FACULTAD DE CIENCIAS ECOLOGÍA

UNJBG E.A.P. BIOLOGÍA MICROBIOLOGIA MICROBIANA

DETERMINACIÓN DE
LA BIOMASA
MICROBIANA

DETERMINACIÓN DE LA BIOMASA MICROBIANA

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 I. INTRODUCCIÓN

Biomasa es un termino general que se refiere a los

M’os presentes en un sistema.

Cantidad

masa de
células personas
seres vivos

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 I. INTRODUCCIÓN

La determinación de la biomasa es una de las

variables más importantes de un bioproceso

su determinación nos
lleva a la comprensión de
la eficiencia del mismo.
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 I. INTRODUCCIÓN

Consumo
de
nutrientes

Es una
variable
clave para Calculo de
establecer: balance de
Tasas de masas de
producción cualquier
proceso
biológico.

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 I. INTRODUCCIÓN
• Existen 2 métodos principales de estudiar
poblaciones microbianas en la naturaleza:

MÉTODO DIRECTO

MÉTODO INDIRECTO

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 A. MÉTODO DIRECTO

Observación de los
organismos

En el microscopio Conteo del número

óptico de M’os

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 A. MÉTODO DIRECTO

• Requiere de preparaciones puras sin ningún tipo

de partículas que puedan interferir en los
resultados y:

 Se refiere básicamente a la medida de la masa

celular.

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 A. MÉTODO DIRECTO

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 PESO SECO

• La cantidad total de biomasa presente en una

muestra puede medirse:

 En términos de peso seco por unidad de

volumen.

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 PESO SECO

DESVENTAJAS
Se puede determinar M’os activos y no, material inerte,
materia orgánica y polímeros extracelulares.

Los componentes volátiles de las células pueden perderse en el

secado.
La muestra seca puede recobrar humedad durante el
pesado.
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 PESO HÚMEDO

• Se obtiene a partir de una muestra en

suspensión que es pesada luego de la
separación de las células por filtración o
centrifugación.

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 PESO HÚMEDO

Técnica útil para

grandes volúmenes
de muestra

El diluyente queda
atrapado en el
espacio intercelular
y contribuye al peso
total de la masa.

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 B. MÉTODOS INDIRECTOS

Actividad Consumo de un
nutriente
metabólica característico

MÉTODOS Métodos Espectrofotométricos

INDIRECTOS turbidimétricos Nefelométricos

Determinación
nitrógeno total

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B. MÉTODOS INDIRECTOS
Medidas de turbidez

Los métodos turbidimétricos de análisis

tienen como fundamento:

La formación de partículas de pequeño

tamaño que causan la dispersión de la luz
cuando una fuente de radiación incide
sobre dichas partículas.

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 B. MÉTODOS INDIRECTOS
Medidas de turbidez

El grado de dispersión de
la luz (o turbidez de la
solución) es proporcional
al número de partículas
que se encuentran a su
paso, lo cual depende de
la cantidad de analito
presente en la muestra.

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 B. MÉTODOS INDIRECTOS
Escala de Mc Farland

• Se trata de una serie de patrones de turbidez

previamente calibrados.

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 B. MÉTODOS INDIRECTOS
Escala de Mc Farland
• Se basa en la capacidad de:

1% de
Cl2Ba

Precipitado
de BaSO4
Cantidades
crecientes
de SO4H2
al 1%

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B. MÉTODOS INDIRECTOS
Escala de Mc Farland

Su utilidad es la de
poder elaborar
suspensiones
bacterianas,

Ajustadas a un
patrón y valorar su
concentración

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 B. MÉTODOS INDIRECTOS
Espectrofotometría

• Se caracteriza por su precisión, sensibilidad y su

aplicabilidad a moléculas de distinta naturaleza
(contaminantes, biomoléculas, etc.) y,

 Estado de agregación (sólido, líquido, gas).

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 B. MÉTODOS INDIRECTOS
Espectrofotometría

• Las principales ventajas de la

espectrofotometría son:

 Sensibilidad relativa elevada.

 Facilidad para realizar mediciones rápidas.

 Grado de especificidad relativamente elevado.

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 B. MÉTODOS INDIRECTOS
Espectrofotometría
• Los espectros de absorción se miden mediante
un instrumento denominado espectrofotómetro.

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 B. MÉTODOS INDIRECTOS
Espectrofotometría
• El espectrofotómetro, mide la absorbancia, A,
que se define por:

D.O. = A = -logT/100
Mide la densidad óptica (D.O.), es decir la absorbancia.
T= transmitancia

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 II. OBJETIVOS

• Lograr determinar la biomasa Microbiana, a

través de diversos métodos.

