Guía 1 Preparación soluciones y espectrofotometría.

SOLUCIONES
Una solución es una mezcla homogénea de dos o más componentes. El componente que
está en mayor proporción se llama solvente y el o los componentes que están en menor
proporción se llaman solutos. Los solutos pueden ser sólidos, líquidos o gases. La gran
mayoría de las soluciones son soluciones acuosas (solvente agua). Para caracterizar una
solución hay que determinar la proporción en que estos están presentes en la solución.

UNIDADES DE CONCENTRACIÓN
Unidades de concentración referidas a volumen: ​indican cantidad de soluto disuelto por
unidad de volumen de solución. como por ejemplo la molaridad, la normalidad, porcentaje
p/v, g/l, etc.
Unidades de concentración referidas a peso: ​indican cantidad de soluto disuelto por
unidad de peso de solución o de solvente. Ejemplo: % p/p, molalidad.
1. Molaridad (M)(mol=L): ​Número de moles de soluto por litro de solución.
1 milimolar (mM) significa : 1 mmol en 1 L de solución
1 micromolar ( M) significa : 1 mol en 1 L de solución
1 nanomolar (nM) significa : 1 nmol en 1 L de solución
1 picomolar (pM) significa : 1 pmol en 1 L de solución

2. Normalidad: ​Número de pesos equivalentes (PE) de soluto por litro de solución. En

general : Para ácidos y bases n = número de protones que puede ceder (el ácido) o captar
(la base) por molécula. Para compuestos que sufren reacciones redox n = N° de electrones
captados (agente oxidante) o cedidos (agente reductor) por molécula.

3. Peso de soluto / volumen de solución en g/l, mg/l, etc.: ​concentración de una solución
es la forma más usual, además de la molaridad.es la forma más sencilla de indicar la

4. Porcentaje peso / volumen (% p/v) : ​peso de soluto en gramos por 100 ml de solución
(% g).

5. Porcentaje peso / peso ( % p/p):​​ peso en gramos de soluto por 100 gramos de solución.

6. Molalidad (m): ​número de moles de soluto por 1000 g de solvente.

PREPARACIÓN DE SOLUCIONES
Para diluciones rige la relación:
V1 x C1 = V2 x C2 (balance de masa soluto)
V1= volumen de la solución concentrada
C1= concentración de la solución concentrada
V2 =Volumen de la solución diluida
C2 = concentración de la solución diluida
C1 y C2 pueden ser unidades de concentración de cualquier sistema referido a volumen.

pH Y TAMPONES:
ÁCIDOS Y BASES
De acuerdo a la definición de Bronsted:
1. ÁCIDO: ​es un compuesto que tiende a ceder protones al medio.
2. BASE:​​ es un compuesto que tiende a captar protones del medio.

FUERZA DE ÁCIDOS Y BASES

Un ácido o una base fuerte es el que está completamente disociado en solución. En cambio
en ácido débil esta solamente parcialmente disociado y la base parcialmente protonada.
Ácidos fuertes: HCl, HNO3, HClO4, H2SO4 (ambos protones), H3PO4 (solamente el
primer protón que
se disocia).
Bases fuertes: ​NaOH, KOH, etc.
Ácidos y bases débiles: prácticamente todos los ácidos y bases orgánicos pertenecen a
este grupo.

ÁCIDOS Y BASES DÉBILES

a. ÁCIDOS DÉBILES
Un ácido débil posee protones ácidos. En solución acuosa coexisten en equilibrio moléculas
de la especie protonada con moléculas del anión y protones. La relación entre la
concentración de las especies nombradas a una temperatura determinada está dada por la
constante de equilibrio de la reacción de disociación, llamada constante de acidez, Ka:
HOAc OAc- + H+
Ka = [ OAc- ] [ H+ ] / [HOAc ]
Se suele expresar la acidez a través del pKa en vez de usar Ka:
pKa = - log Ka

b. BASES DEBILES
Para Una base débil B se puede definir también una constante. En este caso, la llamada
constante
de basicidad Kb
Kb = [ BH+ ] / [ B ] [H+ ]

Para un par ácido / base conjugada se cumple:

Ka x Kb = Kw
Siendo Kw = constante de disociación del agua
Kw = [H+ ] [OH- ] = 14,00 + 10-14 ( 25° C)

ECUACIÓN DE HENDERSON – HASSELBACH

Ka = [A- ] [H+ ] / [HA ]
Despejando H+ y aplicando log se obtiene la ecuación de Henderson – Hasselbach
pH = pKa + log [ A- ] / [ HA ]
Esta ecuación establece la relación entre pH, el pKa y la proporción de la especie protonada
(HA) y la desprotonada ( A- ). Se usa para calcular el pH de la mezcla de un ácido débil con
un ácido fuerte o una base fuerte de un ácido débil con su sal, mezclas tampón, etc.

