênio com o analito. Baixa aderência ao vidro: dificuldade de preparação da

Técnica Geral

Escolha da fase estacionária; Preparação das placas cromatográficas; Ativação das placas cromatográficas; Seleção da fase móvel; Aplicação das amostras nas cromatoplacas; Preparação da cuba cromatográfica e desenvolvimento do cromatograma; Revelação dos cromatogramas; Documentação; Calculo do fator de retenção Rf;

e desenvolvimento do cromatograma; Revelação dos cromatogramas; Documentação; Calculo do fator de retenção Rf;
e desenvolvimento do cromatograma; Revelação dos cromatogramas; Documentação; Calculo do fator de retenção Rf;
e desenvolvimento do cromatograma; Revelação dos cromatogramas; Documentação; Calculo do fator de retenção Rf;

Escolha da fase estacionária

Liofilicidade e liofobicidade Interação com os componentes (polaridade)

Necessidade de aditivos Aglutinantes Substâncias fluorescentes

Capacidade adsorvedora

Preparação da placas

As placas devem ser: resistentes, inertes aos reagentes e solventes, resistentes à temperatura e uniformes.

Dificuldades: Obtenção de camada uniforme.

inertes aos reagentes e solventes, resistentes à temperatura e uniformes. Dificuldades: Obtenção de camada uniforme.
inertes aos reagentes e solventes, resistentes à temperatura e uniformes. Dificuldades: Obtenção de camada uniforme.

Placas pré fabricadas: Dispensam a fase de preparação; são mais uniformes e homogêneas, melhorando a separação e tornando os valores de Rf mais reprodutíveis.

são mais uniformes e homogêneas, melhorando a separação e tornando os valores de Rf mais reprodutíveis.
são mais uniformes e homogêneas, melhorando a separação e tornando os valores de Rf mais reprodutíveis.

Procedimentos para a preparação das placas Limpeza da placa de vidro detergente e água corrente (eliminação de gordura);

das placas Limpeza da placa de vidro → detergente e água corrente (eliminação de gordura); Secagem

Secagem em estufa

das placas Limpeza da placa de vidro → detergente e água corrente (eliminação de gordura); Secagem

Preparação das camadas finas dos adsorventes:

Utilização de espalhadores ( mais empregada); Submersão, aspersão ou vertendo-se sobre as placas suspensão do adsorvente apropriado.

( mais empregada); Submersão, aspersão ou vertendo-se sobre as placas suspensão do adsorvente apropriado.
( mais empregada); Submersão, aspersão ou vertendo-se sobre as placas suspensão do adsorvente apropriado.
( mais empregada); Submersão, aspersão ou vertendo-se sobre as placas suspensão do adsorvente apropriado.
( mais empregada); Submersão, aspersão ou vertendo-se sobre as placas suspensão do adsorvente apropriado.
Riscar as placas, determinando a altura de ínicio e fim da cromatografia

Riscar as placas, determinando a altura de ínicio e fim da cromatografia

Ativação das placas

Objetivo: retirar substâncias interferentes e eliminar água

Metodologia : Varia de uma adsorvente para outro.

Exemplo : Sílica e alumina estufa 105 – 110 ºC por 30 – 60 min;

Celulose estufa 105ºC por 10 min;

Seleção da fase móvel

Depende: natureza química das substâncias a serem separadas e polaridade da fase móvel.

Método de seleção

separadas e polaridade da fase móvel. Método de seleção Seleção da fase móvel em um sistema
separadas e polaridade da fase móvel. Método de seleção Seleção da fase móvel em um sistema

Seleção da fase móvel em um sistema cromatográfico por adsorção: levar em conta a natureza da fase móvel, da fase estacionária e do soluto.

Seleção da fase móvel em um sistema cromatográfico por partição: constitui um processo de separação que depende das diferenças de solubilidade dos componentes das amostras, nas fases estacionária e móvel e na imiscibilidade dessas fases.

