Universidad Nacional de Trujillo Biología de los Microorganismos

E.A.P. Microbiología y Parasitología

Aislamiento e identificación de las bacterias grampositivas y gramnegativas

I. INTRODUCCIÓN
En microbiología, se denominan bacterias gramnegativas aquellas que no se tiñen de azul
oscuro o de violeta por la tinción de Gram, y lo hacen de un color rosado tenue: de ahí el
nombre de "gramnegativas" o también "Gram-negativas".1 Esta característica está
íntimamente ligada a la estructura didérmica dada por la envoltura celular, pues presenta
doble membrana celular (una externa y la otra citoplasmática), lo que refleja un tipo natural
de organización bacteriana. Son uno de los principales supergrupos de bacterias, y cuando se
tratan como taxón se utiliza también el nombre de Negibacteria2 o Didermata. Las restantes
son las bacterias grampositivas.
Las bacterias gramnegativas presentan dos membranas lipídicas entre las que se localiza una
fina pared celular de peptidoglicano, mientras que las bacterias grampositivas presentan solo
una membrana lipídica y la pared de peptidoglicano es mucho más gruesa. Al ser la pared
fina, no retiene el colorante durante la tinción de Gram.3
En microbiología, se denominan bacterias grampositivas, o bacterias Gram-positivas,
aquellas bacterias que se tiñen de azul oscuro o violeta por la tinción de Gram.1 Esta
característica química está íntimamente ligada a la estructura de la envoltura celular, por lo
que refleja un tipo natural de organización bacteriana. Son uno de los principales grupos de
bacterias, y cuando se tratan como taxón se utiliza también el nombre de Posibacteria.2 Las
restantes son las bacterias gramnegativas.
La envoltura celular de las bacterias grampositivas comprende la membrana citoplasmática y
una pared celular compuesta por una gruesa capa de peptidoglucano, que rodea a la anterior.
La pared celular se une a la membrana citoplasmática mediante moléculas de ácido
lipoteicoico. La capa de peptidoglicano confiere una gran resistencia a estas bacterias y es la
responsable de retener el tinte durante la tinción de Gram. A diferencia de las bacterias
grampositivas, las gramnegativas presentan una segunda membrana lipídica externa a la
pared celular.3

II. MATERIAL Y MÉTODOS

Materiales

 Asa bacteriológica

 Microscopio, mechero

 Agua destilada

 Equipo de tinción gram

 Medios de cultivo
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Métodos

o Recoger muestras para ubicarlas en el microscopio.

o Hacer el extendido con un palillo de madera.
o Dejar secar a temperatura ambiente o fijarlas utilizando un mechero.
o Fijar la muestra con metanol durante un minuto o al calor (flameado tres veces
aproximadamente).
o Agregar azul violeta (cristal violeta o violeta de genciana) y esperar un minuto.
o Enjuagar con agua no directamente sobre la muestra
o Agregar lugol y esperar un minuto aproximadamente.
o Agregar alcohol acetona y esperar entre 5 y 30 segundos según la concentración del
reactivo (parte crítica de la coloración). (las gram - se decoloran, las gram + no)
o Enjuagar con agua.
o Tinción de contraste agregando safranina o fucsina básica y esperar un minuto. Este
tinte dejará de color rosado-rojizo las bacterias gram negativas.
o Lavar levemente con agua.
o Para observar al microscopio óptico es conveniente hacerlo a 100x con aceite de
inmersión.

En la observación de mycobacterium tuberculosis El medio de cultivo más usado

y más adecuado es el de Lowenstein Jensen. También se utiliza el medio Ogawa.

Para que el desarrollo de la bacteria sea visible macroscópicamente (a simple

vista) sobre el medio de cultivo se requieren por lo menos 15 días, y hasta ocho

semanas de incubación. Se debe incubar un promedio de 30 días. Sus colonias son

de color blanco cremoso, esféricas, secas, rugosas, opacas, polimorfas y de

dimensiones variables.
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III. RESULTADOS

Figura 01. Streptococcus sp.

Bacterias: grampositivas en forma de cadena

Aumento: 100x

Figura 02. Bacillus sp.