SOLUCIONES TAMPÓN
Cuando se titula una solución de HOAc con una solución de una base fuerte (NaOH),
midiendo el pH después
de cada adición se obtiene el siguiente gráfico, llamado curva de titulación:
Se aprecia que en un rango de pH alrededor de 4.75 (pka) el pH varía muy poco durante la
adición
de base, se trata de la zona tamponante del par HOAC / OAc- .

Las 3 reacciones involucradas son:

1. NaOH Na+ + OH-
2. OH- + H+ ⇒ H2O
3. HOAc ⇒ OAc- + H+

La suma de las dos primeras reacciones hace disminuir la concentración de protones en la

solución. Sin embargo, la tercera reacción simultáneamente repone parte de los protones
neutralizados. El equilibrio de disociación de HOAc se desplaza hacia la formación de
acetato. Para: pH = pKa ocurre que HOAC = OAc-. A medida que la concentración de la
especie protonada HOAc en la solución se hace pequeña, el pH comienza a aumentar más
fuertemente, hasta que la solución pierde su característica de tampón. Al titular una solución
básica que contiene el anión acetato con un ácido fuerte se observa el mismo fenómeno.
Estaríamos recorriendo nuestra curva de derecha a izquierda.

Solución tampón (solución amortiguadora o buffer): ​es una solución cuyo pH se

mantiene prácticamente constante cuando se le agregan pequeñas cantidades de ácido o
base. Las soluciones tampón son sistemas formados por un ácido débil y su base conjugada
o por una base débil con un ácido conjugado.

Rango de un sistema tampón: ​es el rango de pH en el cual el sistema posee propiedades

de tampón, esta dado por el pKa de la especie protonada. Un tampón es “bueno”
aproximadamente 0.5 unidades de pH alrededor del pKa. También se usan mezclas de dos
diferentes sistemastampón, ejemplos: tampón tris / fosfato, trienolamina / dietalamina, etc.

Capacidad de una solución tampón: la capacidad de una solución tampón indica la

cantidad de ácido o de base que es capaz de absorber sin cambiar fuertemente su pH y
depende de:
1. pH: es máxima para pH = pKa
2. Concentración: a mayor concentración, mayor capacidad tamponante.

SELECCIÓN DE UN TAMPÓN: ​Para la selección de un sistema buffer adecuado se deben

considerar las siguientes variables:
a. El pH al cual deseamos trabajar
b. La capacidad tamponante requerida
Otros aspectos importantes a considerar son:
c. Solubilidad de los compuestos
d. Variación del pH con la temperatura
e. Volatilidad: algunos sistemas tampón presentan la desventaja de ser volátiles.
f. Transparencia a la luz U.V. : cuando se desea detectar un compuesto por absorciometría,
es necesario usar un buffer que sea suficientemente transparente (que no absorba) a la
longitud de onda de la determinación.
g. Interacciones: entre el sistema tampón sobre la actividad de determinada enzima.

Observación: la concentración de un buffer es la suma de las concentraciones de la

especie protonada y de la especie desprotonada.

FOTOMETRIA: ABSORCIOMETRIA
MONTAJE DE UNA TÉCNICA FOTOCOLORIMETRICA
Principios de absorciometría de UV / visible. La absorciometría aprovecha la propiedad de
ciertos compuestos de absorber radiación electromagnética.

Los diferentes tipos de radiación electromagnética: rayos X, luz ultravioleta (UV), luz
visible, luz infrarroja, ondas de radio. Etc., se propagan a la misma velocidad, pero difieren
en longitud de onda y frecuencia. El ojo humano detecta la radiación en un rango de
longitudes de onda de 400 a 800 nm, llamada luz visible ( 1 nm = 10-9 m ). La luz del
espectro visible y del UV cercano (200 a 400 nm) posee la energía necesaria para
producir transiciones de electrones desde un orbital molecular de menor energía a otro de
mayor energía de ciertos compuestos, llamados cromóforos. Las sustancias coloreadas
absorben luz visible, su color corresponde a la radiación no absorbida. la luz solar es blanca,
ya que contiene radiación de todo el espectro visible, además de otras radiaciones.

LEY DE LAMBERT - BEER

La ley de Lambert – Beer es la ley fundamental de la absorciometría, ya que relaciona la

absorción de la luz con la concentración de las soluciones. Consideremos un haz de luz
monocromática (luz de una solo longitud de onda) que atraviesa una solución de un
compuesto contenido en un recipiente de vidrio.

