BIOLOGIA CELULAR

AULAS PRÁTICAS

1º ANO
2010/2011

Protocolos Práticos

Biologia Celular

SEGURANÇA EM L ABORATÓRIO
1. INTRODUÇÃO
Embora todo o trabalho efectuado no laboratório de Biologia seja potencialmente perigoso, e as pessoas que nele trabalham estejam sujeitas a numerosos riscos e perigos, é importante ter a noção de que a grande a maioria doa acidentes que ocorrem em laboratório não se devem a procedimentos que são tecnicamente perigosos em si mesmos mas a faltas de atenção e cuidado com o que se está a fazer. É muito importante ter a noção de que a falta de atenção com o trabalho no laboratório poderá muito provavelmente resultar, não só em fracos resultados experimentais, mas também em possíveis acidentes. O trabalho em laboratório envolve uma grande diversidade de riscos, sendo necessário um conhecimento sério e aprofundado dos materiais, técnicas e equipamentos utilizados assim como dos riscos que envolvem e atitudes a adoptar de forma a minimizá-los. O objectivo desta aula é o de alertar e familiarizar os alunos com os principais perigos e riscos associados com o trabalho no laboratório de Biologia, assim como com a forma de os reduzir ao mínimo através da utilização de boas práticas de trabalho que permitam a realização de um bom trabalho de forma segura.

2. ATITUDE A ADOPTAR NO LABORATÓRIO
DSer responsável. D Planear sempre o trabalho a realizar, conhecer bem todos os procedimentos

e estar consciente dos potenciais riscos associados, e adoptar as atitudes adequadas de modo a evitá -los.

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3. REGRAS DE SEGURANÇA
D Não é permitido comer, beber, fumar ou aplicar cosméticos no laboratório.

Manter os dedos, lápis e outros materiais afastados da boca e face.
D Dentro do laboratório deve usar sempre uma bata, de forma a proteger -se a

si próprio e o seu vestiário de contaminações acidentais com culturas, corantes ou outros produtos químicos.
D Usar luvas apropriadas sempre que se manipulam produtos potencialmente

perigosos; as luvas deverão ser substituídas sempre que contaminadas ou danificadas; deverão ser retiradas no fim do trabalho ou sempre que este for interrompido, de modo a evitar a contaminação de objectos do laboratório ou fora dele, como as maçanetas das portas, interrupto res, telefones, etc.
D No início de cada aula, proceder à desinfecção da área de trabalho,

utilizando um desinfectante impregnado em papel absorvente. Este procedimento deve ser repetido no final do trabalho laboratorial.
D Manter perto da área laboratoria l somente o material estritamente necessário

(papel e lápis) para registo das observações. Conservar sempre a bancada limpa e arrumada.
D No início e no fim de cada aula lavar as mãos com um antisséptico. Proceder

da mesma forma sempre que suspeite ter contactado com materiais contaminados.
D Para pipetar, utilizar sempre um dispositivo de pipetagem. A pipetagem à boca é proibida. D Mudar de luvas e lavar as mãos sempre que haja contaminação evidente

com o produto derramado.
D Conhecer a localização e funcionamento dos sistemas de segurança

(telefone, saídas de emergência, extintores, chuveiros).
D Colocar todo o material utilizado durante o trabalho nos locais apropriados:

Material reutilizável: Em contentores apropriados para posterior lavagem e tratamento; material contendo substâncias potencialmente perigosas deverá ser previamente tratado de forma apropriada.
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Protocolos Práticos Material não reutilizável:

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- Vidro e metal cortante (lâminas de bisturi, agulhas de seringa): em lixo próprio devidamente rotulado. - Material contaminado com produtos biológicos: Em lixo próprio para autoclavar/incinerar. - Substâncias químicas perigosas: em locais apropriados, de acordo com o composto em questão e em contentores devidamente rotulados. - Não despejar nos canos qualquer material perigoso/infeccioso.
D Todos os materiais para guardar ou incubar deverão ser devidamente

rotulados, com indicação de conteúdo, nome do utilizador e data.

RISCOS ASSOCIADOS AO TRABALHO DE LABORATÓRIO E PRECAUÇÕES A TOMAR:

4. PRINCIPAIS

4.1 Equipamento de vidro

Riscos: O material de vidro é o mais utilizado no laboratório, e a fonte mais comum de acidentes, resultantes de cortes provocados por vidro partido, incluindo: - cortes provocados pela introdução de tubos de plástico em tubos ou pipetas de vidro - cortes provocados por vidro partido e outros materiais cortantes colocados de forma imprópria em contentores de lixo normal Precauções: - Antes de usar, inspeccionar o material de vidro de forma a garantir que se encontra em perfeitas condições ± sem quebras, falhas ou rachas. - Colocar o vidro partido e os materiais de vidro não reutilizáveis (por ex. Pipetas) em contentores de lixo próprios. Não utilizar os contentores de
lixo geral. Recolher vidros partidos imediatamente e de forma muito

cuidadosa. - Não guardar ou deixar material de vidro na beira de bancadas ou prateleiras.
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- Cuidado com o vidro quente. Colocar num local em que não possa ser acidentalmente tocado até arrefecer.

4.2 Equipamento eléctrico

Não utilizar fichas e tomadas partidas ou danificadas.

4.3 Equipamento de aquecimento: Bicos de Bunsen, placas e banhos de aquecimento

Riscos: Queimaduras provocadas por superfícies e líquidos quentes, vapores ou chamas. Precauções: - Todos os aparelhos de aquecimento (com excepção dos banhos) deverão ser mantidos afastados de materiais e substâncias inflamáveis. - Os bicos de Bunsen nunca deverão ser usados perto de contentores abertos de líquidos inflamáveis, nem em ambientes onde estejam presentes concentrações apreciáveis de vapores inflamáveis. - A chama poderá não ser visível em condições de luz muito intensa. Nunca deixar uma chama acesa sem vigilância. - O vapor dos banhos de aquecimento poderá provocar queimaduras. Ter atenção, especialmente quando se abrem as tampas de banhos a temperaturas elevadas.

4.4 Fontes de luz ultravioleta

Riscos: Queimaduras e danos graves na pele e nos olhos. Precauções - Utilizar protecção adequada para os olhos ± óculos ou máscaras de material opaco aos raios UV.
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Bi l 4. 5. combustíveis ou piróforas. ³F+´: E tremamente inflamável Subst ncias que usam o símbolo do fogo: subst ncias inflamáveis. SE Q Í I s riscos associados manipulação e utili ação de subst ncias químicas são essencialmente de dois tipos. que se especificam em seguida: Riscos físicos Riscos para a saúde Riscos Físicos As subst ncias químicas que representam riscos físicos são geralmente identificadas pela presença. nos rótulos. Símbolo de E plosão ³E´: E plosivo Símbolo ³ ´ em chamas ³ ´: idante ¦¢ ¥ ¤£ ¢ ¡    i l l -5- P t ¨ § ©¦ ¨   §   ¦ l P ti .5 Rel ti manual E ente i t m equi ent utili no l orat rio. que se relacionam com as propriedades das subst ncias: Símbolo do Fogo ³F´: uito inflamável. dos seguintes símbolos e letras. tendo especial e instruções atenção aos riscos associados e ao modo de os utili ar de modo a arantir a segurança e a manutenção dos aparel os em om estado. ler empre o ui adosamente antes de os utili ar. odas estas subst ncias apresentam um risco elevado de provocar incêndio no laboratório.

