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TÉCNICAS DE COLORAÇÃO COMUNS NA BACTERIOLOGIA

(Gram, Ziehl Neelsen, Fontana Tribondeau, Albert-Laybourn, Wirtz-Conklin)

 INTRODUÇÃO

As bactérias podem ser observadas de duas maneiras, com e sem coloração. Em uma
observação sem coloração (a fresco, através de observação de suspensão bacteriana entre lâmina e
lamínula, ou pela gota pendente), os microrganismos são observados vivos. Geralmente, a observação
a fresco é utilizada para visualização da mobilidade e morfologia de bactérias espiraladas (que podem
ficar distorcidas se fixadas), ou mesmo em outras bactérias, para observar alterações na divisão
celular e formação de esporos. Neste caso, utiliza-se geralmente um microscópio de campo escuro,
pois as bactérias ao microscópio de campo claro tendem a aparecer transparentes, sendo necessária,
muitas vezes, a utilização de filtros de densidade neutra para diminuir a intensidade luminosa e
facilitar a visualização.
Por outro lado, em uma preparação com a utilização de corantes, os microrganismos são
corados, após serem mortos pelas interações químicas que muitas vezes podem ocorrer com auxílio
de calor. Assim, quando utilizamos material fixado e corado, temos várias vantagens, pois além de as
células ficarem mais visíveis após a coloração, podemos transportar estas lâminas sem risco (pois o
material está fixado), bem como diferenciar células de afinidades distintas aos corantes e de
morfologia variada.
Apesar de quimicamente distintas do meio que as rodeiam, as bactérias são quase incolores,
não apresentando contraste suficiente, o que dificulta sua visualização. A diferença química entre as
bactérias e o meio é que nos permite distingui-las por técnicas de coloração. Muitas vezes o corante
não reage com o meio externo, tornando-as quando coradas, mais visíveis ao microscópio. Desta
maneira poderemos observar suas formas fundamentais, dimensões e arranjos.
A coloração apresenta ainda outras vantagens, pois com a utilização da objetiva de imersão na
microscopia óptica teremos uma maior amplificação da imagem, além de nos permitir o estudo de
estruturas da célula bacteriana como: parede celular, endósporos, flagelos e cápsula.
Em geral, as bactérias coram-se com os derivados de anilina (azul de metileno, fucsina, cristal,
violeta, etc.) que são corantes básicos (íon colorido = cátion) e que possuem afinidade pelo
citoplasma destas células. Esta afinidade se deve ao fato do citoplasma bacteriano apresentar carga
elétrica negativa, derivada, principalmente, dos radicais fosfatos dos ácidos nucléicos que aí se
encontram.

 São dois os processos que nos permitem corar as bactérias:

 COLORAÇÕES SIMPLES: nestas colorações utilizamos apenas um corante e ela baseia-se na


diferença química existente entre as bactérias e o meio. Uma vez coradas, apresentam
contraste, podendo ser visualizadas com mais clareza.

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Corantes mais frequentemente utilizados em colorações simples bacterianas
Tipo de Corante (Básico) Incubação
Azul de metileno 1-2 minutos
Cristal violeta 20-60 segundos
Carbolfucsina 15-30 segundos

 COLORAÇÕES DIFERENCIAIS: nestes tipos de coloração utilizamos geralmente mais de um


corante além de mordentes e do diferenciador. Baseia-se na diferença química existente nas
diferentes estruturas celulares, consequentemente na reação diferencial de variadas
bactérias e suas estruturas frente a um determinado corante. No geral, as colorações
diferencias tem valor taxonômico e diagnóstico, são utilizadas para distinguir diferentes tipos
de bactérias e suas estruturas. Dentre os métodos diferenciais existentes, aqueles que
apresentam maior importância dentro de um Laboratório de Microbiologia são o método de
Gram, o método de Ziehl-Neelsen e o método de Albert-Laybourn. Além disso, destaca-se
ainda o método de Fontana-Tribondeau, que apesar de não ser diferencial, ainda é utilizado
em alguns laboratórios, com certa frequência. Existem ainda os métodos de coloração pouco
usados na rotina laboratorial, mas que podem ser úteis quando há necessidade de
evidenciação de alguma estrutura específica, como a coloração de flagelos, esporos e cápsula.