Si el compuesto absorbe a una longitud de onda dada, I es menor que I0 . Cuanto mayor es
el número de moléculas de este cromóforo encontradas por el haz de luz en su camino,
menor será la intensidad de la luz transmitida. Dicho número de moléculas depende de la
distancia recorrida a través de la solución (camino óptico) y de la concentración. La relación
entre estos parámetros esta dada por la ley de Lambert – Beer :
 I = I0 x 10- bc (1)

La forma de esta ley que se usa en la práctica es más sencilla y se obtiene aplicando
logaritmos y reordenando:
Log I0 / I = bc

Se define como absorbancia (A) de la solución:

A = Log I0 / I (2)
Luego:

El coeficiente de extinción molar, a una longitud de onda dada es una característica propia
del cromóforo y representa la probabilidad de que el cromóforo absorba la radiación. Km
La ley de Lambert – Beer indica que la absorbancia a una dada aumenta en forma lineal con
la concentración (con b = cte.), mientras que la transmitancia disminuye en forma
exponencial:

El gráfico de la absorbancia de un cromóforo en solución en función de la longitud de onda

se denomina espectro de absorción o espectrograma de absorción. Un espectro de
absorción se obtiene variando para b y c constantes, y por lo tanto representa la
variación de A con ξ (según (3)). En la figura N° 2 se muestra el espectro de absorción de la
riboflavina.

Figura N° 2 espectro de absorción de riboflavina (en fosfato de sodio, pH 7.0)

El espectro de absorción de UV/ visible es característico para un cromóforo determinado, por
lo tanto se puede usar para su identificación. Las características espectroscópicas se
pueden resumir indicando la posición de los máximos de las bandas de absorción ( λ máx )
con los correspondientes.
INSTRUMENTOS DE MEDICIÓN
Los componentes básicos de todos los instrumentos que se usan en absorciometría de UV /
visible son:
- Fuente de luz
- Filtros o monocromador, que permite seleccionar la longitud de onda.
- Portador de muestra
- Detector
- Dispositivo que permite la lectura de la medida directamente o inscriptor

Se pueden distinguir dos tipos de instrumentos:

a. Fotómetros de filtro: ​la selección de la longitud de onda se realiza mediante filtros
intercambiables.
b. Espectrofotómetros: ​poseen un monocromador; son más sofisticados que los
fotómetros de filtro. Por otra parte se distinguen instrumentos que operan en el rango visible
solamente y otros que abarcan el UV y el visible (tiene 2 fuentes de luz ).

LA FUENTE DE LUZ
No existe una fuente de luz que proporcione radiación de todo el rango espectral UV / visible
de suficiente intensidad, por consiguiente, se usan fuentes diferentes.

SELECCIÓN DE LA LONGITUD DE ONDA

FILTROS
No proporcionan luz realmente monocromática, sino que permiten el paso de un cierto rango
de longitudes de onda alrededor de la longitud de onda máxima transmitancia del filtro

MONOCROMADORES
Poseen un elemento dispersor, que puede ser un prisma o una red de disfracción. Un
monocromador permite variar la longitud de onda en forma continua, condición necesaria
para obtener espectros de absorción. Con un fotómetro de filtro no es posible obtener
espectros de absorción.

PORTADOR DE MUESTRA:
Allí se ubica la o las cubetas con las soluciones de muestra de referencia.

DETECTOR
Los detectores son del tipo fotoeléctrico: al incidir luz producen corriente eléctrica, de
intensidad proporcional a la intensidad de la luz.
LECTURA O REGISTRO
La mayor parte de los instrumentos indican o registran el valor de la absorbancia. El rango
de A medible es de 0.000 hasta 1.500 o hasta 2.000 o 3.000
(dependiendo del instrumento).

APLICACIÓN DE LA ABSORCIOMETRÍA EN EL ANÁLISIS CUANTITATIVO

1. DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE UN CROMÓFORO PURO

Midiendo la absorbancia de la solución problema en un espectrofotómetro y conociendo el
correspondiente se puede calcular la concentración. Un método alternativo es construir una
curva de calibración de A en función de C, que será una recta si se cumple la ley de Lambert
– Beer (ver Fig. 1). Interpolando en la recta con la absorbancia de la solución problema se
puede determinar su concentración. La ventaja del método con curva de calibración es que
permite usar también un fotómetro de filtro.

2. DETERMINACIONES A TRAVÉS DE UNA REACCIÓN QUÍMICA O “TEST”

Compuestos que no pueden ser determinados en forma directa porque no absorben
convenientemente, se hacen reaccionar con un reactivo específico formándose un
cromóforo. Se realiza en paralelo el test con la muestra problema y con una o varias
soluciones del compuesto a determinar, de concentración conocida (soluciones patrón).
Posteriormente, se mide la absorbancia. Esta absorbancia será proporcional a la
concentración del compuesto que se va a determinar dentro de cierto rango de
concentraciones.

CASOS EN LOS CUALES SE REALIZA UN TEST

1. El compuesto no absorbe en todo el UV – visible:
Se realiza el test, generando un cromóforo, el cual generalmente absorbe en el visible (se
genera un color) o excepcionalmente solamente en el UV.

