La exposición al desarrollo de la nicotina afecta el tamaño del cerebro Arval y el sistema

dopaminérgico adulto de Drosophila melanogaster

Fondo

El consumo de tabaco se ha relacionado con múltiples enfermedades y contribuye a

aproximadamente siete millones de muertes cada año. Según la Encuesta nacional de consumo
y salud de drogas de 2013, el 15,4% de las mujeres embarazadas informaron haber consumido
cigarrillos recientemente en los Estados Unidos de América y este porcentaje no ha disminuido
significativamente en la última década. Esto se debe al hecho de que fumar durante el embarazo
ha demostrado ser perjudicial y tiene múltiples consecuencias para la descendencia, incluida
una disminución de la viabilidad del desarrollo y las perturbaciones en la arquitectura neuronal
del cerebro, junto con resultados conductuales anormales más adelante. vida.

Aunque el tabaco tiene miles de compuestos, la nicotina ha sido identificada como la sustancia
adictiva. Las mujeres embarazadas también pueden estar expuestas a la nicotina de otras
maneras, como los cigarrillos electrónicos, que se perciben como más seguros que los cigarrillos
de tabaco, o mediante la terapia de reemplazo de nicotina, que es un tratamiento para dejar de
fumar aprobado por la Administración Federal de Medicamentos y Se ofrece monly como una
intervención de cesación. Hay poca evidencia de que los cigarrillos electrónicos sean efectivos
para dejar de fumar y se ha demostrado que la exposición de cigarrillos electrónicos durante el
desarrollo conduce a cambios de comportamiento en roedores.

Los efectos de la exposición al desarrollo de la nicotina en los roedores recapitulan los efectos
conocidos de la exposición al tabaco en los seres humanos e incluyen un menor peso al nacer,
un retraso en el desarrollo y alteraciones del sistema colinérgico. Estos efectos también se han
documentado en Drosophila melanogaster. La exposición prenatal a la nicotina también
conduce a cambios estructurales en el sistema nervioso, que incluyen diferencias en el tamaño
del cerebro y otras alteraciones a la dendrita, espinas y regiones específicas del SNC. El sistema
dopaminérgico, un sistema neurotransmisor implicado en la recompensa y la adicción, también
se ve afectado por la exposición prenatal a la nicotina. La dopamina desempeña un papel en el
desarrollo normal del sistema nervioso, incluido el desarrollo de vías de recompensa. Se ha
demostrado que la exposición prenatal a la nicotina en mamíferos estimula la liberación de
dopamina en el cerebro anterior fetal y afecta los niveles y la rotación de la dopamina, ya sea
con disminuciones o aumentos dependiendo de la región específica del sistema dopalérgico en
estudio. Se necesitan conocimientos adicionales sobre los mecanismos subyacentes a los efectos
de la exposición del desarrollo a la nicotina para descubrir posibles objetivos para nuevas
intervenciones médicas que podrían prevenir o mejorar estos efectos.

La investigación mecanicista en Drosophila melanogaster se puede realizar a un ritmo más

rápido de lo que podría lograrse en los sistemas modelo de mamíferos y puede contribuir a la
dilucidación de los mecanismos que subyacen a los efectos de la exposición a la nicotina del
desarrollo. Existe una alta conservación en propiedades biológicas, fisiológicas y neurológicas
básicas.

entre Drosophila melanogaster y mamíferos. Se ha estimado que entre el 65 y el 75% de los

genes que causan enfermedades en los humanos tienen un homólogo funcional en Drosophila.
Drosophila se ha utilizado con éxito para estudiar los comportamientos inducidos por fármacos
y los mecanismos de acción que subyacen en las respuestas a la exposición aguda al etanol y la
cocaína en moscas adultas. También se han llevado a cabo investigaciones para identificar los
genes implicados en la respuesta aguda y crónica a la nicotina en moscas adultas. Se podría usar
un modelo de Drosophila para dilucidar los mecanismos que subyacen a los efectos de la nicotina
del desarrollo aprovechando la amplia gama de herramientas moleculares y genéticas
disponibles en la investigación de Drosophila.

Recientemente hemos desarrollado un modelo de Drosophila melanogaester que recapitula

varios efectos de la exposición a la nicotina del desarrollo y muestra efectos negativos de la
exposición de la nicotina del desarrollo en el desarrollo normal. Las moscas criadas con nicotina
disminuyeron la supervivencia, retrasaron el desarrollo y redujeron el peso de los adultos al
aumentar las concentraciones de nicotina. Además, la exposición al desarrollo de la nicotina
disminuyó la sensibilidad de los adultos a la exposición aguda a la nicotina y al etanol.

Aquí utilizamos este modelo de Drosophila para la exposición a la nicotina del desarrollo para
demostrar los efectos adicionales de la nicotina en el sistema nervioso en dos etapas de
desarrollo: larva del tercer estadio y adulto. El objetivo de este estudio fue determinar si la
exposición al desarrollo de la nicotina afecta el tamaño del cerebro o altera el sistema
dopaminérgico en Drosophila melanogaster. Nuestros datos muestran que la exposición a la
nicotina en el desarrollo tiene efectos sobre el tamaño del cerebro, los niveles de dopamina y la
cantidad de neuronas en grupos dopaminérgicos individuales que difieren en las etapas de
desarrollo larvales y adultos. Estos datos complementan la caracterización previa de la
exposición a la nicotina del desarrollo en Drosophila melanogaster.

Métodos

Cepas y cultivo de drosophila.

La cepa w1118 Berlin (wB) utilizada para experimentos en este

El manuscrito fue regalado por el Dr. Ulrike Heberlein. La cepa nula subunidad alfa 7 del receptor
nicotínico de Drosophila (Dα7mut), EY6, creada por escisión imprecisa de una inserción del
elemento P, y la cepa de control genético de escisión del elemento P precisa (Dα7WT), EY5,

fueron un regalo del Dr. Amir Fayyazuddin. Todas las cepas de moscas se elevaron a 25 ° C en
baños de agua para mantener la humedad y la presión de vapor más estables. Estas condiciones
han dado resultados homogéneos. Las moscas se criaron en alimentos elaborados en el
laboratorio con melaza, harina de maíz y medio de levadura en un incubador controlado claro-
oscuro en un ciclo de 12 h: 12 h de luz: oscuridad establecido al 65% de humedad.