Técnicas de coloração em microbiologia

Simples Diferencial

Separação de grupos Visualização de


microbianos estruturas celulares
(ex. Gram, (ex. esporos, cápsula,
Ziehl-Neelsen) flagelos)

 PREPARAÇÃO DO ESFREGAÇO E FIXAÇÃO DA AMOSTRA PARA COLORAÇÃO:

O esfregaço do material deve ser pouco espesso e homogêneo. Deve ser feito em área de
segurança biológica, a partir de um caldo preferencialmente, ou do material diluído em salina,
espalhado com alça bacteriológica em lâmina de vidro limpa, desengordurada e seca. Posteriormente,
a lâmina deverá ser seca ao ar. Após a secagem, a lâmina deverá ser fixada, antes de iniciarmos o
processo de coloração.
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A fixação evita que as células dos microrganismos sejam lavadas e perdidas durante o processo
de coloração. Além disto, a fixação permite a aderência das células à lâmina, matando os
microrganismos através da coagulação de seus protoplasmas, preservando suas estruturas na forma e
posição originais. O calor é o método de fixação frequentemente utilizado. Para fixarmos, passamos a
lâmina com o esfregaço voltado para cima, por três vezes através da chama. Evitar o
superaquecimento testando a cada passada na chama a temperatura da lâmina no dorso da mão.

 Na secagem de um esfregaço, não devemos assoprar sobre o esfregaço ou balança a lâmina ao


ar, pois outros microrganismos podem contaminar sua amostra a ser avaliada.

Marcar com lápis dermográfico o lado da lâmina oposto ao que realizaremos o esfregaço e
colocar sobre ela o material contendo os microrganismos. Estes poderão ser provenientes de: água,
solo, alimentos, medicamentos, lesão, sangue, urina, líquor, fezes, escarro, secreção uretral, etc. No
caso do material ser obtido a partir de meio de cultura sólido ou de outro que contenha
microrganismos em excesso, deve-se diluí-lo com uma gota de água destilada ou salina estéril
(colocada anteriormente sobre a lâmina com auxílio de uma alça de platina estéril) até obter-se uma
leve opalescência. Espalhar com movimentos circulares até formar uma fina camada sobre a lâmina.
Deixar a lâmina secar ao ar, em repouso. A secagem ao ar evita a formação de aerossóis que
acontecem quando fixamos a lâmina antes que a mesma esteja seca. Os aerossóis se constituem de
fonte de contaminação, pois nestes estão contidos os microrganismos presentes no material.
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1. COLORAÇÃO DE GRAM

Desenvolvida pelo médico dinamarquês Hans Christian Joachim Gram, em 1884. Tem como
fundamento o fato de que as bactérias, quando coradas por derivados próximos da rosanilina (violeta
genciana, cristal-violeta, metilvioleta, etc.) e depois de tratadas pelo iodo (solução iodo-iodetada,
conhecida como lugol), formam um composto de coloração escura roxa ou azul escuro. Este
composto, nas bactérias Gram-positivas, é fortemente retido e não pode ser facilmente removível
pelo tratamento posterior com o álcool, ao passo que nas Gram-negativas este composto é
facilmente descorado pelo álcool.
Muitas explicações já foram sugeridas na tentativa de elucidar o mecanismo da reação de
Gram. As mais plausíveis dizem respeito à diferença na estrutura química da parede celular. Num
primeiro momento, todas as bactérias (G+ e G-) absorvem igualmente o cristal violeta (corante básico
que possui afinidade pelos seus citoplasmas, devido à carga elétrica negativa oriunda principalmente
dos radicais fosfatos dos ácidos nucléicos). A seguir, o lugol reage com o cristal violeta formando o
complexo iodo-cristal violeta (CV-I), que se fixa e cora a célula mais intensamente.
Posteriormente, quando tratamos o esfregaço com álcool, as bactérias se comportam de
maneira diferente:

