BIOLOGIA CELULAR

AULAS PRÁTICAS

1º ANO
2010/2011

Protocolos Práticos

Biologia Celular

SEGURANÇA EM L ABORATÓRIO
1. INTRODUÇÃO
Embora todo o trabalho efectuado no laboratório de Biologia seja potencialmente perigoso, e as pessoas que nele trabalham estejam sujeitas a numerosos riscos e perigos, é importante ter a noção de que a grande a maioria doa acidentes que ocorrem em laboratório não se devem a procedimentos que são tecnicamente perigosos em si mesmos mas a faltas de atenção e cuidado com o que se está a fazer. É muito importante ter a noção de que a falta de atenção com o trabalho no laboratório poderá muito provavelmente resultar, não só em fracos resultados experimentais, mas também em possíveis acidentes. O trabalho em laboratório envolve uma grande diversidade de riscos, sendo necessário um conhecimento sério e aprofundado dos materiais, técnicas e equipamentos utilizados assim como dos riscos que envolvem e atitudes a adoptar de forma a minimizá-los. O objectivo desta aula é o de alertar e familiarizar os alunos com os principais perigos e riscos associados com o trabalho no laboratório de Biologia, assim como com a forma de os reduzir ao mínimo através da utilização de boas práticas de trabalho que permitam a realização de um bom trabalho de forma segura.

2. ATITUDE A ADOPTAR NO LABORATÓRIO
DSer responsável. D Planear sempre o trabalho a realizar, conhecer bem todos os procedimentos

e estar consciente dos potenciais riscos associados, e adoptar as atitudes adequadas de modo a evitá -los.

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3. REGRAS DE SEGURANÇA
D Não é permitido comer, beber, fumar ou aplicar cosméticos no laboratório.

Manter os dedos, lápis e outros materiais afastados da boca e face.
D Dentro do laboratório deve usar sempre uma bata, de forma a proteger -se a

si próprio e o seu vestiário de contaminações acidentais com culturas, corantes ou outros produtos químicos.
D Usar luvas apropriadas sempre que se manipulam produtos potencialmente

perigosos; as luvas deverão ser substituídas sempre que contaminadas ou danificadas; deverão ser retiradas no fim do trabalho ou sempre que este for interrompido, de modo a evitar a contaminação de objectos do laboratório ou fora dele, como as maçanetas das portas, interrupto res, telefones, etc.
D No início de cada aula, proceder à desinfecção da área de trabalho,

utilizando um desinfectante impregnado em papel absorvente. Este procedimento deve ser repetido no final do trabalho laboratorial.
D Manter perto da área laboratoria l somente o material estritamente necessário

(papel e lápis) para registo das observações. Conservar sempre a bancada limpa e arrumada.
D No início e no fim de cada aula lavar as mãos com um antisséptico. Proceder

da mesma forma sempre que suspeite ter contactado com materiais contaminados.
D Para pipetar, utilizar sempre um dispositivo de pipetagem. A pipetagem à boca é proibida. D Mudar de luvas e lavar as mãos sempre que haja contaminação evidente

com o produto derramado.
D Conhecer a localização e funcionamento dos sistemas de segurança

(telefone, saídas de emergência, extintores, chuveiros).
D Colocar todo o material utilizado durante o trabalho nos locais apropriados:

Material reutilizável: Em contentores apropriados para posterior lavagem e tratamento; material contendo substâncias potencialmente perigosas deverá ser previamente tratado de forma apropriada.
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Protocolos Práticos Material não reutilizável:

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- Vidro e metal cortante (lâminas de bisturi, agulhas de seringa): em lixo próprio devidamente rotulado. - Material contaminado com produtos biológicos: Em lixo próprio para autoclavar/incinerar. - Substâncias químicas perigosas: em locais apropriados, de acordo com o composto em questão e em contentores devidamente rotulados. - Não despejar nos canos qualquer material perigoso/infeccioso.
D Todos os materiais para guardar ou incubar deverão ser devidamente

rotulados, com indicação de conteúdo, nome do utilizador e data.

RISCOS ASSOCIADOS AO TRABALHO DE LABORATÓRIO E PRECAUÇÕES A TOMAR:

4. PRINCIPAIS

4.1 Equipamento de vidro

Riscos: O material de vidro é o mais utilizado no laboratório, e a fonte mais comum de acidentes, resultantes de cortes provocados por vidro partido, incluindo: - cortes provocados pela introdução de tubos de plástico em tubos ou pipetas de vidro - cortes provocados por vidro partido e outros materiais cortantes colocados de forma imprópria em contentores de lixo normal Precauções: - Antes de usar, inspeccionar o material de vidro de forma a garantir que se encontra em perfeitas condições ± sem quebras, falhas ou rachas. - Colocar o vidro partido e os materiais de vidro não reutilizáveis (por ex. Pipetas) em contentores de lixo próprios. Não utilizar os contentores de
lixo geral. Recolher vidros partidos imediatamente e de forma muito

cuidadosa. - Não guardar ou deixar material de vidro na beira de bancadas ou prateleiras.
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- Cuidado com o vidro quente. Colocar num local em que não possa ser acidentalmente tocado até arrefecer.

4.2 Equipamento eléctrico

Não utilizar fichas e tomadas partidas ou danificadas.

4.3 Equipamento de aquecimento: Bicos de Bunsen, placas e banhos de aquecimento

Riscos: Queimaduras provocadas por superfícies e líquidos quentes, vapores ou chamas. Precauções: - Todos os aparelhos de aquecimento (com excepção dos banhos) deverão ser mantidos afastados de materiais e substâncias inflamáveis. - Os bicos de Bunsen nunca deverão ser usados perto de contentores abertos de líquidos inflamáveis, nem em ambientes onde estejam presentes concentrações apreciáveis de vapores inflamáveis. - A chama poderá não ser visível em condições de luz muito intensa. Nunca deixar uma chama acesa sem vigilância. - O vapor dos banhos de aquecimento poderá provocar queimaduras. Ter atenção, especialmente quando se abrem as tampas de banhos a temperaturas elevadas.

4.4 Fontes de luz ultravioleta

Riscos: Queimaduras e danos graves na pele e nos olhos. Precauções - Utilizar protecção adequada para os olhos ± óculos ou máscaras de material opaco aos raios UV.
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odas estas subst ncias apresentam um risco elevado de provocar incêndio no laboratório. 5. ler empre o ui adosamente antes de os utili ar. nos rótulos.Bi l 4.5 Rel ti manual E ente i t m equi ent utili no l orat rio. que se especificam em seguida: Riscos físicos Riscos para a saúde Riscos Físicos As subst ncias químicas que representam riscos físicos são geralmente identificadas pela presença. tendo especial e instruções atenção aos riscos associados e ao modo de os utili ar de modo a arantir a segurança e a manutenção dos aparel os em om estado. SE Q Í I s riscos associados manipulação e utili ação de subst ncias químicas são essencialmente de dois tipos. ³F+´: E tremamente inflamável Subst ncias que usam o símbolo do fogo: subst ncias inflamáveis. que se relacionam com as propriedades das subst ncias: Símbolo do Fogo ³F´: uito inflamável. combustíveis ou piróforas. dos seguintes símbolos e letras. Símbolo de E plosão ³E´: E plosivo Símbolo ³ ´ em chamas ³ ´: idante ¦¢ ¥ ¤£ ¢ ¡    i l l -5- P t ¨ § ©¦ ¨   §   ¦ l P ti .