Exposición al desarrollo de los bloqueadores de los receptores nicotínicos y nicotínicos de

acetilcolina

Se añadió nicotina a la comida para moscas preparada en el laboratorio y fundida hasta una
concentración final de 0,3 mg / ml para experimentos con la cepa wB o 0,1 mg / ml para
experimentos con las cepas EY5 / EY6 (Sigma-Aldrich, N3876). Se añadieron bloqueantes
nicotínicos de la acetilcolina, α-bungarotoxina (Tocris, 2133) o meca-mylamina (Tocris, 2843) al
alimento de control o nicotina a las siguientes concentraciones finales 10 nM α-bungarotoxin,
100 nM α-bungarotoxin, 100μM de mecamilamina. Las moscas wB adultas se cruzaron en viales
(10 hembras y 4 machos por frasco para experimentos en las Figuras 1, 2, 3, 4 y 5; 7 hembras y
4 machos por frasco para experimentos en la Fig. 6) con el control solidificado o comida de
nicotina.

Las moscas pusieron huevos durante 2 días y luego se retiraron de los viales. Su progenie se crió
en alimentos de control o de nicotina de huevo a larvas de tercer estadio para experimentos de
cerebro de larvas y de huevo a 3-4 días después de la eclosión para experimentos de cerebro de
adultos. Por lo tanto, el tratamiento de nicotina de "desarrollo" para adultos incluye la vida
temprana.

Ensayos de desarrollo

Las moscas comenzaron a eclose el día 9 y continuaron eclose hasta el día 14, cuando las
disecamos. Durante este tiempo, las moscas se mantuvieron en los viales que contenían,
conteniendo nicotina o alimentos de control. Para evaluar la supervivencia y el retraso de la
eclosión, se contó el número de moscas recién cerradas cada día a la misma hora desde el día 9
hasta el día 14, marcando pupas vacías en las paredes del vial para indicar cuándo se había
cerrado una mosca. La supervivencia se determinó como el número total de moscas que se
habían cerrado para el día 14. El retraso de eclosión se determinó calculando la ET50, el tiempo
que tomó el 50% del número total de moscas para el día 14 en un frasco dado para eclosionar.
Para los experimentos en la Fig. 6, las moscas tardaron más en eclose cuando se expusieron a la
nictina, por lo que extendimos la recolección de datos de eclosión al día 16.

Inmunotinción

Los cerebros larvales y los cerebros de mosca macho adulto se diseccionaron en solución salina
tamponada con fosfato (PBS) 1X, pH 7,4 el día 7 y el día 14, respectivamente. El estado del 3er
estadio fue asegurado por los distintivos espiráculos ramificados de esta etapa antes de la

horas a temperatura ambiente en un balancín. Luego, los cerebros se incubaron con anticuerpos
primarios, anti-tirosina hidroxilasa de conejo (Chemicon AB152, 1: 400) y ratón anti-bruchpilot
(nc82, Developmental Studies Hybridoma Bank, 1: 500) se diluyó en la solución de bloqueo, se
meció durante la noche a 4 ° C y se lavó 3 veces en PBT durante 30 minutos al día siguiente.

Al día siguiente, los cerebros se incubaron con anticuerpos secundarios en un balancín, el conejo
anti-conejo Alexa Fluor 594 (1: 500; Invitrogen, Molecular Probes) y el anti-ratón Alexa Fluor 488
(1: 500; Invitrogen, Molecular Probes) se diluyó en solución de bloqueo durante 2 horas a
temperatura ambiente y se lavó 2 veces en PBT durante 20 minutos, y una vez más en PBS se
montó en Fluoromount-G (Southern Biotech, 0100–01). El protocolo de inmunotinción utilizado
para la Fig. 6 se modificó ligeramente de la siguiente manera: la incubación con bloques de suero
de cabra fue de 60 minutos, la incubación del anticuerpo primario fue a 4 ° C durante dos noches
sin balanceo. La incubación secundaria del anticuerpo y los pasos de montaje fueron los mismos,
pero se realizaron 2 días después de la disección.
Microscopia confocal

Se tomaron imágenes de cerebros de larvas y adultos con un microscopio confocal de barrido

láser (Laser Scanning Microscope 710, Zeiss) utilizando un objetivo DIC 40X / 1.3 con inmersión
en aceite. Estas imágenes se utilizaron para determinar el número de neuronas en grupos
dopaminérgicos individuales y también para el área del cerebro central y la fluorescencia de
tirosina hidroxilasa (TH) para cerebros adultos. Se tomaron imágenes adicionales de cerebros
larvales con el objetivo 10X / 0.3 DIC para obtener imágenes que incluyeran hemisferios
cerebrales y un fondo único para ambos hemisferios. Estas imágenes se utilizaron para el área
del hemisferio cerebral larvario y las mediciones de fluorescencia de TH.