2. ​El compuesto absorbe en una región espectral (generalmente UV) en la cual no se puede
efectuar la determinación porque la solución problema es una mezcla que contiene otros
compuestos que absorben en la misma región que el compuesto a determinar y / o el
instrumento de la medida permite medir solamente en el rango visible.

Cuando se monta un método fotocolorimétrico, pueden existir tres posibilidades:

a. Que la sustancia sea coloreada y que presente un máximo de absorción característico
solo para ella y por lo tanto, esta podría usarse para su determinación fotocolorimétrica.
b. La sustancia en solución es incolora, y por lo tanto, se aprovecha alguna propiedad
química de ella (poder reductor, oxidante, de sustitución de grupos, etc. ) para desarrollar
una reacción coloreada que sirve entonces para determinar su concentración.
c. La sustancia en solución, a pesar de ser incolora, presenta un máximo de absorción
característico, generalmente a longitudes de onda cortas (UV) que puede ser usada para su
determinación.

GUIA N° 2 BIOL-261: Cuantificación de Proteínas

Se han descrito un gran número de métodos para la cuantificación de proteínas, la selección
de uno en particular va a depender de la proteína que deseamos cuantificar, la sensibilidad
deseada, posibles interferencias, la sencillez del método, absorción ultravioleta, reacciones
de fluorescencia y determinación de nitrógeno.

Método Turbidimétrico: ​Las proteínas precipitan cuando se mezclan con soluciones

diluidas de ácido tricloroacético, sulfosalicílico o ferricianuro de potasio en ácido acético. La
turbidez producida en la solución al momento de la precipitación depende de la cantidad de
proteínas en la muestra y puede ser medida en un espectrofotómetro. Este método tiene
desventajas ya que no todas las proteínas precipitan en la misma cantidad e interfieren otras
sustancias precipitables por ácidos. La ventaja que presenta su uso es la rapidez de la
determinación. El rango útil de trabajo es entre 0.1 y 0.3 mg de proteínas agregadas.

Métodos Colorimétricos: ​Se basan en el desarrollo de color al reaccionar las proteínas de

la muestra con el reactivo correspondiente. La intensidad del color generado es proporcional
a la cantidad de proteínas en la muestra y puede ser medida en un espectrofotómetro.

Los métodos colorimétricos más difundidos son:

a- Método de Biuret: El reactivo de Biuret (sulfato cúprico en medio alcalino) reacciona con
un compuesto que contiene dos o mas enlaces peptídicos dando una coloración violeta. El
color desarrollado se debe a un complejo de coordinación entre el Cu y cuatro átomos de
nitrógeno que provienen de dos cadenas peptídicas adyacentes. Los dipéptidos y los
aminoácidos (excepto la serina y treonina) no dan esta reacción. Mediante este método se
pueden valorar proteínas en un rango de 1 a 20 mg.

b- Método de Löwry (también conocido como Folin-Ciocalteau):​​ en este método el

color final de la reacción, es el resultado de la reacción de Biuret de la proteína con el
ión cobre en medio alcalino y la reducción del reactivo fosfomolíbdico – fosfotúngstico
por los residuos de tirosina y triptofano presentes en las proteínas formando un
complejo de intenso color azul, pudiendo detectarse hasta 5 μg de proteínas.

c- Método de Bradford: ​Este método utiliza la propiedad del colorante azul de Coomassie
G – 250 de unirse a las proteínas. El colorante solo presenta un máximo de absorción a 465
nm mientras que cuando está unido a la proteína el máximo de absorción se desplaza hasta
los 595 nm. Es un método sensible que no depende de la naturaleza de la proteína de la
muestra y no presenta interferencia por otros componentes celulares o sales. aunque si
interfieren en la determinación detergentes y álcalis. La coloración en presencia de proteínas
es lineal en el rango de 0 a 30 μg.

Métodos de Absorción Ultravioleta

La mayoría de las proteínas tiene un máximo de absorción a 280 nm debido, primariamente,
a la presencia de tirosina y triptófano y secundariamente, a la presencia de fenilalanina y
cisteína. Por consiguiente, el coeficiente de extinción molar a 280 nm varía de una proteína
a otra debido a su composición aminoacídica. Más aún, los ácidos nucleicos que muchas
veces están como contaminantes en las preparaciones de proteínas, aunque tiene un
máximo de absorción a 260, también lo hacen a 280 nm, falseando la lectura de las
proteínas. La razón de absorbancia a 280 nm / 260 nm ha sido usada para eliminar la
interferencia de ácidos nucleicos en la determinación de proteínas. El rango útil de trabajo es
entre 0.1 y 0.6 mg / ml. Se han descrito una serie de métodos que utilizan absorbancias
menores a 240 nm, sin embargo, se obtiene mejores resultados con el método de Scopes,
en el cual se efectúan lecturas de absorbancia a 205 y 280 nm, pudiéndose calcular el
coeficiente de extinción molar de una proteína a 205 nm con bastante precisión.

CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS POR EL MÉTODO DE BIURET

El reactivo de Biuret (sulfato cúprico en medio alcalino) reacciona con un compuesto de
contiene dos o más enlaces peptídicos dando una coloración violeta. El color desarrollado se
debe a un complejo de coordinación entre el Cu y cuatro átomos de nitrógeno que provienen
de dos cadenas peptídicas adyacentes. La reacción no es absolutamente específica para los
enlaces peptídicos, interfiriendo una serie de compuestos en la determinación de proteínas
como por ejemplo, sales de amonio. Mediante este método se pueden valorar proteínas en
un rango de 1 a 10 mg.

CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS POR EL MÉTODO DE BRADFORD

Este método utiliza la propiedad del colorante azul de Coomasie G – 250 de unirse a la
proteína. El colorante sólo presenta un máximo de absorción a 465 nm mientras que cuando
está unido a la proteína el máximo es de 595 nm. La coloración en presencia de proteínas
es lineal en el rango de 0 - 30 μg, Interfieren en la determinación, detergentes y álcalis. Este
efecto es especialmente significativo a altas concentraciones de proteínas.

Guía 3, 4 y 5 : ENZIMOLOGÍA 1, 2 y 3.

Características cinéticas de la fosfatasa ácida: ​son enzimas que catalizan la hidrólisis de

monoésteres de fosfato con la liberación de fosfato inorgánico. Algunas de estas actúan
sobre ​algunos sustratos​, en estos casos es fácil asignarles una función fisiológica. Otras que
tienen especificidad por un amplio rango de sustratos se clasifican como ​ácidas o alcalinas.

Las semillas son ​fosfatasas ácidas​​ aumentando su actividad durante la germinación y

disminuyendo cuando se desarrolla. En animales son marcadores de procesos fisiologicos y
patologicos. También está presente en suero y está formada por varias isoenzimas.

Las ​fosfatasas alcalinas ​se encuentra ampliamente distribuida en mamíferos, se conocen

isoenzimas de intestino, placenta (homínidos) y un no tejido específico que se puede
encontrar en hueso, hígado y riñones.

Se usó el p-nitrofenol artificial como sustrato, el grado de hidrólisis se determina por la

medición espectrofotométrica del p-nitrofenol liberado, en medio alcalino el p-NF es amarillo
y absorbe luz a 405 nm.

P-nitrofenilfosfato gracias a la fosfatasa ácida libera el fosfato que se necesita para formar
ATP dando como producto p-nitrofenol el cual en medio alcalino (pH=8, inactiva la enzima
deteniendo la rx) libera un protón y se forma p-nitrofenolato.
● Las enzimas no alteran el equilibrio químico de las reacciones sino que la velocidad.
● Para determinar la actividad de una enzima es posible cuantificar tanto la
desaparición del sustrato como la aparición del producto.
● La KM es la concentración de sustrato a la que se alcanza ½ de la velocidad
máxima.
● Condiciones ideales (velocidades iniciales): condiciones que determinamos un
tiempo en donde está en su máximo rendimiento.
● Estado de transición: variación de la estructura para que le permita convertir el S en
P, [SE] es constante.

Guía 6: ENZIMOLOGÍA 4.

Los inhibidores enzimáticos interactúan con las enzimas para disminuir la actividad de estas.

Inhibidores reversibles:
● ​Inhibidor competitivo:​ compite con el sustrato por el mismo sitio activo, a medida que
el inhibidor ocupa el sitio activo, impide la formación de producto.
● Inhibidor acompetitivo:​ se una a la enzima en un sitio distinto al sitio activo,
uniéndose solo cuando el complejo ES esta conformado.
● Inhibidor mixto: ​se une en un sitio distinto al activo, el inhibidor puede unirse tanto a
la enzima como al complejo ES donde la afinidad del inhibidor por la enzima libre es
distinta a la afinidad de la enzima por el complejo ES.
● Inhibidor no competitivo:​ se une a la enzima en un sitio distinto al sitio activo, puede
unirse tanto a la enzima libre como al complejo ES, presenta la misma afinidad por la
enzima libre que por el complejo ES.

Inhibidor irreversible ​se unen covalentemente a un grupo funcional esencial en la actividad

catalítica, inactivando a la enzima.

V iguales V distintas V disminuye

 Guía 7: CROMATOGRAFÍA POR EXCLUSIÓN MOLECULAR.