 As bactérias Gram-positivas não se descoram facilmente pelo tratamento com o álcool. Isto se
explica pelo fato dessas bactérias possuírem uma espessa parede celular (várias camadas de
peptidioglicano), além de outros possíveis componentes, como: ácidos teicóicos, proteínas,
polissacárides e etc. Estas substâncias não são solúveis em álcool, que parece atuar reduzindo
a permeabilidade da parede, dificultando a extração (saída) do complexo CV-I (no citoplasma).
A bactéria Gram-positiva permanece então com a coloração (coram-se em roxo) até o final.

 As bactérias Gram-negativas são descoradas pelo tratamento com o álcool. Estas bactérias
possuem uma delgada camada de peptideoglicano (que não é suficiente para impedir a
passagem do solvente) além de uma membrana externa rica em lipídios (lipoproteina,
fosfolípides e lipídio “A” que participa do LPS). O álcool solubiliza (dissolve) estes lipídeos
(muitas vezes dissolvendo membrana externa), o que contribui para um aumento da
permeabilidade da parede, permitindo a remoção CV-I, descorando a célula. Finalmente, as
bactérias descoradas pelo álcool, por não apresentarem contraste que permita sua
visualização, são contra coradas pelo corante secundário, que é a fucsina (coram-se em rosa).

É importante sempre utilizar culturas jovens para não haver falsos negativos => Gram-labilidade

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ESTRUTURA DA PAREDE CELULAR DE BACTÉRIAS GRAM-NEGATIVO E GRAM-
POSITIVO

Lipopolissacarídeo
(LPS)
Complexo formado pela Membrana externa,
Lipoproteína e Lipopolissacarídeos

Parede celular / peptideoglicano

Membrana citoplasmática

Lipoproteína

Parede de bactéria Gram-negativo

Camada de Peptideoglicano

Membrana citoplasmática

Parede de bactéria Gram-positivo

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Soluções empregadas

 CRISTAL VIOLETA - função: corante principal ou primário (cora igualmente todas as bactérias).

Cristal violeta (violeta de genciana) 1,0 g


Álcool 95° 10 mL
Fenol fundido 2,0 g
H2O destilada 100 mL

Dissolver o corante no álcool, adicionar o fenol fundido pouco a pouco e acrescentar a H2O destilada.
Filtrar após 24 horas de repouso.

 LUGOL (solução de iodo-iodeto de potássio) - função: mordente. O mordente tem a finalidade


de aumentar a afinidade do corante pela célula, permitindo que ela se core mais
intensamente.

Iodo metálico 1,0 g


Iodeto de potássio 2,0 g
H2O destilada 300 mL

Triturar e misturar o iodo metálico ao iodeto de potássio e adicionar a H2O destilada aos poucos.

 ÁLCOOL ETÍLICO - função: agente descorante e diferenciador. Sua utilização permite que
algumas células se descorem mais facilmente que outras. Este comportamento distinto de
descoloração é que diferencia as bactérias. Em alguns manuais, pode-se encontrar
modificações utilizando álcool-acetona, ou éter-acetona. A técnica preconizada pelo
Ministério da Saúde no Brasil sugere a utilização de álcool 99,5oGL.

 FUCSINA ou SAFRANINA - função: contraste, corante secundário ou contra corante. É o


corante que dá às células descoradas uma cor diferente daquelas que mantêm a cor do
corante principal. Os microrganismos que não se descoram retêm a cor do corante principal
(cristal violeta) enquanto que aqueles que se descoram poderão ser visualizados, pois irão se
corar com o corante de contraste (rosa).

