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DE PROTEÍNAS
6 grupos de estudiantes
COMPONENTES CONSERVACIÓN
Marcador de Proteínas estándar A Congelador
Proteína 1 desconocida B Congelador
Proteína 2 desconocida C Congelador
Proteína 3 desconocida D Congelador
Tampón de electroforesis Tris-Glicina-SDS (10X) Temperatura ambiente
Hojas de Protein InstaStain Temperatura ambiente
Una proteína puede tener una carga positiva o negativa neta, dependiendo de su
composición de aminoácidos y el pH. En ciertos valores de pH de las soluciones, la
molécula puede ser eléctricamente neutra, es decir, negativa y cargas positivas
están en equilibrio. En presencia de un campo eléctrico, las proteínas con cargas
netas migran hacia los electrodos de carga opuesta
Las moléculas de la misma masa y carga pueden tener diferentes formas. En tales
casos, aquellas con forma más compacta (de esfera) migrarán a través del gel más
rápidamente que aquellos con una forma alargada, como una varilla. En resumen,
la carga, tamaño y forma de una proteína nativa afectan a todos sus tasas de
migración electroforética.
Cabe señalar que la acrilamida es una neurotoxina y puede ser absorbida a través
de la piel. Sin embargo, en la forma de poliacrilamida polimerizada no es tóxica. El
proceso de polimerización es inhibida por el oxígeno. Por consiguiente, los geles de
poliacrilamida se prepararon con más frecuencia entre las placas de vidrio
separadas por tiras llamadas espaciadores. Como la mezcla de acrilamida líquido se
vierte entre las placas, el aire es desplazado y el producto de polimerización se
produce más rápidamente.
Durante la electroforesis, las proteínas migran a través del gel hacia el electrodo
positivo a una velocidad que es inversamente proporcional a su peso molecular. En
otras palabras, cuanto menor sea el polipéptido desnaturalizado, más rápido
migrará. El peso molecular de un polipéptido desconocido se obtiene mediante la
comparación de su posición después de la electroforesis con las posiciones de las
proteínas desnaturalizadas estándar. Los pesos moleculares de las proteínas
estándar se han determinado previamente. Después de que las proteínas se
visualizan por tinción y decoloración, se mide su distancia de migración. El log10 de
los pesos moleculares de las proteínas estándar se representa frente su distancia
de migración. Tomando el logaritmo Rf permite que los datos se representen
gráficamente como una línea recta. El peso molecular de las proteínas desconocidas
se calcula fácilmente a partir de la curva estándar.
MUESTRAS DE PROTEÍNAS PARA ESTE EXPERIMENTO
Los marcadores de proteínas estándar (pocillos 1 y 6) son una mezcla de
proteínas que dan los siguientes pesos moleculares: 94000; 67000; 38000;
30000; 20000 y 14000 Da. Los valores se han redondeado para mayor
comodidad en el análisis gráfico.
Dado que las proteínas están precoloreadas, las bandas individuales serán visibles
durante la electroforesis. Después de la electroforesis, las mediciones preliminares
se pueden realizar sin necesidad de retirar el gel de la casete de plástico.
4.1 Precauciones
1. Llevar gafas y guantes de laboratorio mientras se trabaja.
4. Lavarse las manos con jabón y agua después de haber trabajado en el laboratorio
o utilizado reactivos o materiales biológicos.
Los geles de poliacrilamida no están incorporados, usted puede realizar sus propios
geles de poliacrilamida, o bien, comprar nuestros geles preparados.
3. Asegurarse que los microtubos están bien tapados, utilizar los microtubos con
tapón a rosca y marcarlos. La parte inferior de los microtubos deben ser
empujados a través del papel de aluminio y estar inmersos en agua
hirviendo durante 5 minutos. Los microtubos se debería mantener
suspendidos por el papel de aluminio. Se puede también utilizar para ello
algún sistema de laboratorio para hacer flotar las muestras.
TIEMPO DE LA ELECTROFRESIS
La disponibilidad de su tiempo determinará el voltaje y la longitud que correrán las
proteínas. Se recomiendan 125 voltios durante 60-75 minutos.
5. PRÁCTICA
2. Asegurarse que los microtubos están bien tapados, utilizar los microtubos con
tapón a rosca y marcarlos. La parte inferior de los microtubos deben ser empujados
a través del papel de aluminio y estar inmersos en agua hirviendo durante 5
minutos. Los microtubos se deberían mantener suspendidos por el papel de
aluminio. Se puede también utilizar para ello algún sistema de laboratorio para hacer
flotar las muestras.
Una vez han se han sembrado o cargado las muestras para la electroforesis, volver
a congelar las muestras de proteínas no utilizadas. Cuando se vuelvan a utilizar
para otra electroforesis, se deben repetir los pasos 1 al 3.
1. Abra la bolsa que contiene el casete de gel con unas tijeras. Retire el casete
y colóquelo sobre la mesa de trabajo con la parte delantera hacia arriba.
GRUPO A
Pocillo 1 20 microlitros tubo A Marcador de proteínas estándard
Pocillo 2 20 microlitros tubo B Proteína 1 desconocida
Pocillo 3 20 microlitros tubo C Proteína 2 desconocida
Pocillo 4 20 microlitros tubo D Proteína 3 desconocida
GRUPO B
Pocillo 6 20 microlitros tubo A Marcador de proteínas estándard
Pocillo 7 20 microlitros tubo B Proteína 1 desconocida
Pocillo 8 20 microlitros tubo C Proteína 2 desconocida
Pocillo 9 20 microlitros tubo D Proteína 3 desconocida
C) Correr el gel
Configurar la fuente de energía al voltaje deseado y correr el gel. Se recomiendan
125 voltios durante 60-75 minutos.
Los geles de poliacrilamida pueden ser teñidos de una forma muy fácil con las hojas
de Protein InstaStain. La tinción es rápida, sensible y los geles están listos para su
visualización en 1-3 horas.
Los geles de poliacrilamida son muy finos y frágiles. T ener cuidado al manipular el gel
para evitar que se rompa.
3. Flotar suavemente una hoja de Protein InstaStain con la cara azul en el líquido.
Retirar la hoja de Protein InstaStain después de 30 minutos.
En este ejemplo los estándar son: 94.000, 67.000; 38.000; 30.000; 20.000; 14.000.