Análisis de imagen

El análisis de la imagen se realizó en Fiji ImageJ 1.51a. Los hemisferios cerebrales adultos o
larvales dañados se excluyeron del análisis. De manera similar, los cerebros adultos o larvales
en los que identificamos problemas de penetración de anticuerpos basados en la tinción
uniforme entre hemisferios y / o la falta de tinción en grupos conocidos en los cerebros de
control se excluyeron del recuento neuronal TH positivo (TH +) y la fluorescencia de TH análisis
de nivel. Los niveles de fluorescencia de TH se cuantificaron dentro de una región de interés
dibujada alrededor del cerebro central adulto o de los hemisferios individuales del cerebro
larvario. La fluorescencia total de la tinción de TH en esta región se normalizó con respecto al
fondo. Los niveles de TH se informan como "fluorescencia de TH corregida", que se determinó
mediante la adaptación de un procedimiento de "fluorescencia total de células corregida"
descrito anteriormente. Brevemente, la densidad integrada, el área y el valor de gris medio se
midieron en las regiones de interés con el complemento de "Medida" de Fiji en proyecciones de
intensidad máxima con un contraste mejorado del 0,4% para que los bordes de cada cerebro
fueran claramente visibles. Los niveles de tinción de TH de fondo se determinaron en una región
rectangular de interés fuera del cerebro adulto o del cerebro larvario. El nivel de fluorescencia
TH para los cerebros larvales se midió dentro de una región de interés dibujada alrededor de
cada hemisferio por separado usando la herramienta de selección de polígonos. Para los
cerebros adultos, se dibujó una región de interés alrededor del cerebro central, excluyendo los
lóbulos ópticos, utilizando la herramienta de dibujo a mano alzada. La fluorescencia cerebral se
midió en unidades arbitrarias. Dividimos la fluorescencia corregida por 1000, como se indica en
el eje Y de los gráficos que representan estos resultados en la Fig. 3. Las agrupaciones
dopaminérgicas se identificaron de acuerdo con Mao y Davis para cerebros adultos y Selcho et
al, para los cerebros larvales. Se dibujaron regiones de interés en una imagen de proyección
máxima del cerebro para identificar grupos individuales. Estas regiones de interés se guardaron
y se usaron como un marco dentro del cual se contabilizaron las neuronas para cada grupo. Los
recuentos se realizaron a simple vista, pasando por la pila confocal lentamente para resolver
cuando una neurona comenzó y terminó. Las neuronas se contaron utilizando la herramienta
multipunto con el tamaño de punto más pequeño y sin etiquetado seleccionado. Cada contraste
de imagen se mejoró en 0.001%, para ver neuronas individuales. Las imágenes de cerebros de
moscas control o expuestas a la nicotina se contaron a ciegas.
Análisis estadístico

Los valores mostrados son media ± error estándar de la media (SEM). El texto de la leyenda de
la figura informa el número de muestras, el número de experimentos independientes y la prueba
estadística utilizada para cada conjunto de datos. El tamaño de la muestra por experimento se
presenta de la siguiente manera: n = número de muestras por condición de n = número de
experimentos independientes. La "muestra" para cada experimento se define en la leyenda de
la figura correspondiente. Las comparaciones estadísticas se llevaron a cabo en SPSS (versión
24). Las diferencias estadísticamente significativas a un nivel de significación de p <0,05 fueron

Se utiliza para determinar las diferencias entre el control y las condiciones experimentales. Los
datos se analizaron con pruebas paramétricas o no paramétricas según el resultado de la prueba
de Levene de igualdad de varianza. Si las variaciones no fueron significativamente diferentes, se
utilizó la prueba t de Student para determinar las diferencias entre el control y la condición
experimental. Si las variaciones eran significativamente diferentes, se utilizó la prueba U de
Mann-Whitney. Cuando se compararon más de dos condiciones, utilizamos la prueba no
paramétrica de Kruskal-Wallis seguida de comparaciones por pares ajustadas para
comparaciones múltiples. Los asteriscos en los gráficos denotan los niveles de significación de la
siguiente manera; uno para p <0.05, dos para p <0.01, tres para p <0.001.

Resultados

Para determinar los efectos de la nicotina en el tamaño del cerebro y en el desarrollo del sistema
dopaminérgico en el cerebro de la mosca de la fruta, expusimos Drosophila melanogaster a la
nicotina durante el desarrollo desde el huevo hasta la larva y el adulto. Luego utilizamos la
inmunohistoquímica para visualizar el cerebro y las neuronas dopaminérgicas en los cerebros
del 3er larvas de instar y moscas de la fruta adultas, que cuantifican varias características para
determinar los efectos de la exposición al desarrollo de la nicotina (Fig. 1a).

Para examinar si la exposición al desarrollo de la nicotina tiene un efecto en el sistema

dopaminérgico, primero confirmamos que el protocolo de exposición a la nicotina había sido
efectivo. Cabe señalar que la exposición al desarrollo de la nicotina fue continua desde el huevo
hasta la larva del tercer estadio, o desde el huevo hasta 3-4 días después de la eclosión. Por lo
tanto, cuando nos referimos a la "exposición al desarrollo de la nicotina" para adultos, esto
abarca desde el embrión hasta la vida temprana. Se ha demostrado previamente que la
exposición a la nicotina del desarrollo disminuye la supervivencia y aumenta el tiempo de
desarrollo en Drosophila melanogaster. Por lo tanto, esperábamos que las moscas con
exposición a la nicotina en el desarrollo en nuestros experimentos tuvieran igualmente una
disminución significativa en el número de moscas que sobrevivieron hasta la edad adulta y
exhibieran un retraso en el desarrollo en comparación con las moscas cultivadas en un medio
sin nicotina. Como se anticipó, hubo un efecto significativo de la nicotina en la supervivencia y
el retraso del desarrollo (Fig. 1b, c). Menos moscas alcanzaron la edad adulta cuando se criaron
en un medio que contenía nicotina (74.9 ± 3.1 moscas cerradas en control versus 20.7 ± 1.8 en
nicotina; n = 64 viales para control y n = 95 viales para nicotina; p <0.001) y tomaron
significativamente más tiempo (11.5 ± 0.1 días a 50% de eclosión en control versus 12.5 ± 0.1 en
nicotina; n ≥ 64 viales; p <0.001) para alcanzar 50% de eclosión (ET50). Esto indica que la
exposición al desarrollo de nicotina fue efectiva.