óxicos ³ ) / uito tóxicos . s produtos perigosos para a saúde.Bi l Riscos para a Saúde ma subst ncia química considerada nociva para a saúde quando existem evidências de que pode provocar efeitos nocivos. mesmo em doses reduzidas. Provocam reacção alérgica cut nea ou respiratória. irritar ou atacar destrutivamente os tecidos vivos. ICAÇÃO OS P ODUTOS QUÍ ICOS PRI CIPAIS TIPOS DE RISCOS PARA A SAÚDE CLASSI DE ACORDO orrosivos ³ ´ Podem queimar. por três vias: Inalação Absorção pela pele ou entrada através de feridas Ingestão s efeitos provocados pelas subst ncias químicas no organismo relacionam-se com a sua toxicidade capacidade de uma subst ncia causar um efeito nocivo) e com a dose quantidade) a que o organismo é exposto. mas não causam danos tecidulares permanentes prejudiciais que produtos tóxicos.       i l l COM OS      P t l P ti ausam a -6- . irritantes corrosivos) . para as subst ncias químicas. o que pode ocorrer.venenos ³ +´) danos menores danos menores que produtos Sensibili antes morte ou danos muito graves. em pessoas ou animais expostos a esse produto. crónicos ou agudos. apenas representam um risco quando entram em contacto com o organismo. Prejudiciais ³Xn´)/Irritantes ³Xi´) Por contacto causam vermelhidão ou inchaço da pele ou olhos.

Conhecer a localização dos alarmes de incêndio. 6.Não usar os elevadores echar as portas e se possível as janelas. PREVENÇÃO DE INCÊNDIOS A prevenção de incêndios é tão importante como o desenvolvimento de meios de os combater.Evacuar o edifício o mais rápido possível.Trabalhar com produtos inflamáveis em hotes . Radioactivos ± Estes produtos representam uma classe especial de produtos químicos. de forma calma e ordenada .Utilizar fósforos. É essencial ter a noção da necessidade de evitar práticas perigosas no laboratório e dos perigos colocados por um fogo que atinge proporções descontroladas. desde que tal não ponha em risco a sua própria segurança .1 Medidas de Prevenção . fontes de aquecimento.Activar o sistema de alarme e ligar o 112 . aparelhos eléctricos e outras possíveis fontes de ignição de forma cuidadosa 6. Biologia Celular Teratogéneos ± Afectam o desenvolvimento embrionário normal.2 Medidas de emergência em caso de incêndio .Ajudar qualquer pessoa que se encontre em perigo. Nunca deverão ser utilizados antes de adquiridos esses conhecimentos. à medida que se abandonam as salas -7- . cuja utilização apresenta riscos específicos pelo que requer um conhecimento e preparação técnica especiais. 6.Protocolos Práticos Carcinogéneos ± Podem provocar cancro. podendo causar malformações congénitas ou morte do feto. extintores e mangueiras .

PRIMEIROS SOCORROS 7.Evacuar a área e mover a vítima para local arejado .Lavar a zona afectada com água abundante durante pe lo menos 15 minutos .Remover qualquer peça de roupa que cubra a zona afectada .Remover lentes de contacto tão depressa quanto possível .No caso de a área afectada cobrir uma extensão larga.3 Inalação de produtos químicos .Ligar 112 -8- .Ligar 112 7. ligar 112 e pedir ajuda Olhos .2 Ingestão de produtos químicos .Não aplicar gorduras nas zonas afectadas .Lavar com água abundante no sentido do nariz para a orelha durante pelo menos 15 minutos .Utilizar protecção adequada de modo a não ser também afectado Pele: .Se a vítima estiver consciente e for capaz de engolir.Ligar 112 .1 ueimaduras químicas No caso de queimaduras provocadas pelo contacto de produtos químicos nocivos com a pele ou olhos. seguir os seguintes procedimentos: .Abrir as pálpebras de modo a assegurar uma lavagem eficaz .Cobrir com um penso seco e estéril .Protocolos Práticos Biologia Celular 7. dar-lhe a beber água ou leite 7.

MSDS Todos os produtos químicos são acompanhados de um folheto denominado MSDS (Material Safety Data Sheet ). -9- . reactividade. assim como em caso de acidente. equipamento de protecção e procedimentos de emergência. primeiros socorros.Protocolos Práticos Biologia Celular 8. Os MSDS incluem informações como propriedades físicas e químicas. detritos. armazenamento. de modo a familiarizar-se com os perigos e precauções que deverá ter ao utilizá -lo. perigos para a saúde. Todas estas informações são essenciais para trabalhar em condições de segurança. elaborado de mo do a fornecer tanto a quem os utiliza como ao pessoal de emergência todas as informações referentes aos procedimentos adequados para a utilização e manuseamento do produto em questão. Qualquer pessoa que manuseie qualquer produto químico deverá ler o MSDS correspondente. toxicidade. Os MSDS acompanham sempre os produtos comercializados e deverão ser mantidos no laboratório de forma acessível a todos os que trabalhem com os produtos em questão.

concentra a luz que vai incidir so bre esta. al como é visível na Figura . . mm. a revolução que o microscópio induziu na biologia.ocular é responsável pela ampliação e projecção da luz que atravessa a amostra para o olho. microscópio óptico é composto por um sistema de lentes de vidro distribuído de modo a que a luz emitida pela fonte de luz se concentre no plano da amostra e depois seja de novo concentrada e ampliada de forma a ser visualizada no olho do observador. Por esta razão. por isto mesmo.Bi l Aul MICROSCÓPIO ÓPTICO I TRODUÇÃO limite inferior para o olho humano distinguir dois objectos é da ordem dos 0. o condensador. ou de campo claro. e distinguir detalhes nessas µm). situado após a fonte de luz e antes da amostra. Para tal. como é descrito no diagrama da Figura . . permite -nos visualizar células com tamanhos na ordem de células na ordem dos 0 nm 0. É compreensível. µm 0 -6 m).Limi utili ação i rsos ti os mi roscópios &" % $# " ! i l l 46 48 6 46 7 46 543 ( ' )& ( 22 10 ' P t l P ti & . sistema objectiva . .10 - @ 9 i ura . a ampliação obtida é dada pelo produto da ampliação descrita na objectiva e da ampliação descrita na ocular. . uma vez que permitiu descobrir um novo mundo. o microscópio óptico.

± Esquema e formação a imagem o microscópio óptico. deixando de s er útil. o entanto. Para melhor compreender este conceito observe a Figura . Verifica -se que.3. Este facto é compreensível com a introdução do conceito de resolução. apesar de teoricamente ser possível ampliar ma lente indefinidamente a imagem. a partir de determinados limites essa ampliação não é acompanhada por melhoria de resolução. era legítimo afirmar que a capacidade de aumento do microscópio óptico seria virtualmente infinita. A imagem observada ampliada. a ampliação útil é na realidade na ordem das 000 X. pode ampliar uma imagem sem aumentar a sua resolução. GC F ED C BA A i l l .11 - U U T V T IAH PG IA AHA AG S R Q P t l P ti . i vertida e virtual Estando a ampliação total do microscópio dependente das ampliações parciais da objectiva e da ocular.Bi l Ampliação total = Ampliação da objectiva x Ampliação da ocular Fi ura .

