ARTicuLO ORIGINAL
ORIGIIMAUES
iCOMO EVALUAR LA EFICIENCIA DEL SISTEMA
ANTIOXIDANTE EN EL ESTRES OXIDATIVO?
PROPUESTA DE UN CONSTRUCTO
*Beristain-Perez Ada S, Sanchez-Rodriguez Martha A, Ruiz-Ramos Mirna,
Mendoza-Niihez Victor M.
Resumen:
Antecedentes: La medicion de la eficiencia del sistema antioxidante es funda-
mental para el diagn6stico, seguimiento y pronostico de los padecimientos croni-
co-degenerativos en los que esta involucrado el estres oxidativo (EOx), sin embar-
go no existen parametros que nos permitan una evaluacion integral de dicho sis-
tema, por lo que surge la necesidad de proponer un construoto para dicho fin.
Objetlvo: Evaluar la eficiencia del sistema antioxidante en los adultos mayores a
traves de un constructo conformado por varios elementos antioxidantes.
Material y Metodos: Se realizo un estudio exploratorio, transversal y comparati-
vo en una poblacion de 74 sujetos mayores de 60 anos de Actopan, Hidalgo. Con
base en las razones SOD/GPx y SOD/GPx+CAT, ademas de las determinaciones
de antioxidantes totales (AT) y la brecha antioxidante (GAP), el constructo
propuesto fue definido como: sistema antioxidante eficiente (SAE), deficiencia
antioxidante enzimAtica (DAEN), deficiencia antioxidante exogena (DAEX) y deficien-
cia global del sistema antioxidante (DGSA). En ei analisis de datos se empleo el calcu-
lo de proporciones y el ANDEVA al 95%.
Resultados: El porcentaje de adultos mayores con SAE aumento de 44.6 a
60.8% al emplear la raz6n SOD/GPx+GAT, y disminuyo el porcentaje de sujetos
con DAEN de 21.6 a 5.4% y DGSA de 20.3 a 1.3%. Se observo que los
lipoperoxidos aumentan conforme se presenta deficiencia en el SAcon SOD/GPx
(p=0.001) y SOD/GPx-^CAT (p<0.0001).
Concluslones: El constructo conformado por la razon SOD/GPx-^CAT, AT y GAP
constituye una buena opcion para evaluar la eficiencia del sistema antioxidante en
el estr6s oxidativo.
Palabras Clave: Antioxidantes, SOD, GPx, Catalasa.
INTRODUCCION.
El estres oxidativo (EOx) se define como el dese-
quilibrio entre las moleculas de alto potencial oxi-
dante, denominadas especies reactivas de oxigeno
(EROs), que en su mayoria son radicales libres
(RL), y el sistema de defensa antioxidante en favor
de la generacion de EROs'. El EOx, esta relaciona-
do con el envejecimiento y la patogenesis de mas de
100 padecimientos cronico-degenerativos rela-
Unidad de Investigacibn en Gerontologia, FES ZARAGOZA, UNAM
lOO
Summary:
Background: The measurement of antloxidant system efficiency is fundamental
to diagnostic, management and prognosis of the chronio-degenerative illnesses in
which it is involved the oxidative stress (OxS), nevertheless, there are not param-
eters that permit us an integral evaluation of the OxS, therefore we have proposed
a construct for this aim.
Objective: To evaluate the antioxidant system efficiency on elderly subjects
through a construct to be made up by some many antioxidant elements.
Material and Methods: It was realized out an exploratory, transversal and compar-
ative study in a population of 74 elderly people from Actopan, Hidalgo. With base-
line to SOD/GPx and SOD/GPx+GAT ratios, besides of total antioxidant (TA) and
antioxidant GAP determinations, the construct proposed has been defined as: effi-
cient antioxidant system (EAS), enzymatic antioxidant deficiency (ENAD), exoge-
nous antioxidant deficiency (EXAD) and global antioxidant system deficiency
(GASD). It was used percentages and ANOVA with 95% for data analyses.
Results: The elderly percentage with EXAD was increased from 44.6 to 60.8%
when it used SOD/GPx+CAT, and decreased the elderly person percentage with
ENAD from 21.6 to 5.4% and GASD from 20.3 to 1.3%. It was observed out that
lipoperoxides increase according deficiency in the antioxidant system presents,
using SOD/GPx (p=0.001) and SOD/GPx+CAT (<0.0001).
Conclusions: The construct proposed was integrated for SOD/GPx+CAT ratio, TA
and GAP. The results showing that this construct is efficient to evaluate the antiox-
idant system in the oxidative stress.