La exposición al desarrollo de la nicotina aumenta el área larvaria del cerebro Se ha demostrado

previamente que la nicotina prenatal en ratones disminuye el tamaño del cerebro del recién
nacido, pero esta diferencia ya no se detectó en el día 10 postnatal. Otros estudios han
encontrado un efecto de la exposición prenatal a la nicotina en el tamaño del cerebro en el día
21 postnatal. Nuestro objetivo fue determinar si la exposición al desarrollo de la nicotina puede
afectar el tamaño del cerebro en Drosophila melanogaster en dos etapas de desarrollo, larvas
del tercer estadio y adultos. Las moscas se criaron en alimentos de control o de nicotina y se
recolectaron en larvas del tercer estadio o 4 días después de la eclosión para moscas adultas.
Los cerebros fueron diseccionados e inmunotenidos para Bruchpilot (anti-BRP), que marca zonas
activas sinápticas en todo el cerebro, y se midió el área del cerebro. El área del hemisferio
cerebral larvario aumentó significativamente (0.021 ± 0.0007 mm2 en control versus 0.028 ±
0.0009 mm2 en nicotina; n = 35 hemisferios cerebrales para control y n = 28 hemisferios
cerebrales para nicotina; p <0.001) en moscas criadas en nicotina ( Fig. 2a). Sin embargo, no
encontramos diferencias estadísticamente significativas en el área central del cerebro (0.039 ±
0.0015 mm2 en el control frente a 0.036 ± 0.0012 mm2 en la nicotina; n = 24 cerebros para el
control y 21 cerebros para la nicotina; p = 0.194) en la etapa adulta (Fig. 2b). Estos resultados
muestran que la exposición al desarrollo de la nicotina tiene un efecto en el tamaño del cerebro
en la etapa larvaria, pero no en la etapa adulta en Drosophila melanogaster.

La exposición al desarrollo de la nicotina disminuye los niveles generales de tirosina hidroxilasa

en cerebros adultos pero no en larvas

Se ha demostrado que la nicotina prenatal altera los niveles de dopamina en el cerebro de los
mamíferos. La mayoría de estos estudios.

en los sistemas de mamíferos se utilizó un enfoque bioquímico para detectar cambios en los
niveles de dopamina, midiendo los metabolitos de la dopamina en el cerebro completo o en
homogéneos de la región del cerebro. En Drosophila, los cambios generales en la expresión de
los neurotransmisores después de la exposición al fármaco se han detectado con éxito utilizando
inmunohistoquímica. Por lo tanto, utilizamos un enfoque inmunohistoquímico para determinar
si la exposición al desarrollo de la nicotina tiene un efecto en la expresión de dopamina en
cerebros de larvas del tercer estadio o cerebros de moscas adultas de moscas criadas en
alimentos de control o de nicotina. Se inmunizaron los cerebros de larvas o adultos para la
tirosina hidroxilasa (TH) en lugar de la dopamina, porque la enzima TH, la enzima limitante de la
velocidad para la síntesis de dopamina, es un marcador para las neuronas dopaminérgicas en
Drosophila melanogaster. Los niveles de fluorescencia de densidad integrada se normalizaron
con respecto al fondo y se informaron como fluorescencia TH corregida. Mientras que los niveles
de TH en el estado larvario se elevaron moderadamente para las larvas criadas con nicotina
(317.92 ± 22.94 fluorescencia en unidades arbitrarias en control vs. 392.74 ± 36.61 en nicotina;
n = 18 hemisferios cerebrales para control y n = 22 hemisferios cerebrales; p = 0.089) (Fig. 3a),
los niveles de TH fueron significativamente más bajos en los cerebros centrales adultos de las
moscas criadas con nicotina (278.24 ± 35.31 fluorescencia en unidades arbitrarias en control
versus 190.75 ± 24.88 en nicotina; n = 10 cerebros para control y n = 17 cerebros para la nicotina;
p <0.05) (Fig. 3b). Estos datos muestran que la exposición al desarrollo de nicotina a la
concentración probada no tuvo un efecto estadísticamente significativo en los niveles generales
de TH en la etapa larvaria, pero disminuyó significativamente los niveles en la etapa adulta.
La exposición al desarrollo de la nicotina no tiene efecto en la cantidad de neuronas TH + en los
cerebros larvales

Los resultados anteriores indican que la exposición al desarrollo de la nicotina afecta la

estructura cerebral general y la expresión general de TH en diferentes etapas de desarrollo. A
continuación, examinamos los cambios en la expresión de dopamina a nivel celular mediante la
determinación de la influencia de la exposición a la nicotina del desarrollo en el número de
neuronas en los núcleos dopaminérgicos individuales. Contamos todas las neuronas TH positivas
(TH +) por grupo en los hemisferios cerebrales larvales de moscas criadas en control o en
alimentos de nicotina. Los cerebros larvales se tiñeron conjuntamente con un anticuerpo anti-
TH para visualizar neuronas dopaminérgicas y un anticuerpo anti-BRP como tinción de fondo
para todo el cerebro (Fig. 4a-c). Los grupos dopaminérgicos DM, DL1 y DL2 se identificaron en
base a una caracterización previa.

El número de neuronas por grupo que contamos en las imágenes de los cerebros de control fue
comparable a los números informados previamente para estos grupos. La exposición al
desarrollo de la nicotina no tuvo un efecto estadísticamente significativo en el número de
neuronas TH + en la DM (11.4 ± 0.6 neuronas en el control frente a 12.7 ± 1.4 en la nicotina; p =
0.4), DL1 (7 ± 0.3 neuronas en el control frente a 7 ± 0,6 en nicotina; p = 1) o DL2 (6,2 ± 0,4
neuronas en control frente a 5,9 ± 0,3 en nicotina; p = 0,6; para DM, DL1 y DL2 n = 19 hemisferios
cerebrales para el control y n = 15 hemisferios cerebrales para la nicotina ) agrupamientos (Fig.
4d-f). Estos resultados muestran que la exposición al desarrollo de la nicotina no afectó el
número de neuronas TH + en la etapa larvaria.