) da luz incidente e A.12 - cY b a` Y XW W i l l h eWd fc eW WdW Wc g P t l P ti .N . é a abertura numérica definida pela equação.3 .d. A.N .o.N. r! 0.61 v P A. em que P é o comprimento de onda c.Bi l Figura . ! N ™ sen U .Efeito da ampliação e da resolução a imagem obtida É possível calcular o limite de resolução r) de um microscópio recorrendo equação.

cujo c.Bi l com N o índice de refracção do meio compreendido entre a amostra e a objectiva e U o semi-ângulo de abertura do cone luminoso que após passar pela amostra atinge a objectiva Figura . ) o limite de resolução seria de cerca de . o valor de A.4).o. de resolução com o valor de Para aprender a trabalhar com o microscópio convém saber a localização e nome dos seus principais constituintes Figura .3 ficando o limite de 0 nm. Figura . ).o. . a prática.13 - . máximo é de 0 nm para um c.d.N.Principais constituintes do microscópio óptico q t sr q pi i i Protocolos Práticos l l r w v x u .5 . Figura . e para a maior abertura numérica teórica 60 nm. varia entre 400 nm e 700 nm.4 .d.Representação gráfica do significado dos parâmetrosN e U para o cálculo da Abertura u m rica Assim para a luz visível.

colocar uma gota de óleo de imersão. puxar a platina para baixo até obter uma imagem nítida da amostra D epois da amostra estar focada com a objectiva de objectiva de 40X. sobre a preparação.PARTE EXPERIME TAL Observações microscópicas DLigar a fonte luminosa D olocar a amostra na platina lamela para cima) D om o auxílio do condensador e do diafragma obter uma boa iluminação Subir o condensador para a objectiva de imersão em óleo ou baixar para objectivas de baixa ampliação) DRodando o parafuso macrométrico aproximar a platina o mais perto possível da objectiva de 0X DRodando novamente o parafuso macrométrico. focar com a om o auxílio do parafuso micrométrico podem-se obter se uma maior resolução na observação da amostra Figura .14 - . Focar.Efeito da adição do óleo de imersão sobre a dispersão da luz y ‚ € y Protocolos Práticos Biologi l l r ƒ . rodar a objectiva de 40X e. utilizando o parafuso micrométrico. O uso de óleo de imersão umérica por influenciar o valor de N obtendomelhora o valor da Abertura 0X.7 . Figura . diferentes planos das estruturas a observar DSe pretender utilizar a objectiva de 00X. já com a objectiva de 00X.7).

Perceber a utilização do óleo de imersão. Saber descrever o funcionamento do microscópio óptico (m. o.Protocolos Práticos Biologia Celular OBJECTIVOS: y Compreender o âmbito de aplicação da microscopia óptica (noção de escala microscópica). Compreender os factores que influenciam a ampliação e a resolução. e saber utilizá -lo. y y y y . o.15 - . Conseguir nomear os principais constituintes do m.).

6.4 mm 4 0 Qm) da lâmina. Calibração (mm) Figura . DVerificar em que outro ponto do campo as escalas se sobrepõem igualmente.16 - .Representação esquemática da calibração DColocar a ocular micrométrica em posição no tubo do microscópio e instalar a lâmina graduada na platina do microscópio. de cada objectiva.Aula 3 MEDIÇÃO COM OCULAR MICROMÉTRICA Medições em preparações microscópicas As observações em microscopia envolvem muitas vezes a medição do objecto de estudo.e. verifica -se que 80 divisões da ocular divisão = 4 0/80 = . „ ‡ †… „ Protocolos Práticos Biologi l l r ‰ˆ . . o exemplo da Figura . DRodar a ocular micrométrica de modo a que as escalas da ocular e da lâmina fiquem paralelas e se sobreponham parcialmente ver Figura .0). D eslocar a lâmina para que o início da graduação das duas escalas se sobreponha 0 e 0. com auxílio de uma ocular micrométrica e uma lâmina graduada. A medição pode ser realizada após calibração. i..6 correspondem a 0.6).

por ex. DPara a medição de um objecto desconhecido. .17 - . Saber converter as Unidades de medida (µm. e multiplica-se pelo valor micrométrico previamente determinado. sendo pois necessário proceder à calibração para cada uma das outras objectivas. 5. determina -se primeiro o número de divisões.Protocolos Práticos Biologia Celular Qm. y .6. recorrendo a uma ocular micrométrica e lâmina graduada. Å). obtendo -se a dimensão 22. OBJECTIVOS: y Saber fazer medições ao m. o. Qm. por ex. nm. Este valor só é válido para a objectiva utilizada.

as dimensões PROCEDIME TO EXPERIME — — TAL 1.Aula 4 DIVERSIDADE CELULAR PARTE EXPERIME MATERIAL Zaragatoa ou palito Pinça Bisturi Lâminas e lamelas Soro fisiológico Solução de azul de metileno Esc eric i coli S cc aromyces cerevisiae Bolbo de cebola Folha de Elodea TAL otas importantes: y Antes de efectuar cada preparação limpe bem a lâmina e a lamela com álcool y Para cada desenho a efectuar não se esqueça de indicar: a) a ampliação com que observou a preparação b) a legenda. cobrir com uma lamela e observar ao microscópio ver Figura . coli que lhe foi fornecida sobre uma lâmina.18 - . os pormenores relevantes e sempre que possível. Cultura de Esc eric ia coli DColocar uma gota da cultura de E. com indicação da amostra observada. ) ’ ‘  Protocolos Práticos Biologi el l r ”“ – • “ .

rodar a objectiva de posição correcta e focar a preparação micrométrico e fazendo pequenos movimentos D esenhar o que observa. Rodar o revólver no sentido da objectiva de 00 X e colocar uma gota de óleo de imersão sobre a lamel a. . Cobrir com uma lamela. Colocar uma lamela e observar DDesenhar o que observa com a objectiva de 00X. Proceder como indicado na Figura . Juntar uma gota de soro fisiológico e misturar bem. cerevisiae sobre uma lâmina. Figura . Observar ao microscópio. 00 X até esta ficar na usar apenas o parafuso .Recol a da epiderme do bolbo de cebola DColocar sob uma gota de soro fisiológico em cima de uma lâmina. primeiro com a objectiva de 0X. Células de Sacc aromyces cerevisiae fermento de padeiro) DCom a ajuda de um palito colocar uma pequena amostra de S.Colocação da lamela DComeçar por focar a preparação com a objectiva de 0 X e em seguida mudar para a objectiva de 40 X e voltar focar.Figura . Epiderme interna da escama do bolbo da cebola Alli m cepa) DSeparar duas escamas carnudas que formam o bolbo da cebola e com a ajuda de uma pinça destacar um pequeno quadrado da epiderme interna que recobre a parte côncava que ficou a descoberto. Lenta e cuidadosamente. .19 - . 3. ™ ˜ Protocolos Práticos Biologia el lar g e i d hh f .