Key Words: Antioxidants, SOD, GPx, Catalase.
cionados con la edad, tales como diabetes mellitus
tipo 2, enfermedad de Alzheimer, hipertension arte-
rial, enfermedad de Parkinson, cataratas y cancer,
entre otros, de ahi la importancia de su evaluacion.^
Dentro de los diversos marcadores biologicos que
se han empleado para la determinacion del estres
oxidativo en los adultos mayores (AM), se encuen-
tran los productos terminates de la reaccion de
EROs con macromoleculas, como la produccion de
malondialdehido (MDA), producto de la peroxi-
dacion lipidica'. En este sentido, la medicion de RL
Archivo Geriatrico / vol. 6 afio 6 no. 4 octubre/diciembre 2003
^;Como evaluar la eficiencia del sistema antioxidante en el estres oxidativo? propuesta de un constructo
se utiliza con frecuencia como marcador biologico
de EOx, sin considerar integralmente la partici-
pacion del sistema antioxidante.
Por otro lado, se han propuesto como marcadores
biologicos del sistema antioxidante la medicion de
las enzimas superoxido dismutasa (SOD), glutation
peroxidasa (GPx) y catalasa (CAT), ademas de los
componentes no enzimaticos como vitaminas A, C
y E, antioxidantes totales (AT) y recientemente, el
GAP (o brecha antioxidante), que son los antioxi-
dantes diferentes de albumina y acido lirico, no
medidos en las tecnicas para la determinacion de
AT."*"** Sin embargo, la determinacion de los compo-
nentes del sistema antioxidante por separado, solo
permite tener un panorama parcial sobre la eficien-
cia de dicho sistema, propiciando errores de inter-
pretacion teorica y limitaciones para su aplicacion
Por tai motivo, el objetivo del presente estudio fue
evaluar la utilidad de un constructo que incluyera
integralmente a los elementos bioquimicos que
mostraran mayor eficiencia antioxidante, utilizando
como indicador de efectividad la disminucion en la
concentracion de lipoperoxidos plasmaticos (LPO).
MATERIAL Y METODOS.
Se realizo un estudio exploratorio, transversal y
comparativo en una poblacion de 74 adultos
mayores residentes en Actopan, Hidalgo, con edad
promedio de 67.5 ±8.7 anos, de ambos sexos y sin
ingesta de suplementos antioxidantes, A todos los
individuos se tomo muestra sanguinea por puncion
venosa posterior a un ayuno minimo de 8h en tubos
al vacio con heparina sodica (Vacutainer, Beckton-
Dickinson), de la muestra se tomaron alicuotas con
las que se determino SOD, GPx y CAT, y posterior-
mente se separo plasma para la determinacion de
antioxidantes totales (AT) y lipoperoxidos, ademas
se determino la concentracion de albumina y acido
lirico para el calculo del GAP antioxidante.
Preparacion de muestra y determinacion de SOD.
Los eritrocitos (500mL) se lavaron con solucion de
NaCl al 0.9% en 3 ocasiones, posteriormente se
resuspendieron en agua bidestilada fria y se
diluyeron con amortiguador de fosfatos
O.Olmmol/L. La determinacion de SOD se realizo
empleando el estuche comercial RANSOD
(Randox Laboratories, Ltd), que se basa en la
inhibicion de la formacion de radicales superoxido
derivados de xantina y xantin-oxidasa por la SOD
en una reaccion colorimetrica que se determino
espectrofotometricamente a 505 nm. La actividad
de SOD se expreso en U/L.
Preparacion de muestras y determinacion de GPx
Los eritrocitos (500mL) se diluyeron con reactivo
de Drabkin a doble concentracion. Se empleo el
Archivo Geriatrico / vot. 6 ano 6 no. 4 octubre/diciembre 2003
ARTicuLO ORIGINAL
estuche comercial RANSEL (Randox Laboratories,
Ltd) para determinar la actividad de la GPx por un
metodo colorimetrico que emplea glutation reduc-
tasa, usando hidroperoxido de cumeno como
substrato y midiendo la absorbancia a 340 nm. Su
actividad se expreso en U/L.
Preparacion de muestras y determinacion de CAT
Se lisaron los eritrocitos (lOOmL) con reactivo para
determinar CAT con el estuche comercial
BIOXYTECH, Catalase-520T™ (OxisResearch™ )
que se basa en una reaccion colorimetrica donde la
muestra que contiene la enzima se incuba en
presencia de una concentracion conocida de H2O2,
al detener la reaccion la cantidad restante de
peroxido reacciona con 4-aminofenazona, DHBS y
peroxidasa con lo que se forma un compuesto
colorido que se mide a 520 nm. Su actividad se
expreso en U/L.