La exposición al desarrollo de la nicotina disminuye el número de neuronas TH + en el grupo de

PPM3 de adultos

El hallazgo de que la exposición a la nicotina disminuyó la fluorescencia total de TH (Fig. 3b)

sugiere que puede haber cambios en el número de neuronas TH + en la etapa adulta. Por lo
tanto, investigamos si la exposición a la nicotina en el desarrollo tenía un efecto sobre el número
de neuronas TH + en los grupos dopalérgicos adultos. Los cerebros de los adultos se tiñeron
conjuntamente con un anticuerpo anti-TH para visualizar neuronas dopaminérgicas y un
anticuerpo anti-BRP como tinción de fondo (Fig. 5). Los grupos dopaminérgicos se identificaron
en función de una caracterización previa. El número de neuronas que detectamos en cerebros
de moscas criadas en alimentos de control fue similar a lo que se mostró anteriormente.
Primero, cuantificamos si la exposición al desarrollo de la nicotina cambió el número de células
TH + en los grupos dopaminérgicos anteriores, PAM (Fig. 5a-c, 88.7 ± 3.3 neuronas en control
vs. 84 ± 3.9 en nicotina; p = 0.5) y PAL (Fig. 5a-c, 4,9 ± 0,2 neuronas en control frente a 4,8 ± 0,2
en nicotina; p = 0,9). Nuestros resultados muestran que no hubo una diferencia significativa en
el número de neuronas TH + en los grupos dopaminérgicos anteriores entre el control y los
cerebros tratados con nicotina.

A continuación, determinamos el efecto de la exposición a la nicotina del desarrollo en los

grupos dopaminérgicos posteriores. Encontramos que el número de neuronas TH + no fue
significativamente diferente en las moscas expuestas a la nicotina en el PPM1 (Fig. 5d-f, 1.5 ±
0.2 neuronas en el control vs. 1.7 ± 0.2 en la nicotina; p = 0.4), PPM2 (Fig. 5d -f, 7.5 ≥ 0.6 neuronas
en control vs. 6.6 ≥ 0.3; p = 0.2), PPL1 (Fig. 5d-f, 9.9 ± 0.3 neuronas en control vs 8.3 ± 0.6 en
nicotina; p = 0.2), PPL2ab (Fig. 5d -f, 5,3 ± 0,5 neuronas en control frente a 5 ± 0,3 en nicotina; p
= 0,7), y grupos de PPL2c (Fig. 5d-f, 1,6 ± 0,2 neuronas en control frente a 1,7 ± 0,1 en nicotina;
p = 0,5). Sin embargo, detectamos una disminución significativa en el número de neuronas TH +
en el grupo PPM3 (Fig. 5d-i, 7 ± 0.6 neuronas en control versus 3.2 ± 0.5 en nicotina; p <0.001;
n = 20 hemisferios cerebrales para control y n = 34 hemisferios cerebrales para la nicotina para
cada uno de los grupos dopaminérgicos adultos. Estos resultados muestran que la exposición al
desarrollo de la nicotina tuvo un efecto específico de grupo en el sistema dopaminérgico adulto
del cerebro de Drosophila.

Discusión

Nuestros resultados demuestran que Drosophila melanogaster puede ser un organismo modelo
para el estudio de una variedad de efectos de la exposición al desarrollo de la nicotina. Mientras
que el trabajo previo mostró una disminución en la supervivencia inducida por la nicotina,
desarrollo retardado y sensibilidad disminuida a la exposición aguda a la nicotina y al etanol en
la edad adulta, aquí mostramos grandes cambios estructurales en el sistema nervioso y efectos
celulares después de la exposición al desarrollo a la nicotina. Específicamente, encontramos que
el desarrollo de la exposición a la nicotina causó un aumento en el área del hemisferio cerebral
de los cerebros larvarios sin afectar el tamaño del cerebro en los adultos. La nicotina también
causó una disminución en la fluorescencia de la tinción de TH en la etapa adulta, pero no hubo
cambios en la etapa larvaria. Además, la nicotina causó una disminución en el número de
neuronas TH + en un grupo dopaminérgico adulto, PPM3, sin cambiar significativamente ningún
otro núcleo adulto o cualquiera de los grupos larvales dopaminérgicos. Por último, validamos un
papel para Dα7 en la promoción de la disminución de la supervivencia durante la exposición a la
nicotina e identificamos un posible papel para los nAChR que no contienen Dα7 en la mediación
del efecto de la nictina en el tamaño del cerebro larvario.

Efecto de la exposición prenatal a la nicotina en el tamaño del cerebro

Aquí mostramos que la exposición al desarrollo de la nicotina aumentó el área del cerebro en
los cerebros larvales en un 30%, pero esta diferencia no persistió hasta la edad adulta en
Drosophila melanogaster (Fig. 2). Existe un precedente para un aumento en el tamaño del
cerebro como resultado de la exposición prenatal a la nicotina en ratas Long Evans en el día 21
postnatal. Sin embargo, este efecto difirió en las mujeres frente a los hombres. Si bien hubo un
aumento en el tamaño del cerebro en las mujeres, se observó una disminución en los hombres.
Esta fue la única etapa probada, por lo que no se sabe si este efecto estuvo presente antes en el
desarrollo y persistió, ni si este efecto habría desaparecido en etapas posteriores. El presente
estudio no distinguió entre larvas femeninas y masculinas. Sería interesante determinar si la
exposición al desarrollo de la nicotina tiene diferentes efectos en las mujeres frente a los
hombres en una investigación de seguimiento.