Biologia Celular X. Compreender os limites de resolução do microscópio óptico e do microscópio electrónico. DDesenhar o que observa.20 - . Aplicar sobre uma gota de azul de metileno. OBJECTIVOS: y y y y Compreender o conceito de célula. Saber escolher a ampliação adequada ao objecto que pretende observar. Tente reduzir a iluminação ajustando o diafragma do microscópio. Repetir o processo. olha de uma planta aquática ( Elodea canadiensis) DDestacar uma folha de Elodea e fazer um pequeno corte na epiderme superior da folha com o auxílio do bisturi. y y . Células de gengiva D riccionar ligeiramente a gengiva a vezes com a ponta de uma zaragatoa. Adicionar uma gota de soro fisiológico. Diferenciar células animais e vegetais. Cobrir com uma lamela e desenhar o que observa. Cobrir com uma lamela DDesenhar o que observa com as objectivas de Xe1 X. . Examine então com a objectiva de maior ampli ação.Protocolos Práticos depois com a objectiva de de metileno. Saber registar e legendar a observação realizada. 5. Diferenciar células procariotas de eucariotas. mas desta vez com azul Nota : especímenes não corados são muitas vezes melhor visualizados com menos luz. espalhando bem.

a amostra é colocada num ambiente o mais semelhante possível às condições nas quais ela se encontra in vivo (água doce ou salgada. etc.Protocolos Práticos Biologia Celular Aula CITO UÍMICA E HISTO UÍMICA INTRODUÇÃO A observação de células ao microscópio óptico de fundo claro apresenta dois problemas: as pequenas dimensões das células e a ausência de contraste entre os constituintes celulares. TIPOS DE PREPARAÇÕES 1. Outro obstáculo à qualidade da observação é a opacidade da amostra à luz. vermelho Congo. Para tal.) e a sua utilização permite a coloração de estruturas celulares mantendo as funções vitais da célula durante algum tempo. etc) e depois colocada entre lâmina e lamela. Sudão III. que permitem uma melhor visualização dos componentes celulares. soro fisiológico. Estas preparações podem contudo ser contrastadas com substâncias que não alteram as características do material biológico. Embora evitem a formação de artefactos na amostra. utilizam-se as técnicas denominadas técnicas citológicas ou técnicas citoquímicas . Preparações temporárias ou extemporâneas Destinam-se à observação momentânea de uma amostra de material biológico no seu estado natural. Este tipo de líquidos que não alteram as condições do material a observar designam-se líquidos indi erentes . De forma a superar estes factores. este tipo de preparação não permite observar estruturas celulares com grande detalhe. A coloração de preparações temporárias pode fazer -se de dois modos:  Imersão: o corante é adicionado ao meio de montagem . vermelho neutro. I.21 - . Estas substâncias são denominadas corantes vitais (azul de metileno.

2. Essas finas fatias são então montadas em lâmina. não tendo igual importância no caso de se trata r de células isoladas. a amostra é cortada em sucessivas camadas muito finas utilizando um micrótomo. De modo a permitir esta conservação. Consiste na inserção da amostra numa matriz de um material que a mantenha estável e sem deformações. . as amostras são de novo desidratadas e cobertas com um meio de montagem (usualmente o Bálsamo do Canadá). É fundamentalmente utilizada na obtenção de preparações definitivas de tecidos. Esta técnica permite também proceder à substituição de um meio de montagem por outro em preparações temporárias.  Inclusão e corte: processo normalmente utilizado em histoquímica.) tendo como finalidade preservar as estruturas do material a observar.22 - .  Desidratação: usualmente obtida através da passagem do mater ial biológico por álcoois ou acetonas de concentração crescente (este tratamento visa a remoção da água dos tecidos a observar). Depo is de solidificada. ácido acético.Protocolos Práticos Irrigação: Biologia Celular o meio de montagem com a amostra entre lâmina e  lamela é substituído por capilaridade. frio) ou químicos (metanol. etc.   Coloração: os cortes são tratados com corantes. A substância mais utilizada como matriz é a parafina fundida. o material biológico é submetido a uma sequência de tratamentos destinados a desidratar e a fixar as células a ser observadas. Preparações definitivas Permitem conservar o material biológico entre lâmina e lamela durante longos períodos de tempo. Fase inal de montagem: após a coloração.  Fixação: tratamentos físicos (calor.

 Coloração di erencial: um agente de envolve o uso. assim como os mecanismos de ligação às moléculas biológicas: a) Forças electrostáticas: corantes com carga positiva podem ligar-se a estruturas celulares com carga negativa e vice -versa. o iodo. este método é designado como citoquímica. o ferro. Exemplos de corantes utilizados em microscopia óptica . geralmente de natureza orgânica. Se estiverem em estudo tecidos. que coram estruturas celulares em geral ou em particular .23 - . As especificidades dos corantes são variadas. Utilizam-se substâncias. Alguns mordentes utilizados em citoquímica são o cobre.corantes . COLORAÇÃO Biologia Celular Uma das técnicas mais usadas para incrementar o contraste das preparações biológicas é a coloração. b Acido ilia: os corantes acidófilos são substâncias de natureza básica que se ligam a estruturas celulares ácidas (ácidos nucleicos.  Coloração combinada: utilização de diferentes corantes para pôr em evidência e distinguir estruturas celulares diferentes (ex: hematoxilina eosina). d Mordentes: substâncias que favorecem a ligação de corantes sem carga eléctrica a determinadas estruturas celulares.  Coloração simples: utilização de um único corante para pôr em evidência estruturas celulares (ex: azul de metileno). No estudo de células isoladas. proteínas). c Baso ilia: os corantes basófilos são substâncias de natureza ácida que se ligam a estruturas celulares básicas. designa-se como histoquímica.Protocolos Práticos II. no processo de coloração de que permite distinguir diferentes diferenciação composições da mesma estrutura celular (ex: coloração Gram). possibilitando ou aumentando a eficácia da coloração.

Protocolos Práticos Corantes gerais Básicos: y y y Biologia Celular Hematoxilina ucsina básica Violeta de cresilo Ácidos: y y y Eosina Laranja G Azul de anilina Corantes para citoquímica y y y y Ácido periódico-Schiff: corante para glúcidos Corante de eulgen: DNA e RNA Negro Sudão (Sudão III): lípidos Enzimas Corantes para imunocitoquímica y y y y luoresceína Rodamina Enzimas Ouro coloidal PARTE EXPERIMENTAL MATERIAL - Culturas em meio sólido de Escherichia coli Corantes: violeta cristal e safranina Lugol Álcool a 95% Óleo de imersão Soro fisiológico estéril Lâminas para microscópio Palitos .24 - .

arrefecer e transferir duas gotas de soro fisiológico estéril para o centro da lâmina DRecolher com o auxílio de uma ansa. para de seguida se executar a coloração. com as iniciais do organismo a testar e o nome do grupo D lamejar a lâmina. 2. segura pela pinça DCobrir a lâmina com lugol (Gram's Iodine) e deixe actuar durante 1 minuto DLavar a preparação com água DDescorar a lâmina com álcool etílico 95%. durante 1 a 2 segundos. (esterilizada à chama e arrefecida). Preparação de esfregaços D Marcar a lâmina. Método de Coloração: coloração diferencial de Gram DCobrir o esfregaço com violeta cristal. mantendo a lâmina em posição oblíqua.Protocolos Práticos Pinças Bico Bunsen Microscópio Varetas de vidro Pipeta de Pasteur Pompete Biologia Celular - PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL 1.25 - . no lado oposto onde é efectuado o esfregaço. até desaparecimento completo da cor DLavar a preparação com água . Evitar fazer esfregaços densos DDeixar secar e fixar a preparação à chama. uma pequena quantidade de massa bacteriana e colocar na lâmina DEspalhar de forma a obter uma distribuição homogénea. Deixar actuar durante segundos DRetirar o excesso de corante com água destilada.