Fucsina básica* 1,0 g


Álcool absoluto (etanol) 10 mL
*Usa-se diluída essa solução na diluição 1/10

Safranina 2,5 g
Água destilada 500 Ml
Misturar bem o pó na água até a completa dissolução.

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2. COLORAÇÃO DE ZIEHL-NEELSEN

Desenvolvida pelo bacteriologista Franz Ziehl e pelo patologista alemão Friedrich Carl Adolf
Neelsen, em 1882. Baseia-se na propriedade de poucos gêneros bacterianos (Micobacterium e
Nocardia) de resistirem ao descoramento com uma solução de álcool-ácido, após tratamento pela
fucsina fenicada aquecida, permanecendo coradas de vermelho (BAAR- Bacilo-Álcool-Ácido-
Resistente), diferentemente das outras bactérias, que, por não possuírem esta propriedade, tomam a
cor do corante de fundo, normalmente feita com azul de metileno ou ácido pícrico saturado.
A álcool-ácido-resistência está relacionada à existência na parede celular destas bactérias de
lipídeos fortemente ligados (ex.: ácido micólico), que provocam hidrofobicidade, dificultando a
penetração de corantes aquosos, a ação dos mordentes e dos diferenciadores, o que não ocorre em
outros gêneros bacterianos.
O estudo das micobactérias apresenta grande importância em medicina humana e animal. No
gênero Mycobacterium incluem-se os agentes da tuberculose humana (M. tuberculosis) e bovina (M.
bovis) e da lepra (M. leprae), além de outras espécies, algumas saprófitas e outras oportunistas.
As espécies de gênero Mycobacterium são bactérias com forma de bastonetes, não
esporuladas e aeróbias estritas (o que explica a predileção delas em causar doenças no pulmão), que
não são coradas com facilidade (não são Gram positivas e nem Gram negativas). Estas bactérias
apresentam grande resistência à ação dos agentes químicos (detergentes, ácidos e álcalis), o que
permite o seu isolamento em material contaminado com outros microrganismos.
As micobactérias possuem crescimento lento, mesmo em condições ótimas (seu g = 18 horas),
e exigem meios de cultura complexos para seu crescimento, que ocorre a partir de 12 a 15 dias para
visualização de poucas colônias (as culturas devem ser mantidas em observação de 6 a 8 semanas
para diagnóstico definitivo). Os meios mais usados são: Lowestein-Jensen e Petragnani (meios a base
de ovo). Antes da semeadura do material, se contaminado, deve-se proceder à descontaminação,
para a qual existem vários métodos. O isolamento da bactéria permite a sua tipificação, quer pelo
aspecto da colônia desenvolvida, quer por provas bioquímicas. Também o aspecto microscópico da
cultura é importante (fator corda).

Representação esquemática da parede de micobacterias


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A bacterioscopia do escarro pela coloração de Ziehl-Neelsen é um método simples, porém de extrema
valia no diagnóstico da tuberculose pulmonar. Em nosso meio está sendo largamente utilizado para a
detecção de novos casos da doença, mesmo em postos de saúde do interior do país.

É importante lembrar que o método apresenta apenas valor PRESUNTIVO e não de certeza, isto é,
outras espécies de micobactéria também podem se corar. Assim, o resultado do BAAR positivo num
escarro implica na ideia de que se trata do M. tuberculosis, e, associado aos sinais e sintomas do
paciente, este resultado tem grande margem de segurança, mas não deve ser encarado como valor
absoluto. Contudo, isso não desvaloriza o método, e quando executado adequadamente, permite o
diagnóstico, muitas vezes precoce. O método permite ainda acompanhar a evolução do tratamento,
pela diminuição dos bacilos por campos microscópicos. Além do escarro, outros materiais biológicos
podem ser usados para o diagnóstico da tuberculose pulmonar (lavado brônquico, lavado gástrico,
“swab” de laringe) e de outros órgãos (urina, líquor, peças de biópsia, etc).