mas não causam danos tecidulares permanentes prejudiciais que produtos tóxicos. Provocam reacção alérgica cut nea ou respiratória. crónicos ou agudos. s produtos perigosos para a saúde. por três vias: Inalação Absorção pela pele ou entrada através de feridas Ingestão s efeitos provocados pelas subst ncias químicas no organismo relacionam-se com a sua toxicidade capacidade de uma subst ncia causar um efeito nocivo) e com a dose quantidade) a que o organismo é exposto. ICAÇÃO OS P ODUTOS QUÍ ICOS PRI CIPAIS TIPOS DE RISCOS PARA A SAÚDE CLASSI DE ACORDO orrosivos ³ ´ Podem queimar. apenas representam um risco quando entram em contacto com o organismo. Prejudiciais ³Xn´)/Irritantes ³Xi´) Por contacto causam vermelhidão ou inchaço da pele ou olhos. para as subst ncias químicas.venenos ³ +´) danos menores danos menores que produtos Sensibili antes morte ou danos muito graves.       i l l COM OS      P t l P ti ausam a -6- . mesmo em doses reduzidas. irritantes corrosivos) . o que pode ocorrer.Bi l Riscos para a Saúde ma subst ncia química considerada nociva para a saúde quando existem evidências de que pode provocar efeitos nocivos. em pessoas ou animais expostos a esse produto. irritar ou atacar destrutivamente os tecidos vivos. óxicos ³ ) / uito tóxicos .

É essencial ter a noção da necessidade de evitar práticas perigosas no laboratório e dos perigos colocados por um fogo que atinge proporções descontroladas.Não usar os elevadores echar as portas e se possível as janelas. desde que tal não ponha em risco a sua própria segurança . PREVENÇÃO DE INCÊNDIOS A prevenção de incêndios é tão importante como o desenvolvimento de meios de os combater.Evacuar o edifício o mais rápido possível.1 Medidas de Prevenção . Biologia Celular Teratogéneos ± Afectam o desenvolvimento embrionário normal.Protocolos Práticos Carcinogéneos ± Podem provocar cancro. Nunca deverão ser utilizados antes de adquiridos esses conhecimentos.2 Medidas de emergência em caso de incêndio . à medida que se abandonam as salas -7- .Trabalhar com produtos inflamáveis em hotes .Activar o sistema de alarme e ligar o 112 .Ajudar qualquer pessoa que se encontre em perigo. de forma calma e ordenada . extintores e mangueiras . aparelhos eléctricos e outras possíveis fontes de ignição de forma cuidadosa 6. podendo causar malformações congénitas ou morte do feto. cuja utilização apresenta riscos específicos pelo que requer um conhecimento e preparação técnica especiais. 6. fontes de aquecimento. 6.Conhecer a localização dos alarmes de incêndio.Utilizar fósforos. Radioactivos ± Estes produtos representam uma classe especial de produtos químicos.

3 Inalação de produtos químicos . dar-lhe a beber água ou leite 7.Lavar com água abundante no sentido do nariz para a orelha durante pelo menos 15 minutos .Se a vítima estiver consciente e for capaz de engolir.Não aplicar gorduras nas zonas afectadas .No caso de a área afectada cobrir uma extensão larga.Remover qualquer peça de roupa que cubra a zona afectada .Cobrir com um penso seco e estéril .Evacuar a área e mover a vítima para local arejado .1 ueimaduras químicas No caso de queimaduras provocadas pelo contacto de produtos químicos nocivos com a pele ou olhos.Ligar 112 -8- .Ligar 112 7.Remover lentes de contacto tão depressa quanto possível .Utilizar protecção adequada de modo a não ser também afectado Pele: .Lavar a zona afectada com água abundante durante pe lo menos 15 minutos . ligar 112 e pedir ajuda Olhos .Ligar 112 . PRIMEIROS SOCORROS 7.Abrir as pálpebras de modo a assegurar uma lavagem eficaz .Protocolos Práticos Biologia Celular 7. seguir os seguintes procedimentos: .2 Ingestão de produtos químicos .

reactividade. elaborado de mo do a fornecer tanto a quem os utiliza como ao pessoal de emergência todas as informações referentes aos procedimentos adequados para a utilização e manuseamento do produto em questão. armazenamento. detritos. toxicidade. de modo a familiarizar-se com os perigos e precauções que deverá ter ao utilizá -lo. primeiros socorros. Os MSDS acompanham sempre os produtos comercializados e deverão ser mantidos no laboratório de forma acessível a todos os que trabalhem com os produtos em questão. Os MSDS incluem informações como propriedades físicas e químicas. assim como em caso de acidente. Todas estas informações são essenciais para trabalhar em condições de segurança. -9- . perigos para a saúde. Qualquer pessoa que manuseie qualquer produto químico deverá ler o MSDS correspondente. equipamento de protecção e procedimentos de emergência.Protocolos Práticos Biologia Celular 8. MSDS Todos os produtos químicos são acompanhados de um folheto denominado MSDS (Material Safety Data Sheet ).

uma vez que permitiu descobrir um novo mundo. o microscópio óptico. o condensador. É compreensível. µm 0 -6 m). concentra a luz que vai incidir so bre esta.ocular é responsável pela ampliação e projecção da luz que atravessa a amostra para o olho. sistema objectiva . microscópio óptico é composto por um sistema de lentes de vidro distribuído de modo a que a luz emitida pela fonte de luz se concentre no plano da amostra e depois seja de novo concentrada e ampliada de forma a ser visualizada no olho do observador. . e distinguir detalhes nessas µm). . mm. . a ampliação obtida é dada pelo produto da ampliação descrita na objectiva e da ampliação descrita na ocular. al como é visível na Figura . a revolução que o microscópio induziu na biologia. permite -nos visualizar células com tamanhos na ordem de células na ordem dos 0 nm 0. por isto mesmo. situado após a fonte de luz e antes da amostra.10 - @ 9 i ura .Bi l Aul MICROSCÓPIO ÓPTICO I TRODUÇÃO limite inferior para o olho humano distinguir dois objectos é da ordem dos 0. como é descrito no diagrama da Figura .Limi utili ação i rsos ti os mi roscópios &" % $# " ! i l l 46 48 6 46 7 46 543 ( ' )& ( 22 10 ' P t l P ti & . Para tal. ou de campo claro. . Por esta razão.