Distinguir os vários tipos de coloração (simples. Distinguir preparações temporárias de definitivas. Saber enumerar os passos necessários à elaboração destes dois tipos de preparações. combinada e diferencial).Protocolos Práticos Biologia Celular DAplicar o corante de contraste. OBJECTIVOS: y y Compreender o que é a Citoquímica e qual a sua utilidade.26 - . Inferir sobre a vantagem da utilização de corantes (comparação das preparação de E. assim como as cores associadas. Conhecer os métodos de coloração de preparações temporárias (imersão e irrigação). . coli corada com a realizada na aula anterior). Conhecer a técnica de preparação de esfregaços Saber executar a coloração de Gram. Distinguir cocos de bacilos. safranina e deixar actuar durante segundos DLavar com água e deixar secar DColocar uma gota de óleo de imersão e observar a preparação ao microscópio na objectiva de imersão DRegistar as formas e cores das células observadas. Diferenciar os vários corantes quanto aos mecanismos de ligação às moléculas biológicas e classificá-los quanto à sua natureza. perceber em que se baseia e qual a sua utilidade. Observação de preparações definitiva DObservar as diferentes preparações definitivas. y y y y y y y . registando os tipos de células e componentes celulares observados.

passagem de água através de uma membrana semi-permeável que separa duas soluções com concentrações diferentes.Determinação da pressão osmótica k j Protocolos Práticos Biologia el lar l . A água movimentase da solução com menor concentração de soluto i. . As trocas real izam-se através da membrana plasmática. as células vivas são constituídas por 7 -8 % de água. A pressão osmótica de uma solução é a pressão que deve ser aplicada para impedir que a entrada de água por osmose ocorra Figura . que separa o meio intracelular do extracelular. Figura 5. de forma a assegurar o seu metabolismo. aquela em que existe maior número de moléculas de água) para a solução com maior concentração i. )..e. De uma forma geral.27 - . pelo que a compreensão dos mecanismos de difusão movimento de solutos a favor do gradiente de concentração) e osmose movimento de água através de uma membrana semi-permeável) é fundamental para o estudo da biologia celular. Osmose .e..Aula 6 OSMOSE I TRODUÇÃO A célula tem necessidade de trocar substâncias com o meio exterior e com outras células. menor número de moléculas de água).

em meio hipotónico.2).quando comparado com outro.Protocolos Práticos Biologia Celular A pressão osmótica é determinada pelo número de partículas em solução. Daqui a importância de se manter as células animais sempre em meio isotónico.2). tem maior con centração de soluto (em número de partículas).2 Preparações de glóbulos vermelhos em soluções com di erentes osmolaridades o n m . tem menor concentração de soluto (em número de partículas). Em células animais A ausência de parede celular torna as células animais mais vulneráveis ao fenómeno da osmose.quando comparado com outro. Meio hipotónico . independentemente da sua natureza (moléculas ou iões). Meio hipertónico . O número de partículas por unidade de volume (litro) é dado pela osmolaridade . podendo mesmo rebentar ± lisar ( igura 5. Hipotónica Isotónica Hipertónica Figura . O fenómeno inverso ocorre em meio hipertónico. A. O termo osmol designa a concentração em número de partículas.28 - . a água tende a entrar e as células aumentam de volume. Assim. com as células perdendo água e ficando encolhidas ± crenadas ( igura 5.

).1M . Quando colocadas em meio hipertónico. ficando túrgida. M NaCl .Protocolos Práticos B. A parede celular impede que a célula aumente de volume e rebente.29 - r q p Figura . as células perdem água (através do vacúolo).3 Comportamento de uma célula vegetal em soluções com di erentes osmolaridades . a célula vegetal tende a absorver água e a acumulá -la no vacúolo.2M NaCl . Em células vegetais Biologia Celular Em meio hipotónico. ocorrendo o fenómeno de plasmólise ( igura 5.5M NaCl . Esta turgidez origina a rigidez mecânica característica da maioria das plantas. M NaCl . Meio hipotónico Meio hipertónico PARTE EXPERIMENTAL MATERIAL olhas frescas de Elodea Lâminas Lamelas Soro fisiológico NaCl .

5M) DObservar cada preparação ao microscópio DPara cada solução utilizada.1M e . fazendo um esquema legendado DDeverá determinar e indicar. ao mesmo tempo que se coloca a nova solução de montagem.30 - .Protocolos Práticos NaCl . hipertónica ou isotónica. se a solução utilizada é hipotónica. Solução NaCl Lamela Papel Lâmina Figura . registar as alterações que observar. M. . cobrir com uma gota de soro fisiológico e montar com uma lamela. M.4 Técnica da irrigação: O primeiro meio de montagem é retirado por absorção com papel.2M. Observar ao microscópio DUtilizando o método de irrigação ( igura 5. para cada caso. ). .5M. . . com o auxílio de uma pipeta de Pasteur t s . 5M Papel absorvente Pipetas Pasteur Microscópio Biologia Celular - PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL DColocar uma folha de Elodea sobre uma lâmina. substituir o meio de montagem por cada uma das soluções de NaCl que lhe foram fornecidas ( .

Distinguir meios hipotónicos.31 - . Perceber as alterações produzidas em células animais e vegetais quando colocadas em meios de diferentes osmolaridades. Compreender o conceito pressão osmótica.Protocolos Práticos Biologia Celular OBJECTIVOS: y y y y Distinguir osmose de difusão simples. isotónicos e hipertónicos. y . Compreender a técnica utilizada (irrigação) na determinação da solução isotónica para as células de Elódea.

os cromossomas individualizam-se e inicia-se um processo que garante a distribuição do material genético de uma célula que foi duplicado na fase S) em partes iguais para as células filhas. . 2 divisão nuclear e a 1 Profase Metafase v u Protocolos Práticos Biologia el lar . Os acontecimentos que ocorrem na mitose são classicamente divididos em cinco fases.Aula 7 MITOSE I TRODUÇÃO O ciclo celular consiste na sequência contínua e ordenada de processos que ocorrem numa célula desde o crescimento até filhas.32 - . A mitose fase fase. esta A interfase representa a maior parte do ciclo celular fases processo de replicação fase S). das quais as quatro primeiras correspondem última divisão do citoplasma. o ADN encontra-se descondensado cromatina interfásica) e dá -se o ) é o processo celular que rege a repartição do material genético entre células eucarióticas em divisão.Se ). o ADN é condensado. Ao entrar na mitose. Este ciclo pode ser dividido em Interfase e sua divisão em duas células itose.