Métodos utilizando fluorocromos (microscopia de fluorescência) são também de valor na


bacteriosopia, contudo, são menos difundidos por exigir um equipamento muito mais caro e escasso
em nosso meio e pela falta de experiência da maioria dos nossos técnicos na sua execução.

 Interpretação:

Os BAAR apresentam-se como bastonetes finos, corados em vermelho, sobre fundo corado
em azul. O resultado do exame de escarro corado pelo Ziehl-Neelsen pode ser dado conforme a
seguinte tabela do Serviço Nacional de Tuberculose.

RESULTADO INTERPRETAÇÃO

 Negativo Ausência de BAAR em 100 campos microscópicos

 Exame a ser repetido 1 a 2 BAAR em 100 campos microscópicos

 Positivo
(+) Menos de 10 BAAR em 100 campos microscópicos
(++) 1 a 10 BAAR em 10 campos microscópicos
(+++) 11 a 100 BAAR em 10 campos microscópicos
(++++) Mais de 100 BAAR em 10 campos microscópicos

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Método de Ziehl-Neelsen

A partir de esfregaços em lâminas (ex. escarro bacilífero de paciente tuberculoso), homogêneo,


delgado e fixado.

 Cobrir o esfregaço com solução de fucsina de Ziehl, deixar agir por 5 a 10 minutos, aquecendo
com chama branda (evitar a fervura), até desprendimento de vapores (essa etapa pode ser
realizada em banho-maria, todavia, o tempo de aquecimento dobra para até 20 minutos).

 Lavar em água corrente e descorar com solução de álcool-ácido clorídrico a 1%.

 Cobrir o esfregaço com azul de metileno, por aproximadamente 30 segundos.

 Lavar e deixar secar.

 Examinar a lâmina ao microscópio com a objetiva de imersão.

Soluções empregadas

 Fucsina de Ziehl

Fucsina básica 1,0 g


Álcool absoluto (etanol) 10 mL

Dissolver e acrescentar:

Fenol aquoso (*) 5 mL


H2O destilada 100 mL

Repousar por 48 horas e filtrar em papel de filtro de média porosidade. (*) Fenol aquoso: l00g de
fenol para 100 mL de H2O.

 Azul de Metileno

Azul de metileno 2,0 g


Álcool absoluto (etanol) 10 mL

Dissolver e acrescentar fenol aquoso (*) 2,2 g

Agitar e completar com H2O destilada 100 mL

(*) Fenol aquoso: l00 g de fenol para 100 mL de H2O.

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3. COLORAÇÃO DE FONTANA TRIBONDEAU

Método desenvolvido em 1920, não é um método de coloração verdadeiro. Na realidade,


trata-se de uma técnica de impregnação pela prata usada para auxiliar a visualização de bactérias
espiraladas, as quais, geralmente, são muito finas e se coram de forma insuficiente pelo Gram (ex.:
Leptospira interrogans e treponemas). A partir desta técnica, as espiroquetas aparecem em cor
marrom-escura ou negra, sobre um fundo amarelo-castanho ou marrom claro.
Atualmente, os laboratórios têm utilizado mais a microscopia de campo escuro a fresco para
visualizá-las, ou os métodos de imunoflorescência

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Método de Fontana-Tribondeau

A partir de esfregaços em lâminas homogêneo, delgado e fixado.

 Cobrir o esfregaço com a solução fixadora (renová-la 3x, por 30 segundos).

 Cobrir com solução mordente, aquecendo a lâmina até emitir vapores. Aguardar 30 segundos
e lavar em água corrente.

 Tratar pela solução impregnadora de prata (nitrato de prata amoniacal), aquecendo


ligeiramente a lâmina até a emissão de vapores, deixando agir por 30 segundos (a preparação
toma a cor marrom).

