Revista Costarricense de Ciencias Médicas

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Rev. costarric. cienc. méd vol.23 n.3-4 San José Dec. 2002

Aplicaciones biomédicas de la microscopia electrónica y el análisis elemental con

espectrómetro de Rayos X

1 , 2* ,
Francisco Hernández-Chavarría Alejandro Sáenz 1 ,3 ,4 y Enrique Freer 1

Resumen

La microscopio electrónica ha avanzado mucho desde su invención hace 60 años y su aplicación

en las ciencias biomédicas ha sido muy grande. Paralelo al desarrollo de nueva tecnología en este
campo y que ha permitido alcanzar una resolución de 1,4. A para el microscopio de transmisión y
de 30 a 70 A para el microscopio de rastreo, se le han adaptado a estos microscopios otros
aparatos que permiten realizar un análisis elemental de la muestra que está siendo examinada en
el microscopio. La ventaja de este procedimiento es que la muestra que está siendo observada en
tiempo real puede ser analizada en su composición química sin ser destruida. Adicionalmente es
posible realizar un análisis de la distribución de sus elementos en toda la muestra. La aplicación de
este nuevo método en las ciencias biológicas es muy amplia. Podemos detectar materiales
inorgánicos como el plomo, arsénico, calcio, mercurio, aluminio, etc, en diferentes tejidos de¡
cuerpo, obtenidos de biopsia o autopsia. Una aplicación práctica es el análisis de la composición
de cálculos vesiculares o urinarios determinando de esta manera la fisiopatogenia del proceso.

Palabras clave

Microscopia electrónica de rastreo, Espectrómetro de rayos X, nefrolitiasis, cálculos urinarios.

Introducción

Un haz de electrones puede considerarse como constituido por partículas u ondas. En este último
caso, la longitud de onda (X) asociada depende del voltaje con que fue acelerado dicho haz; así, a
100KV X es aproximadamente de 0,1 Á, o sea unas 50 000 veces menor que X de la luz visible.
Recordemos que la resolución del microscopio de luz tiene como limitante la longitud onda de la
luz visible (1 ).

En 1934 Ernest Ruska desarrolló un sistema de electroimanes para concentrar y enfocar un haz de
electrones de manera análoga a la acción que ejerce un lente de vidrio sobre un haz de luz. Este
dispositivo, que luego se denominaría "lente electromagnético" le permitió construir el primer
microscopio electrónico, cuyo aumento máximo era de 16 X. Sin embargo, este fue el inicio de la
era de la microscopio electrónica, que se bifurcaría en os grandes corrientes, la microscopio
electrónica de transmisión y la microscopio electrónica de rastreo. En paralelo se desarrolló otra
metodología, que permite el análisis elemental de la muestra mediante el patrón de dispersión de
rayos X generados por la interacción del haz de electrones con la muestra ( 2 ).El objetivo de esta
revisión es mostrar la aplicación biomédica de la microscopio electrónica en conjunto con el
microanálisis elemental, empleando un detector de rayos X, que permite conocer la composición
química de la muestra en la micro-área irradiada sin que esta tenga que ser destruida.

Microscopio electrónico de transmisión

El microscopio electrónico de transmisión (MET), al igual que ocurre en el microscopio de luz,

forma una imagen con el haz de energía que atraviesa la muestra; que en el caso de MET se trata
de electrones acelerados a muy alto voltaje y en el microscopio de luz se trata de luz visible. Por
eso, a este microscopio electrónico se le denominó de transmisión y siguiendo tal razonamiento, al
microscopio de luz: microscopio de luz transmitida ( 3 ).