meristemas. Na Telofase. Dá-se o aparecimento do nucléolo. Na Citocinese. Cada cromatídeo fica ligado a um dos polos do fuso mitótico é aqui que se garante a divisão do material genético em duas partes iguais). ocorre a divisão do citoplasma com a distribuição dos organelos e outros constituíntes celulares pelas duas células filh as. ao nível do centrómero. migração de cada cromatídeo para um dos polos da célula. dá-se o alinhamento dos cromossomas no plano equatorial do fuso mitótico.33 - x w Protocolos Práticos Biologia el lar y . Formam -se dois conjuntos de Nas plantas. localizados nas extremidades de caules e raízes e no câmbio. o fuso mitótico desaparece e a membrana nuclear reconstitui-se em torno de cada um dos dois conjuntos de cromossomas. . Na Metafase. a divisão nuclear e celular ocorre em áreas específicas. É a fase mais curta da mitose. . a interação dos centrómeros com o fuso mitótico leva cromossomas idênticos. Este processo tem início durante a telofase.Fases da Mitose Telofase Na Profase. Na Anafase. o desaparecimento da membrana nuclear e a formação do fuso mitótico. os cromossomas descondensam-se.3 4 Anafase Figura 7. dá-se a condensação dos cromossomas cada um com dois cromatídeo). O meristema apical é a região que contém a maior percentagem de células em mitose.

durante 3min min . Observação de figuras de mitose em ápices radiculares de Alli m cepa MATERIAL icroscópio óptico Lâminas Pinça de madeira Bico de Bunsen Ápices radiculares de Alli m cepa cebola) Cl 1N Orceína acética PROCEDIME TO EXPERIME TAL DColocar o ápice radicular de Alli m cepa em Cl 1N.Região de divisão celular Figura 7.34 - DAdicionar 3 gotas de orceína acética e deixar repousar { z Protocolos Práticos Biologia el lar }  ~ | . .Secção longitudinal da extremidade de uma raíz PARTE EXPERIME TAL 1.

determinar a fracção de tempo (%) que as células do tecido .Protocolos Práticos Biologia Celular DAqueçer suavemente até concentrar o corante em torno do ápice. mais duas vezes. Com a ponta do dedo aplicar uma pequena pressão sobre a lamela.35 - . após adicionar uma gota de orceína acética DTransferir o material para uma lâmina limpa. 2. Use as imagens da igura . de forma a obter uma única camada de células.1 DConsiderando que o número de células em cada fase da mitose é directamente proporcional ao tempo que cada célula passa em cada uma destas fases. Observação de figuras de mitose em preparações definitivas de cortes histológicos de Ascaris MATERIAL Microscópio óptico Preparação definitiva de cortes histológicos de Ascaris corados com azul de toluidina PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL DLigar o microscópio DColocar a preparação definitiva na platina D ocar a uma ampliação 1 X e observar a X ou 1 X.1 como ajuda para identificar as fases do ciclo celular nas quais se encontram as células DDesenhar e legendar uma célula em cada fase DContar em diferentes campos de observação o número de células que se encontra em cada fase da mitose e apontar os dados na Tabela . sem deixar secar DRepitir a operação. adicionar uma gota de orceína acética e colocar a lamela.

1 ase da Mitose Interfase Número de células % de tempo em cada fase ____________% Profase ____________________________________________ ____________% Metafase ____________________________________________ ____________% Anafase ____________________________________________ ____________% Telofase ____________________________________________ ____________% Total ____________________________________________ 100% OBJECTIVOS: y y y Compreender o processo da mitose e a sua integração no ciclo celular.36 - . Compreender o cálculo da duração relativa de cada uma das fases do ciclo celular.1 Tabela 7. Anotar os valores obtidos na Tabela . Perceber a função da mitose e em que células ocorre. Identificá -las em preparações de células animais e vegetais. Descrever as várias fases da mitose. y .Protocolos Práticos Biologia Celular observado passam em cada fase do ciclo celular que observou.

e a meiose. os acontecimentos que têm lugar durante cada uma das divisões meióticas I e II são distintos.meiose I e meiose II ± sem a ocorrência de uma fase S intercalar. A combinação da meiose e da fertilização no ciclo de vida é a base da reprodução sexuada. a ana ase I e a telo ase I . em que ocorre a separação dos é separado.37 - . que é a fase mais longa e complexa. a meta ase II. a ana ase II e a telo ase II.Protocolos Práticos Biologia Celular AULA 8 MEIOSE INTRODUÇÃO A meiose constitui um tipo de ciclo celular especializado. S e G2. A meiose II compreende a pro ase II. Durante a meiose ocorrem duas divisões sucessivas . Nesta primeira divisão ocorrem os processos de recombinação entre cromossomas homólogos: formam -se os bivalentes . metafase. engloba a interfase meiótica. de modo a dar origem a duas células haplóides (n) cada uma delas cromatídeos das células resultantes da meiose I originando células haplóides. Nos animais superiores. a meiose ocorre nos órgãos sexuais tanto masculinos como femininos. A meiose I denomina-se por isso divisão reducional . O ciclo celular meiótico. num processo que se denomina respectivamente espermatogénese e oogénese. A fertilização é o processo que resulta da fusão de duas células sexuais haplóides. No final da meiose I cada par de cromossomas homólogos da célula -mãe (2n) com 2 cromossomas. que se subdivide nas fases G1. A meiose I compreende a pro ase I. através do qual os organismos produzem células com metade do material genético (haplóides n ) destinadas à reprodução sexual. . anafase e telofase. estruturas que garantem a diversidade genética de todos os organismos sexuados através do mecanismo de ³crossing over´. à semelhança do ciclo celular mitótico. Apesar de cada uma das divisões meióticas ser também formalmente dividida em profase. a meta ase I . Corresponde a uma divisão equacional .

.Figura 8.Representação esquemática da meiose PARTE EXPERIME MATERIAL TAL PROCEDIME TO EXPERIME TAL Identificar e desenhar ampliação de 400X) células em cada uma das fases da meiose.38 - . elofase I  € Protocolos Práticos Biologia el lar ‚ . guie-se pelas fotografias da Figura 8. Para tal. : Profase I etafase I Anafase I ƒ - icroscópio e Preparações definitivas de Lili m sp.

função.Intercinese etafase II Anafase II elofase II Figura 8. .Fases da meiose OBJECTIVOS: y Distinguir meiose e mitose quanto a) ocorre e c) fases que a compõem. y Identificar as diferentes fases da meiose nas preparações observadas na aula.39 - … „ Protocolos Práticos Biologia el lar † . b) ao tipo de células em que AULA 9 EXTRACÇÃO DE DNA PLASMÍDICO INTRODUÇÃO . y y y Distinguir células haploides de diploides. Compreender o fenómeno de ³crossing -over´ e suas consequências. Conhecer as causas do aumento da variabilidade genética em organismos com reprodução sexuada versus assexuada.