Cdtcuto de razones
Para el calculo de la razon SOD/GPx se obtuvo el
cociente entre la actividad de SOD y GPx. Se con-
sidero razon SOD/GPx normal si los valores eran <
0.022 y alta si los valores eran > 0.022. Para el cal-
culo de la razon SOD/GPx+CAT se obtuvo el
cociente entre la actividad de SOD y GPx+CAT, se
consideraron valores normales las razones < 0.014,
y alteradas > 0.014.
Determinacion de AT
Con 20mL de plasma se determinaron los antioxi-
dantes totales, y para tai efecto se empleo el estuche
comercial TOTAL ANTIOXIDANT STATUS
(Randox Laboratories, Ltd). La presencia de
antioxidantes en el plasma inhibe la formacion del
radical cation ABTS+, al incubar el ABTS con
peroxidasa y H2O2. Los AT se expresaron en
mmol/L, considerandose valores de AT normales >
0.90 mmol/L y valores de AT bajos £ 0.90 mmol/L.
Cdlcuto de GAP antioxidante
El GAP antioxidante se calculo a partir de los AT
en mmol/L, albumina (Alb) y acido urico (Aur)
sericos en mmol/L, y los valores de TEAC para
albumina y acido urico. El calculo se realiz6 de la
siguiente manera:
GAP = AT - ( [Alb * TEAC] + [Aur * TEAC] )
Donde el TEAC de albumina es 0.69 y el de acido
lirico es de 1.0. Se consideraron como valores de
GAP normales > 190 mmol/L y bajos los valores £
190 mmol/L.
Constructo para medir ta eficiencia det sistema antioxidante
Para la integracion y evaluacion del constructo se
consideraron dos propuestas denominadas como
sistema antioxidante 1 (SAl), que incluyo a la
razon SOD/GPx, AT y GAP, y como sistema
antioxidante 2 (SA2) a la razon SOD/GPx+CAT,
AT y GAP. (Cuadrol)
Al determinar estos parametros, en SAl, se
 ARTicuLO ORIGINAL
considero como sistema antioxidante eficiente
(SAE), cuando la razon SOD/GPx, AT y GAP se
encuentran dentro de los valores de referencia; defi-
ciencia antioxidante enzimatica (DAEN) si la razon
SOD/GPx esta incrementada y la defensa exogena
se encuentra dentro de rango de referencia; defi-
ciencia antioxidante exogena (DAEX) si los AT y el
GAP estan disminuidos y la razon SOD/GPx en
rango normal; y deficiencia global del sistema
antioxidante (DGSA) si los componentes de ambas
partes estan alterados.
Para la evaluacion de la eficiencia del sistema
antioxidante en SA2 se consideraron los mismos
criterios que para SAl, pero en lugar de emplear la
razon SOD/GPx, se considero la razon
SOD/GPx+CAT.
Determinacion de Lipoperoxidos
El malondialdehido (MDA), un producto de la
lipoperoxidacion lipfdica se determino empleando
la reaccion con acido tiobarbitiirico (TBA) segiin el
metodo propuesto por Jentzch et al. (1996)'"; en
esta reaccion, una molecula de MDA reacciona con
dos moleculas de TBA para formar un pigmento
rosa con un maximo de absorcion de 532 a 535 nm.
Para evitar la peroxidacion excesiva en el ensayo,
se adiciono butiril hidroxitolueno (BHT) 2mmol/L.
La concentracion de especies reactivas a acido tio-
barbitiirico (TBARS) se expreso como MDA en
mmol/L. Los valores normales de lipoperoxidos se
encuentran por debajo de 0.322 mmol/L y los
valores elevados se encuentran por encima de 0.322
m.mol/L.
Andtisis estadi'stico
Para el analisis de los datos se empleo el paquete
estadi'stico SPSS 10.0, se recurrio al calculo de
promedios, desviacion estandar, proporciones y
analisis de varianza (ANDEVA) con un nivel de
confianza al 95%.
RESULTADOS
En el SAl el 44.6% de los AM presento SAE,
21.6% DAEN, 13.6% DAEX y 20.3% DGSA. En el
SA2 se observa que el 60.8% presenta SAE, 5.4%
DAEN, 32.4% DAEX y el 1.3% presenta DGSA,
con lo que se observa que si solo se considera la
razon SOD/GPx, es posible que se detecte una defi-
ciencia antioxidante enzimatica y al incluir CAT en
el constructo, se compensa la actividad enzimatica
que no realiza GPx y de este modo se reduce el por-
centaje de individuos que presentan DAEN y
DGSA y aumenta el porcentaje de individuos con
SAE (Figura 1).