Cromatografía por exclusión molecular separa compuestos de diferentes pesos molecular o

tamaño. Cuando la solución se coloca en una columna de ​gel​​ ​dextrano(tipo de gel que se
utiliza en cromatografía) ​las moléculas más grandes no penetran los poros así que se
mueven más rápido que las pequeñas, en cambio las más pequeñas se extienden a través
de los poros quedando así las más grande en el fondo y las más pequeñas en la parte
superior.
Es el método más efectivo para fraccionar proteínas ya que aprovecha la diferencia de
cargas, tamaño, afinidad de unión. Este método tiene dos fases: FASE ESTACIONARIA
dentro de la columna y FASE MÓVIL se aplica sobre la fase estacionaria donde se filtra. Las
proteínas se colocan sobre la primera fase
EL movimiento de las proteínas individuales migra a diferentes velocidades dependiendo de
sus propiedades.
NANOPARTÍCULAS
Partículas con menos de una dimensión en la escala de nanométrica hay de muchos tipos
como; nanotubos, dendrómetros, liposomas, nanopartículas metálicas etc.
NPs Metálicas: están compuestas por elementos químicos o por mezclas de elementos esto
depende de las características o aplicaciones que tenga.
QDs( Quantium Dots o Puntos cuánticos) son NPs semiconductoras y presetana
fluorescencia en luz UV emitiendo diferentes coloraciones dependiendo de su tamaño. Los
de menos tamaño (1-3nm) son de color celeste o verde, los de mayor tamaño(4-10nm) son
de color rojo. Se utilizó QDs de CdTe
Aplicaciones: tinción de tejidos, placas fotovoltaicas, marcaje de proteínas, TV etc.

GUIA 8: CROMATOGRAFÍA POR INTERCAMBIO IÓNICO

Este tipo de cromatografía aprovecha la diferencia de carga neta en proteínas a un pH

determinado para que se separen, en la matriz de la columna se usa un polímero sintético
con carga, los que tienen grupos aniónicos se llaman intercambiadores de cationes y los que
tienen grupos catiónicos intercambiadores de aniones, los iones unidos a la matriz son
reemplazados por iones de la fase móvil.
La afinidad de las proteínas con los grupos cargados se afecta con el pH. El pH determina el
estado de ionización de las proteínas y la concentración de iones. Es elegido para que las
proteínas que se quiere purificar se unan fuertemente a la matriz, aunque muchas se unirán
pero con la elución más con mejor afinidad migrarán más rápido que las con más afinidad.
Estas proteínas fuertemente unidas a la matriz se “liberan” cambiando el buffer, pero uno de
mayor concentración. Esto se puede hacer cambiando el pH de forma gradual o cambiando
la concentración de sales.
Los Intercambiadores Iónicos Celulíticos son los más usados para separar moléculas
biológicas como la celulosa( derivada de madera o algodón) es derivatizada (transformar
compuesto químico en producto) con grupos ionizables. El IIC aniónico más utilizado es
DEAE-celulosa y el IIC catiónico más utilizado es la carboximetil (CM)-Celulosa.

GUIA N° 9 Electroforesis geles poliacrilamida.

Electroforesis:
● técnica basada en la migración de proteínas cargadas en un campo eléctrico.
● Útil como un método de análisis para visualizar y separar para estimar el número
proteínas o el grado de pureza de una preparación.
● Permiten determinar propiedades como su punto isoeléctrico y su peso molecular
aproximado.

La electroforesis es una técnica que consiste en la separación de moléculas, al ser

sometidas a un campo eléctrico dentro de un determinado material, que favorecerá o
impedirá su migración de acuerdo a las propiedades del mismo.

La electroforesis se realiza generalmente en geles preparados con el polímero entrecruzado

poliacrilamida. La poliacrilamida actúa como un tamiz (colador) molecular que hace más
lenta la migración de las proteínas en forma proporcional a su relación carga-masa,
dependiendo de su forma y tamaño.
● El SDS es un detergente que se une a la mayoría de las proteínas por interacciones
hidrofóbicas, en cantidad proporcional al peso molecular de ellas (aproximadamente
una molécula de SDS cada dos residuos de aminoácidos). Este detergente otorga
una carga neta negativa a las proteínas.
● La electroforesis en geles de poliacrilamida en presencia de SDS (SDS_PAGE)
separa las proteínas casi exclusivamente en base a su peso molecular, por lo tanto,
los polipéptidos más pequeños migran más rápido y los más grandes migran más
lento.
● Las proteínas de la electroforesis pueden ser visualizadas al incubar el gel en
presencia de un colorante como el azul de Coomassie R-250 que ​se une a las
proteínas, pero no al gel.
● Al comparar las migraciones de proteínas en un estándar de peso molecular se
puede estimar el peso molecular de las primeras. Si una proteína consiste en dos o
más subunidades, estas se separaran con el tratamiento con SDS y aparecerán
como bandas independientes en el gel.

Los factores que pudiesen afectar a la electroforesis son: campo eléctrico, muestra, buffer y
el soporte en el cual se realiza.
 Electroforesis geles agarosa – Lisis Alcalina.

