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La biodegradabilidad intrínseca de los hidrocarburos y la distribución del dominio

En el presente estudio, las capacidades de biodegradación de los consorcios bacterianos

nativos hacia el petróleo total hidrocarburos (TPH) con especial énfasis en hidrocarburos Poly
aromáticos fueron determinado.
El objetivo del estudio fue aislar las cepas bacterianas degradantes de TPHde varios suelos
Introducción
sustancias tóxicas
incluyendo la mezcla compleja de alifáticos, compuestos aromáticos, nitrógeno,
sulfuro, metales etc. en la cadena alimenticia

). Debido a su compleja naturaleza química, el petróleo

posee la capacidad de provocar múltiples tipos de efectos tóxicos. Se puede
causar toxicidad aguda letal, toxicidad crónica subletal o ambos
dependiendo de la exposición, la dosificación y el organismo expuesto.
Algunos de los componentes del petróleo tienen el potencial de
Bio-acumule dentro de los organismos acuáticos susceptibles y puede ser
transferido al nivel subsiguiente de la cadena alimenticia por la
Transfer (Orisakwe et al., 2004).

4 El éxito de las tecnologías de biorremediación depende de la

las capacidades biodegradantes de las poblaciones microbianas nativas
los microorganismos de aplicación exógena no suelen realizar
en el nivel esperado en el ambiente extranjero

(Díaz-Ramírez
et al., 2003; Venosa y Zhu, 2003). Las comunidades indígenas
que fueron expuestos a los hidrocarburos llegan a ser conocidos,
exhibiendo enriquecimiento selectivo y modificaciones genéticas (Atlas
y Bartha, 1998). Las comunidades microbianas adaptadas pueden
responder a la presencia de contaminantes de hidrocarburos dentro de un
lapso de tiempo relativamente corto y exhiben una mayores tasas de biodegradación
que las comunidades sin antecedentes de exposición en
condiciones
4
requieren la cooperación de más de un solo
especie, porque un microorganismo individual puede generalmente
metabolizar sólo una gama limitada de sustratos de hidrocarburos.
5
El uso del petróleo en la agricultura dio origen a la Revolución Verde entre los años 40 y 70. En
este período se produjo un cambio radical en la agricultura mundial, ya que se introdujo la
maquinaria agrícola a gran escala, hubo una mejora en los sistemas de riego y se usaron
grandes cantidades de fertilizantes y pesticidas derivados del petróleo.
La tecnología de biorremediación no es intrusiva y tampoco exige componentes estructurales
o mecánicos que haga falta mencionar.

Desventajas
. A pesar
frustrados por numerosos factores como el
substrato obstinación y la solubilidad pobre de hidrofóbico
compuestos orgánicos en sistemas acuosos que limitan su
biodisponibilidad para la biodegradación
tienen la habilidad de secretar enzimas degradación importantes y
factores de crecimiento, mientras que otros pueden exponer la potencialidad de
producción de biosurfactante que conduce a la solubilización mejorada
de hidrocarburos hidrofóbicos para su mejor utilización por
Microbios

Los biosurfactantes son metabolitos anfipáticos activos en la superficie

producidos por ciertos microorganismos. El biosurfactante reduce
la tensión superficial (St) y la dilución micela crítica (CMD) en ambos
solución acuosa y mezclas de hidrocarburos, facilitando así la
la creación de micro-emulsiones con la formación de micela,
en el que los hidrocarburos pueden solubilizar en agua o agua en
hidrocarburos
a la concentración mínima de surfactante a partir de la cual se forman micelas
espontáneamente en una disolución.1
Las micelas tienen una parte hidrofóbica, que esta en el interior y otra hidrofílica en su
exterior. La gran ventaja esta en que pueden transportar moléculas insolubles en un medio
acuoso. Sin las micelas ninguna sustancia insoluble en agua podría transportarse a través de un
solvente polar como el agua.