Aplicação das amostras

AA amostraamostra éé aplicadaaplicada nana formaforma dede solusoluççãoão 0,10,1 1%,dependendo1%,dependendo dada sensibilidadesensibilidade dodo revelador,revelador, usandousando solventessolventes maismais volvolááteisteis posspossííveis.veis.

AplicaAplica--sese aa amostraamostra comcom micropipetas,micropipetas, microsseringasmicrosseringas ouou tubostubos capilares.capilares.

amostra com com micropipetas, micropipetas, microsseringas microsseringas ou ou tubos tubos capilares. capilares.
amostra com com micropipetas, micropipetas, microsseringas microsseringas ou ou tubos tubos capilares. capilares.
amostra com com micropipetas, micropipetas, microsseringas microsseringas ou ou tubos tubos capilares. capilares.

AsAs amostrasamostras devemdevem estarestar aa maismais ouou menosmenos 2,02,0 cmcm acimaacima dada parteparte inferiorinferior dada placa,placa, afimafim dede queque essasessas nãonão entrementrem emem contatocontato diretodireto comcom oo solventesolvente durantedurante oo desenvolvimentodesenvolvimento dodo cromatogramacromatograma AlinhamentoAlinhamento horizontalhorizontal uniforme.uniforme.

desenvolvimento do do cromatograma cromatograma Alinhamento Alinhamento horizontal horizontal uniforme. uniforme.

Preparação da cuba

AA cubacuba devedeve estarestar satursaturadaada comcom vaporvapor dede fasefase mmóóvel,vel, parapara isso,isso, colocacoloca--sese papelpapel dede filtrofiltro nana cuba,cuba, queque indicaindica oo nníívelvel dede saturasaturaçção.ão. AA cubacuba devedeve serser dotadadotada tampatampa esmerilhadasesmerilhadas dede formaforma aa vedvedáá--lala hermeticamente,hermeticamente, garantindogarantindo umauma boaboa saturasaturaççãoão dada atmosferaatmosfera interna.interna.

garantindo garantindo uma uma boa boa satura satura ç ç ão ão da da atmosfera atmosfera

Desenvolvimento de um cromatograma numa cuba

AA placaplaca devedeve serser colocada,colocada, rapidamenterapidamente (( parapara evitarevitar evaporaevaporaçção)ão) ee verticalmente,verticalmente, apapóóss aplicadasaplicadas asas amostras,amostras, numanuma cubacuba dede vidrovidro contendocontendo aa fasefase mmóóvelvel desejadadesejada

numa numa cuba cuba de de vidro vidro contendo contendo a a fase fase m m
numa numa cuba cuba de de vidro vidro contendo contendo a a fase fase m m

Revelação dos cromatogramas

AA-- ProcedimentosProcedimentos FFíísicossicos: Luz ultravioleta (aromáticos ou dupla ligação conjugada).

BB-- ProcedimentosProcedimentos BiolBiolóógicosgicos ee EnzimEnzimááticosticos: Antibióticos, Enzimas e Substratos.

CC-- ProcedimentosProcedimentos QuQuíímicosmicos: Aplicação de um reativo químico para formar um derivado colorido ou fluorescente.

Reveladores Físicos

RadiaRadiaççãoão ultravioletaultravioleta parapara compostoscompostos fluorescentes.fluorescentes. Ex:Ex: clorofila.clorofila.

ultravioleta ultravioleta para para compostos compostos fluorescentes. fluorescentes. Ex: Ex: clorofila. clorofila.
ultravioleta ultravioleta para para compostos compostos fluorescentes. fluorescentes. Ex: Ex: clorofila. clorofila.
ultravioleta ultravioleta para para compostos compostos fluorescentes. fluorescentes. Ex: Ex: clorofila. clorofila.
ultravioleta ultravioleta para para compostos compostos fluorescentes. fluorescentes. Ex: Ex: clorofila. clorofila.