40 - .Protocolos Práticos Biologia Celular O DNA genómico bacteriano é geralmente circular com tamanho que varia entre algumas centenas de kb (1 kb aproximadamente 1 1 pares de bases) e kb.ver igura 1 . . sendo repartidos entre as células quando há divisão celular (transmissão vertical). entre outros. Esta vantagem pode ser conferida através de genes de resistência a antibióticos. existem outros elementos genéticos como plasmídeos. produção de insulina). Na bactéria. os plasmídeos são frequentemente utilizados como vectores de clonagem. A maioria são circulares e possuem replicação autónoma. por processos de virulência. por processos de restrição / modificação.1) de uma estirpe de Escherichia coli recorrendo à técnica de lise alcalina. pela produç ão de toxinas. Os plasmídeos podem ainda ser transferidos por conjugação ocorrendo a sua passagem de uma célula para a outra (transmissão horizontal). permitindo a expressão de genes de outros organismos pela bactéria (ex. conferem vantagem selectiva ao hospedeiro. O objectivo desta aula prática. Os plasmídeos de ocorrência natural apresentam uma variação de tamanho entre 1 kb e algumas centenas de kb. além do DNA genómico. Os plasmídeos contêm genes essenciais para a sua manutenção na célula e ainda genes que em determinados ambientes. transposões e vírus. Em laboratório. é a extracção de DNA plasmídico (plasmídeo pBR322 que confere resistência ao antibiótico ampicilina . contendo cada célula uma cópia.

Solução 1: Glucose 5 mM EDTA 1 mM TrisHCl 25 mM (pH ) . com micropipeta. DCentrifugar o lisado durante 5 min a 15 rpm. ajustado com ácido Tris HCl 1 mM (pH ) EDTA 1 mM RNAse 2 Qg / ml PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL DInocular a estirpe de E. durante 3 min. a ºC. Transferir o sobrenadante para novo tubo e adicionar 9 µl de etanol absoluto (a -2 ºC).Etanol %. Remover completamente o sobrenadante. DPipetar 1 ml para um tubo eppendorf e centrifugar 1 min a 15 rpm. a ºC. DLavar o sedimento de DNA plasmídico com 5 (-20ºC).41 - . Misturar por inversão e colocar em gelo durante 3 min à temperatura ambiente.2 M SDS 1% . e adicionar 1 Q l de solução 1.Solução 2 (preparar no momento): NaOH . µl de etanol a 70% Deixar 15 min a -2 ºC. Remover o sobrenadante e secar o pellet de DNA plasmídico a 60ºC. Ressuspender e incubar 3 min em gelo. coli contendo o plasmídeo em 1 ml de meio LB com ampicilina e incubar durante a noite a 37ºC com agitação. Misturar suavemente por inversão e manter Ql de solução 3. .Protocolos Práticos Biologia Celular PARTE EXPERIMENTAL MATERIAL . Centrifugar 15 min a ºC e remover o sobrenadante. . .Solução 3: .Etanol absoluto.Cultura de Escherichia coli em meio LB líquido com ampicilina.Tampão TE (com RNase) KAc 3 M (pH acético glacial) . DAdicionar 2 DAdicionar 15 Q l de solução 2. 5 min. DCentrifugar 3 min a 15000 rpm. .

Protocolos Práticos Biologia Celular DRessuspender o sedimento de DNA em 50 µl de TE com RNase. y y . OBJECTIVOS: y y Perceber que os plasmídeos fazem parte do genoma extracromossomático. Saber que a sua transmissão além de vertical é também h orizontal. Saber executar e explicar cada uma das etapas do protocolo de extracção de DNA plasmídico. Compreender a função dos plasmídeos nas bactérias que os possuem. Perceber a importância dos plasmídeos em processos como a clonagem.42 - . Conservar a -20ºC.

A separação e visualização destes fragmentos serão feitas por electroforese. Estas enzimas são quase exclusivamente produzidas por procariotas sendolhes imputada uma função protectora µi vivo¶ contra ácidos nucleicos invasores como é. as endonucleases são ferramentas importantes em processos de clonagem de genes. ˆ ‡ Protocolos Práticos Biologia el lar ŒŒ  ‰ com a . dois fragmentos lineares de DNA com 1. respectivamente. XmnI 1.3 Kb XmnI Amp R Š ‹Š Figura .3') ver Figura 10. . após a hidrólise. Kb pBR3 4. O objectivo desta aula prática é a digestão do plasmídeo pBR3 enzima de restrição XmnI.AULA DI ESTÃO DE DNA PLASMÍDICO E ELECTROFORESE EM EL DE AGAROSE INTRODUÇÃO As endonucleases são enzimas que reconhecem sequências de bases no DNA sendo capazes de hidrolisar digerir) as cadeias de DNA em locais específicos.Mapa de restrição do plasmídeo pBR3 com a enzima XmnI.43 - . Este plasmídeo possui dois locais contendo a sequência de bases que XmnI reconhece 5'.GAANN NNTTC.1). Kb e . produzindo-se. execução de mapas físicos e outros. Em laboratório.4 Kb. por exemplo o caso dos bacteriófagos.

radiação A com o produto da digestão de pBR3 ’’ ‘ Figura .(A) Marcador de pesos moleculares. (B) esquema da electroforese realizada com XmnI  Ž B Protocolos Práticos Biologia el lar ’ . da concentração da matriz de agarose utilizada. Após a electroforese. uando se faz uma electroforese de ácidos nucleicos em gel de agarose é indispensável a utilização de um marcador de pesos moleculares para o cálculo do peso molecular da amostra. da conformação das moléculas.A electroforese é uma técnica capaz de separar moléculas com carga pela aplicação de um campo eléctrico) em função do seu peso molecular e/ou carga eléctrica das moléculas. A velocidade de migração depende da massa função do número de pares de bases pb)).44 - . os ácidos nucleicos no gel de agarose tornam -se visíveis por acção do brometo de etídeo adicionado previamente ao gel de agarose). por interpolação é possível relacionar o peso molecular da amostra com as bandas do marcador. m marcador de pesos moleculares é constituído por uma série de fragmentos de DNA de peso conhecido. A agarose forma uma matriz porosa cujo tamanho do poro pode ser controlado) através da qual migram as moléculas de ácidos nucleicos. . A separação de ácidos nucleicos que se encontram carregados negativamente grupos fo sfato) é geralmente efectuada em géis de agarose. do campo eléctrico aplicado ao sistema e ainda da composição do tampão utilizado na electroforese. Este composto intercala -se nas cadeias de ácidos nucleicos e fluoresce quando submetido ultravioleta.

5 µl .Protocolos Práticos Biologia Celular PARTE EXPERIMENTAL MATERIAL .DNA plasmídico (pBR322) (extraído na aula anterior) . Digestão de DNA plasmídico com a enzima de restr ição XmnI DFazer a mistura de digestão (em tubo eppendorf) adicionando cada um dos reagentes indicados na tabela pela ordem apresentada.25% Xilenocianol 0.1 ml ácido acético glacial 100 ml EDTA 0.Marcador de pesos moleculares .Tampão TAE 50 X: 2 2 g Tris base 57.25% PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL 1.0) H2O até perfazer 1l Ajustar pH a . Água Tampão de enzima 10 X BSA 10X DNA plasmídico Enzima de restrição XmnI 10.5 µl 2 µl 2 µl 5 µl 0.0 .45 - .Agarose .Tampão de enzima 10 X .5 M (pH .Enzima XmnI 5U / Q l .BSA 10 X .Solução STOP (tampão de aplicação): Sacarose 0% Azul de bromofenol 0.Brometo de etideo .