(Banat et al., 2014). Los biosurfactantes son menos tóxicos

y más biodegradables que los tensioactivos sintéticos
Tal práctica
ofrecer la ventaja de un suministro continuo de biosurfactantes
a un bajo costo. También, la aplicación de microbios posando
capacidad coexistente y para degradar hidrocarburos junto con
la producción de biosurfactantes puede agilizar eficazmente la
biorremediación del medio ambiente contaminado con hidrocarburos (Kumar
et al., 2006). Además, las bacterias degradantes de hidrocarburos son
bien conocido por su capacidad para producir biosurfactantes in situ,
facilitando así su supervivencia en hidrocarburos contaminados
ambientes (Ganesh y Lin, 2009; Reddy et al., 2010).
Materiales y métodos
Un Consorcio Microbiano es una asociación natural de dos o más poblaciones microbianas, de
diferen tes especies, que actúan conjuntamente como una comunidad en un sistema
complejo, donde todos se benefician de las actividades de los demás.

Petróleo crudo, muestras del suelo, y productos químicos

El petróleo crudo fue obtenido de la refinería de Digboi, Assam, la India y
se ha utilizado durante todo el estudio.
Microorganismos
Para el aislamiento bacteriano, 1g de cada hidrocarburo contaminado
las muestras de suelo fueron inoculadas en medio de sal mineral (MSM) que contiene el 2%
(v/v) de petróleo crudo como fuente de carbono para el enriquecimiento.
10 ml de solución de oligoelementos que contiene (g l − 1): CuSO4 · 5H2O
(0,5), H3BO3 (0,26), (NH4) 6Mo7O24 · 4H2O (0,06), MnSO4 · 7H2O
(0,5) y ZnSO4 · 7H2O(0,7).
se ajustó el pH del medio a 7,0 ± 0,2.
Los frascos cónicos se incubaron a 35 ◦ C a 150 rpm durante 7 días. Después de 7 días, se
agregó 1 ml de inóculo a 100 ml de MSM fresco e incubado de nuevo bajo similares
condiciones para otros 7 días para disminuir los microbios no deseados carga.
Una vez más, después de 7 días 1 ml de los medios de cultivo, se utilizó para
dilución en serie seguida por la propagación de 100 µ l de 10 − 4
a 10 – 6 muestras diluidas en placas de agar nutrientes e incubación del
placas a 35 ◦ C durante 24 h. morfológicamente diferentes colonias fueron
entonces seleccionado y separadamente veteado en las placas de agar nutriente para
para obtener el cultivo puro de los aislados bacterianos. Los aislados fueron
mantenido en agar nutriente inclinado y preservado en el glicerol del 30%
almacenamiento a − 80 ◦ C incubadora.
Junto con estos aislantes, previamente reportados eficientes
cepa bacteriana degradante de hidrocarburos Bacillus pumilus KS2
(GenBank de acceso no. KF021245; Patowary et al., 2014) fue
también se incluye para otras experimentaciones.
Selección de hidrocarburos eficientes
Aislantes bacteriales degradantes
Las bacterias fueron seleccionadas dependiendo en su crecimiento en el petróleo crudo
enriqueció la condición. La proyección
. Al principio, los cultivos nativos de la misma densidad óptica (OD600 = 1,0) se preparó de
todos los aislados bacterianos en el caldo de nutrientes (NB). Para la proyección,
5 ml de cultivo de cada bacteria fue inoculada en
500 ml frascos erlenmeyer que contienen 100 ml de esterilizado
medio mineral enriquecido con el aceite crudo del 2% (v/v) y guardado
una incubadora agitadora por 7 días a 35 ◦ C y 200 rpm.
Un conjunto de frascos que contengan la misma composición de medios de cultivo
también se mantienen en las mismas condiciones que el control abiótico donde no
se añadieron inóculos. El crecimiento bacteriano en el medio de
cada frasco en el día 0 y 7 se estimó mediante la toma de óptica
densidad en 600 nm por el espectrofotómetro UV-Vis
Los aislados bacterianos que muestran el máximo se seleccionó el crecimiento en petróleo
crudo que contenía medios para consorcios
desarrollo.
Cribado para producción de biosurfactante
Bacterias
es un anglicismo utilizado para indicar una estrategia aplicada sobre una población para