Bi l Ampliação total = Ampliação da objectiva x Ampliação da ocular Fi ura . Para melhor compreender este conceito observe a Figura . GC F ED C BA A i l l . apesar de teoricamente ser possível ampliar ma lente indefinidamente a imagem.3. A imagem observada ampliada. Verifica -se que. pode ampliar uma imagem sem aumentar a sua resolução. era legítimo afirmar que a capacidade de aumento do microscópio óptico seria virtualmente infinita. ± Esquema e formação a imagem o microscópio óptico. i vertida e virtual Estando a ampliação total do microscópio dependente das ampliações parciais da objectiva e da ocular. a partir de determinados limites essa ampliação não é acompanhada por melhoria de resolução. a ampliação útil é na realidade na ordem das 000 X. deixando de s er útil. Este facto é compreensível com a introdução do conceito de resolução.11 - U U T V T IAH PG IA AHA AG S R Q P t l P ti . o entanto.

o. ! N ™ sen U .Efeito da ampliação e da resolução a imagem obtida É possível calcular o limite de resolução r) de um microscópio recorrendo equação. r! 0.12 - cY b a` Y XW W i l l h eWd fc eW WdW Wc g P t l P ti . em que P é o comprimento de onda c. é a abertura numérica definida pela equação.d.Bi l Figura .3 . A.N .N.N .) da luz incidente e A.61 v P A.

. Figura .Representação gráfica do significado dos parâmetrosN e U para o cálculo da Abertura u m rica Assim para a luz visível. Figura .3 ficando o limite de 0 nm.d. a prática.d.5 .4 . máximo é de 0 nm para um c. ) o limite de resolução seria de cerca de . cujo c.Principais constituintes do microscópio óptico q t sr q pi i i Protocolos Práticos l l r w v x u .4). varia entre 400 nm e 700 nm. ). de resolução com o valor de Para aprender a trabalhar com o microscópio convém saber a localização e nome dos seus principais constituintes Figura . e para a maior abertura numérica teórica 60 nm.o.o.13 - .N. o valor de A.Bi l com N o índice de refracção do meio compreendido entre a amostra e a objectiva e U o semi-ângulo de abertura do cone luminoso que após passar pela amostra atinge a objectiva Figura .

rodar a objectiva de 40X e. utilizando o parafuso micrométrico. focar com a om o auxílio do parafuso micrométrico podem-se obter se uma maior resolução na observação da amostra Figura .14 - . sobre a preparação.PARTE EXPERIME TAL Observações microscópicas DLigar a fonte luminosa D olocar a amostra na platina lamela para cima) D om o auxílio do condensador e do diafragma obter uma boa iluminação Subir o condensador para a objectiva de imersão em óleo ou baixar para objectivas de baixa ampliação) DRodando o parafuso macrométrico aproximar a platina o mais perto possível da objectiva de 0X DRodando novamente o parafuso macrométrico. colocar uma gota de óleo de imersão.Efeito da adição do óleo de imersão sobre a dispersão da luz y ‚ € y Protocolos Práticos Biologi l l r ƒ . O uso de óleo de imersão umérica por influenciar o valor de N obtendomelhora o valor da Abertura 0X. Figura . diferentes planos das estruturas a observar DSe pretender utilizar a objectiva de 00X. puxar a platina para baixo até obter uma imagem nítida da amostra D epois da amostra estar focada com a objectiva de objectiva de 40X. já com a objectiva de 00X.7). Focar.7 .

o. Saber descrever o funcionamento do microscópio óptico (m.Protocolos Práticos Biologia Celular OBJECTIVOS: y Compreender o âmbito de aplicação da microscopia óptica (noção de escala microscópica).15 - . y y y y . e saber utilizá -lo. o.). Conseguir nomear os principais constituintes do m. Compreender os factores que influenciam a ampliação e a resolução. Perceber a utilização do óleo de imersão.

.6 correspondem a 0. A medição pode ser realizada após calibração.Aula 3 MEDIÇÃO COM OCULAR MICROMÉTRICA Medições em preparações microscópicas As observações em microscopia envolvem muitas vezes a medição do objecto de estudo. D eslocar a lâmina para que o início da graduação das duas escalas se sobreponha 0 e 0. „ ‡ †… „ Protocolos Práticos Biologi l l r ‰ˆ . com auxílio de uma ocular micrométrica e uma lâmina graduada. DVerificar em que outro ponto do campo as escalas se sobrepõem igualmente.0).6. Calibração (mm) Figura . DRodar a ocular micrométrica de modo a que as escalas da ocular e da lâmina fiquem paralelas e se sobreponham parcialmente ver Figura . . verifica -se que 80 divisões da ocular divisão = 4 0/80 = . o exemplo da Figura .e.16 - .4 mm 4 0 Qm) da lâmina. de cada objectiva.Representação esquemática da calibração DColocar a ocular micrométrica em posição no tubo do microscópio e instalar a lâmina graduada na platina do microscópio.6). i.

o. obtendo -se a dimensão 22. por ex. 5. recorrendo a uma ocular micrométrica e lâmina graduada. DPara a medição de um objecto desconhecido. Este valor só é válido para a objectiva utilizada. por ex. Saber converter as Unidades de medida (µm. nm. y . sendo pois necessário proceder à calibração para cada uma das outras objectivas.6. . determina -se primeiro o número de divisões.Protocolos Práticos Biologia Celular Qm. Å). e multiplica-se pelo valor micrométrico previamente determinado.17 - . Qm. OBJECTIVOS: y Saber fazer medições ao m.

as dimensões PROCEDIME TO EXPERIME — — TAL 1. com indicação da amostra observada. ) ’ ‘  Protocolos Práticos Biologi el l r ”“ – • “ . os pormenores relevantes e sempre que possível.18 - . cobrir com uma lamela e observar ao microscópio ver Figura . coli que lhe foi fornecida sobre uma lâmina. Cultura de Esc eric ia coli DColocar uma gota da cultura de E.Aula 4 DIVERSIDADE CELULAR PARTE EXPERIME MATERIAL Zaragatoa ou palito Pinça Bisturi Lâminas e lamelas Soro fisiológico Solução de azul de metileno Esc eric i coli S cc aromyces cerevisiae Bolbo de cebola Folha de Elodea TAL otas importantes: y Antes de efectuar cada preparação limpe bem a lâmina e a lamela com álcool y Para cada desenho a efectuar não se esqueça de indicar: a) a ampliação com que observou a preparação b) a legenda.

Cobrir com uma lamela. Rodar o revólver no sentido da objectiva de 00 X e colocar uma gota de óleo de imersão sobre a lamel a. 00 X até esta ficar na usar apenas o parafuso . Proceder como indicado na Figura . primeiro com a objectiva de 0X.Recol a da epiderme do bolbo de cebola DColocar sob uma gota de soro fisiológico em cima de uma lâmina. Células de Sacc aromyces cerevisiae fermento de padeiro) DCom a ajuda de um palito colocar uma pequena amostra de S.Colocação da lamela DComeçar por focar a preparação com a objectiva de 0 X e em seguida mudar para a objectiva de 40 X e voltar focar. Figura . Lenta e cuidadosamente. . ™ ˜ Protocolos Práticos Biologia el lar g e i d hh f . Colocar uma lamela e observar DDesenhar o que observa com a objectiva de 00X.Figura . 3. Juntar uma gota de soro fisiológico e misturar bem.19 - . Observar ao microscópio. . rodar a objectiva de posição correcta e focar a preparação micrométrico e fazendo pequenos movimentos D esenhar o que observa. Epiderme interna da escama do bolbo da cebola Alli m cepa) DSeparar duas escamas carnudas que formam o bolbo da cebola e com a ajuda de uma pinça destacar um pequeno quadrado da epiderme interna que recobre a parte côncava que ficou a descoberto. cerevisiae sobre uma lâmina.

