“Año del Buen Servicio al Ciudadano”

UNIVERSIDAD ANDINA “NÉSTOR CÁCERES VELÁSQUEZ”

FACULTAD DE INGENIERÍAS Y CIENCIAS PURAS

Escuela Profesional de Ingeniería Sanitaria y Ambiental

AISLAMIENTO DE BACTERIAS POTENCIALMENTE

DEGRADADORAS DE HIDROCARBUROS PRESENTES
EN SEDIMENTOS DE UNA ESTACIÓN DE SERVICIO DE
COMBUSTIBLE EN JULIACA-PERÚ
Curso: Contaminación de Suelos
Docente: Ing. Yesica Magnolia Mamani Arpasi
Integrantes:

Quispe Incahuamán, Luis Trevor (1514418025)

Zuñiga Quenallata, Judith (1514418006)

Juliaca – Perú
2017
“AISLAMIENTO DE BACTERIAS POTENCIALMENTE DEGRADADORAS

DE HIDROCARBUROS PRESENTES EN SEDIMENTOS DE UNA

ESTACIÓN DE SERVICIO DE COMBUSTIBLE EN JULIACA-PERÚ”

RESUMEN

En la presente investigación se evaluó el efecto de la bioestimulación en

sedimentos contaminados con hidrocarburos de la Estación de Servicio de

Combustible PETRO PERÚ - Juliaca – Perú. Estos sedimentos son producto

principalmente de la venta del combustible, llenado de tanques de

almacenamiento de combustible y del lavado de vehículos en la Estación de

Servicio. Para el desarrollo de esta investigación, la técnica de

bioestimulación, a los sedimentos contaminados, se les añadió un nutriente

(guano de vacuno), se realizó el tratamiento, beneficiando el desarrollo y

crecimiento de los microorganismos degradadores. Para esta investigación se

utilizó cuatro (4) mesocosmos (muestras). Primero se tomaron sedimentos

contaminados y se les adicionó guano de vacuno como nutriente, se realizó

una réplica para cada uno de estos procedimientos.

Para su seguimiento y control, se realizaron mediciones a lo largo de los

experimentos, de temperatura, pH y humedad al inicio. En las muestras de

suelo en las placas Petri que lo colocamos en la incubadora, dio como

resultados la sobrevivencia de bacterias, de la familia de cocos y también

bacilo; del cual a simple deducción, son microorganismos que pueden

2
sobrevivir en un suelo contaminado por petróleo o dicho de otra manera, estos

tiene como fuente de alimento al petróleo.

Para la muestra 1 consiste en 200g de suelo con hidrocarburos y 200g de

guano más agua destilada, con un pH de 8.84 y conductividad de 1104s/cm.

Se evidenció la presencia de cocos gram positivos con probabilidad de

pertenecer a la familia de Rhodococcus.

Para la muestra 2 consiste en 200g de suelo con hidrocarburos y 100g de

guano mas agua destilada; con un PH de 8.98 y conductividad 892us/cm. Las

características nos indican que existen la misma diversidad de bacterias que

en la muestra 1 y también se añaden bacterias como bacillus gram negativos,

presumiblemente del género Pseudomonas.

Para la muestra 3 consiste en 200g de suelo con hidrocarburos y 50g de

guano mas agua destilada, con un PH de 8.96 y conductividad de 470us/cm.

Se encontró mayor prevalencia de cocos gram positivos y pseudomonas gram

negativas.

Para la muestra 4 consiste en 200g de suelo con hidrocarburos con ausencia

de guano mas agua destilada, con un PH de 9.14 con una conductividad de

1158us/cm. Se encontró la precedencia de cocos dispersos gram positivos

con ausencia de pseudomonas.

3
 ABSTRACT

The present investigation evaluated the effect of biostimulation in sediments

contaminated with hydrocarbons from the PETRO PERU - Juliaca - Peru Fuel

Service Station. These sediments are mainly produced by the sale of fuel,

filling fuel storage tanks and washing vehicles at the Service Station. For the

development of this research, the biostimulation technique, the contaminated

sediments, were added a nutrient (cattle guano), the treatment was performed,

benefiting the development and growth of degrading microorganisms. For this

investigation four (4) mesocosms (samples) were used. Contaminated

sediments were first taken and cow guano was added as a nutrient. A replicate

was performed for each of these procedures.