Bacterias: gramnegativas

Aumento: 100x

Figura 03. Staphylococcus aureus

Bacterias: grampositivas

Aumento: 100x
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Figura 04. Mycobacterium tuberculosis

Bacteria: acidorresistente

Aumento: 100x

Figura 05. Bacteria: S. aureus

Cultivo: Agar Chapman

Figura 06. M. tuberculosis en medio de Löwenstein-Jensen

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IV. DISCUSION

Muchas especies de bacterias gramnegativas causan enfermedades. Algunos cocos

gramnegativos causan la gonorrea (Neisseria gonorrhoeae), la meningitis (Neisseria
meningitidis) y síntomas respiratorios (Moraxella catarrhalis), entre otros. Los bacilos
gramnegativos incluyen un gran número de especies. Algunos de ellos causan principalmente
enfermedades respiratorias (Haemophilus influenzae, Klebsiella pneumoniae , Legionella
pneumophila, Pseudomonas aeruginosa), enfermedades urinarias (Escherichia coli, Proteus
mirabilis, Enterobacter cloacae, Serratia marcescens) y enfermedades gastrointestinales
(Helicobacter pylori, Salmonella enteritidis, Salmonella typhi). Otros están asociadas a
infecciones nosocomiales (Acinetobacter baumanii).
Bacterias Grampositivas incluyen especies tanto móviles (vía flagelos) como inmóviles con
forma de bacilo (Bacillus, Clostridium, Corynebacterium, Lactobacillus, Listeria) o coco
(Staphylococcus, Streptococcus); con gruesas paredes celulares o sin ellas (Mycoplasma).
Algunas especies son fotosintéticas, pero la mayoría son heterótrofas. Muchas de estas
bacterias forman endosporas en condiciones desfavorables.4 Realmente, no todas las
bacterias del grupo son grampositivas (no se tiñen por la aplicación de ese método), pero se
incluyen aquí por su similitud molecular con otras bacterias grampositivas.

Agar Manitol salado o siglas en inglés MSA (Manitol Salt agar) es un medio de cultivo que
se utiliza normalmente en microbiología. Permite el crecimiento de bacterias Gram-positivas
mientras inhibe el crecimiento de Gram-negativas. Este medio es importante en el laboratorio
clínico debido a que es capaz de distinguir los microorganismos patogénicos en un corto
periodo de tiempo. Contiene una alta concentración (~7.5%-10%) de sal (NaCl), haciéndolo
selectivo para Staphylococcus debido su alta concentración de NaCl es inhibitorio para la
mayoría de las bacterias Gram negativas. Además, contiene manitol otro inhibidor de
bacterias Gram negativas y un indicador de pH indicador de fermentación; rojo de fenol.
(Brock y col ;2003)
El medio de Löwenstein-Jensen es un medio de cultivo que se emplea en microbiología para
hacer posible el crecimiento de micobacterias, sobre todo Mycobacterium tuberculosis
(Bacilo de Koch), agente causal de la tuberculosis. Los nutrientes que proporciona este medio
facilitan el crecimiento de las micobacterias, con la excepción de Mycobacterium leprae,
agente causal de la lepra. Contiene verde malaquita que dificulta el desarrollo de la flora
microbiana potencialmente contaminante, sobre todo la gram positiva, y glicerina que actúa
como estimulante del crecimiento de M. tuberculosis. (Brock y col ;2003)
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V. CONCLUSIÓN

Se logró cultivar y hacer tinción de Bacterias.

El medio de Löwenstein-Jensen es un medio de cultivo para el M. tuberculosis.

El agar Chapman tiene una alta concentración de NaCl

Las bacterias grampositivas se tiñen de azul y las gramnegativas de rojo.

VI. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

• Brooks, G. F., Karen C. Carroll , Janet S. Butel, Stephen A. Morse, & Timothy A. Mietzner.

(2013). Jawet, Melnick y Adelberg Microbiología médica.25 edición. México. McGraw Hill

Lange.

•Madigan, M. T., Martinko, J. M., y Parker, J. Brock. (2003). Biología de los

Microorganismos. 10ª edición. Madrid. Prentice-Hall