Reveladores Químicos

ConsisteConsiste emem utilizarutilizar reveladoresreveladores ququíímicosmicos que,que, emem contatocontato comcom asas substânciassubstâncias dada amostra,amostra, asas tornamtornam coloridascoloridas ee visvisííveis.veis.

tornam coloridas coloridas e e vis vis í í veis. veis. Anisaldeído Ác. fosfomolibdico Iodo Tipos
Anisaldeído Ác. fosfomolibdico Iodo
Anisaldeído
Ác. fosfomolibdico
Iodo

TiposTipos dede reveladoresreveladores ququíímicosmicos AlcalAlcalóóides:ides: DragendorffDragendorff,, iodoplatinatoiodoplatinato FlavonFlavonóóidesides:: NPNP--PEGPEG

Anti-oxidantes: ββ--carotenocaroteno SaponinasSaponinas,, terpenosterpenos ee esteresteróóidesides:: anisaldeanisaldeíídodo sulfsulfúúricorico AntraquinonasAntraquinonas ee cumarinascumarinas:: vaporvapor dede amôniaamônia FenFenóólicos,licos, saponinassaponinas ee terpenterpenóóidesides:: vaporvapor dede iodoiodo ee solusoluççãoão dede CeSOCeSO 44

Reveladores Biológicos

UtilizaUtiliza--sese reareaççõesões enzimenzimááticasticas ouou bacterianasbacterianas parapara tornartornar aa manchamancha visvisíível.vel. Ex.:Ex.: parapara testartestar sese umauma amostraamostra contcontéémm substânciasubstância antianti-- ffúúngicangica,, revelarevela--sese oo cromatogramacromatograma comcom esporosesporos dede fungos.fungos. OsOs fungosfungos nãonão crescerãocrescerão ondeonde houverhouver essasessas substâncias.substâncias.

Os Os fungos fungos não não crescerão crescerão onde onde houver houver essas essas substâncias. substâncias.

Fator de Retenção Rf (Relation front ou Rate factor)

Rf = distância percorrida pela substância / distância percorrida pela fase móvel.

Os valores Rf variam entre 0 e 1 e são dados com dois algarismos após a vírgula.

percorrida pela fase móvel. Os valores Rf variam entre 0 e 1 e são dados com

ParâmetrosParâmetros UtilizadosUtilizados nana CromatografiaCromatografia PlanarPlanar

FartorFartor dede RetenRetenççãoão ((RR ff ):):

R f = d r / d m

ResoluResoluççãoão ((RR ss ):):

R s = 2(d r1 – d r2 ) / (W s1 + W s2 )

EficiênciaEficiência::

n = 16 (d r – W s ) 2

Linha de chegada da FM

Ws1

dm dr2 dr1
dm
dr2
dr1
= 16 (d r – W s ) 2 Linha de chegada da FM Ws1 dm
= 16 (d r – W s ) 2 Linha de chegada da FM Ws1 dm

Ws2

Ponto de partida da amostra Profundidade da FM

Desvantagens da CCD

DifDifíícilcil reprodutibilidade:reprodutibilidade:

quantidadequantidade dede amostraamostra aplicadaaplicada obtenobtenççãoão dede cromatoplacascromatoplacas comcom caractercaracteríísticassticas idênticas.idênticas.

DificuldadeDificuldade dede detecdetecççãoão devidodevido àà difusãodifusão dada amostraamostra

DifDifíícilcil determinadeterminaççãoão exataexata dodo RfRf

difusão da da amostra amostra Dif Dif í í cil cil determina determina ç ç ão
difusão da da amostra amostra Dif Dif í í cil cil determina determina ç ç ão

Constantes Físicas

Constantes Físicas

Bibliografia

COLLINS,COLLINS, CarolCarol H.H. etet al,al, introduintroduççãoão aa mméétodostodos cromatogrcromatográáficos,ficos, 66ªª eded,, ed.ed.

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THETHE MERCKMERCK INDEX,INDEX, 13th,13th, ed.ed. MerckMerck && CO.,CO., Inc.,Inc., Usa,Usa, 2001.2001.

LabjeduardoLabjeduardo iqiq unespunesp brbr

Agradecimentos

• Marcos Antonio Alves (Marquinho)

• Alberto Camilo Alécio (Albertinho)

• Amanda Coelho Danuello