Compreender a técnica de electroforese.46 - y y y . . Perceber o processo utilizado para a visualização de ácidos nucleicos em gel de agarose. Ferver em microondas até obter uma mistura homogénea. DIniciar a electroforese por aplicação de um campo eléctrico (100 V 20 min). DApós a corrida retirar o gel da tina e colocar em cima do transiluminador (fonte de radiação ultravioleta). DFotografar o gel. DConservar a ºC. Biologia Celular DRetirar os tubos da estufa e adicionar 2 µl de solução STOP a cada tubo. DRemover o pente e colocar o gel na tina de electoforese. Adicionar tampão (TAE 1X) à tina de electroforese até cerca de 1 mm acima da superfície do gel. % em tampão TAE 1X. Saber qual a sua função in vivo¶ e perceber a sua utilização in vitro¶ (ferramentas moleculares). DAplicar 5 Ql do marcador de pesos moleculares no primeiro poço e 5 Q l no último poço do gel. DPreparar um gel de agarose 0. Deixar arrefecer a mistu ra líquida até atingir aproximadamente 50ºC e adicionar 1 Q l de brometo de etídeo. Adicionar o tampão (TAE 1X) até atingir o volume desejado.( MUITO IMPORTANTE usar luvas para manipular este reagente). OBJECTIVOS: y Perceber o que são endonucleases (enzimas) de restrição. MUITO IMPORTANTE usar óculos de protecção contra UV. 2. Para tal pesar a agarose necessária para um volume final de 50 ml e colocar num recipiente adequado.Protocolos Práticos D Misturar cuidadosamente e incubar a 37ºC durante 1h. Visualização dos produtos de digestão por elecro orese em gel de agarose. Deixar solidificar b 30 min. Saber para que serve um marcador de pesos moleculares e como permite calcular o peso molecular das bandas da amostra. Deitar a agarose dentro do molde contendo um pente adequado ao volume e número de amostras que pretende aplicar.

47 - . Conseguir interpretar um perfil de digestão de DNA plasmídico. Co nhecer as condições óptimas de actuação das enzimas de restrição. y .Protocolos Práticos Biologia Celular y Saber realizar uma reacção de digestão de um DNA plasmídico.

Soluções padrão: preparar diferentes soluções de concentrações conhecidas 2. sendo por vezes necessário quantificá -las. procede -se da seguinte forma: 1. A espectrofotometria nas regiões visível e ultra -violeta. é uma técnica que permite determinar a concentração de substâncias em solução. Traçar em papel milimétrico o gráfico ³Absorvância vs. Executar o procedimento experimental escolhido para quantificar a substância padrão 3. (concentração da solução padrão ´ 4. Determinar a gama de concentrações onde é válida a Lei de Lambert -Beer (onde há proporcionalidade directa entre A e C) . Para traçar a curva de calibração e determinar a equação da recta. definida pela Lei de Lambert-Beer: A = IC l A: Absorvância I: Coeficiente de extinção molar C: concentração da solução absorvente l: Percurso óptico na solução absorvente Para avaliar a concentração de uma substância. Esta técnica baseia-se na proporcionalidade direct a existente entre a quantidade de luz absorvida por uma dada solução e a sua concentração.Protocolos Práticos Biologia Celular AULA 11 UANTIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS INTRODUÇÃO As proteínas encontram-se envolvidas na maioria dos processos biológicos que ocorrem dentro da célula.48 - . determina -se a relação entre as concentrações conhecidas de várias soluções dessa substância e as absorvâncias registadas a um dado comprimento de onda (construção da curva de calibração).

Outros métodos exploram as propriedades espectroscópicas intrínsecas das proteínas absorvância a 80 nm). permitindo num curto espaço de tempo analisar várias amostras.Azul Coomassie G25 (forma desprotonada) ” “ Protocolos Práticos Biologia el lar . étodo de – • •• Figura . -250) Figura 11. C + b Quantificação de proteínas Existem vários métodos para quantificar as proteínas presentes em amostras biológicas ou em soluções de proteínas preparadas no laboratório. O método de Bradford baseia -se na formação de interacções iónicas ou hidrofóbicas entre um corante azul de Coomassie absorvância máxima a 595 nm.1) e alguns aminoácidos.5.49 - . Alguns desses métodos baseiam-se na formação de complexos corados entre reagentes específicos e as ligações peptídicas ou determinados aminoácidos. Calcular a equação da recta resultante regressão linear) A = m. Para amostras com maior concentração de proteína pode usar -se o Lowry mg/dL) ou étodo do Biureto g/dL). sendo um método rápido e simples. que apresenta uma O método de Bradford é suficientemente sensível para detectar quantidades de proteína de 1 µg/mL. originando um complexo azul. .

1 mg/mL (µL 0 10 20 50 100 200 250 Volume de água (µL 00 790 780 750 700 600 550 [BSA] (mg/L 0 1. Medir a absorvância de cada tubo a 595 nm DRepresentar graficamente a absorvância medida a 595 nm versus a concentração de proteína em µg/mL e traçar a correspondente curva de calibração DCalcular a equação da recta da zona linear da curva de calibração .Cuvettes para espectrofotómetro .Micropipetas .Calculadora . Construção da curva de calibração O método de Bradford apresenta uma resposta linear numa gama de concentrações de proteína entre 1 e 20 µg/mL.Reagente de Bradford .Papel milimétrico .25 DAdicionar 200 µL do reagente comercial de Bradford a cada tubo DIncubar 5 minutos à temperatura ambiente.Espectrofotómetro . DPreparar 7 tubos com a seguinte composição: Tubo (número 1 (Branco 2 3 4 6 7 Volume de solução BSA 0.25 2.Amostra desconhecida PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL 1.5 25 31.Protocolos Práticos Biologia Celular PARTE EXPERIMENTAL MATERIAL .25 12.50 - .Solução de albumina sérica bovina (BSA) a 0.1 mg/mL .5 6. A construção de uma curva que relacione a concentração de proteína co m a absorvância a 595 nm. permite determinar a concentração de proteína existente numa amostra.

Conhecer outros métodos de quantificação de proteínas. Compreender e aplicar a lei de Lambert-Beer. Saber usar a equação da recta para calcular a concentração de proteína duma solução desconhecida. y y y y y y y . [proteína] b Biologia Celular 2. Saber executar o método de Bradford. Perceber sumariamente o funcionamento da técnica de espectrofotometria. Compreender qual o seu fundamento e as suas limitações. Compreender a necessidade da sua utilização.51 - . Conhecer os conceitos de branco e solução padrão. utilizando a equação que determinou. Quantificação da concentração de proteínas numa amostra desconhecida DPipetar para um tubo (nº 8) 800 µL da amostra desconhecida DAdicionar 200 µL do reagente comercial de Bradford DIncubar 5 minutos à temperatura ambiente. Saber calcular a equação da recta que expressa a relação entre a absorvância e a concentração de proteína. OBJECTIVOS: y y Compreender a importância de quantificar proteínas. Identificar a gama de concentrações onde é válida a lei de Lambert -Beer.Protocolos Práticos A (595nm) m . Medir a absorvância a 595 nm DDeterminar a concentração de proteína na amostra. Saber elaborar uma curva de calibração.

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