olha de uma planta aquática ( Elodea canadiensis) DDestacar uma folha de Elodea e fazer um pequeno corte na epiderme superior da folha com o auxílio do bisturi. Diferenciar células procariotas de eucariotas. Saber escolher a ampliação adequada ao objecto que pretende observar.Protocolos Práticos depois com a objectiva de de metileno. DDesenhar o que observa. Adicionar uma gota de soro fisiológico.20 - . Células de gengiva D riccionar ligeiramente a gengiva a vezes com a ponta de uma zaragatoa. Biologia Celular X. Diferenciar células animais e vegetais. Examine então com a objectiva de maior ampli ação. Tente reduzir a iluminação ajustando o diafragma do microscópio. Saber registar e legendar a observação realizada. Cobrir com uma lamela DDesenhar o que observa com as objectivas de Xe1 X. . Compreender os limites de resolução do microscópio óptico e do microscópio electrónico. Aplicar sobre uma gota de azul de metileno. 5. Cobrir com uma lamela e desenhar o que observa. mas desta vez com azul Nota : especímenes não corados são muitas vezes melhor visualizados com menos luz. Repetir o processo. espalhando bem. OBJECTIVOS: y y y y Compreender o conceito de célula. y y .

Para tal. vermelho neutro. Sudão III.21 - . a amostra é colocada num ambiente o mais semelhante possível às condições nas quais ela se encontra in vivo (água doce ou salgada. etc) e depois colocada entre lâmina e lamela. I. Preparações temporárias ou extemporâneas Destinam-se à observação momentânea de uma amostra de material biológico no seu estado natural. Outro obstáculo à qualidade da observação é a opacidade da amostra à luz.Protocolos Práticos Biologia Celular Aula CITO UÍMICA E HISTO UÍMICA INTRODUÇÃO A observação de células ao microscópio óptico de fundo claro apresenta dois problemas: as pequenas dimensões das células e a ausência de contraste entre os constituintes celulares. etc. De forma a superar estes factores. vermelho Congo. Estas substâncias são denominadas corantes vitais (azul de metileno. TIPOS DE PREPARAÇÕES 1. Embora evitem a formação de artefactos na amostra. que permitem uma melhor visualização dos componentes celulares. soro fisiológico. Estas preparações podem contudo ser contrastadas com substâncias que não alteram as características do material biológico. A coloração de preparações temporárias pode fazer -se de dois modos:  Imersão: o corante é adicionado ao meio de montagem . Este tipo de líquidos que não alteram as condições do material a observar designam-se líquidos indi erentes . este tipo de preparação não permite observar estruturas celulares com grande detalhe.) e a sua utilização permite a coloração de estruturas celulares mantendo as funções vitais da célula durante algum tempo. utilizam-se as técnicas denominadas técnicas citológicas ou técnicas citoquímicas .

  Coloração: os cortes são tratados com corantes. frio) ou químicos (metanol. De modo a permitir esta conservação.  Inclusão e corte: processo normalmente utilizado em histoquímica. Consiste na inserção da amostra numa matriz de um material que a mantenha estável e sem deformações. Esta técnica permite também proceder à substituição de um meio de montagem por outro em preparações temporárias. o material biológico é submetido a uma sequência de tratamentos destinados a desidratar e a fixar as células a ser observadas. etc. 2.  Fixação: tratamentos físicos (calor. as amostras são de novo desidratadas e cobertas com um meio de montagem (usualmente o Bálsamo do Canadá). Preparações definitivas Permitem conservar o material biológico entre lâmina e lamela durante longos períodos de tempo. Depo is de solidificada. Fase inal de montagem: após a coloração.Protocolos Práticos Irrigação: Biologia Celular o meio de montagem com a amostra entre lâmina e  lamela é substituído por capilaridade.) tendo como finalidade preservar as estruturas do material a observar. A substância mais utilizada como matriz é a parafina fundida. ácido acético. . não tendo igual importância no caso de se trata r de células isoladas. a amostra é cortada em sucessivas camadas muito finas utilizando um micrótomo.  Desidratação: usualmente obtida através da passagem do mater ial biológico por álcoois ou acetonas de concentração crescente (este tratamento visa a remoção da água dos tecidos a observar).22 - . É fundamentalmente utilizada na obtenção de preparações definitivas de tecidos. Essas finas fatias são então montadas em lâmina.

 Coloração di erencial: um agente de envolve o uso.  Coloração combinada: utilização de diferentes corantes para pôr em evidência e distinguir estruturas celulares diferentes (ex: hematoxilina eosina). Exemplos de corantes utilizados em microscopia óptica . No estudo de células isoladas.23 - . designa-se como histoquímica. b Acido ilia: os corantes acidófilos são substâncias de natureza básica que se ligam a estruturas celulares ácidas (ácidos nucleicos. Se estiverem em estudo tecidos.  Coloração simples: utilização de um único corante para pôr em evidência estruturas celulares (ex: azul de metileno). possibilitando ou aumentando a eficácia da coloração. Alguns mordentes utilizados em citoquímica são o cobre.corantes . Utilizam-se substâncias. no processo de coloração de que permite distinguir diferentes diferenciação composições da mesma estrutura celular (ex: coloração Gram). que coram estruturas celulares em geral ou em particular . o ferro. d Mordentes: substâncias que favorecem a ligação de corantes sem carga eléctrica a determinadas estruturas celulares. COLORAÇÃO Biologia Celular Uma das técnicas mais usadas para incrementar o contraste das preparações biológicas é a coloração. As especificidades dos corantes são variadas. assim como os mecanismos de ligação às moléculas biológicas: a) Forças electrostáticas: corantes com carga positiva podem ligar-se a estruturas celulares com carga negativa e vice -versa.Protocolos Práticos II. o iodo. proteínas). geralmente de natureza orgânica. este método é designado como citoquímica. c Baso ilia: os corantes basófilos são substâncias de natureza ácida que se ligam a estruturas celulares básicas.

24 - .Protocolos Práticos Corantes gerais Básicos: y y y Biologia Celular Hematoxilina ucsina básica Violeta de cresilo Ácidos: y y y Eosina Laranja G Azul de anilina Corantes para citoquímica y y y y Ácido periódico-Schiff: corante para glúcidos Corante de eulgen: DNA e RNA Negro Sudão (Sudão III): lípidos Enzimas Corantes para imunocitoquímica y y y y luoresceína Rodamina Enzimas Ouro coloidal PARTE EXPERIMENTAL MATERIAL - Culturas em meio sólido de Escherichia coli Corantes: violeta cristal e safranina Lugol Álcool a 95% Óleo de imersão Soro fisiológico estéril Lâminas para microscópio Palitos .