For its monitoring and control, measurements were made throughout the

experiments, temperature, pH and humidity at the beginning. In the soil

samples in the Petri dishes that we placed in the incubator, gave as a result

the survival of bacteria, coccus family and also bacillus; Of which to simple

deduction, are microorganisms that can survive in soil contaminated by oil or

said in another way, these have as fuel source of oil.

For sample 1 it consists of 200g of soil with hydrocarbons and 200g of guano

plus distilled water, with a pH of 8.84 and conductivity of 1104s / cm. The

presence of gram positive coccus was evidenced with probability of belonging

to the family of Rhodococcus.

For sample 2 consists of 200g of soil with hydrocarbons and 100g of guano

plus distilled water; With a PH of 8.98 and conductivity 892us / cm. The

4
characteristics indicate that there are the same diversity of bacteria as in

sample 1 and also bacteria like gram negative bacillus, presumably of the

genus Pseudomonas are added.

For sample 3 it consists of 200g of soil with hydrocarbons and 50g of guano

plus distilled water, with a PH of 8.96 and conductivity of 470us / cm.

We found a higher prevalence of gram positive cocci and gram negative

pseudomonas.

For sample 4 it consists of 200g of soil with hydrocarbons with absence of

guano plus distilled water, with a PH of 9.14 with a conductivity of 1158us / cm.

We found the precedence of gram positive cocci dispersed with absence of

pseudomonas.

5
 INTRODUCCIÓN

La contaminación por hidrocarburos del petróleo es una problemática de

carácter mundial y amplia distribución geográfica, teniendo en cuenta que

independiente de la zona afectada (lagos, suelos, zonas freáticas, ríos y

playas) por procesos biológicos y físicos, los hidrocarburos tienen como

destino final los mares y océanos (Shanidul y Tanaka, 2004).

La biorremediación es una tecnología basada en la utilización de los

microorganismos y su potencial degradador para eliminar los contaminantes

del medio, mediante su transformación en productos inocuos como el CO 2 y

el H2O. De entre todos los tipos de contaminantes, los hidrocarburos son los

que han mostrado mejores resultados en la aplicación de la tecnología de la

biorremediación (Rosenberg et al. 1992).

La ciudad de Juliaca se ha visto afectada en los últimos años por la

contaminación de hidrocarburos producto de las actividades del parque

automotor. Así mismo, por procesos relacionados con la explotación,

transporte, manejo del petróleo y sus derivados. En la ciudad existen

problemas debido a derrames leves en las estaciones de servicio de petróleo,

terminales petroleros. Las zonas más afectadas son casi todos los

alrededores del Servicio de Combustible.

La adición de nutrientes promueve la biodegradación al aumentar las

poblaciones microbianas. Los nutrientes a emplearse contiene elementos

6
asimilables por lo microorganismos tales como C, N, P y entre otros (Swannell

et al., 1996).

Bajo este marco de referencia, teniendo en cuenta que son pocas las

investigaciones realizadas en Juliaca a nivel de biorremediación en ambientes

terrestres, se desarrolló la presente investigación, que tuvo como objetivo

evaluar bacterias degradadoras en estaciones de servicios petroleros

impactadas por hidrocarburos, la peligrosidad de estos radica en que son una

fuente potencial de contaminación de aguas subterráneas y causar malestar

entre la población de la zona, las bacterias con mayor índice de sobrevivencia

en estratos contaminados con hidrocarburos son de género pseudomona y

algunas familias de cocos como Rhodococcus y con el fin de que

posteriormente puedan ser aplicadas como una herramienta estratégica en la

biorremediación de suelos contaminados.

7
 I. OBJETIVOS

1.1. Objetivo General

 Evaluar supervivencia de bacterias degradadoras de hidrocarburos

presentes en una estación de servicio de combustible.

1.2. Objetivos Específicos

 Conocer el efecto de la bioestimulación (adición de guano de vacuno)

en la biodegradación de hidrocarburos en una estación de servicio de

combustible (PETRO PERÚ)

 Establecer la sobrevivencia de las bacterias biodegradadoras, en los

diferentes mesocosmos (muestras).

