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IMPORTANCIA DE THIOBACILLUS CALDUS EN LA LIXIVIACIÓN DE SULFUROS

METÁLICOS

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Gustavo Curutchet Marisa Viera

CONICET. Consejo Nacional de Investigaciones Cientificas y Tecnicas. (National Sc… National Scientific and Technical Research Council
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Edgardo Donati
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 Jornadas SAM 2000 - IV Coloquio Latinoamericano de Fractura y Fatiga, Agosto de 2000, 1-6

IMPORTANCIA DE THIOBACILLUS CALDUS EN LA LIXIVIACIÓN

DE SULFUROS METÁLICOS
M. Semenza, G. Curutchet, M. Viera y E. Donati

Centro de Investigación y Desarrollo de Fermentaciones Industriales (CINDEFI-CONICET),

47 y 115 (1900) La Plata, Argentina

RESUMEN
En este trabajo se comprobó que las células de Thiobacillus caldus pueden participar en
los procesos de biolixiviación a través de la generación de ácido sulfúrico. Además, esta
bacteria solo es capaz de lixiviar eficazmente sulfuros metálicos puros cuando son
suficientemente solubles; de este modo, se lograron elevadas solubilizaciones de sulfuro de
cinc pero las biolixiviaciones de sulfuro de níquel y sulfuro de cobre alcanzaron
recuperaciones semejantes a los controles estériles. El mecanismo de ataque es,
probablemente semejante al de Thiobacillus thiooxidans, consistiendo fundamentalmente en
un primer ataque ácido abiótico sobre el sulfuro generando especies sulfuradas solubles que
son oxidadas por la bacteria hasta azufre elemental.

Palabras claves
Thiobacillus caldus, Biolixiviación, Sulfuros Puros, Azufre

INTRODUCCION
El género Thiobacillus comprende a bacterias capaces de obtener energía de la catálisis
oxidativa de compuestos reducidos de azufre utilizando oxígeno como último aceptor
electrónico. De este género, algunas especies acidófilas (resisten muy bajos valores de pH),
mesófilas (actúan a temperaturas intermedias) y autotróficas (utilizan CO2 como fuente de
carbono), tales como Thiobacillus ferrooxidans y Thiobacillus thiooxidans, han mostrado
sistemáticamente una acción importante en la solubilización de metales a partir de minerales
sulfurados de baja ley. Esta acción se produce por ataque directo sobre la matriz sulfurada o,
en el primer caso, por un mecanismo indirecto que implica la generación de un oxidante como
hierro(III) el cuál luego actúa abióticamente sobre el sulfuro [1,2].
Recientemente se ha aislado una nueva especie de Thiobacillus, denominada
Thiobacillus caldus, que se encuentra asociada esencialmente a minerales sulfurados de baja
ley [1,3-5]. Esta especie, al igual que otras habitualmente reconocidas por su acción lixiviante
tales como Thiobacillus ferrooxidans o Thiobacillus thiooxidans, es quimiolitotrófica,
autotrófica y acidófila pero el rango de temperaturas óptimo para su crecimiento es
ligeramente mayor al de aquellas. La presencia de grandes poblaciones de T. caldus en
explotaciones comerciales, sugiere que su relevancia en la lixiviación de sulfuros es mayor a
la supuesta hasta el momento. Previamente, T. caldus solo ha sido utilizado en experiencias
de biolixiviación en cultivos mixtos junto a bacterias hierro-oxidantes y siempre en presencia
de hierro de modo que se genere un agente oxidante como el hierro(III) capaz de atacar
abióticamente a los sulfuros [4].

1
 Semenza, Curutchet, Viera y Donati

En este trabajo, analizamos el crecimiento de poblaciones puras de T. caldus sobre

azufre elemental y el efecto biolixiviante de estos microorganismos sobre sulfuros metálicos
puros en diferentes densidades de pulpa y en ausencia de hierro adicionado.

