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Las herramientas
moleculares
Extracción de ácidos nucleotidos 499
Capítulo 16
Extracción de ácidos nucleicos
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500 Las herramientas moleculares
El ADN en el laboratorio
Precauciones
ADN
Métodos de extracción
1. Lisis celular
2. Eliminación de proteínas
3. Precipitación y limpieza del ADN
• PURIGEN
• QUIAGEN
• MILIPORE
• GENTRA
• MoBio
Tratamiento previo
Lisis celular
Precipitación de proteínas
Precipitación de ADN
Mini-prep
Reactivos:
1. Moler 0.5 g de tejido fresco con nitrógeno líquido hasta obtener un polvo
fino. De ser posible, tratar de moler en un solo evento y no remoler la
muestra excesivamente (esto provoca que el ADN se fraccione).
2. Agregar 260 µl de CTAB y 975 µl de STE, agitando hasta obtener un jarabe.
3. Agregar 65 µl de SDS al 20% agitando vigorosamente por 5 minutos e
incubar a 65°C por 10 minutos.
4. Agregar 325 µl de acetato de potasio 5M frío e incubar a -20ºC por 40
minutos.
5. Centrifugar los tubos a 12 000 xg por 30 minutos.
6. Filtrar la fase acuosa con un trozo de algodón estéril insertado en la boca
del tubo (no muy apretado ni muy suelto) y sobre éste recuperar el sobre-
nadante en un tubo nuevo.
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Reactivos:
SDS 20%
Acetato de potasio 5 M
Acetato de sodio 3 M
ARN
Precauciones
Una vez colectado el material es necesario agregarle una solución que estabilice al
ARN lo antes posible, ya que los cambios en el patrón de expresión de los genes
debido a la degradación del ARN o a inducciones en la transcripción ocurren
inmediatamente. Debido a su estructura química el ARN es una molécula muy
frágil que puede romperse por acción de los grupos 2’-OH (altamente reactivos)
adyacentes al esqueleto de ribosa-fosfato. Existen paquetes comerciales para
estabilización de muestras de ARN de compañías como QIAGEN, Ambion y
RNA-works, que en general funcionan con una mezcla de anticuerpos específicos
para ribonucleasas, inhibidores de ribonucleasas y/o contienen compuestos que
neutralizan a los grupos 2’-OH (como es el caso de RNA-works).
Dado que las ARNasas no van a ser inactivadas en su totalidad en el autoclave,
resulta esencial trabajar con material estéril y de preferencia de un solo uso. El
material de vidrio debe lavarse con una solución 0.5 N de NaOH, enjuagarse tres
veces con agua de-ionizada y meterse al autoclave durante 2 horas. El material
de plástico deberá limpiarse con etanol absoluto y meterse al autoclave durante
45 minutos. Las micro esferas de vidrio, generalmente utilizadas en la extracción
para incrementar la lisis celular por acción física, deben someterse a combustión
durante 12 hrs. a 450º C y deben pasar en el autoclave 45 minutos.
Es importante que los reactivos que se utilicen en la extracción de ARN se
mantengan en alícuotas con los volúmenes mínimos necesarios para cada etapa
del proceso y en caso de ser posible se pasen dos veces por el autoclave.
Extracción de ácidos nucleotidos 513
El método utilizado con más frecuencia es el de GIPS (por sus siglas en inglés;
acido tiosanato de guanidina, fenol, sarcosyl) desarrollado por Chomczynski
y Sacchi (1987). Cada uno de estos componente juega un papel específico:
el ácido tiosanato de guanidina es sumamente fuerte y tiene un alto poder
denaturalizante; el fenol, al estar acidificado, provoca que el ADN se acumule
en la interfase entre la fase acuosa y la del fenol, dejando al ARN en la fase
acuosa; el sarcosyl, por su parte, es un detergente muy potente que ayuda a la
lisis celular, pero no reemplaza la ruptura física de las células que generalmente
se logra con micro esferas de vidrio agitadas con la ayuda de un vórtex o de
un homogenizador celular (como Bead-Beater). Sin embargo, es importante
tratar las muestras con ADNasas libres de ARNasas.
BOOM
El método BOOM, desarrollado por Boom et al. (1990) lleva a cabo la extrac-
ción con el ácido tiosanato de guanidina, separando los ácidos nucleicos con
base en su alta afinidad para enlazarse en matrices de sílica, en vez de utilizar
fenol. Dado que este método aisla tanto ADN como ARN, resulta esencial
utilizar las nucleasas específicas para ADN que lo eliminen de la muestra.
Algunas compañías han creado paquetes de extracción basados en este
principio, que utilizan matrices de sílica diseñadas para favorecer el enlace
de ARN (como RNeasy de QIAGEN).
Las moléculas grandes de ARN, incluyendo ARNr y ARNm, son insolubles
en soluciones con altas concentraciones de sal, por lo que durante su preci-
pitación es común utilizar cloruro de litio 8 M (libre de ARNasas) e incubar
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las muestras a 0ºC durante dos horas antes de centrifugar. Sin embargo, este
método no debe ser utilizado para ARN que será sometido a transcripción
reversa (véase más adelante).
Transcripción reversa
Bibliografía
Boom, R., C J Sol, M M Salimans, C L Jansen, P M Wertheim-van Dillen y J van der
Noordaa, 1990. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. Journal
of Clinical Microbiology 28(3): 495-503.
Chomczynski, P. y N Sacchi, 1987. RNA isolation from cultured cells. Analytical
Biochemistry 162: 156-159.
Doyle, JJ y JL Doyle, 1987.A rapid DNA isolation procedure for small quantities of
fresh leaf tissue. Phytochemistry Bulletin 19: 11-15.
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