II. MARCO TEÓRICO

2.1. LA IMPORTANCIA DEL PETRÓLEO EN LA SOCIEDAD

El petróleo es un recurso natural no renovable, es el resultado de la

degradación anaeróbica de materia orgánica, durante largos períodos de

tiempo y bajo condiciones de alta temperatura y presión, que la convierte en

gas natural, crudo y derivados del petróleo. El petróleo es una mezcla

extremadamente compleja y variable de compuestos orgánicos, donde la

mayoría de los ellos son hidrocarburos, que varían en peso molecular desde

el gas metano hasta los altos pesos moleculares de alquitranes y bitúmenes.

8
Estos hidrocarburos pueden presentarse en un amplio rango de estructuras

moleculares: cadenas lineales y ramificadas, anillos sencillos, condensados o

aromáticos. Los dos grupos principales de hidrocarburos aromáticos son los

monocíclicos, el benceno, tolueno y xileno (BTEX) y los hidrocarburos

policíclicos (PAHs) tales como el naftaleno, antraceno y fenantreno (Vargas,

P., et al., 2004).

La historia del petróleo como elemento vital y factor estratégico de desarrollo

es relativamente reciente, de menos de 200 años. Se comercializó por primera

vez bajo el nombre de "aceite de roca", en el año 1850, Samuel Kier, un

boticario de Pittsburg, Pennsylvania de EE.UU., a partir de entonces se puede

decir que comenzó el desarrollo de la industria del petróleo y el verdadero

aprovechamiento de un recurso que indudablemente ha contribuido a la

formación del mundo actual (Vasallo, J., y Herrera, D., 2002).

2.2 IMPACTOS AMBIENTALES DE LOS HIDROCARBUROS

En la actividad petrolera, las disposiciones y el manejo habitual de

hidrocarburos y combustibles, en algunos casos conlleva a la contaminación

del ambiente, cuando tanques, oleoductos y diversas instalaciones sufren

daños. Los líquidos migran hacia el suelo, subsuelo (zona vadosa) y hacia el

agua subterránea (zona saturada – acuífero) o superficialmente hacia un bajo

topográfico o curso de agua, y sus componentes volátiles a la atmosfera. No

solo las contaminaciones se producen por roturas de los sistemas de

almacenaje o de transporte, sino que el mal manejo del producto puede

9
provocar impactos negativos en la ecología regional (Vasallo, J., y Herrera,

D., 2002).

2.3 ACTIVIDADES DE LAS ESTACIÓNES DE SERVICIO

De acuerdo con el decreto 1521 de 1998, expedido por el Ministerio de Minas

y Energía, las estaciones de servicio son: “establecimientos destinados al

almacenamiento y distribución de combustibles líquidos derivados del petróleo

y gas licuado del petróleo (GLP), para vehículos automotores a través de

equipos fijos (surtidores) que llenan directamente los tanques de combustible”.

Además, puede incluir facilidades para uno o varios de los siguientes

servicios: lubricación, lavado general y/o motor, cambio y reparación de

llantas, alineación y balanceo, servicio de diagnóstico, trabajos menores de

mantenimiento automotor, venta de llantas, neumáticos, lubricantes, baterías,

accesorios y demás servicios afines. En las estaciones de servicio también

podrán operar mini mercados, tiendas de comidas rápidas, cajeros

automáticos, tiendas de video y otros servicios afines a estos, siempre y

cuando se obtengan de las autoridades competentes las autorizaciones

correspondientes y se cumplan todas las normas de seguridad para cada uno

de los servicios ofrecidos. Estas actividades comerciales no deberán interferir

con el objeto principal para el cual se autorizó la operación de la estación de

servicio, vale decir, el almacenamiento, manejo, transporte y distribución de

combustibles líquidos derivados del petróleo y/o gaseosos (Ministerio del

Medio Ambiente, 1999).