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 III. MATERIALES Y MÉTODOS

• Métodos directos: determinación del peso

húmedo y peso seco
 Materiales:
Levadura de panificación “Fleishmann”
Agua destilada
Pipetas de 5ml
Tubos de ensayo
Balanza analítica
Centrifuga
Estufa
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 III. MATERIALES Y MÉTODOS

• Métodos directos: determinación del peso

húmedo y peso seco

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 III. MATERIALES Y MÉTODOS

• Peso Seco:
 Tomar muestras de 5 mL de la solución inicial y
colocar en 3 tubos de ensayos previamente pesados.
 Luego llevar los tubos a la centrifuga y hacerlo girar
a 4 000 rpm, por un tiempo de 10 minutos.
 Luego pesar cada tubo de ensayo en la balanza
analítica y anotar los pesos.
 Posteriormente, llevar los tubos a estufa, a una Tº de
105 ºC por un tiempo promedio de 3 horas.
 Pasado el tiempo anotar, los pesos y luego obtener
un promedio. (Anexo 1).
DETERMINACIÓN DE LA BIOMASA MICROBIANA 26
 III. MATERIALES Y MÉTODOS

 Por ultimo expresar los datos en la siguiente

formula.

Fuente: Arnáiz,C,Determinación De La Biomasa En Procesos Biológicos. Sevilla

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 III. MATERIALES Y MÉTODOS

• Peso Húmedo:
 Tomar muestras de 5 mL de la solución inicial y
colocar en 3 tubos de ensayos previamente
pesados.
 Llevar los tubos a la centrifuga, donde se hacen
girar a 4 000 r.p.m., por un tiempo de 10
minutos.
 Luego pesar cada tubo de ensayo en la balanza
analítica, anotamos los pesos y luego promediar
(Anexo 1).
DETERMINACIÓN DE LA BIOMASA MICROBIANA 28
 III. MATERIALES Y MÉTODOS

 Por ultimo expresar los datos en la siguiente

formula.

Fuente: Arnáiz,C,Determinación De La Biomasa En Procesos Biológicos. Sevilla

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Figura 01: Metodología de peso seco y húmedo
Fuente: Google Imágenes
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 III. MATERIALES Y MÉTODOS

• Métodos indirectos: determinación de turbidez a través

de la Escala de McFarland y espectrofotometría
 Materiales:
 cepa de E. coli
 Agar Nutritivo
 Solución Salina 0.85%
 BaCl2 1%
 H2SO4 1%
 Agua destilada estéril
 Tubos de ensayo
 Pipetas
 Espectrofotómetro

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 III. MATERIALES Y MÉTODOS

• Métodos indirectos: determinación de

turbidez a través de la Escala de McFarland
y espectrofotometría

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 III. MATERIALES Y MÉTODOS

• Nefelométria de McFarland:
 Agregar los reactivos a los tubos rotulados de
manera apropiada (1 a 10) en las cantidades que
se indican a continuación:

Estándares de sulfato de bario

Tubo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

BaCl2 1%(ml) 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0

H2SO4 1%(ml) 9.9 9.8 9.7 9.6 9.5 9.4 9.3 9.2 9.1 9

Densidad aprox. De
3 6 9 12 15 18 21 24 27 30
células (x108/ml

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 III. MATERIALES Y MÉTODOS

 Sellar los tubos y rotular. El precipitado de BaSO4

suspendido corresponde aproximadamente a la
densidad de células homogéneas de
Escherichia coli por mililitro.
 Luego, se toma una alícuota de la muestra de
bacterias.
 Se inocula en un tubo contenido de solución
salina fisiológica (0,85%) y se procede a
comparar el tubo con los de la escala estándar y
obtener los resultados de la densidad.

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Figura 02: Escala de Mc Farland

Fuente: Google Imágenes

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 III. MATERIALES Y MÉTODOS

• Espectrofotometría:
 En el espectrofotómetro establecer la
absorbancia a 546 nm de longitud de onda, de
cada uno de los tubos de la escala de
MacFarland.
 Con estos datos, teniendo en cuenta las
concentraciones celulares correspondientes a
cada tubo y mediante el uso de un papel
milimetrado semilogarítmico establezca una
curva patrón de número de bacterias con relación
a la absorbancia.

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 III. MATERIALES Y MÉTODOS

 Prepare diluciones seriadas de la muestra

biológica en SSF. Para ello, utilice los tubos de
15x125mm y las pipetas estériles. Realice las
siguientes diluciones: 10-1, 10-2,10-3,10-4,y 10-5.
 Establezca la absorbancia de las diluciones y a
través de la curva patrón determine el número de
bacterias presentes en cada dilución y teniendo
en cuenta el factor de dilución del tubo trabajado,
establezca el número de bacterias por mililitro.
 Promediando estos datos, determine el número
de bacterias presente en la muestra.

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Figura 03: Espectrofótometro

Fuente: Google Imágenes

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 III. MATERIALES Y MÉTODOS

 Adicional a esto realice una siembra

incorporación de las muestras en una placa con
agar nutritivo, incubarlas a 37ºC por horas;
realice un recuento y compare si los resultados
obtenidos concuerdan con lo esperado.

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Figura 04: siembra por incorporación

Fuente: propia
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Escuela De Bioanalisis-Carrera De Microbiología

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