 Secar ao ar. Examinar a lâmina ao microscópio com a objetiva de imersão.

Soluções empregadas

 Líquido de Ruge (Fixador)

Ácido acético glacial 1 mL


Formalina 40% 2 mL
Água destilada 100mL

 Mordente

Ácido tânico 5g
Ácido fênico (fundido) 1 mL
Água destilada 100 mL

Dissolver o ácido fênico na água. Colocar o ácido tânico em um balão, adicionar cerca de 10 mL da
água fenicada e misturar bem, para dissolver o máximo possível. Acrescentar o restante da água
fenicada para completa dissolução. Filtrar no dia seguinte, se necessário.

 Nitrato de Prata Amoniacal (solução impregnadora)

Nitrato de prata 5g
Água destilada 100 mL

Reservar 5 mL da solução acima e, aos 95 mL restantes, adicionar amônia, gota a gota (misturando
sempre), até que o precipitado de cor castanho-acinzentada, que se forma, se dissipe. Adicionar,
então, as gotas da solução de nitrato de prata reservada, até desenvolver uma leve opalescência que
persiste após agitação. Armazenar em frasco escuro.
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4. COLORAÇÃO DE ALBERT-LAYBOURN

Foi sugerida inicialmente por Henry Albert, em 1920, e modificada por Ross Laybourn, em
1924. Baseia-se no fato de algumas bactérias apresentarem corpúsculos citoplasmáticos localizados
nas regiões polares (corpúsculos metacromáticos, ou corpúsculos de Babes Ernst, ou também
chamadas de granulações de volutina), que se coram pelo Lugol forte (de cor marrom), se
evidenciando, em contraste com o corpo bacilar, que se cora em verde-azulado pela solução de
Laybourn.
Tais características são observadas nas corinebactérias e sua presença é associada aos
sintomas clínicos característicos da difteria, o que possibilita um diagnóstico presuntivo da doença,
pela microscopia ótica.
O método é auxiliar no diagnóstico da difteria. Seu diagnóstico é geralmente clínico, mas a
pesquisa de bacilos metacromáticos cuidadosamente coletados a partir da face anterior da
pseudomembrana pode ser um importante auxiliar diagnóstico. O cultivo de corinebactérias é
possível, mas seu uso clínico é bastante reduzido. O exame direto de esfregaço de naso e orofaringe
continua é padrão outro para triagem de infecção pelo Corynebacterium diphtheriae.

Indicações: Método auxiliar no diagnóstico da difteria.


Interpretação clínica: Sugere positividade a presença de bacilos gram-positivos pleomorfos, em
grande número (predominância), com morfologia e distribuição características. À coloração de Albert-
Laybourn, presença de grânulos metacromáticos no citoplasma de bacilos, além da morfologia e
distribuição característica (em paliçada, letras chinesas). Tais achados sugerem bacilo diftérico e
devem ser comunicados imediatamente ao médico.

A difteria, que também pode ser chamada de crupe, é uma doença infecciosa causada por uma
bactéria conhecida como Corynebacterium diphtheriae, transmitida de pessoa para pessoa por meio
das vias respiratórias ou então através de contato físico. As bactérias formam placas amareladas que
se alojam nas amígdalas, laringe, faringe, nariz e até mesmo na conjuntiva e na pele. Em casos
severos da difteria, inchaços no pescoço aumentando os gânglios linfáticos podem ocorrer causando
dificuldade para respirar ou bloquear totalmente a respiração, levando o paciente à morte.

A doença pode ser prevenida com a vacinação. A difteria afeta mais crianças do que adultos. Apesar
de ser mais comum nos mais jovens, a mortalidade da doença afeta de 5 a 10% das crianças e 20%
adultos com mais de 40 anos de idade.