En la etapa de operación, los efectos potenciales sobre el medio ambiente

pueden verse ampliamente reducidos gracias a las tecnologías utilizadas, a

10
las tareas de monitoreo que se realicen y al cuidado en la prestación del

servicio; si a esto se suma las medidas preventivas implementadas en la

etapas de planeación y de construcción, el impacto al medio ambiente se ve

reducido a los efectos que puedan tener las actividades secundarias de la

estación de servicio o a casos aislados y fortuitos (Ministerio del Medio

Ambiente, 1999).

2.4 TASAS DE GENERACIÓN DE LODOS Y/O RESIDUOS EN LAS

ESTACIONES DE SERVICIO

Los lodos, arenas y/o sedimentos contaminados con diferentes fracciones de

hidrocarburo provenientes de las Estaciones de Servicio (E.D.S.), durante

muchos años han sido dispuestos de manera inapropiada en lotes baldíos,

junto con los residuos ordinarios y en las fuentes de agua sin un control

estricto. En la actualidad, dada la aparición del decreto 1713 de 2002 del

Ministerio de Desarrollo Económico de la República de Colombia y los

intensos controles que se han iniciado, se exige que estas dispongan estos

residuos de manera apropiada teniendo en cuenta su naturaleza como

residuos peligrosos y su entrega a un movilizador debidamente registrado

ante la autoridad ambiental (Corporación Autónoma Regional de Risaralda y

Universidad Tecnológica de Pereira, 2007).

2.5 REMEDIACIÓN DE SUELOS CONTAMINADOS CON

HIDROCARBUROS

2.5.1. La Bioestimulación: Se define como la estimulación de los

microorganismos nativos, para activar y acelerar la degradación de

11
contaminantes, se puede llevar a cabo con la adición de agua, oxigeno,

nutrientes, aceptor de electrones, entre otros parámetros que permitan el buen

desarrollo de los microorganismos, dentro de los nutrientes se encuentran

principalmente el nitrógeno y fósforo, el nitrógeno proporciona el elemento

necesario para la producción de aminoácidos y enzimas, y la fuente de fósforo

interviene en la formación de compuestos energéticos dentro de la célula que

se utilizan en los procesos de reproducción y degradación, estos fertilizantes

pueden ser de uso agrícola o de origen orgánico como estiércol, también se

puede llevará a cabo una estimulación con adición de agua y oxígeno, si el

área contaminada ya cuenta con buena presencia de nutrientes (Taccaria, M.,

et al, 2012).

2.6 DEGRADACIÓN DE LOS HIDROCARBUROS

En la degradación ocurren procesos fisicoquímicos entre la interacción

natural del contaminante con el ambiente que incluyen la dispersión, dilución,

absorción, volatilización, estabilización química o la biodegradación del

contaminante (Biorremediación). En la mayoría de los casos, la

biorremediación es la mejor alternativa para el tratamiento de esta

contaminación (Arroyo, M., et al., 2001).

2.6 FACTORES QUE INFLUYEN EN LA BIORREMEDIACIÓN.

Uno de los principales problemas de la biodegradación es que, en presencia

de altas concentraciones del contaminante en el suelo, pueden existir efectos

de toxicidad sobre la población microbiana. Otro, es la insuficiencia de

nutrientes en el suelo; sin embargo, la presencia de cantidades mínimas de

12
nitrógeno y fósforo permiten la biodegradación, aunque en tiempos más

largos. Los factores ambientales que influyen en la biodegradación son:

temperatura, pH, humedad, nutrientes (principalmente nitrógeno y fósforo),

aceptores de electrones (oxígeno, nitrato, sulfato) y presencia de

microorganismos (Roldán, A., y Iturbe, R., 2002).

2.6.1 Temperatura

Es uno de los factores ambientales más importantes, esta tiene una gran

influencia en la biodegradación por su efecto sobre la naturaleza física y

química del petróleo y sus derivados (Pardo, J., et al., 2004).

A bajas temperaturas la viscosidad de los hidrocarburos aumenta, la

volatilización de alcanos de cadena corta se reduce y disminuye la solubilidad

del O2 en agua, afectando así la biodegradación. Las tasas de degradación

generalmente aumentan cuando la temperatura incrementa (Ríos, R., 2005).