● Técnica que permite separar fragmentos de ADN de acuerdo a su tamaño molecular

al someterlos a un campo eléctrico.
● No es necesario ningún tratamiento especial a la muestra (la carga eléctrica del ADN
ya es negativa debido a su grupo fosfato) puede ser disuelto en agua destilada.
● La concentración de agarosa a utilizar en el gel se debe decidir en base a los
fragmentos de ADN que se intenta separar ya que la migración de la muestra en un
gel de agarosa se verá afectada principalmente por el tamaño de la muestra y la
concentración de la agarosa, de manera que concentraciones más altas de agarosa
permitirán la separación de fragmentos pequeños de ADN, pero dificultarán la
resolución de fragmentos grandes de ADN.
● Se puede estimar el tamaño de fragmentos desconocidos al comparar su migración
con la de los estándares. Para esto es necesario trabajar con fragmentos lineales de
ADN, ya que el ADN circular presenta una migración alterada debido al fenómeno de
sobreenrollamiento.

​CONTROLES.
Control 1.
1. En el laboratorio, usted debe preparar un litro de buffer Tris-Glicina 1X que
contiene lo siguiente: 25 mM de Tris-HCl, 250 mM de Glicina y 0,1% SDS al 10%
(p/v). Indique cuánto necesita de cada solución para el buffer.

TRIS-HCl (25 mM)

250 nm x (X) = 25 nm x 1L
X= 0,1L

Glicina (250 mM) PM= 75,05 g/mol.

0,25 M = g / 75,05 g/mol x 1L
g= 18,7625 g.

SDS (0,1%)
0,1% x 1L = 10% x (X)
X= 0,01 L → 10 mL.
2. Defina:
- ​Molaridad:​​ Concentración de una solución expresada en número de moles
disueltos por litro.
- ​Peso molecular:​​ Masa de una molécula, cuyo valor es la suma de todos sus
átomos que la componen.
- ​Porcentaje peso/peso:​​ cantidad de gramos de una sustancia en 100g de solvente,
expresada en %.
-​ Porcentaje peso/volumen:​​ cantidad en gramos de una sustancia en 100 mL de
solvente, expresado en %.
- ​Mol:​​ unidad que mide cantidad de sustancia, expresado en el nº de avogadro
 (6,022 x 10E23)
-​ umol (micromol): ​unidad más pequeña de un mol, equivalente 10E-6.

Control 2.

1. Describa los métodos de cuantificación de Biuret y Bradford, indique cómo

funcionan y el rango de detección de cada uno.
Biuret:reacciona con compuestos que tengan dos enlaces peptidicos volviendolo de
color violeta ¿cómo? por la coordinacion de Cu+4N
-sirve para dipeptidos y aminoacidos (menos serina y tirosina)
-no es especifica para enlaces peptidicos
-Interfieren sales de amonio
-Mide preteínas de 1 a 20mg a 540nm
Brandfort:
usa propiedades de azul de comasie a 595nm y de 0-30ug
-sensible
-no depende de la naturaleza de la proteína
-no interfieren celulas o sales
-intervienen detergentes y alcalisis
-el color presipita en 10 minutos por eso el color no es estable
2. ¿Qué es y para que se utiliza la curva de calibración?
para determinar la concentración de una sustancia (analito) en una muestra desconocida,
sobre todo en disoluciones. El método se basa en la relación proporcional entre la
concentración y una determinada señal analítica
3. ¿De qué depende la utilización de un método de cuantificación de proteínas
con respecto a otro?
de lo que se quiere hacer, la cantidad de muestra, la sensibilidad del experimento y lo que
se quiere determinar (si es una proteína y de que tipo de preteína o si quiero tenerlas
presipitadas, etcc…)

Control 3.

1. En este práctico, nuevamente deberá realizar una curva de calibración, en este

caso tendrá que graficar los umoles de producto obtenido luego de la reacción
catalizada por la fosfatasa ácida del germen de trigo, en función a la
absorbancia. Teniendo en cuenta esto:
a) ¿Cuál es la finalidad o para qué sirve la confección de una curva de
calibración?
Sirve para poder determinar la linealidad entre la concentración y la absorbancia de
la solución en cuestión.
Sirve también como una forma de establecer una ecuación de la recta para poder
encontrar la concentración de alguna sustancia X según su absorbancia.
b) ¿Cómo puede ser utilizada para determinar la concentración de una muestra
problema?
Se toma en cuenta la absorbancia de la muestra problema y se la reemplaza por la
“y” en “y=mx+n”, donde “y” es absorbancia y “x” es concentración de la solución.
2. Con respecto a la actividad biológica de la fosfatasa ácida de germen de trigo, ¿esta
enzima requiere de algún cofactor para su actividad catalítica? Fundamente su
respuesta.
● Esta enzima favorece la hidrólisis de monoesteres de fosfato a su vez, liberando
fosfatos inorgánicos.
● Sí, la enzima fosfatasa ácida necesita de p-nitrofenilfosfato para liberar p-nitrofenol
(en medio alcalino)

Control 4.