Para que los electrones atraviesen la muestra sin destruirla por calentamiento debe seguirse un
procesamiento, que resulta un tanto similar al que se sigue para obtener los cortes histológicos
para microscopio de luz. En resumen, los tejidos deben fijarse químicamente, deshidratarse e
incluirse en un medio de soporte para hacer los cortes. En el caso de microscopia electrónica, la
fijación se realiza con aldehídos (usualmente glutaraldehído y paraformaldehído) y el medio de
inclusión más corriente son resinas epóxicas de gran dureza. Los cortes deben tener un grosor
máximo de unos 100 nm; recordemos que para luz se usa parafina como medio de inclusión y los
cortes usualmente son de alrededor de 5 ìm de espesor, o sea unas 50 veces más gruesos que lo
requerido en MET. Luego los cortes deben contrastarse, lo que usualmente se denomina "tinción",
aunque en microscopio electrónica no se maneja el concepto de color, pues este corresponde a
una pequeña porción del espectro electromagnético ( de 0,4 a 0, 7 ìm). El contraste en realidad
consiste en una impregnación del tejido con sales de metales pesados, como acetato de uranilo o
citrato de plomo, que aumentan la electrondensidad en el sitio de deposición, esto hace que
algunas zonas aparezcan oscuras o negras en la pantalla, lo que contrasta con lo claro de las
zonas no impregnadas con esos metales ( 4 ).La gran diferencia en los aumentos logrados en el
MET estriba en el límite de resolución (d). Tanto en et microscopio de luz como el MET la
resolución obedece ala ecuación de Abbe: d = 0,62 / 2 AN. Donde ~ se refiere a la longitud de
onda empleada para generar la imagen y AN es la abertura numérica del lente. En el caso del
microscopio de luz, corresponde a 0,55 ìm (promedio del espectro visible humano) y la AN
oscila alrededor de 1,3. El valor 2 se refiere a que suma la AN del objetivo y la del condensador
que deben ser iguales según la ley de Rayleigh. Esto produce un límite de resolución de
aproximadamente 0,22 ìm para el microscopio de luz (1). La limitante en el poder de resolución del
microscopio de luz es la propia longitud de onda de la luz; lo que fue superado en el ME
empleando electrones acelerados a gran velocidad (alto voltaje) de manera que se mueven en
forma ondulatorio, con una que depende del voltaje de aceleración. A 100 000 v, es de
aproximadamente 0,1 ; no obstante, debido a las imperfecciones o aberraciones de los lentes
electromagnéticos, la resolución del MET es de 1,4 Å (5 ). Se comparan las imágenes obtenidas de
secciones de colon de un caso de balantidiasis, observadas al microscopio de luz ( Fig. l ), al MER
(Fig. 2 y 3 ) y al MET (Fig 4 y 5 ).

Microscopio electrónico de rastreo o barrido

El haz de electrones que impacta a la muestra interacciona con ella, unos electrones la atraviesan
y son los utilizados en MET, otros emergen de la superficie; entre éstos están los electrones
secundarios, que son arrancados de los orbitales de átomos de alto número atómico y generan las
imágenes con carácter tridimensional que caracterizan a la microscopio electrónica de rastreo
(MER). Para generar estás imágenes el haz de electrones debe desplazarse sobre la superficie de
la muestra de un lado a otro, haciendo un barrido o rastreo de su superficie, de donde deriva el
nombre de este equipo (6 ). La figura 1c corresponde a una muestra de colon del mismo caso
ilustrado en las figuras 1a y 1b, pero en esta ocasión fotografiada al MER.

La resolución del MER depende del diámetro final de la sonda electrónica que barre la superficie
de la muestra, pues la señal generada lleva ese diámetro. La mayoría de los MER tienen
resolución es que oscilan entre 70 y 30 A (7 a 3 nm), dependiendo entre otras cosas de la distancia
de trabajo y el recubrimiento metálico que se dé a las muestras ( 6 ).

Rayos X característicos

Al igual que la luz visible los rayos X son parte del espectro electromagnético. Cuando el haz de
electrones impacta la muestra genera una serie de señales; que como mencionamos previamente
incluyen , electrones transmitidos, electrones reflejados y electrones secundarios; además de esas
se producen dos tipos de señales de rayos X. Una denominada rayos X blanco o no
característicos, que para nuestros propósitos no interesan y por el contrario representan un
contaminante de la otra señal, que corresponde a los rayos X característicos cuya longitud de onda
es de 0,01 a 1 0 nm (6 ).