2.6.2 pH

El pH es un factor químico importante que influye en la recuperación de suelos

contaminados por hidrocarburos, ya que determina el grado de adsorción de

iones por las partículas del suelo, afectando así su solubilidad, movilidad,

disponibilidad y sus formas (Volke, T., y Velasco, J., 2002).

2.6.3 Humedad

La humedad es un factor importante porque actúa como medio de transporte

de nutrientes y oxígeno a la célula ya que forma parte de su protoplasma

bacteriano, este proceso es necesario para su crecimiento y desarrollo. Es

conveniente mantener una humedad del orden del 20 - 75 % de la capacidad

13
de campo, la cual se define como la masa de agua que admite el suelo hasta

la saturación (Gómez, S., et al., 2008).

Un exceso de humedad inhibirá el crecimiento bacteriano al reducir la

concentración de oxígeno en el suelo y una poco o nula humedad priva el

intercambio de gases y da como resultado zonas anaeróbicas. Por lo anterior,

la humedad del suelo puede limitar de forma severa la biodegradación (Torres,

K. y Zuluaga, T., 2009).

2.6.4 Nutrientes

Los nutrientes son uno de los factores más relevantes por ser sustancias

químicas necesarias para la actividad microbiana y metabólica de los

microorganismos, por lo que estos constituyentes se deben encontrar

disponibles para su asimilación y síntesis, las disponibilidades de estos

aumentan la eficiencia y el buen desarrollo de la biorremediación (Gómez, S.,

et al., 2008).

2.7 EXPERIENCIAS DE BIORREMEDIACIÓN EN SUELOS

CONTAMINADOS CON HIDROCARBUROS.

 En el artículo científico realizado para maestría en Ingeniería Ambiental

por:

DIANA CRISTINA ÑUSTEZ CUARTAS

“BIORREMEDIACIÓN PARA LA DEGRADACIÓN DE HIDROCARBUROS

TOTALES PRESENTES EN LOS SEDIMENTOS DE UNA ESTACIÓN DE

SERVICIO DE COMBUSTIBLE”

Señala lo siguiente:

14
Las estrategias de bioestimulación y bioaumentación, para el tratamiento de

sedimentos generados en una estación de servicio de combustible,

presentaron reducciones promedio de hidrocarburos totales de petróleo de

16391,18 mg/Kg de suelo seco y 15601,44 mg/Kg de suelo seco

respectivamente, en un tiempo de 23 semanas (6 meses), al ver los resultados

de la investigación podemos decir que las mayores reducciones de

hidrocarburo ocurrieron hasta la semana 15 (4 meses), a este tiempo las

estrategias presentaron reducciones de 15326,96 mg/Kgss para la técnica de

bioestimulación y 13815,60 mg/Kgss para la técnica de bioaumentación,

valores que cubren un gran porcentaje de los valores totales degradados, lo

que indica que el tratamiento puede plantearse en menores tiempos.

Para esta investigación se encontró que no existen diferencias significativas

entre la estrategia de bioaumentación y la estrategia de bioestimulación, para

el tratamiento de los sedimentos contaminados con hidrocarburos, producidos

por la estación de servicio, ambas estrategias lograron efectos positivos en la

reducción de hidrocarburos totales.

 En el artículo científico realizado por la facultad de ciencias de la salud

por:

Joaquín Benavides López de Mesa Msc1, Gladis Quintero Msc1, Andrea

Liliana Guevara Vizcaíno, Diana Carolina Jaimes Cáceres, Sandra Milena

Gutiérrez Riaño, Johanna Miranda García.

“BIOREMEDIACIÓN DE SUELOS CONTAMINADOS CON

HIDROCARBUROS DERIVADOS DEL PETRÓLEO”

Señala lo siguiente:

15
La biorremediación con hidrocarburos para México DC con bacterias es

eficiente tanto económicamente, así como factible ecológicamente. El

porcentaje de degradación para las bacterias es de 40% en las primeras

semanas siendo este más rápido en las semanas de mayor proliferación de

bacterias llegando hasta un 95% de degradación total de los hidrocarburos.