A transmissão é feita através de gotículas de secreção respiratória, com espirros, tosse ou até mesmo
durante conversas, e também pode ocorrer através do consumo de leite cru. Com período de
incubação médio de 3 a 5 dias, a pessoa infectada pode transmitir a doença por até 15 dias após o
primeiro contato. Após o tratamento, a bactéria pode ficar inativa no corpo por 6 meses ou mais.

As pessoas mais suscetíveis à doença são aquelas que estão com a imunidade baixa, vivem em
condições de superlotação ou insalubres, vão à cidades em que a difteria é endêmica, e que não
receberam a vacina.

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Método de Albert-Laybourn

A partir de esfregaços em lâminas homogêneo, delgado e fixado.

 Cobrir o esfregaço por 3 a 5 minutos, com a solução de Albert-Layborn.

 Escorrer (sem lavar).

 Cobrir com solução Lugol forte, por aproximadamente 2 minutos.

 Examinar a lâmina ao microscópio com a objetiva de imersão

Soluções empregadas

 Solução de Albert-Laybourn

Azul de toluidina 0,15 g


Verde de malaquita 0,20 g
Ácido acético glacial 1 mL
Álcool 95° 2 mL
Água destilada 100 mL

 Solução de Lugol Forte

Iodo metálico 2,0 g


Iodeto de potássio 3,0 g
Água destilada 300 mL

Guardar em frasco âmbar ao abrigo da luz.

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5. COLORAÇÃO PARA ESPOROS COM VERDE MALAQUITA (WIRTZ-CONKLIN)

A descoberta dos endósporos bacterianos data de 1838, tendo sido descritos por Ehrenberg
como sendo corpos refratários à coloração, formados no interior de células bacterianas. Estudos,
feitos de modo independente por Cohn e Koch em 1876, demonstraram a resistência destas
estruturas a temperaturas elevadas (100ºC) e a sua germinação sob condições diferentes das que
tinham permitido a sua formação. Koch, em 1888, descreveu os principais acontecimentos envolvidos
na esporulação e germinação de Bacillus anthracis.
Define-se como espessamento da membrana celular, formando uma forma rígida, que pode
ser esférica ou alongado no interior do qual a célula é capaz de resistir ao processo de perda de água
(desidratação) e altas temperaturas ou a congelamentos, ficando no estado de dormência por tempo
indeterminado. Durante o tempo de dormência esse organismo se divide uma ou mais vezes, quando
o ambiente torna-se novamente favorável o esporo se rompe liberando novos indivíduos.
Assim, considera-se o esporo ou endósporo bacteriano é uma célula de parede espessa
formada no interior de algumas bactérias. É muito resistente ao calor, à dessecação e outros agentes
químicos e físicos, sendo capaz de permanecer em estado latente por longos períodos e, em seguida,
germinar, dando origem a uma nova célula vegetativa. O esporo é formado por vários envoltórios. O
primeiro, mais externo, fino, formado por proteínas, é denominado exospório. Abaixo do exospório
fica a capa do esporo, formada por várias camadas de proteínas ricas em ligações de dissulfetos,
responsáveis pela resistência do esporo a agentes químicos e físicos. Mais internamente fica o córtex
do esporo, formado por camadas de peptidioglicano. Abaixo do córtex localiza-se o protoplasto ou
núcleo do esporo formado pela parede celular, citoplasma, material genético etc, provenientes da
célula vegetativa. Os esporos são difíceis de serem corados, pois os corantes geralmente não
atravessam a parede do esporo a não ser que seja utilizado o calor.
A esporulação, processo pelo qual alguns gêneros de bactérias formam esporos, ocorre
quando estas bactérias estão frente a situações críticas para sua sobrevivência, ou seja, as condições
ambientais são adversas para o crescimento bacteriano. De maneira geral, isto ocorre quando há falta
de nutrientes, como carbono ou nitrogênio. Na fase esporulada, as bactérias não realizam atividade
biossintética e reduzem sua atividade respiratória. Nesta fase também não ocorre a multiplicação e
crescimento bacteriano. Esta incapacidade de reprodução pode ser devida a basicamente dois
fatores: (i) incapacidade de iniciar a germinação; (ii) incapacidade de duplicar macro moléculas críticas
para seu metabolismo. Assim que o ambiente se torna favorável, estes esporos podem voltar a se
reproduzir e multiplicar.