Al realizar la prueba ANDEVA, se encontro una
diferencia estadfsticamente significativa de los
lipoperoxidos en ambos sistemas antioxidantes
ArcJiivo Geriatrico / vol. 6 afio 6 no. 4 octubre/diciembre 2003
Berlslahi-Perez Ada Sv col.
(SAl p=0.001; SA2 p<0.001) (Figura 2). En este
sentido, se observo que cuando el sistema antioxi-
dante es eficiente, los lipoperoxidos se encuentran
disminuidos, e incluso dentro del rango de referen-
cia; conforme se presenta deficiencia en el sistema
antioxidante, ya sea enzimatica o exogena, aumen-
tan los lipoperoxidos, aunque los valores estan den-
tro del rango de referencia y es solo cuando se pre-
senta deficiencia global del sistema antioxidante
que los lipoperoxidos se incrementan incluso por
encima de los valores de corte (Cuadro 2), no
obstante el nivel de lipoperoxidos es similar en el
SAl y en el SA2 (Figura 2)
DISCUSION
Se ha demostrado que la resistencia al estres oxida-
tivo puede ser adquirida por cambios coordinados
en multiples vfas antioxidantes. Un buen sistema de
defensa antioxidante debe mantener valores bajos
de razon SOD/GPx o SOD/GPx+CAT y valores
altos de AT y GAP.
En diversos estudios se ha mencionado que la
evaluacion de la razon SOD/GPx o SOD/GPx+CAT
ofrece una mejor interpretacion del equilibrio entre
las enzimas.'"'^ En este estudio se observo una mejor
aproximacion al estado del sistema antioxidante
empleando la razon SOD/GPx+CAT en conjunto
con los AT y GAP. En este sentido, al incluir CAT
disminuyo la proporcion de adultos mayores con
DAEN, con lo que tambien se incremento el por-
centaje de ancianos con SAE y se redujo el por-
centaje de sujetos con DGSA; ya que en la SA2
intervienen la mayor parte de los componentes
antioxidantes, tanto enzimaticos como no enzimati-
cos y una evaluacion constituida de todos ellos,
proporciona una mejor perspectiva del sistema
antioxidante en los individuos.
Por otro lado, se observo que el sistema antioxi-
dante mantiene su eficiencia contra la lipoperoxi-
dacion, se considere o no CAT, ya que en el SAl y
SA2 se mantienen los niveles de lipoperoxidos
practicamente iguales a excepcion de aquellos
casos en los que se presenta DGSA, hecho que
posiblemente se debe al tamano de la muestra.
Ademas, se encontro que si el sistema antioxidante
es eficiente, los niveles de lipoperoxidos se
mantienen bajos, cuya condicion bioqufmica es
deseable para la prevencion y tratamiento de los
padecimientos cronico-degenerativos de mayor
prevalencia durante el envejecimiento.
Por otro lado, si existe una deficiencia parcial del
sistema antioxidante, los LPO se incrementan, y si
la deficiencia del sistema antioxidante se presenta a
nivel enzima^tico y no enzimatico, entonces la pro-
duccion de LPO es mucho mayor llegando a valores
iComo evaluar la eficiencia del sistema antioxidante en el estres oxidativo'/ proptiesta de un constructo ARTI'CULO ORIGINAL

que son potencialmente daninos para las celulas; Cuadro 1. Marcadores biologicos del sistema antioxidante en
esto concuerda parcialmente con estudios realiza- las propuestas SAl y SA2 y el efecto de sus valores en los
dos con anterioridad en los que un aumento de lipoperoxidos plasmatieos.