 En el artículo científico realizado para maestría en Ingeniería

Agroforestal por:

María Alejandra Trujillo Toro y Juan Fernando Ramírez Quirama

“BIORREMEDIACIÓN EN SUELOS CONTAMINADOS CON

HIDROCARBUROS EN COLOMBIA”

Señala lo siguiente:

El avance de las investigaciones enfocadas a la sustitución parcial o total del

agar como agente gelificante en los medios de cultivo in vitro para

propagación, ha arrojado resultados prometedores, principalmente en lo que

respecta al uso de almidones, ya que, aunque algunos resultados con gomas

como solidificantes son muy buenos, los almidones tienen un menor costo y

son de fácil adquisición y extracción; además, pueden ser modificados para

conferir propiedades funcionales específicas, que les permitan ser utilizados

con mayor eficiencia en micropropagación vegetal in vitro, ya sea como único

agente gelificante, o mezclado con agar u otro tipo de goma.

La implementación de almidones o gomas como agentes gelificantes

alternativos reporta una disminución en los costos de los medios de cultivo

para tejido in vitro de hasta el 70% comparados con los del agar, aunque

16
fisiológicamente hablando los mejores resultados se obtienen en las

sustituciones parciales que se han estudiado.

III. MARCO CONCEPTUAL

SUELO

El Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (USDA, 1998),

define el suelo como un cuerpo natural formado por una fase sólida

(minerales y materia orgánica), una fase líquida y una fase gaseosa que

ocupa la superficie de la tierra, organizada en horizontes o capas de

materiales distintos a la roca madre, como resultado de adiciones,

pérdidas, transferencias y transformaciones de materia y energía, que

tiene capacidad para servir de soporte a las plantas con raíces en un medio

natural.

BIORREMEDIACIÓN

La biorremediación es una tecnología que utiliza el potencial metabólico

de los microorganismos (fundamentalmente bacterias, pero también

hongos y levaduras) para transformar contaminantes orgánicos en

compuestos más simples poco o nada contaminantes, y, por tanto, se

puede utilizar para limpiar terrenos o aguas contaminadas (Glazer y

Nikaido, 1995).

HIDROCARBUROS

Son compuestos orgánicos formados únicamente por átomos de carbono

e hidrógeno. La estructura molecular consiste en un armazón de átomos

de carbono a los que se unen los átomos de hidrógeno (Química Orgánica,

17
extraído de

http://www.ing.unp.edu.ar/asignaturas/quimica/teoria/quimicaorganica.pdf

PETRÓLEO

Es una mezcla oleosa que se encuentra en lechos geológicos

continentales o marítimos. Es un recurso natural no renovable y utilizado

como fuente energética en el mundo (más del 50% de la energía utilizada

a nivel mundial proviene del petróleo).

El petróleo es una mezcla de hidrocarburos sólidos, líquidos y gaseosos.

Es un líquido oleaginoso e inflamable de color variable (desde pardo

pasando por el verde claro hasta negro). Generalmente tiene un olor muy

desagradable y su densidad varía entre 0.7 y 0.95 g/ml, por lo tanto es

menos denso que el agua pero más viscoso. (Química, análisis de

principios y aplicaciones. Tomo II, 2010)

GUANO

es un fertilizante altamente efectivo debido a su excepcional contenido alto

en los tres componentes principales para el crecimiento de las

plantas: nitrógeno, fósforo y potasio (Wikipedia, 2017).

AGAR NUTRITIVO

Es un medio de cultivo usado normalmente como rutina para todo tipo de

bacteria. Es muy útil porque permanece sólido incluso a relativas altas

temperaturas. Además, el crecimiento bacteriano en este agar lo hace en

la superficie, por lo que se distinguen mejor las colonias (Wikipedia, 2017).

18
 IV. METODOLOGÍA DE LA INVESTIGACIÓN

El presente trabajo de investigación siguió los siguientes procedimientos:

SEMANA 1

Día 1, 19-06-17: Es en donde tomamos las muestras de sedimentos de

suelos en la Estación de Servicio “PETRO PERÚ” a las 3:30 p.m. de la

tarde en 4 puntos. Y ese mismo día analizamos parámetros como pH,

conductividad eléctrica, temperatura y humedad gravimétrica. Para lo cual

se siguió el siguiente procedimiento:

Para pH, Conductividad Eléctrica y Temperatura:

 Pesamos 10 gramos de suelo de cada muestra.