Otros estudios también han reportado disminuciones en el tamaño del cerebro en ratones. Sin
embargo, hay variaciones en la etapa o etapas de desarrollo cuando se observó la disminución
en el tamaño del cerebro. Por ejemplo, un estudio mostró que la exposición prenatal a la
nicotina en ratones disminuyó el peso del cerebro y la longitud del cerebro al nacer. Sin
embargo, estas diferencias no persistieron y ya no se detectaron en los días postnatales 10, 20
o 50. Un estudio diferente en ratas Sprague-Dawley mostró reducciones en el peso para regiones
específicas del cerebro (cerebro medio / tronco cerebral, corteza y cerebelo) después de la
exposición prenatal a la nicotina que se pudo detectar en varios puntos temporales postnatales,
pero que ya no se detectaron en la quinta semana de desarrollo postnatal. Nuestros datos
coinciden con estos estudios en que demostramos que el tamaño del cerebro se ve afectado por
la exposición a la nicotina en el desarrollo en etapas tempranas del desarrollo, pero esta
diferencia ya no se detecta más adelante en el desarrollo. los

Las diferencias en la etapa específica de desarrollo en la que la exposición al desarrollo de la

nicotina tuvo un efecto sobre el tamaño del cerebro, la duración de este efecto y si el efecto
observado fue un aumento o una disminución en el tamaño del cerebro puede deberse a
variaciones en el protocolo de exposición a la nicotina. Diferencias de dosis, cepas o especies, o
etapa de desarrollo probada. A pesar de estas disparidades en los resultados específicos, se
puede concluir que la exposición al desarrollo de la nicotina afecta el tamaño del cerebro en una
etapa temprana del desarrollo en múltiples especies.

Los mecanismos moleculares subyacentes a los cambios en el tamaño del cerebro no se conocen
bien. Slotkin et al., (1987) propusieron que la disminución en el peso de la región cerebral que
mostraron es parte de un retraso general en el desarrollo causado por la exposición prenatal a
la nicotina, que se resuelve con el tiempo suficiente para que las crías se recuperen. Sin
embargo, los mecanismos moleculares para este retraso en el desarrollo no son bien conocidos.
Los estudios que se centran en los cambios a nivel celular han identificado cambios en la
composición celular después de la exposición prenatal a la nicotina, con un aumento en la glía y
una disminución en el área neuronal acoplada a un aumento en la densidad neuronal. Estos
resultados apuntan hacia un mecanismo que involucra la regulación de la diferenciación y
proliferación celular.

Efecto de la exposición prenatal a la nicotina en los niveles de dopamina.

Nuestros resultados muestran que los niveles de TH disminuyeron con la exposición al desarrollo
de nicotina en Drosophila melanogaster en moscas adultas. No se encontraron diferencias en la
3ª etapa de larva de estadio (Fig. 3). Estos resultados son consistentes con los estudios que han
encontrado una correlación entre la exposición prenatal a la nicotina y la disminución de los
niveles de dopamina. Sin embargo, estudios previos han mostrado disparidades en los efectos
de la exposición a la nicotina prenatal en los niveles de dopamina, dependiendo de la región del
cerebro estudiada y las etapas de desarrollo estudiadas. Un estudio encontró una reducción en
el contenido de dopamina en la corteza cerebral de rata después de la exposición prenatal a la
nicotina que fue mayor después del nacimiento y se disipó por destete. Este estudio no incluyó
estadios fetales. Otro estudio midió los niveles de dopamina después de la exposición prenatal
a la nicotina y no informó cambios en los niveles de dopamina en el cerebro anterior de las ratas
en el día gestacional 18, un aumento en los niveles de dopamina en el día 15 postnatal y ninguna
diferencia en las 10 semanas de edad. Un estudio diferente no encontró cambios en los niveles
de dopamina en la corteza frontal después de la exposición prenatal a la nicotina en el día 22
postnatal. Sin embargo, este estudio mostró cambios en los niveles de dopamina en otras
regiones del cerebro, como el cuerpo estriado, el núcleo accumbens, el VTA y la sustancia negra,
que disminuyeron o aumentaron según la concentración de nicotina analizada y si las crías
habían desarrollado hiperactividad después de la nicotina prenatal. exposición. Al contrastar
estos resultados, otro estudio no encontró diferencias en los niveles de dopamina en el estriado
ni en el hipotálamo, pero disminuyó los niveles de dopamina en el neocórtex y en la mitad del
cerebro y la posmedulla en los cerebros de de ratas adultas jóvenes sometidas a eutanasia a las
8–9 semanas de edad

Un estudio más reciente en ratones mostró un aumento en los niveles basales de dopamina en
la corteza frontal, pero no hubo diferencias en el cuerpo estriado en el día postnatal 42 después
de la exposición prenatal a la nicotina. También en ratones, un par de estudios realizados por
un grupo diferente informaron niveles reducidos de dopamina en la corteza prefrontal de
ratones en los días 28 y 56 postnatales mediante HPLC y extendieron estos resultados al medir
los niveles basales de dopamina mediante microdiálisis en ratones en los días postnatales 56 a
63. Como lo demuestran los estudios mencionados anteriormente, los efectos exactos de la
exposición a la nicotina en el desarrollo informados en la literatura varían, posiblemente debido
a las diferencias en el modo de exposición a la nicotina, las cepas y las diferencias de especies,
la etapa o etapas de desarrollo probadas y el cerebro. región analizada. Sin embargo, nuestros
resultados coinciden con estos estudios en el hecho de que se ha demostrado que la exposición
a la nicotina del desarrollo afecta los niveles de dopamina en el cerebro.

Los mecanismos que subyacen al efecto de la exposición al desarrollo de nicotina en los niveles
de dopamina no se conocen bien. Alkam et al. mostraron una disminución en las varices de TH
+ en la corteza prefrontal, que se asocian con la disminución de los niveles de dopamina medidos
por microdialisis. Estos resultados sugieren que la disminución de los niveles de dopamina
podría deberse a los cambios en la expresión de la dopamina a nivel celular, ya sea cambiando
el número de varices TH + por neurona o cambiando el número de neuronas dopaminérgicas TH
+. Sin embargo, estas cuantificaciones no se informaron.