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A parede do esporo é relativamente impermeável, porém os corantes podem atravessá-la mediante o
aquecimento da preparação. A seguir, a mesma impermeabilidade serve para evitar a descoloração
do esporo pelo tratamento com álcool, suficiente para descorar as células vegetativas, que podem ser
finalmente contracoradas. Comumente, os esporos são corados com verde de malaquita ou
carbolfucsina.

A exposição prolongada ao corante verde malaquita, associado ao aquecimento, permite a


penetração do corante e a coloração do esporo por um verde intenso. Como contraste
(contracorante), utiliza-se a safranina, que cora outras estruturas em vermelho, facilitando a
diferenciação dos esporos.

Método para coloração de esporos de Wirtz-Conklin

A partir de esfregaços em lâminas homogêneo, delgado e fixado.

 Cobrir o esfregaço com o corante verde malaquita.

 Aproximar da chama até que desprenda vapor, sem deixar que o corante ferva. Afastar do
fogo e, após 1 a 2 minutos, repetir a operação por 3 a 4 vezes.

 Lavar suavemente com água, evitando o choque térmico, que poderá quebrar a lâmina.

 Adicionar a solução de safranina por 30 segundos, lavar e secar.

 Observar ao microscópio com objetiva de imersão.

Soluções empregadas

 Solução A: Verde malaquita a 5%

Verde malaquita 2,5 g


Água destilada 50mL

Misturar e deixar em repouso durante uma noite para dissolver.

 Solução B: Safranina

B.1 Solução estoque


Safranina 50 g
Etanol 95% 2000mL

B.2 Solução de trabalho


Solução estoque de Safranina (B.1) 300 mL
Água destilada 2700 mL
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 MATERIAL POR BANCADA

 04 Lâminas de vidro para realização de esfregaços de espécime clínico para pesquisa de


bastonetes e cocos Gram positivos, Gram negativos, bactérias espiraladas, bacilos
metacromáticos e bastonetes com endósporos.
 01 Lâmina de vidro com esfregaço já fixado de secreção de trato respiratório de pacientes
com suspeita clínica de tuberculose para pesquisa de micobactérias (baciloscopia).
 Bateria de coloração de Gram
 Bateria de coloração de Ziehl-Neelsen
 Bateria de coloração de Albert-Laybourn
 Bateria de coloração de Albert-Laybourn
 Bateria de coloração de esporos de Wirtz-Conklin
 04 Swabs de algodão para coleta de espécime clínico;
 01 Alça bacteriológica;
 01 Tubo contendo solução salina para diluição de massa celular
 01 Placa de petri com culturas microbianas diversas para coloração de Gram
 Óleo mineral para microscopia
 Microscópios ópticos com objetiva de imersão

 Para controle experimental, em prática demonstrativa, lâminas coradas e prontas já


focalizadas nos microscópios para controle experimental

 EXECUÇÃO

 Cada grupo deverá reproduzir as seguintes técnicas de coloração:

o Coloração de Gram;
o Coloração de Fontana Tribondeau
o Coloração de Ziehl-Neelsen
o Coloração de Albert-Laybourn
o Coloração de Wirtz-Conklin

 As Lâminas devem ser identificadas e analisadas por microscopia óptica com a objetiva de
imersão.

 INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS E DISCUSSÃO

Avaliar as reações morfotintoriais nos esfregaços bacterianos, avaliando as formas, os


tamanhos, os arranjos celulares e as estruturas evidenciadas pelas diferentes técnicas de coloração.

Versão: 01.2018

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