La generación de los rayos X característicos depende de los electrones del átomo que los generan.
Recordemos que un átomo es neutro, pues tiene un número de electrones igual al número de
protones del núcleo (designado como Z) y que esos electrones están dispuestos en orbitales con
diferentes niveles energéticos, que ordenados del núcleo hacia fuera, son denominados K, L, M
etc, y que esos orbitales deben irse llenando ordenadamente. El orbital K acepta dos electrones, el
L 8, el M 18, el N 32 y así sucesivamente. Esto significa que un elemento con doce electrones,
debe llenar primero las dos plazas en el orbital K que serían ocupadas por los electrones cuya
energía de en lance es mayor y luego se alojarían los otros ocho electrones del orbital L y
finalmente los dos electrones con menos energía de enlace ocuparían su lugar en el orbital M.
Cuando un electrón es removido de un orbital, su lugar será ocupado por otro electrón de un orbital
más externo, o sea que su energía de enlace aumentará. Esa diferencia energética es eliminada
como un fotón de rayos X cuya energía es equivalente a la diferencia existente entre ambos
orbitales (6 ). Por ejemplo, si la vacante quedó en el orbital K y fue llenada por un electrón que
provenía de L se estaría generando una emisión de rayos X denominada Ká; pero si fue llenado
por un electrón de dos orbitales más atrás, o sea de M, la radiación será Ká otra posibilidad sería
una emisión Kâ si proviene de tres orbitales atrás. Si la vacante hubiese quedado en L, los
ejemplos anteriores corresponderían a Lá , Lâ Lã y así sucesivamente. Esas diferencias
energéticas son características de cada elemento; por lo tanto, si la cuantificamos sabremos de
qué elemento proviene. Por ejemplo para el hierro tenemos los siguientes valores en kiloelectrones
voltio (KeV) Fe Ká 6 403, Fe Kâ 6 390, Fe Kã 7 057, etc ( 5 ).

Los equipos analizadores de rayos X en microscopio electrónica cuentan con programas de

computación cuya base de datos tiene esta información, de manera que el programa identifica
automáticamente el elemento responsable de la emisión. Esto significa, que empleando un
detector de rayos X en un microscopio electrónico es posible hacer un análisis químico de la
muestra en escala puntual, indicando qué elementos están presentes en determinada área de la
muestra.

Los detectores de rayos X más utilizados en microscopio son el "Energy Dispersive Spectroscopy"
(EDS) y el "Wavelength Dispersive Spectroscopy" (WDS) éste permite un análisis rápido y
simultáneamente puede detectar varios elementos, gracias a que segrega o dispersa las diferentes
señales de. Acuerdo a su energía empleando un detector de cristal semiconductor. La figura
6 muestra un equipo EDS acoplado a un MER y la figura 7 muestra unos cristales obtenidos de
orina de un paciente.

Cuando los fotones de rayos X golpean el cristal semiconductor, este absorbe una cantidad de
energía determinada, que es convertida en una señal eléctrica, la cual es emitida, amplificada y
digitalizada para alimentar un analizador multicanal, que identifica los elementos que originaron
esa señal y la despliega gráficamente, como se muestra en la figura 8 que corresponde a un
cálculo renal.