PARTE EXPERIMENTAL
Las células de T. caldus fueron cultivadas en frascos agitados y termostatizados a 40 o C.
La cepa utilizada recibe la denominación ATCC 51756. El medio de cultivo utilizado es una
modificación del medio 9 K [6] y está compuesto por (NH4 )2 SO4 (3,0 g/l) Na2 SO4 .10H2 O (3,2
g/l), KCl (0,1 g/l), KH2 PO4 (0,05 g/l), MgSO4 .7H2 O (0,5 g/l) de pH inicial igual a 2,5 y con
10 % p/v de azufre elemental como fuente de energía. Los inóculos para las diversas
experiencias fueron obtenidos por filtración para eliminar el azufre residual, posterior
centrigufación y re-suspensión en medio estéril. La población bacteriana presente en las
suspensiones utilizadas como inóculo estuvo comprendida entre 2,1-2,7x108 células/ml.
En las experiencias de biolixiviación, se utilizaron como sustratos sulfuros sintéticos
puros en tamaño de polvo (CuS, NiS y ZnS) a tres densidades de pulpa diferentes, 0,10, 0,25
y 0,5 % p/v. Los cultivos fueron realizados en frascos de 500 ml con 150 ml del medio estéril
descripto, previamente inoculado al 10 % v/v. El pH inicial fue 2,5 y no fue controlado
durante la experiencia. Los frascos fueron agitados a 180 rpm y termostatizados a 40 o C. Los
controles estériles se prepararon reemplazando el inóculo por medio estéril.
En muestras periódicas, se determinó la concentración del metal respectivo por
espectrofotometría de absorción atómica y la concentración de sulfatos por turbidimetría, el
pH y la población bacteriana en suspensión.

RESULTADOS
En la figura 1 se muestra una cinética representativa de un cultivo de T. caldus sobre
azufre elemental.

6e+8

5e+8
Células por ml

600 4e+8 2
pH
Concentración de protones (mmoles.l )

3e+8
-1

24
2e+8
Concentración de sulfato (g.l -1 )

1e+8
450
1
0 100 200 300
Tiempo (horas)

16
300

150
8

0
0 50 100 150 200 250 300
Tiempo (horas)

Figura 1: Crecimiento de T. caldus sobre azufre elemental: evolución de protones y sulfatos

(gráfico externo) y población bacteriana en suspensión y pH (gráfico interno)

2
 Jornadas SAM 2000 - IV Coloquio Latinoamericano de Fractura y Fatiga

En esta figura se observan que cualquiera de los cuatro parámetros indicados,

concentración de protones y sulfatos (gráfico externo), pH y población bacteriana libre en
suspensión (gráfico interno), puede utilizarse como descriptiva de la evolución del cultivo.
En controles estériles semejantes a los sistemas inoculados pero en los cuales fue
reemplazado el inóculo por medio estéril, las concentraciones de sulfatos y de protones se
mantuvieron prácticamente constantes durante la experiencia.
En la figura 2 se han graficado los resultados obtenidos durante la biolixiviación de
sulfuro de cinc. En ella puede observarse que la solubilización en los sistemas inoculados fue
claramente superior a los controles estériles. En el gráfico interno puede comprobarse que la
solubilización de cinc ha sido acompañada por un crecimiento de la población bacteriana.

3000
Celulas por ml (x10 )
-8

2500
4 0,50 % p/v
Concentracion de cinc(II) (mg.l )
-1

0,25 % p/v
2000 0,10 % p/v
0
0 200 400
Tiempo (horas)

1500

Inoculados (simbolos rellenos en negro)

Esteriles (simbolos no rellenos)
1000

500

0
0 100 200 300 400 500
Tiempo (horas)

Figura 2: Biolixiviación de sulfuro de cinc para tres densidades de pulpa diferentes utilizando
células de T. caldus: evolución de la concentración de cinc en solución (gráfico externo)
y evolución de la población bacteriana en suspensión (gráfico interno)

En las biolixiviaciones de sulfuro de níquel y de cobre, la acción bacteriana no fue

significativa tal cual puede observarse en la figura 3. En ella se han volcado los porcentajes de
recuperación de níquel y de cobre en los sistemas inoculados y en los controles respectivos
luego de 15 días de lixiviación.

3
 Semenza, Curutchet, Viera y Donati

35
CuS (Inoc)
CuS (Est) 0,10 % 0,25 % 0,50 %
30 NiS (Inoc)
NiS (Est)
Porcentaje de recuperacion del metal

25

20
0,10 % 0,25 % 0,50 %
15

10

Figura 3: Recuperaciones de níquel y cobre durante las biolixiviaciones de

sulfuro de níquel y sulfuro de cobre utilizando células de T. caldus.