Preparação de esfregaços D Marcar a lâmina. no lado oposto onde é efectuado o esfregaço. Evitar fazer esfregaços densos DDeixar secar e fixar a preparação à chama. mantendo a lâmina em posição oblíqua. (esterilizada à chama e arrefecida). Deixar actuar durante segundos DRetirar o excesso de corante com água destilada. segura pela pinça DCobrir a lâmina com lugol (Gram's Iodine) e deixe actuar durante 1 minuto DLavar a preparação com água DDescorar a lâmina com álcool etílico 95%.Protocolos Práticos Pinças Bico Bunsen Microscópio Varetas de vidro Pipeta de Pasteur Pompete Biologia Celular - PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL 1. com as iniciais do organismo a testar e o nome do grupo D lamejar a lâmina. uma pequena quantidade de massa bacteriana e colocar na lâmina DEspalhar de forma a obter uma distribuição homogénea. Método de Coloração: coloração diferencial de Gram DCobrir o esfregaço com violeta cristal. para de seguida se executar a coloração. 2. arrefecer e transferir duas gotas de soro fisiológico estéril para o centro da lâmina DRecolher com o auxílio de uma ansa. até desaparecimento completo da cor DLavar a preparação com água . durante 1 a 2 segundos.25 - .

OBJECTIVOS: y y Compreender o que é a Citoquímica e qual a sua utilidade. Inferir sobre a vantagem da utilização de corantes (comparação das preparação de E. perceber em que se baseia e qual a sua utilidade. Distinguir preparações temporárias de definitivas. Conhecer os métodos de coloração de preparações temporárias (imersão e irrigação).Protocolos Práticos Biologia Celular DAplicar o corante de contraste. registando os tipos de células e componentes celulares observados. Observação de preparações definitiva DObservar as diferentes preparações definitivas. Distinguir cocos de bacilos. . combinada e diferencial). assim como as cores associadas. Diferenciar os vários corantes quanto aos mecanismos de ligação às moléculas biológicas e classificá-los quanto à sua natureza. y y y y y y y . coli corada com a realizada na aula anterior). Distinguir os vários tipos de coloração (simples. Conhecer a técnica de preparação de esfregaços Saber executar a coloração de Gram. Saber enumerar os passos necessários à elaboração destes dois tipos de preparações.26 - . safranina e deixar actuar durante segundos DLavar com água e deixar secar DColocar uma gota de óleo de imersão e observar a preparação ao microscópio na objectiva de imersão DRegistar as formas e cores das células observadas.

Aula 6 OSMOSE I TRODUÇÃO A célula tem necessidade de trocar substâncias com o meio exterior e com outras células. ).e.27 - .passagem de água através de uma membrana semi-permeável que separa duas soluções com concentrações diferentes. De uma forma geral. Figura 5. A água movimentase da solução com menor concentração de soluto i. de forma a assegurar o seu metabolismo. as células vivas são constituídas por 7 -8 % de água. ... Osmose .e. aquela em que existe maior número de moléculas de água) para a solução com maior concentração i. menor número de moléculas de água). pelo que a compreensão dos mecanismos de difusão movimento de solutos a favor do gradiente de concentração) e osmose movimento de água através de uma membrana semi-permeável) é fundamental para o estudo da biologia celular. que separa o meio intracelular do extracelular.Determinação da pressão osmótica k j Protocolos Práticos Biologia el lar l . As trocas real izam-se através da membrana plasmática. A pressão osmótica de uma solução é a pressão que deve ser aplicada para impedir que a entrada de água por osmose ocorra Figura .

Em células animais A ausência de parede celular torna as células animais mais vulneráveis ao fenómeno da osmose. em meio hipotónico. Hipotónica Isotónica Hipertónica Figura . tem maior con centração de soluto (em número de partículas). A.quando comparado com outro. podendo mesmo rebentar ± lisar ( igura 5.2 Preparações de glóbulos vermelhos em soluções com di erentes osmolaridades o n m . Meio hipotónico . O termo osmol designa a concentração em número de partículas. O número de partículas por unidade de volume (litro) é dado pela osmolaridade . Meio hipertónico .28 - . a água tende a entrar e as células aumentam de volume. Assim. com as células perdendo água e ficando encolhidas ± crenadas ( igura 5.2). O fenómeno inverso ocorre em meio hipertónico.quando comparado com outro. tem menor concentração de soluto (em número de partículas).Protocolos Práticos Biologia Celular A pressão osmótica é determinada pelo número de partículas em solução. Daqui a importância de se manter as células animais sempre em meio isotónico. independentemente da sua natureza (moléculas ou iões).2).

). Meio hipotónico Meio hipertónico PARTE EXPERIMENTAL MATERIAL olhas frescas de Elodea Lâminas Lamelas Soro fisiológico NaCl . M NaCl . Em células vegetais Biologia Celular Em meio hipotónico.29 - r q p Figura . a célula vegetal tende a absorver água e a acumulá -la no vacúolo.2M NaCl . A parede celular impede que a célula aumente de volume e rebente.5M NaCl . ficando túrgida.3 Comportamento de uma célula vegetal em soluções com di erentes osmolaridades . ocorrendo o fenómeno de plasmólise ( igura 5. M NaCl . Quando colocadas em meio hipertónico. Esta turgidez origina a rigidez mecânica característica da maioria das plantas. as células perdem água (através do vacúolo).1M .Protocolos Práticos B.

5M) DObservar cada preparação ao microscópio DPara cada solução utilizada. com o auxílio de uma pipeta de Pasteur t s . ao mesmo tempo que se coloca a nova solução de montagem.1M e . M. . substituir o meio de montagem por cada uma das soluções de NaCl que lhe foram fornecidas ( . cobrir com uma gota de soro fisiológico e montar com uma lamela.5M. se a solução utilizada é hipotónica.4 Técnica da irrigação: O primeiro meio de montagem é retirado por absorção com papel. fazendo um esquema legendado DDeverá determinar e indicar. . . .30 - . 5M Papel absorvente Pipetas Pasteur Microscópio Biologia Celular - PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL DColocar uma folha de Elodea sobre uma lâmina. Solução NaCl Lamela Papel Lâmina Figura . Observar ao microscópio DUtilizando o método de irrigação ( igura 5. M.Protocolos Práticos NaCl . para cada caso. ).2M. hipertónica ou isotónica. registar as alterações que observar.

y . Distinguir meios hipotónicos.Protocolos Práticos Biologia Celular OBJECTIVOS: y y y y Distinguir osmose de difusão simples. isotónicos e hipertónicos.31 - . Compreender a técnica utilizada (irrigação) na determinação da solução isotónica para as células de Elódea. Compreender o conceito pressão osmótica. Perceber as alterações produzidas em células animais e vegetais quando colocadas em meios de diferentes osmolaridades.

A mitose fase fase.Aula 7 MITOSE I TRODUÇÃO O ciclo celular consiste na sequência contínua e ordenada de processos que ocorrem numa célula desde o crescimento até filhas.Se ). esta A interfase representa a maior parte do ciclo celular fases processo de replicação fase S). Os acontecimentos que ocorrem na mitose são classicamente divididos em cinco fases. o ADN é condensado. . os cromossomas individualizam-se e inicia-se um processo que garante a distribuição do material genético de uma célula que foi duplicado na fase S) em partes iguais para as células filhas.32 - . das quais as quatro primeiras correspondem última divisão do citoplasma. Ao entrar na mitose. Este ciclo pode ser dividido em Interfase e sua divisão em duas células itose. 2 divisão nuclear e a 1 Profase Metafase v u Protocolos Práticos Biologia el lar . o ADN encontra-se descondensado cromatina interfásica) e dá -se o ) é o processo celular que rege a repartição do material genético entre células eucarióticas em divisão.