Tomados en conjunto, estos estudios sugieren que el efecto de la exposición a la nicotina

prenatal en los niveles de dopamina refleja cambios a nivel celular que afectan el número de
células que expresan dopamina o el número de varices neuronales que tienen. La investigación
futura podría centrarse en identificar cómo la nicotina regula la proliferación, especificación y
diferenciación de las neuronas dopaminérgicas.

Efecto de la exposición prenatal a la nicotina en el número de neuronas TH +.

El presente estudio cuantificó el número de neuronas TH + en cerebros de moscas criadas con

alimentos de control o nicotina y encontró una disminución en el número de neuronas TH + en
un grupo de adultos, PPM3, 4 días después de la eclosión, que es la edad adulta temprana para
Drosophila melanogaster.
Pocos estudios en mamíferos han cuantificado los cambios en el número de neuronas
dopaminérgicas después de la exposición prenatal a la nicotina. Un estudio cuantificó el número
de células TH + en la sustancia negra y VTA de cerebros de ratas adultas después de la exposición
prenatal a la nicotina y no encontró ningún efecto en los días postnatales 75 u 82. Alkam et al,
al que se hace referencia en la sección anterior, no contó el número de neuronas TH +, sino que
se centró en el número de varicosidades axonales TH + de las neuronas dopalérgicas del cerebro
medio después de la exposición prenatal a la nicotina en

Cerebros de ratones en el día 44 postnatal. Contaron menos varicosidades TH + en la corteza

prefrontal y el núcleo pulmonar, pero no cambios en el estriado después de la exposición
prenatal a la nicotina. La disminución en las varices axónicas puede haber reflejado una
disminución en las neuronas TH +, pero esto no se investigó.

Otros estudios han mostrado cambios en el número de neuronas dopaminérgicas en ratas

después de la exposición prenatal o perinatal a otros compuestos, como los glucocorticoides.
Estos estudios sugieren que la cantidad de neuronas dopaminérgicas es altamente plástica.
Además, la noción de neuronas dopaminérgicas como una población plástica se ha mostrado
anteriormente en el contexto de la investigación sobre la especificación de neurotransmisores
dependiente de la actividad. Varios estudios han informado cambios en el número de neuronas
dopaminérgicas que dependen de la actividad.

En Drosophila melanogaster, no encontramos efecto de la exposición prenatal a la nicotina en

la etapa larvaria. Sin embargo, un grupo de adultos dopaminérgicos, PPM3, se vio afectado por
la exposición prenatal a la nicotina. PPM3 es un grupo protoperebral posteror dopaminérgico
medial con proyecciones neuropil principales que van a una estructura en el cerebro de
Drosophila llamada complejo central. El complejo central es un neuropil involucrado en la
locomoción, la memoria para los objetos visuales, el sueño, la excitación inducida por el
sobresalto, la vigilia y la agresión. De estos comportamientos, la dopamina, y específicamente
las neuronas del grupo PPM3, han estado involucradas en la locomoción inducida por etanol, la
vigilia y la agresión. Se ha demostrado que el grupo PPM3 tiene menos neuronas TH + en los
modelos de Drosophila de la enfermedad de Parkinson. Sin embargo, ha habido discrepancias
en los informes que muestran cambios en las neuronas dopaminérgicas en los modelos de
enfermedad de Drosophila Parkinson. Navarro et al, no encontraron cambios estadísticamente
significativos en el número de células dopaminérgicas, pero encontraron disminuciones
significativas en los niveles de dopamina, evaluados a través de un informador de GFP bajo el
control del promotor TH. Kong et al, también muestran evidencia de que el grupo PPM3 tiene
un papel en un comportamiento inducido por fármacos, la locomoción inducida por etanol, lo
que hace que este grupo sea un buen candidato para mediar los efectos conductuales de la
exposición al desarrollo de la nicotina. En conjunto, estos estudios sugieren que las neuronas
dopaminérgicas, incluida la agrupación PPM3, en Drosophila son una población plástica.

No determinamos si la disminución en las neuronas PPM3 observada con la exposición al

desarrollo de la nicotina resultó de la pérdida de TH o la pérdida de las neuronas en la región del
clúster PPM3. Podría haber dos mecanismos diferentes en juego: 1) neurotoxicidad, que resulta
en la muerte celular, que se asemejaría a un modelo de Parkinson, o 2) plasticidad del
neurotransmisor, en la cual las neuronas cambiarían la expresión del neurotransmisor a otra
diferente. Hay evidencia de que las neuronas dopaminérgicas pueden aumentar o regular hacia
abajo la expresión de TH dentro de agrupaciones dopaminérgicas específicas después de la
activación crónica. También se ha demostrado que las neuronas dopaminérgicas coexpresan
otros neurotransmisores, como NPY y GABA. El cambio de neurotransmisores dependiente de
la actividad es un fenómeno bien documentado. Será interesante determinar qué mecanismo
subyace a la disminución de las neuronas PPM3 TH + después de la exposición al desarrollo de
la nicotina.

Participación de los nAChR en los efectos de la nicotina del desarrollo en la eclosión y el tamaño
del cerebro

La acetilcolina es el principal neurotransmisor rápido en los insectos y Drosophila tiene 10 genes

que codifican las subunidades nAChR. La nicotina actúa sobre los nAChR, que están relacionados
con la proliferación, diferenciación, maduración y supervivencia celular en el desarrollo del
sistema nervioso. Bloqueamos los nAChR para determinar su posible papel en los efectos de la
exposición a la nicotina del desarrollo, pero el bloqueo de los nAChR con el bloqueador no
selectivo mecamilamina o con el bloqueador más selectivo α-bungarotoxin dio lugar a
disminuciones significativas en la supervivencia (Fig. 6a). Además, el bloqueo de los nAChR
durante la exposición al desarrollo de la nicotina afectó la eclosión al mismo nivel que el
tratamiento con nicotina solo (Fig. 6b). Sin embargo, notamos una disminución del 70% en la
eclosión entre 100 nM α-bungarotoxin por sí sola y 100 nM α-bungarotoxin con nicotina, en
comparación con el 94% de la eclosión entre 10 nM α-bungarotoxin por sí sola y 10 nM α-
bungarotoxin con nicotina. Esto sugiere que la mayor dosis de α-bungarotoxina mejoró
ligeramente el efecto de la exposición al desarrollo de la nicotina en la eclosión, lo que podría
indicar que los nAChR bloqueados por la α-bungarotoxina median los efectos de la nicotina en
la eclosión.