1. De acuerdo al practic anterior, grafique la concertación de producto generado

en el tiempo cuando la relación de enzima sustrato es A) 1:10 B) 5:10 C) 10:1.
Explique que sucede en cada relación.

2. Defina los siguientes conceptos: velocidad inicial en función de la

concentración de sustrato, Km, Vmax de una enzima.
Km: constante de michaelis → afinidad de enzima por sustrato. Concentración de sustrato a
la cual la velocidad de la rx es ½ de la Vmax.
Vmax: velocidad máxima de la rx.

Control 5.
Control 6.
1. Defina que es un inhibidor enzimático, los tipos de inhibidores que existen y
explique las características de estos.
Inhibidores reversibles:
● ​Inhibidor competitivo:​ compite con el sustrato por el mismo sitio activo, a medida que
el inhibidor ocupa el sitio activo, impide la formación de producto.
● Inhibidor acompetitivo:​ se una a la enzima en un sitio distinto al sitio activo,
uniéndose solo cuando el complejo ES esta conformado.
 ● Inhibidor mixto: ​se une en un sitio distinto al activo, el inhibidor puede unirse tanto a
la enzima como al complejo ES donde la afinidad del inhibidor por la enzima libre es
distinta a la afinidad de la enzima por el complejo ES.
● Inhibidor no competitivo:​ se une a la enzima en un sitio distinto al sitio activo, puede
unirse tanto a la enzima libre como al complejo ES, presenta la misma afinidad por la
enzima libre que por el complejo ES.
Inhibidor irreversible ​se unen covalentemente a un grupo funcional esencial en la actividad
catalítica, inactivando a la enzima.

2. En relación a la Ecuación de Michaelis Menten, indique al menos tres

consideraciones que los autores “asumieron” para poder desarrollar la
ecuación.
● Consideraron que la concentración de producto era cero.
● Consideraron que todas las enzimas se comportan de la misma manera en el estado
estacionario.
● Consideraron que Et= [Elibre] + [ES]

Control 7.

1. Explique el principio de la cromatografía de Intercambio Iónico. ¿Para qué

utilizaría esta técnica? ¿Qué es una fase estacionaria? ¿Qué es una fase
móvil?
Este tipo de cromatografía aprovecha la diferencia de carga neta en proteínas a un pH
determinado para que se separen en la matriz de la columna se usa un polímero sintético
con carga, los que tienen grupos aniónicos se llaman intercambiadores de cationes y los que
tienen grupos catiónicos intercambiadores de aniones.

● Fase estacionaria:​​ La fase estacionaria insoluble lleva en la superficie cargas

electrostáticas fijas, que retienen contraiones móviles que pueden intercambiarse por
iones de la fase móvil.
Es el el gel dentro de la columna con los poros
● Fase móvil:​​ suele ser una disolución acuosa con cantidades moderadas de metanol
u otro disolvente orgánico miscible con agua que contiene especies iónicas
generalmente en forma de buffer. Los iones de ésta compiten con los analitos por los
sitios activos de la fase estacionaria.
Es la sustancia con algún solvente, es lo que percola
2. Usted posee una muestra de tres proteínas cuyos pesos moleculares son 8, 19,
15 kDa. Indique cual es el orden de separación en una cromatografía de
exclusión molecular, es decir, cual eluye en primer, segundo y tercer lugar. ¿De
qué manera determinaría el tamaño de las proteínas? Explique el
procedimiento a realizar y el gráfico a construir.

Control 8.
Control 9.
 1. Describa en qué consiste la cromatografía de intercambio iónico, ¿en que se
diferencia con la cromatografía de exclusión molecular?
Es un método que permite la separación de moléculas basada en sus propiedades
de carga eléctrica, se diferencian en
2. Si tengo una muestra en la cual hay una proteína con carga positiva y otra con
carga negativa ¿cómo las separaría?

Control 10.
1. Explique cuál es la finalidad de hacer un gel concentrador y un gel separador y
como las distintas composiciones de ambos geles favorecen este propósito.
El gel concentrador sirve para juntar las proteínas y que corran de forma uniforme
El gel separador separa las proteínas según su carga, tamaño y peso.
2. Indique cuales son los componentes de un gel SDS-PAGE y explique su
función.

Control 11.
1. ¿Qué controles (control positivo y control negativo) utilizará al momento de
cargar el gel de agarosa?
control negativo: un tubo extra al que se le agreguen todos los reactivos utilizados en el
PCR, excepto ADN
El control positivo : ADN más reactivo

2. ¿Qué carga tiene el DNA y a que se debe? ¿En qué sentido migra en una
electroforesis de agarosa?
Tiene carga negativa por la conformación que presenta su ADN gracias a su grupo fosfato.
Migran del polo negativo al polo positivo, ya que cargas opuestas se atraen.