DISCUSION
En la figura 1 puede apreciarse que en un cultivo de T. caldus sobre azufre elemental, la
evolución de las concentraciones de protones y sulfatos es prácticamente paralela, en especial
durante las primeras 150 hs. En este período, la relación entre la producción de protones y la
de sulfatos se mantuvo en aproximadamente 2,5 lo que es algo superior a la relación
estequiométrica esperada (molesH+ /molesSO4 2-= 2) para la oxidación de azufre. Esta menor
producción de sulfatos puede justificarse con mecanismos de oxidación de azufre semejantes
a los aceptados para otras especies del género Thiobacillus ya que la producción de protones
se produce esencialmente en las primeras etapas de oxidación de azufre (con la formación de
compuestos intermediarios tales como sulfito o tiosulfato entre otros) y, en una segunda etapa
de produce la oxidación de estas especies a sulfato prácticamente sin que haya consumo o
liberación de protones. Esto concuerda con la tendencia de aquella relación a acercarse al
valor teórico (es decir, a 2) en los últimos tramos del crecimiento donde, debido al gran
consumo de azufre (superior al 80 %), las bacterias comienzan a consumir los compuestos
intermediarios acumulados en el cultivo. Esta capacidad de T. caldus de producir ácido
sulfúrico a partir de azufre elemental muestra dos de los roles que puede cumplir esta bacteria
durante los procesos de biolixiviación: la acidificación permanente del medio que facilita la
solubilización de los metales y el consumo de azufre que puede acumularse sobre los
minerales por ataques oxidantes como los producidos por hierro(III), en general, producido
por la acción oxidante de bacterias como T. ferrooxidans o L. ferrooxidans. Este segundo

4
 Jornadas SAM 2000 - IV Coloquio Latinoamericano de Fractura y Fatiga

proceso permite la liberación de la superficie de los minerales y la continuidad de los procesos

de solubilización de los minerales.
En las biolixiviaciones solo se observó una acción bacteriana significativa cuando el
sustrato fue sulfuro de cinc puro. Una inmediata explicación a este fenómeno, es la diferencia
en solubilidad de los sulfuros utilizados, que muestra solo actividad bacteriana en la
solubilización solo en el caso del sulfuro mas soluble. El mecanismo sería entonces semejante
al reportado previamente para T. thiooxidans (un microorganismo muy semejante a T. caldus
salvo que su temperatura óptima de crecimiento es más baja) [7] y consistiría en una primera
disolución química del sulfuro en el medio de cultivo, generando HS - y H2 S (ecuación 1) y la
oxidación bacteriana de estas especies (ecuación 2) permitiendo el desplazamiento
permanente del equilibrio de disolución del sulfuro. El azufre formado puede ser finalmente
oxidado por la bacteria de acuerdo a la ecuación 3.

ZnS + 2 H+ → Zn2+ + H2 S (1)

H2 S + ½ O2 → S + H2 O (2)

S + 3/2 O2 + H2 O → H2 SO4 (3)

La evolución del pH concuerda con este mecanismo ya que se observa un ligero ascenso
inicial (producto de la disolución ácida) y un posterior descenso (debido a la producción de
ácido a partir de la oxidación del azufre). En los controles estériles, se observa un ascenso
constante del pH hasta valores cercanos a 2,6 coincidiendo con el máximo de solubilización
que fue entre el 7 y el 25 % (creciendo con la densidad de pulpa).
Las solubilizaciones de cinc fueron superiores al 85 % para las tres densidades de pulpa
(y cercana al 100 % a la densidad mas baja), con velocidades promedios de solubilización de
181, 103 y 44 ppm/día para 0,50 %, 0,25 y 0,10 % de densidad de pulpa respectivamente. Las
recuperaciones alcanzadas, si bien bastante elevadas, fueron menores a las alcanzadas en
cultivos similares de T. ferrooxidans o de T. thiooxidans a 30 o C [7] e incluso, aunque la
temperatura fue mayor en este caso, las velocidades de disolución fueron bastante menores (T.
ferrooxidans y T. thiooxidans alcanzaron velocidades medias de solubilización de 233 y 270
ppm/día respectivamente). Por otro lado, las poblaciones bacterianas alcanzadas en este caso
fueron mayores que las reportadas para las otras especies de Thiobacillus, sugiriendo que T.
caldus tiene mayor afinidad por el azufre (ecuación 3) y que, probablemente, esto disminuya
la velocidad del proceso indicado en la ecuación 2 y, por ende, la del proceso de
solubilización de cinc (ecuación 1).
En la figura 3, se observa que no hubo prácticamente catálisis bacteriana de la
disolución del sulfuro de níquel. Sin embargo, se observó un pequeño crecimiento de la
población bacteriana en suspensión, especialmente a la menor densidad de pulpa.
Paralelamente, se comprobó un elevado ascenso del pH en el sistema de mayor densidad de
pulpa que pudo haber inhibido la actividad bacteriana. Los resultados en el caso del sulfuro de
cobre fueron similares.
El mecanismo indicado a través de las ecuaciones 1-3, es semejante aunque con algunas
modificaciones al que recientemente ha sido publicado por otros investigadores [8]. Sin
embargo, estos investigadores proponen que ese ataque es semejante en las biolixiviaciones
con bacterias del género Thiobacillus, si el hierro no está presente y si los sulfuros utilizados
son aquellos cuyo producto primario durante los procesos de disolución es azufre. De acuerdo