. Dá-se o aparecimento do nucléolo. meristemas. ocorre a divisão do citoplasma com a distribuição dos organelos e outros constituíntes celulares pelas duas células filh as. a divisão nuclear e celular ocorre em áreas específicas. os cromossomas descondensam-se. localizados nas extremidades de caules e raízes e no câmbio. ao nível do centrómero. .Fases da Mitose Telofase Na Profase. a interação dos centrómeros com o fuso mitótico leva cromossomas idênticos.33 - x w Protocolos Práticos Biologia el lar y . dá-se a condensação dos cromossomas cada um com dois cromatídeo). Na Telofase. Este processo tem início durante a telofase. Cada cromatídeo fica ligado a um dos polos do fuso mitótico é aqui que se garante a divisão do material genético em duas partes iguais). dá-se o alinhamento dos cromossomas no plano equatorial do fuso mitótico. Formam -se dois conjuntos de Nas plantas. Na Metafase. o desaparecimento da membrana nuclear e a formação do fuso mitótico. É a fase mais curta da mitose. Na Citocinese. migração de cada cromatídeo para um dos polos da célula. o fuso mitótico desaparece e a membrana nuclear reconstitui-se em torno de cada um dos dois conjuntos de cromossomas. Na Anafase. O meristema apical é a região que contém a maior percentagem de células em mitose.3 4 Anafase Figura 7.

durante 3min min . .Região de divisão celular Figura 7.34 - DAdicionar 3 gotas de orceína acética e deixar repousar { z Protocolos Práticos Biologia el lar }  ~ | . Observação de figuras de mitose em ápices radiculares de Alli m cepa MATERIAL icroscópio óptico Lâminas Pinça de madeira Bico de Bunsen Ápices radiculares de Alli m cepa cebola) Cl 1N Orceína acética PROCEDIME TO EXPERIME TAL DColocar o ápice radicular de Alli m cepa em Cl 1N.Secção longitudinal da extremidade de uma raíz PARTE EXPERIME TAL 1.

de forma a obter uma única camada de células. determinar a fracção de tempo (%) que as células do tecido .1 como ajuda para identificar as fases do ciclo celular nas quais se encontram as células DDesenhar e legendar uma célula em cada fase DContar em diferentes campos de observação o número de células que se encontra em cada fase da mitose e apontar os dados na Tabela . sem deixar secar DRepitir a operação. Com a ponta do dedo aplicar uma pequena pressão sobre a lamela. Use as imagens da igura . 2. Observação de figuras de mitose em preparações definitivas de cortes histológicos de Ascaris MATERIAL Microscópio óptico Preparação definitiva de cortes histológicos de Ascaris corados com azul de toluidina PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL DLigar o microscópio DColocar a preparação definitiva na platina D ocar a uma ampliação 1 X e observar a X ou 1 X.Protocolos Práticos Biologia Celular DAqueçer suavemente até concentrar o corante em torno do ápice.35 - . após adicionar uma gota de orceína acética DTransferir o material para uma lâmina limpa. mais duas vezes.1 DConsiderando que o número de células em cada fase da mitose é directamente proporcional ao tempo que cada célula passa em cada uma destas fases. adicionar uma gota de orceína acética e colocar a lamela.

Protocolos Práticos Biologia Celular observado passam em cada fase do ciclo celular que observou.36 - . Compreender o cálculo da duração relativa de cada uma das fases do ciclo celular. Identificá -las em preparações de células animais e vegetais. Anotar os valores obtidos na Tabela .1 Tabela 7. Descrever as várias fases da mitose. Perceber a função da mitose e em que células ocorre. y .1 ase da Mitose Interfase Número de células % de tempo em cada fase ____________% Profase ____________________________________________ ____________% Metafase ____________________________________________ ____________% Anafase ____________________________________________ ____________% Telofase ____________________________________________ ____________% Total ____________________________________________ 100% OBJECTIVOS: y y y Compreender o processo da mitose e a sua integração no ciclo celular.

a meiose ocorre nos órgãos sexuais tanto masculinos como femininos. a ana ase II e a telo ase II.37 - . que se subdivide nas fases G1. A meiose I compreende a pro ase I. O ciclo celular meiótico. a ana ase I e a telo ase I . metafase. Nesta primeira divisão ocorrem os processos de recombinação entre cromossomas homólogos: formam -se os bivalentes . em que ocorre a separação dos é separado. anafase e telofase. a meta ase I . estruturas que garantem a diversidade genética de todos os organismos sexuados através do mecanismo de ³crossing over´. Corresponde a uma divisão equacional . engloba a interfase meiótica. . A fertilização é o processo que resulta da fusão de duas células sexuais haplóides. A meiose II compreende a pro ase II. A combinação da meiose e da fertilização no ciclo de vida é a base da reprodução sexuada. A meiose I denomina-se por isso divisão reducional . e a meiose. num processo que se denomina respectivamente espermatogénese e oogénese.meiose I e meiose II ± sem a ocorrência de uma fase S intercalar. os acontecimentos que têm lugar durante cada uma das divisões meióticas I e II são distintos. No final da meiose I cada par de cromossomas homólogos da célula -mãe (2n) com 2 cromossomas. de modo a dar origem a duas células haplóides (n) cada uma delas cromatídeos das células resultantes da meiose I originando células haplóides. Durante a meiose ocorrem duas divisões sucessivas . à semelhança do ciclo celular mitótico. a meta ase II. que é a fase mais longa e complexa. Nos animais superiores. S e G2. Apesar de cada uma das divisões meióticas ser também formalmente dividida em profase. através do qual os organismos produzem células com metade do material genético (haplóides n ) destinadas à reprodução sexual.Protocolos Práticos Biologia Celular AULA 8 MEIOSE INTRODUÇÃO A meiose constitui um tipo de ciclo celular especializado.

Representação esquemática da meiose PARTE EXPERIME MATERIAL TAL PROCEDIME TO EXPERIME TAL Identificar e desenhar ampliação de 400X) células em cada uma das fases da meiose. . elofase I  € Protocolos Práticos Biologia el lar ‚ . : Profase I etafase I Anafase I ƒ - icroscópio e Preparações definitivas de Lili m sp.38 - . guie-se pelas fotografias da Figura 8.Figura 8. Para tal.

y Identificar as diferentes fases da meiose nas preparações observadas na aula. Compreender o fenómeno de ³crossing -over´ e suas consequências. Conhecer as causas do aumento da variabilidade genética em organismos com reprodução sexuada versus assexuada.Fases da meiose OBJECTIVOS: y Distinguir meiose e mitose quanto a) ocorre e c) fases que a compõem. b) ao tipo de células em que AULA 9 EXTRACÇÃO DE DNA PLASMÍDICO INTRODUÇÃO . y y y Distinguir células haploides de diploides. função. .Intercinese etafase II Anafase II elofase II Figura 8.39 - … „ Protocolos Práticos Biologia el lar † .