 Una vez pesado los 10 gramos de suelo de las muestras, llenamos

agua destilada en 4 vasos de precipitado, un volumen de 50ml.

 Descargamos los 10 gramos de suelo a los vasos de precipitado y

después removemos durante 20 minutos.

 Pasado ese tiempo, determinamos el pH, la conductividad eléctrica

y temperatura del suelo de cada vaso de precipitado con el equipo

multiparámetro.

Para Humedad Gravimétrica:

 Primeramente, hicimos 4 recipientes de papel aluminio y sobre ellos

pesamos 10 gramos de suelo en cada recipiente con la ayuda de una

espátula en una balanza analítica.

 Rotulamos los recipientes contenidos con suelo.

19
  Colocamos los 4 recipientes en el horno mufla a 105°C/24H

Día 2, 20-06-17: Anotamos los resultados de humedad gravimétrica.

Para ello, aplicamos la siguiente fórmula:

𝑃𝐻𝑠−𝑃𝑆𝑆
%𝑎𝑔𝑢𝑎 =
𝑃𝑆𝑆

En donde:

PHs: peso seco suelos secado al aire

PSS: peso del suelo seco secado a 105°C
Día 3, 21-06-17: Se hizo la compra del guano de vacuno, y esa misma

tarde se hizo la trituración del mismo.

Día 4, 22-06-17: Trituración de guano (continuación).

Ese mismo día, se hizo otro procedimiento, se menciona como sigue:

 Pesamos una misma cantidad de suelo para las 4 muestras: 200

gramos de suelo. Después de pesar 200 gramos de suelo de cada

muestra, se colocaron en un papel craff.

 Pesamos diferentes cantidades de guano, pero solo para 3

muestras; las cantidades son como sigue: 200, 100 y 50 gramos de

guano respectivamente.

 Empezamos a mezclar el suelo con el guano, para lo cual se tomó

en cuenta lo siguiente: Muestra 1 con una relación 1/1 (suelo

guano), muestra 2 (1/0.5) y muestra 3 (1/0.25) respectivamente

(muestra 4 no tiene guano)

 Mezclamos como se indica en la viñeta anterior, y se le añade una

cierta cantidad de agua destilada, tal como sigue: muestra 1, 200ml,

muestra 2, 100ml, muestra 3, 50ml y muestra 4, 100ml.

20
  Terminado ello, llevamos los 4 recipientes de suelo con diferentes

dosis de guano a la incubadora, a una temperatura de 20°C por 4

días.

SEMANA 2

Día 5, 27-06-17

Procedimiento de la preparación del caldo de cultivo.

 Hacemos un recipiente de papel aluminio para pesar el agar

nutritivo.

 Terminado ello, pesamos el recipiente en la balanza, lo taramos y

pesamos los 3.1 gramos de agar nutritivo con la ayuda de la

espátula.

 Luego lo echamos en un matraz Erlenmeyer, y seguido le

agregamos 100ml de agua destilada, lo diluimos lo mejor que se

pueda y lo ponemos al autoclave, durante 15 minutos a 20rev/15min

a 121°C.

 Posterior a ello, descargamos el agar en las 4 placas Petri, y luego,

por “método directo”, le agregamos una cantidad de suelo diluido a

las 3 placas con ayuda de una pipeta graduada.

 La 4ta placa solo tiene agar nutritivo, y para experimentarlo, solo le

añadimos petróleo.

 Una vez terminado con todo ello, lo colocamos en la incubadora a

105°C/24H.

SEMANA 3

21
Día 6, 04-07-17: Identificación de bacterias que sobrevivieron en las

placas. Para ello se siguieron un procedimiento, tanto para la muestra 1 y

4, que en teoría, se sigue el mismo procedimiento.

 Primeramente, sacamos las placas en el que se desarrollaron las

bacterias, pero por fines prácticos, solo agarramos las muestras 1 y

4, la primera por tener mayor cantidad de guano y la segunda por

tener en lugar de guano, petróleo.