MDA se relaciona con el desequilibrio entre las
enzimas antioxidantes o la alteracion en la activi-
dad antioxidante t o t a l . ' " " "
Los estudios que solo involucran la relacion entre
SOD/GPx (N) SOD/GPx (A)
los niveles de MDA y alguno de los componentes
del sistema antioxidante, permiten visualizar un
GAPyAT(N) GAPyAT(B) GAPyAT(N) GAPyAT(B)
panorama parcial de la actividad de este sistema
contra las EROs, ya que este abordaje no es integral DA EX DAE,\
y, como se menciono anteriormente, el proceso bio-
quimico del EOx se caracteriza por el desequilibrio
DA EX DAEN
entre las sustancias oxidantes y los sistemas de
defensa antioxidante, por lo que puede reportarse la GAPyAT(N) GAPyAT(B) GAP y AT (N) GAPyAT(B)
concentracion de MDA elevada y la actividad de las
enzimas o el nivel de antioxidantes totales SOD/GPx+CAT (K) SOD/GPx+CAT (A)
alterados. En este sentido, en diversos estudios se
ha mencionado que una disminucion en la actividad
de las enzimas antioxidantes o en los antioxidantes
totales no siempre es una condicion no deseable si
los niveles de especies oxidantes disminuyen a SAl y SA2: sistemas antioxidantes 1 y 2, GAP: brecha
valores aceptables, lo que contribuye a la hipotesis antioxidante, AT: antioxidantes totales, LPO: lipoperoxidos
de que si los niveles de los elementos que confor- plasmatieos, (N): niveles dentro del rango de referencia, (B):
man el sistema antioxidante estan disminuidos, no niveles bajos, (A): niveles altos, SAE: sistema antioxidante
siempre se debe a defectos en la defensa antioxi- eficiente, DAEN: defieiencia antioxidante enzimatica,
dante sino a que esta^n actuando contra los radicales DAEX: deficiencia antioxidante exogena, DGSA: defieiencia
global del sistema antioxidante.
libres para evitar que se produzcan excesivamente y
danen a las celulas, o a que no son necesarios
porque no hay especies oxidantes que degradar. Cuadro 2. Media ± desviaeion estandar de lipoperoxidos en
mmol/L por tipo de respuesta antioxidante en SAl y SA2. Se
Por otro lado, niveles altos de antioxidantes, no consideran como valores normales si se encuentran por deba-
siempre garantizan un efecto benefico contra las jo de 0.322 mmol/L.
especies oxidantes a pesar de ser resultado de una
adaptacion al incremento en la formacion de RL, ya
que bajo ciertas circunstancias se convierten en
pro-oxidantes, que tambien son oxidantes de interes SAl* SA2**
patol6gico7"*
n=74 n=74
Por tai motivo, si la evaluacion de los marcadores
SAE 0.220 ± 0.077 0.212 ±0.079
biologicos de EOx no se realiza de manera integral
y dinamica, y solo se evalua la formacion de EROs DAEN 0.192 ±0.075 0.201 ± 0.043
y su efecto en las biomoleculas sin contemplar la
DAEX 0.292 ±0.121 0.306 ±0.140
eficiencia del sistema antioxidante, se puede llegar
a conclusiones erroneas acerca del estado oxidativo DGSA 0.333 ±0.164 0.569 ±0.000
en los individuos. Al respecto, se puede establecer
erroneamente que los sujetos cursan con EOx solo
por tener valores bajos de antioxidantes, cuando
ANDEVAal 95%, *p = 0.001; **p < 0.0001.
posiblemente tambien presentan valores bajos de
lipoperoxidos y por lo tanto no existe un desequili- SAE: sistema antioxidante eficiente, DAEN: deficiencia
antioxidante enzimatica, DAEX: deficiencia antioxidante
brio entre la produccion de oxidantes y la accion del
exogena y DGSA: deficiencia global del sistema antioxi-
sistema antioxidante.
dante.
Finalmente, aunque este estudio es exploratorio y
por lo tanto los resultados no son del todo con-
cluyentes, los datos demuestran que el constructo
propuesto puede tener posibilidades de aplicacion
clfnica y de investigacion en Gerontologia.

Archivo Geridtrico / vol. 6 ano 6 no. 4 octubre/didembre 2003 103

 ARTicuLO ORIGINAL
70 n
60 -
50 -
40 - nSAi
DSA2
30 -
20 -
10 -
0
SAE DAEN DAEX DGSA
Sistema antioxidante
Figura 1. Eficiencia proporcional del sistema antioxidante 1
(SAi) y sistema antioxidante 2 (SA2)
SAE: sistema antioxidante eficiente, DAEN: deficieneia
antioxidante enzimatica, DAEX: deficieneia antioxidante
exogena y DGSA: deficieneia global del sistema antioxi-
dante.
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1 0 4
Beristain-Perez Ada S y col.
0.6 -
0.5 -
I 0.4 -
DSAI*
I 0.3 - D SA2*'
I
O 0.2 -
0.1 -
DAEN DAEX DGSA
Sistema antioxidante
Figura 2: Media ± desviacion estandar de lipoperoxidos con
respecto al tipo de respuesta antioxidante en SAI y SA2.
ANDEVAal 95%, *p=0.001, **p<0.0001.
SAE: sistema antioxidante eficiente, DAEN: deficieneia
antioxidante enzimatiea, DAEX: defieiencia antioxidante
exogena y DGSA: defieiencia global del sistema antioxi-
dante.
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