Os plasmídeos podem ainda ser transferidos por conjugação ocorrendo a sua passagem de uma célula para a outra (transmissão horizontal). existem outros elementos genéticos como plasmídeos. é a extracção de DNA plasmídico (plasmídeo pBR322 que confere resistência ao antibiótico ampicilina . contendo cada célula uma cópia. produção de insulina).Protocolos Práticos Biologia Celular O DNA genómico bacteriano é geralmente circular com tamanho que varia entre algumas centenas de kb (1 kb aproximadamente 1 1 pares de bases) e kb. além do DNA genómico. sendo repartidos entre as células quando há divisão celular (transmissão vertical). Em laboratório. Os plasmídeos contêm genes essenciais para a sua manutenção na célula e ainda genes que em determinados ambientes. permitindo a expressão de genes de outros organismos pela bactéria (ex. por processos de virulência. A maioria são circulares e possuem replicação autónoma.1) de uma estirpe de Escherichia coli recorrendo à técnica de lise alcalina. transposões e vírus. entre outros. os plasmídeos são frequentemente utilizados como vectores de clonagem. O objectivo desta aula prática. Na bactéria. Os plasmídeos de ocorrência natural apresentam uma variação de tamanho entre 1 kb e algumas centenas de kb.ver igura 1 . Esta vantagem pode ser conferida através de genes de resistência a antibióticos. . conferem vantagem selectiva ao hospedeiro. pela produç ão de toxinas.40 - . por processos de restrição / modificação.

Protocolos Práticos Biologia Celular PARTE EXPERIMENTAL MATERIAL . ajustado com ácido Tris HCl 1 mM (pH ) EDTA 1 mM RNAse 2 Qg / ml PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL DInocular a estirpe de E. DAdicionar 2 DAdicionar 15 Q l de solução 2. a ºC. DPipetar 1 ml para um tubo eppendorf e centrifugar 1 min a 15 rpm. Remover o sobrenadante e secar o pellet de DNA plasmídico a 60ºC. Centrifugar 15 min a ºC e remover o sobrenadante. DLavar o sedimento de DNA plasmídico com 5 (-20ºC). coli contendo o plasmídeo em 1 ml de meio LB com ampicilina e incubar durante a noite a 37ºC com agitação. durante 3 min. . Transferir o sobrenadante para novo tubo e adicionar 9 µl de etanol absoluto (a -2 ºC). e adicionar 1 Q l de solução 1. com micropipeta. DCentrifugar o lisado durante 5 min a 15 rpm. .41 - .Solução 3: . Remover completamente o sobrenadante. µl de etanol a 70% Deixar 15 min a -2 ºC.Etanol %.Solução 1: Glucose 5 mM EDTA 1 mM TrisHCl 25 mM (pH ) . Misturar por inversão e colocar em gelo durante 3 min à temperatura ambiente.Tampão TE (com RNase) KAc 3 M (pH acético glacial) . a ºC. 5 min.Solução 2 (preparar no momento): NaOH . . Misturar suavemente por inversão e manter Ql de solução 3.Cultura de Escherichia coli em meio LB líquido com ampicilina.2 M SDS 1% . DCentrifugar 3 min a 15000 rpm. .Etanol absoluto. Ressuspender e incubar 3 min em gelo.

42 - . Compreender a função dos plasmídeos nas bactérias que os possuem. Saber executar e explicar cada uma das etapas do protocolo de extracção de DNA plasmídico. y y . Perceber a importância dos plasmídeos em processos como a clonagem. OBJECTIVOS: y y Perceber que os plasmídeos fazem parte do genoma extracromossomático. Conservar a -20ºC.Protocolos Práticos Biologia Celular DRessuspender o sedimento de DNA em 50 µl de TE com RNase. Saber que a sua transmissão além de vertical é também h orizontal.

Em laboratório.43 - . após a hidrólise.3') ver Figura 10. A separação e visualização destes fragmentos serão feitas por electroforese. execução de mapas físicos e outros.Mapa de restrição do plasmídeo pBR3 com a enzima XmnI. O objectivo desta aula prática é a digestão do plasmídeo pBR3 enzima de restrição XmnI. Estas enzimas são quase exclusivamente produzidas por procariotas sendolhes imputada uma função protectora µi vivo¶ contra ácidos nucleicos invasores como é. XmnI 1. produzindo-se.4 Kb. Kb pBR3 4. por exemplo o caso dos bacteriófagos.GAANN NNTTC.AULA DI ESTÃO DE DNA PLASMÍDICO E ELECTROFORESE EM EL DE AGAROSE INTRODUÇÃO As endonucleases são enzimas que reconhecem sequências de bases no DNA sendo capazes de hidrolisar digerir) as cadeias de DNA em locais específicos.1). Kb e . Este plasmídeo possui dois locais contendo a sequência de bases que XmnI reconhece 5'. . dois fragmentos lineares de DNA com 1.3 Kb XmnI Amp R Š ‹Š Figura . as endonucleases são ferramentas importantes em processos de clonagem de genes. ˆ ‡ Protocolos Práticos Biologia el lar ŒŒ  ‰ com a . respectivamente.

m marcador de pesos moleculares é constituído por uma série de fragmentos de DNA de peso conhecido. os ácidos nucleicos no gel de agarose tornam -se visíveis por acção do brometo de etídeo adicionado previamente ao gel de agarose). uando se faz uma electroforese de ácidos nucleicos em gel de agarose é indispensável a utilização de um marcador de pesos moleculares para o cálculo do peso molecular da amostra. por interpolação é possível relacionar o peso molecular da amostra com as bandas do marcador. Após a electroforese. (B) esquema da electroforese realizada com XmnI  Ž B Protocolos Práticos Biologia el lar ’ . do campo eléctrico aplicado ao sistema e ainda da composição do tampão utilizado na electroforese. radiação A com o produto da digestão de pBR3 ’’ ‘ Figura .(A) Marcador de pesos moleculares. A velocidade de migração depende da massa função do número de pares de bases pb)). . Este composto intercala -se nas cadeias de ácidos nucleicos e fluoresce quando submetido ultravioleta. A separação de ácidos nucleicos que se encontram carregados negativamente grupos fo sfato) é geralmente efectuada em géis de agarose. A agarose forma uma matriz porosa cujo tamanho do poro pode ser controlado) através da qual migram as moléculas de ácidos nucleicos. da conformação das moléculas.A electroforese é uma técnica capaz de separar moléculas com carga pela aplicação de um campo eléctrico) em função do seu peso molecular e/ou carga eléctrica das moléculas. da concentração da matriz de agarose utilizada.44 - .

5 µl .Marcador de pesos moleculares .DNA plasmídico (pBR322) (extraído na aula anterior) .Solução STOP (tampão de aplicação): Sacarose 0% Azul de bromofenol 0.0 . Água Tampão de enzima 10 X BSA 10X DNA plasmídico Enzima de restrição XmnI 10.Tampão de enzima 10 X .5 µl 2 µl 2 µl 5 µl 0.25% Xilenocianol 0.Protocolos Práticos Biologia Celular PARTE EXPERIMENTAL MATERIAL . Digestão de DNA plasmídico com a enzima de restr ição XmnI DFazer a mistura de digestão (em tubo eppendorf) adicionando cada um dos reagentes indicados na tabela pela ordem apresentada.Enzima XmnI 5U / Q l .45 - .0) H2O até perfazer 1l Ajustar pH a .BSA 10 X .Tampão TAE 50 X: 2 2 g Tris base 57.1 ml ácido acético glacial 100 ml EDTA 0.Agarose .Brometo de etideo .25% PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL 1.5 M (pH .