Se ha demostrado que la α-bungarotoxina se une a la subunidad Dα5, que puede formar canales
heteroméricos con las subunidades Dα7. En Drosophila, se demostró previamente que Dα7
estaba involucrado en el efecto sobre la supervivencia y el retraso del desarrollo causado por la
exposición al desarrollo de la nicotina. Nuestros resultados coinciden con estos hallazgos, ya que
no hubo diferencias en la eclosión entre las moscas Dα7mut criadas en el control o en los
alimentos con nicotina (Fig. 6c). Por lo tanto, Dα7 es necesario para la supervivencia reducida
en la exposición al desarrollo de la nicotina mostrada por las moscas con Dty7 de tipo salvaje.

Luego, probamos si Dα7 medía el efecto de la nicotina en el desarrollo del cerebro. Nuestros
resultados sugieren que Dα7 no participa en la regulación del tamaño normal del cerebro, dado
que las moscas sin una copia funcional del gen, Dα7mut, tenían cerebros de larvas o adultos con
un tamaño similar al del cerebro de la cepa de control genético Dα7WT (Fig. 6d, e ). No
observamos un efecto de la nicotina del desarrollo en la concentración de 0,1 mg / ml en la cepa
Dα7WT. La falta de efecto de la nicotina del desarrollo en los cerebros de larvas Dα7WT puede
explicarse por las diferencias en la dosis de nicotina utilizadas en cada conjunto de experimentos
o en el fondo genético entre las moscas wB y las cepas Dα7. Por ejemplo, el tamaño de la hemi-
esfera del cerebro larvario de wB y Dα7WT fue considerablemente diferente (0,021 mm2 frente
a 0,014 mm2, respectivamente). Cabe señalar que las moscas Dα7WT son muy sensibles a la
exposición a la nicotina, con una disminución del 93% en la eclosión en los alimentos con
nicotina. Por lo tanto, los sobrevivientes del tratamiento pueden ser inmunes a algunos de los
efectos del desarrollo del tratamiento con nicotina a través de mutaciones de novo. Sin
embargo, Dα7mut tuvo un aumento de alrededor del 50% en el área del hemisferio cerebral
larval después de la exposición al desarrollo de la nicotina, lo que sugiere que Dα7 no es
necesario para el aumento inducido por la nicotina en el tamaño del cerebro larvario. Se deduce
que la activación de nicotina de otros nAChR que no contienen Dα7 podría ser suficiente para
transmitir la señal para aumentar el tamaño del cerebro larvario. Sería interesante determinar
las contribuciones específicas de diferentes nAChR en futuras investigaciones.

Conclusiones.

El abuso de la nicotina es un problema de salud importante en todo el mundo y, a pesar del

conocimiento generalizado de las consecuencias de fumar, muchas mujeres continúan fumando
durante el embarazo o están expuestas a la nicotina mediante la terapia de reemplazo de
nicotina o el uso de cigarrillos electrónicos. La investigación actual está abordando los cambios
en el desarrollo inducidos por la nicotina a nivel genético, molecular y celular, y cómo esos
cambios resultan en consecuencias de comportamiento a largo plazo.

Hemos demostrado que la exposición al desarrollo de la nicotina en Drosophila melanogaster

afecta el sistema dopaminérgico. Estos efectos se detectaron a una concentración de nicotina
que en las moscas ha demostrado afectar el desarrollo normal y disminuir su sensibilidad a la
exposición aguda a la nicotina y al etanol en la edad adulta. En general, encontramos cambios
en el área del cerebro, los niveles de TH y la cantidad de neuronas TH + que eran específicas de
la etapa y del clúster. La exposición al desarrollo de la nicotina aumentó el área del hemisferio
cerebral larvario del tercer estadio, disminuyó los niveles generales de TH en los cerebros
adultos y disminuyó el número de neuronas TH + en el grupo dopalérgico de adultos PPM3.
También confirmamos los resultados anteriores de que Dα7 medió los efectos de la nicotina del
desarrollo en la supervivencia, mientras que no parece desempeñar un papel en el tamaño
normal del cerebro. Nuestros resultados sugieren que los receptores no Dα7 median el efecto
de la nicotina en el tamaño del cerebro larvario.

Estos cambios en el sistema dopaminérgico podrían tener consecuencias en los

comportamientos mediados por este sistema de neurotransmisores, como la recompensa y las
respuestas a los medicamentos. Además, se han notificado alteraciones en núcleos
dopaminérgicos específicos en el cerebro de los mamíferos después de la exposición prenatal a
la nicotina, aunque no se conocen los mecanismos subyacentes para estas alteraciones. Hay
conservación a nivel genético y molecular en los procesos de desarrollo desde Drosophila hasta
un orden superior de los organismos. Los estudios de desarrollo en mamíferos toman más
tiempo y son más costosos que los estudios de desarrollo en moscas de la fruta. Un modelo de
Drosophila para la exposición a la nicotina en el desarrollo será muy valioso para contribuir a
dilucidar los genes y las vías de señalización que conducen a los efectos de la nicotina que se
han descrito. Drosophila es un organismo modelo poderoso para estudiar los efectos de las
drogas. Dados los efectos específicos de la exposición a la nicotina del desarrollo, hemos
caracterizado en el sistema dopaminérgico una investigación más profunda en los mecanismos
genéticos, celulares y moleculares subyacentes para la exposición de la nicotina en el desarrollo
en Drosophila ofrecerá una opción viable para un descubrimiento más rápido y complementario.
Lo que se ha logrado utilizando otros sistemas modelo.