Aplicaciones biomédicas
Entre las aplicaciones del análisis elemental con rayos X en la biomedicina está la identificación de
depósitos de metales pesados en tejidos, como el cobre en tejido hepático de pacientes con
enfermedad de Wilson (7 ), el plomo en eritrocitos de pacientes con saturnismo, el mercurio en piel
(8 ), el arsénico en las intoxicaciones y carcinomas de piel, el tetraóxido de osmio en traumatismos
de piel (9 ), etc. También, es posible analizar la composición de cristales urinarios y litiasis renal y
vesicular (10 ). El análisis de la etiología de la microlitiasis renal representa un ejemplo de
aplicación de esta técnica. Esta patología puede ser multicausal y representa uno de los problemas
de salud cuya importancia se reconoce cada día más. Entre las posibles causas se mencionaron
las infecciones bacterianas debidas a agentes ureasa positivos,
principalmente Klebsiella penuemoniae, Proteus spp yUreaplasma urealyticum. La ureasa de estas
bacterias hidroliza la urea excretada por la orina, produciendo amonio que eleva el pH, lo que
favorece la precipitación de cristales de fosfato de calcio. Esto unido a otros problemas
subyacentes como alteraciones anatómicas o reducción del flujo urinario induce la formación de
microlitiasis y cálculos renales ( 11 , 12 ). Actualmente, otra teoría infecciosa involucro
a Nanobactería, un género de bacterias 10 a 100 veces más pequeñas que la mayoría de las
bacterias conocidas. En todo caso, se destaca que el tamaño y número de cristales urinarios de
oxalato de calcio o fosfato de calcio, cuya relación con la porosidad de las células de los
canalículos pueden llevar a la formación de núcleos de precipitación sobre los que se seguirá
depositando más calcio, lo que agrava el problema (13 , 14 ). Para comprender mejor la génesis de
las urolitiasis es importante conocer la composición y distribución del calcio en la matriz de los
cálculos y poder demostrar los sitios de deposición de fosfato de calcio amorfo en relación con la
deposición de cristales de oxalato de calcio ( 10 ). Este tipo de información se puede obtener con
un espectrómetro de Rayos X acoplado a un microscopio electrónico de rastreo. Pues el análisis
químico solo brinda la composición ya sea cualitativa o cuantitativa de¡ elemento en cuestión; pero
no brinda información sobre su distribución en la muestra. En tanto, las imágenes de MER brindan
una visión tridimensional de la muestra, incluyendo su patrón cristalino y el espectrómetro de rayos
X indica la composición química en el área seleccionada. Al mismo tiempo, el análisis de
materiales de cirugía o autopsia, en los cuales se obtenga el tejido renal con el cálculo puede
brindar información concerniente a la deposición de cristales dentro de los canalículos. Las figura 7
muestra un cristal urinario cuyo análisis elemental puede ser obtenido mediante un analizador
EDS. En la figura 8 se muestra el patrón de composición de un cálculo renal.

Cuando los fotones de rayos X golpean el cristal semiconductor, este absorbe una cantidad de
energía determinada, que es convertida en una señal eléctrica, la cual es emitida, amplificada y
digitalizada para alimentar un analizador multicanal, que identifica los elementos que originaron
esa señal y la despliega gráficamente, como se muestra en la figura 8 que corresponde a un
cálculo renal.

Conclusión

El avance acelerado de los conocimientos científicos y la tecnología han permitido a la microscopio

electrónica tener una gran capacidad de análisis ultraestructural en organelas, células, tejidos y
materiales inorgánicos. Se ha podido llegar a aumentar imágenes hasta casi un millón de veces
con una resolución de 1.4 A. Esto ha permitido conocer ultraestructuralmente los materiales y
sistemas biológicos ayudando a entender mejor su funcionamiento. Sin embargo, esta técnica no
permitía conocer la composición química elemental de los objetos que estábamos viendo. Para ello
necesitábamos realizar un análisis químicos de la muestra lo que implicaba su destrucción. El
desarrollo de sistemas de detección de rayos X y programas de computación de inteligencia
artificial que permiten analizar gran cantidad de información en forma eficiente y amigable, ha
permitido que la microscopio electrónica de un gran salto en su capacidad de análisis. Debido a
que el microscopio electrónico produce un has de electrones que impacta la muestra que estamos
observando y que en este proceso se liberan rayos X, los cuales son característicos de cada
elemento, podemos entonces determinar qué elementos están presentes en la imagen que
estamos viendo en el microscopio. Además, podemos ver su distribución en la muestra, lo cual nos
permite hacer diagnóstico de intoxicación por metales o elementos inorgánicos debido a que la
presencia de estos no natural en los tejidos. También, nos permite entender mejor la fisiopatogenia
de procesos que incluyen el depósito de materiales orgánicos o inorgánicos como es el caso de la
formación de cálculos en diferentes órganos.
Referencias
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1 . Centro de Investigación de Estructuras Microscópicas (ClEMIC).

2 . Facultad de Microbiología.

3 . Escuela de Física.

4 . Centro de Investigación en Ciencia de Materiales (CICIMA), Universidad de Costa Rica. San

José.
Costa Rica.

* Correspondencia. CIEMIC, Ciudad de la Investigación, Universidad de Costa Rica, CP 2060 , San

José, Costa Rica.hchavarr@cariari.ucr.ac.cr Fax: 207 3182