 Con una asa de siembra, se saca un poco de las colonias en el que

crecieron las bacterias, y se pone en un portaobjetos.

 Posteriormente, se le agrega 3 gotas de cristal violeta, y después

de 30 segundos, se procede a lavarlo con una pizeta a chorro.

 Después le agregamos 2 gotas de Lugol, esperamos 30 segundos

y lo lavamos con una pizeta a chorros.

 Le echamos decolorante, 2 gotas de alcohol acetol, esperamos 60

segundos, y procedemos a agregar 2 gotas de safranina, también

esperamos 30 segundos y también lo lavamos a chorros con una

pizeta.

 Terminado ello lo secamos al fuego, flameándolo. Y se deja secar

durante 5 minutos.

 Utilizamos el microscopio con una ampliación de 100X. De esa

forma identificamos bacterias en formas de cocos, y bacilos.

SEMANA 4

11-07-17: Elaboración del borrador de investigación.

12-07-17: Elaboración del borrador de investigación (continuación)

22
 V. RESULTADOS: Se presentan a continuación:

Cuadro N°01: Análisis de humedad gravimétrica.

Muestras Peso Peso Peso después de

papel muestra 24h a 105°C en el
(gramos) (gramos) horno mufla
(gramos)
Muestra 01 0.7731 10.0013 10.2965

Muestra 02 0.6665 10.0039 10.2555

Muestra 03 0.7309 10.0033 10.2100

Muestra 04 0.6843 10.0049 10.3023

Fuente: Elaboración propia

Tabla N°02: Resultados de Humedad gravimétrica en las muestras de suelo.

Muestras %agua

Muestra 01 4.6414%

Muestra 02 4.0456%

Muestra 03 5.1342%

23
 Muestra 04 3.7555%

Fuente: Elaboración propia

Tabla N°03: Resultados de pH y conductividad eléctrica

PH Conductividad Temperatura
Eléctrica
Muestra 01 8.84 1104 /cm 18.4°C

Muestra 02 8.98 892 /cm 18.9°C

Muestra 03 8.96 470 /cm 18.4°C

Muestra 04 9.14 1158 /cm 18.65°C

Fuente: Elaboración propia

Figura N°01: Extraído de la web, de

https://irbinbarrientosandia.wordpress.com/2016/06/26/escala-de-ph-del-
suelo/

VI. CONCLUSIONES

Al inicio de este trabajo de investigación, nuestro principal objetivo era evaluar

la supervivencia de bacterias degradadoras de hidrocarburos presentes en

una estación de servicio de combustible, y para poder llegar a ello, se debe

conocer el efecto de la bioestimulación en la biodegradación de hidrocarburos

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en el mismo sitio, así como establecer la sobrevivencia de las bacterias

biodegradadoras en las diferentes muestras. Pues, por contratiempo, solo se

puedo llegar hasta una cierta parte, el cual fue solo identificar 2 tipos de

bacterias, cocos y bacilos, una familia de bacterias que se clasifican según su

forma, más no pudimos identificar el nombre de la especie que es capaz de

sobrevivir en un suelo contaminado por petróleo.

En cierta forma, el agregar guano en una muestra de suelo contaminado por

petróleo, es una forma de bioestimular, ya que se agrega nutrientes y el guano

en sí, tiene nutrientes, ya que es un desecho orgánico; y en tal razón, ayuda

aal crecimiento bacteriano.

De alguna forma, no se puedo conocer el efecto de la bioestimulación en la

biodegradación de hidrocarburos, porque no se hizo repeticiones, y por lo

tanto, este objetivo, no se cumplió, al menos en un 50% sí.

Las bacterias que se identificaron en las placas, al parecer si se adaptaban

en un entorno no adecuado para cualquier organismo vivo. Por lo tanto,

sencillamente diremos que sí existen bacterias que pueden sobrevivir en el

petróleo, o al menos, sobrevivir en un suelo contaminado por petróleo, o mejor

dicho, tiene como fuente de alimento al petróleo.

Como conclusión final, sí se pudo identificar qué clase de bacterias puede

sobrevivir en un suelo contaminado ´por petróleo en una estación de servicio

de combustible.

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