Saber qual a sua função in vivo¶ e perceber a sua utilização in vitro¶ (ferramentas moleculares). 2. Ferver em microondas até obter uma mistura homogénea. Deitar a agarose dentro do molde contendo um pente adequado ao volume e número de amostras que pretende aplicar. Biologia Celular DRetirar os tubos da estufa e adicionar 2 µl de solução STOP a cada tubo. . Adicionar o tampão (TAE 1X) até atingir o volume desejado.46 - y y y . DPreparar um gel de agarose 0. % em tampão TAE 1X. DAplicar 5 Ql do marcador de pesos moleculares no primeiro poço e 5 Q l no último poço do gel. DApós a corrida retirar o gel da tina e colocar em cima do transiluminador (fonte de radiação ultravioleta). Perceber o processo utilizado para a visualização de ácidos nucleicos em gel de agarose. DFotografar o gel. Saber para que serve um marcador de pesos moleculares e como permite calcular o peso molecular das bandas da amostra.( MUITO IMPORTANTE usar luvas para manipular este reagente). Adicionar tampão (TAE 1X) à tina de electroforese até cerca de 1 mm acima da superfície do gel. DIniciar a electroforese por aplicação de um campo eléctrico (100 V 20 min). DRemover o pente e colocar o gel na tina de electoforese. Compreender a técnica de electroforese. Deixar solidificar b 30 min. OBJECTIVOS: y Perceber o que são endonucleases (enzimas) de restrição. Para tal pesar a agarose necessária para um volume final de 50 ml e colocar num recipiente adequado. MUITO IMPORTANTE usar óculos de protecção contra UV. DConservar a ºC. Deixar arrefecer a mistu ra líquida até atingir aproximadamente 50ºC e adicionar 1 Q l de brometo de etídeo. Visualização dos produtos de digestão por elecro orese em gel de agarose.Protocolos Práticos D Misturar cuidadosamente e incubar a 37ºC durante 1h.

47 - .Protocolos Práticos Biologia Celular y Saber realizar uma reacção de digestão de um DNA plasmídico. Co nhecer as condições óptimas de actuação das enzimas de restrição. Conseguir interpretar um perfil de digestão de DNA plasmídico. y .

Protocolos Práticos Biologia Celular AULA 11 UANTIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS INTRODUÇÃO As proteínas encontram-se envolvidas na maioria dos processos biológicos que ocorrem dentro da célula. Determinar a gama de concentrações onde é válida a Lei de Lambert -Beer (onde há proporcionalidade directa entre A e C) . sendo por vezes necessário quantificá -las. Traçar em papel milimétrico o gráfico ³Absorvância vs. Esta técnica baseia-se na proporcionalidade direct a existente entre a quantidade de luz absorvida por uma dada solução e a sua concentração. é uma técnica que permite determinar a concentração de substâncias em solução. procede -se da seguinte forma: 1. definida pela Lei de Lambert-Beer: A = IC l A: Absorvância I: Coeficiente de extinção molar C: concentração da solução absorvente l: Percurso óptico na solução absorvente Para avaliar a concentração de uma substância. A espectrofotometria nas regiões visível e ultra -violeta. Para traçar a curva de calibração e determinar a equação da recta.48 - . Executar o procedimento experimental escolhido para quantificar a substância padrão 3. (concentração da solução padrão ´ 4. determina -se a relação entre as concentrações conhecidas de várias soluções dessa substância e as absorvâncias registadas a um dado comprimento de onda (construção da curva de calibração). Soluções padrão: preparar diferentes soluções de concentrações conhecidas 2.

-250) Figura 11. Calcular a equação da recta resultante regressão linear) A = m.5.1) e alguns aminoácidos. sendo um método rápido e simples.Azul Coomassie G25 (forma desprotonada) ” “ Protocolos Práticos Biologia el lar .49 - . Alguns desses métodos baseiam-se na formação de complexos corados entre reagentes específicos e as ligações peptídicas ou determinados aminoácidos. permitindo num curto espaço de tempo analisar várias amostras. C + b Quantificação de proteínas Existem vários métodos para quantificar as proteínas presentes em amostras biológicas ou em soluções de proteínas preparadas no laboratório. que apresenta uma O método de Bradford é suficientemente sensível para detectar quantidades de proteína de 1 µg/mL. O método de Bradford baseia -se na formação de interacções iónicas ou hidrofóbicas entre um corante azul de Coomassie absorvância máxima a 595 nm. originando um complexo azul. Outros métodos exploram as propriedades espectroscópicas intrínsecas das proteínas absorvância a 80 nm). Para amostras com maior concentração de proteína pode usar -se o Lowry mg/dL) ou étodo do Biureto g/dL). étodo de – • •• Figura . .

25 12. DPreparar 7 tubos com a seguinte composição: Tubo (número 1 (Branco 2 3 4 6 7 Volume de solução BSA 0.Solução de albumina sérica bovina (BSA) a 0. permite determinar a concentração de proteína existente numa amostra.Espectrofotómetro .5 25 31.Amostra desconhecida PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL 1.5 6.Cuvettes para espectrofotómetro . Medir a absorvância de cada tubo a 595 nm DRepresentar graficamente a absorvância medida a 595 nm versus a concentração de proteína em µg/mL e traçar a correspondente curva de calibração DCalcular a equação da recta da zona linear da curva de calibração .Protocolos Práticos Biologia Celular PARTE EXPERIMENTAL MATERIAL .1 mg/mL .Calculadora .25 2.50 - .1 mg/mL (µL 0 10 20 50 100 200 250 Volume de água (µL 00 790 780 750 700 600 550 [BSA] (mg/L 0 1.25 DAdicionar 200 µL do reagente comercial de Bradford a cada tubo DIncubar 5 minutos à temperatura ambiente. A construção de uma curva que relacione a concentração de proteína co m a absorvância a 595 nm.Papel milimétrico .Reagente de Bradford .Micropipetas . Construção da curva de calibração O método de Bradford apresenta uma resposta linear numa gama de concentrações de proteína entre 1 e 20 µg/mL.

Saber elaborar uma curva de calibração. [proteína] b Biologia Celular 2. OBJECTIVOS: y y Compreender a importância de quantificar proteínas. Medir a absorvância a 595 nm DDeterminar a concentração de proteína na amostra. Conhecer os conceitos de branco e solução padrão. Saber executar o método de Bradford. utilizando a equação que determinou. Saber calcular a equação da recta que expressa a relação entre a absorvância e a concentração de proteína. Quantificação da concentração de proteínas numa amostra desconhecida DPipetar para um tubo (nº 8) 800 µL da amostra desconhecida DAdicionar 200 µL do reagente comercial de Bradford DIncubar 5 minutos à temperatura ambiente. Identificar a gama de concentrações onde é válida a lei de Lambert -Beer.Protocolos Práticos A (595nm) m . Saber usar a equação da recta para calcular a concentração de proteína duma solução desconhecida. Conhecer outros métodos de quantificação de proteínas. Perceber sumariamente o funcionamento da técnica de espectrofotometria. y y y y y y y . Compreender a necessidade da sua utilização. Compreender qual o seu fundamento e as suas limitações. Compreender e aplicar a lei de Lambert-Beer.51 - .

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