detectar una enfermedad en individuos sin signos o síntomas de esa enfermedad
Se prepararon inóculos de semillas de los aislados bacterianos seleccionados
como se mencionó anteriormente. Una cantidad de 5 ml de inóculo madre
al. consorcio bacteriano para la remediación de hidrocarburos
fueron inoculados a Frascos Erlenmeyer de 500 ml que contenían 100 ml
MSM enriquecido con la glucosa del 2% (w/v) como la fuente del carbón
e incubado a 35 ◦ C con temblor a 200 rpm.
Producción de biosurfactante de los aislados bacterianos fue ensayado en términos
del análisis caida de gota y de la reducción del St(solidos totales) del medio de cultivo
Análisis de colapso de caída y tensión superficial
Medición
El análisis del derrumbamiento de gota fue realizado usando el petróleo crudo como
sustrato de hidrocarburos de forma ligeramente modificada
Como la intención principal de este estudio
fue la degradación del petróleo crudo, usamos el mismo crudo
substrato del hidrocarburo del aceite para este análisis. Un solo gota
de petróleo crudo se estableció en una diapositiva de vidrio, a raíz de lo cual
un solo gota de caldo de cultivo de 48-h crecido
en la actividad de caída y caída de petróleo crudo fue
observado.
La reducción del St de los caldos del cultivo fue medida después
cada 24 h hasta el 5º
Los caldos de cultivo se centrifugaron a
10000 rpm para 10 min y sobrenadante sin células filtradas
fueron utilizados para la determinación del St. Los aislantes que podrían
reduzca el St del medio de la cultura debajo de 35 Mn m − 1
fueron evaluados como productores eficientes de biosurfactante
el potente degradador de hidrocarburos previamente seleccionado
Desarrollo de consorcios de la
Bacterias seleccionadas
Diferentes consorcios fueron diseñados tomando hidrocarburos seleccionados
bacterias degradantes en los siguientes tres criterios,
(i) Combinación de productores y no productores de biosurfactante
cepas;
(II) combinación de sólo cepas de productores de biosurfactante;
y (III) combinación de sólo productor no-biosurfactante
cepa.
Selección del mejor consorcio
Se prepararon culturas maternas de todas las bacterias seleccionadas
aislantes en NB según el procedimiento antes mencionado. Para
Esta selección, los inóculos de semilla de 5 ml de cada consorcio
fue inoculado en un frasco erlenmeyer de 500 ml que contenía
100 ml de medio mineral esterilizado con crudo del 2% (v/v)
aceite cultivado en una incubadora de agitación a 35 ◦ C y 200 rpm
durante 1, 2 y 3 semanas. Para esto, los inóculos madre fueron
fueron preparados añadiendo la misma cantidad de respectivas bacterias
Cultura (OD600nm = 1,0) para diferentes consorcios y la final
el volumen para la inoculación se realizó hasta 5 ml. restante
petróleo crudo del caldo de cultivo después de cada incubación
el período fue extraído usando método de la extracción solvente por
diclorometano (DCM) y después de la evaporación solvente almacenado
en vaso de vidrio limpio previamente pesado. La cantidad de
petróleo crudo restante se determinó gravimétricamente y
así, la degradación del crudo por cada consorcio en diferentes
se calculó el tiempo de incubación. El porcentaje de degradación
de hidrocarburos se calculó siguiendo la fórmula
propuesto por Ganesh y Lin (2009), a lo largo del estudio.
Degradación de hidrocarburos (%) =
(peso del petróleo crudo residual en
el control abiótico − peso de
petróleo crudo residual en la muestra de la prueba)
_____________________________________________*100
Peso original de crudo
aceite introducido
Identificación de los miembros de
Consorcio seleccionado
El aislante R2 fue entonces identificado por
(1) estudiando el características morfológicas y fisiológicas (cappuccino
y Sherman, 1999)
(2) identificación bioquímica según
Manual de Bergey de la bacteriología sistemática (vos et al., 2009),
por (3) identificación molecular en la que el ADN genómico
de las bacterias fue extraída usando el protocolo estándar.