5
 Semenza, Curutchet, Viera y Donati

a ello, cabría esperar procesos semejantes de disolución de sulfuro de cobre y sulfuro de

níquel por T. caldus aunque con velocidades menores a las observadas para sulfuro de cinc.
Nuestros resultados no concuerdan con estas expectativas ya que no se observaron diferencias
significativas entre sistemas inoculados y estériles aun a tiempos largos. Previamente ha sido
comprobado que situaciones semejantes se producen cuando se utilizan células de T.
thiooxidans [9]; en este caso, se ha sugerido que las diferencias se deban a que la
biolixiviación de sulfuros muy insolubles, exige una adherencia sobre el sustrato y una acción
directamente sobre la superficie [10] que parece no ser posible para ninguna de las especies de
Thiobacillus excepto para T. ferrooxidans.

CONCLUSIONES
Los resultados de este trabajo muestran que, de modo semejante a lo observado para T.
thiooxidans, T. caldus es capaz solo de lixiviar sulfuros no demasiado insolubles, como
sulfuro de cinc, a velocidades algo menores a las alcanzadas por aquel microorganismo. Sin
embargo, no es capaz de incrementar la solubilización de sulfuros más insolubles como los de
cobre y níquel. De este modo, su contribución en los procesos de biolixiviación, se reduce a la
oxidación de los depósitos de azufre sobre minerales liberando la superficie de los mismos y
en la acidificación del medio a través de la generación de ácido sulfúrico.

REFERENCIAS
1. D.E. Rawlings. Biomining: theory, microbes and industrial processes, Springer-Verlag,
Berlin, 1997.
2. E. Donati, G. Curutchet, C. Pogliani, H. Tedesco. Bioleaching of covellite using pure
and mixed cultures of Thiobacillus ferrooxidans and Thiobacillus thiooxidans, Proc.
Biochem., 31, 129-134, 1996.
3. K.H. Hallberg, M. Dopson, E.B. Lindstrom. Reduced sulfur compound oxidation by
Thiobacillus caldus, J. Bacteriol., 178, 6-11, 1996.
4. M.D. Dopson, E. B. Lindstrom. Potential role of Thiobacillus caldus in arsenopyrite
bioleaching, Appl. Env. Microbiol., 65, 36-40, 1999.
5. D.E. Rawlings, N.J. Coram, M.N. Gardner, S.M. Deane. Thiobacillus caldus and
Leptospirillum ferrooxidans are widely distributed in continuous flow biooxidation
tanks used to treat a variety of metal containing ores and concentrates. Proceedings of
the International Biohydrometallurgy Symposium, Madrid, España, 777-786, 1999.
6. M.P. Silverman, D.G. Lundgren. Studies on the chemoautotrophic iron bacterium
Thiobacillus ferooxidans. I. An improved medium and a harvesting procedure for
securing high cellular yields, J. Bacteriol., 77, 642-647, 1959.
7. M. Pistorio, G. Curutchet, E. Donati, H. Tedesco. Direct zinc sulphide bioleaching by
Thiobacillus ferrooxidans and Thiobacillus thiooxidans, Biotechn. Lett., 16, 419-424,
1994.
8. A. Schippers, W. Sand. Bacterial leaching of metal sulfides proceeds by two indirect
mechanisms via thiosulfate or via polysulfides and sulfur. Appl. Env. Microbiol., 65,
319-321, 1999.
9. S. Porro , S. Ramírez, C. Reche, G. Curutchet, S. Alonso, E. Donati. Bacterial
attachment: its role in bioleaching processes, Proc. Biochem., 32, 573-578, 1997.
10. C. Pogliani, G. Curutchet, E. Donati, H. Tedesco. A need for direct contact with particle
surfaces in the bacterial oxidation of covellite in the absence of a chemical lixiviant,
Biotechn. Lett., 12, 515-518, 1990.

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