11/12 - O SI em Funcionamento III.

Mecanismos de citotoxicidade

Citotoxicidade e ativação de macrófagos, etapas de migração celular, circulação linfocitária, distúrbios no

processo, situações ou casos clínicos associados a essa discussão, regulação do sistema em funcionamento.

Mecanismos envolvidos na função citotóxica observada no sistema imune ativado.

Citotoxicidade é uma ação tóxica sobre uma célula, que pode acontecer em várias situações. Duas dessas
situações terão destaque aqui, onde serão observadas determinadas células do sistema imune que têm a
capacidade, na hora de exercer sua ação efetora, de matar uma célula-alvo.

A principal célula citotóxica do sistema imunológico e a CÉLULA TCD8+, porém outra célula que também tem
uma importância fundamental em eventos de citotoxicidade é a CÉLULA NATURAL KILLER. Neste contexto
também é importante destacar grupos de moléculas fundamentais na execução da citotoxicidade (moléculas
que medeiam ou definem o mecanismo pelo qual estas células citotóxicas (TCD8+ e NK) levam a morte da
célula-alvo).

Existem outros componentes (inúmeras vezes substâncias solúveis), produzidos pelo sistema imunológico, que
também podem induzir a morte. Nesses processos também há componentes que podem evitar a morte.

Num sistema onde há uma célula infectada, o reconhecimento desta célula-alvo por uma célula TCD8+ requer a
presença de um peptídeo (derivado do antígeno) apresentado na fenda do MHC I, pois apenas a molécula CD8
consegue interagir bioquimicamente com as porções monomórficas (... que não variam, que não são definidas
pelo polimorfismo gênico) do MHC de classe I. Dessa forma, conclui-se que os antígenos-alvo da célula TCD8+
são aqueles apresentados pelo MHC I, ou seja, aqueles que geram peptídeos a partir do citosol, sendo que a
fenda do MHC I é preenchida pelo peptídeo em nível de retículo endoplasmático, numa ação mediada por
moléculas transportadoras dependentes de ATP conhecidas como TAP-1 e TAP-2 (transportador associado
ao processamento de antígenos). Estas moléculas transportam peptídeos do citosol para o retículo
endoplasmático, onde os peptídeos podem se associar a moléculas de MHC I recém-formadas.

(ABBAS) "A proteína TAP está localizada na membrana do RE, onde medeia o transporte ativo dependente de
ATP de peptídeos do citosol para o lúmen do RE".

"Os resíduos polimórficos das moléculas de MHC classe I estão confinados aos domínios alfa um e alfa dois. O
segmento alfa três da cadeia se dobra para formar um domínio de Ig, cuja sequência de aminoácidos é a
mesma em todas as moléculas de MHC de classe I. Esse segmento contem uma alça que serve de local de
ligação para a molécula CD8".

A partir do momento em que há o reconhecimento específico, permite-se então a ação efetora da célula
TCD8+, que é levar essas células-alvo à morte.

A morte celular programada (apoptose) tem importância fundamental no organismo. Neste processo não
acontece lise celular, mas sim encolhimento da célula e, principalmente, uma condensação do núcleo com
posterior desintegração deste. Este é um processo fundamental de homeostasia no organismo, pois, quando
acontece isto, sinais são gerados nesta célula e então esta passa a ser alvo também de outras células do
organismo, principalmente macrófagos e células dendríticas, que definem que esta célula tem que ser retirada
do sistema antes que cause inflamação.

Outro tipo de morte comum é a necrose celular por lise e liberação de conteúdos intra-celulares no meio
externo, o que gera grande processo inflamatório.

*Apenas para saber, existem dois tipos de apoptose. Uma delas é a apoptose induzida mediante ativação.
Outro tipo é uma apoptose não-induzida por ativação, mais natural/fisiológica. Os mecanismos são diferentes.
A natural acontece, por exemplo, no SNC no momento em que um neurônio não funciona bem, simplesmente por
ter privação de algum fator, impedindo um processo inflamatório no SNC. Este tipo também existe no sistema
imune. Caso haja ausência do fator de crescimento IL-7 para pré-Ts, no timo, acontece morte por apoptose
por privação de fator.

ABBAS - Fig. 9.4

A) O processo de infecção de uma célula dendrítica, por si só, já provoca um amadurecimento desta célula, de
forma que ela passa a ter aumento na expressão de MHC e aumento da expressão de moléculas B7 em sua
membrana, o que permite primeiro e segundo sinal e ativação de uma célula TCD8+ diretamente. Neste caso
não é necessária a célula TCD4+. Essa regra vale para um certo número de respostas imunes onde a célula
TCD8+ participa.

B) Porém, em várias respostas de células T (principalmente em respostas anti-vírus, mas também em processos
de rejeição de transplante) a presença das células TCD4+ é necessária para uma resposta citotóxica eficiente.
Este fato é observado em animais cujas células TCD4+ estão ausentes ou em pacientes que possuem defeitos
nas células TCD4+, onde a AIDS é um exemplo clássico. Nessa síndrome a célula-alvo é claramente a célula
TCD4+, de forma que, no início, a resposta citotóxica permanece ativa e funciona bem durante bom tempo, mas
quando o número de células TCD4+ cai a um nível muito baixo, até a resposta citotóxica deixa de ser de fato
efetiva, podendo levar o indivíduo a morte.

C) Provavelmente, uma situação que pode ser considerada ótima é quando uma célula TCD4+ efetora reconhece
o peptídeo específico exibido por uma APC e auxilia esta APC a ser ativada. Isso leva a produção de IL-2 por
essa APC, de forma que uma célula TCD8+ (que também é específica a um peptídeo do mesmo antígeno-alvo)
possa usar a IL-2 produzida por essa APC, levando a ativação dessa célula TCD8+ e fazendo com que ela entre
em expansão clonal.

A célula TCD8+ é muito mais exigente que a célula TCD4+ para ser ativada. A célula dendrítica tem que possuir
bastantes moléculas B7 para ativar a célula TCD8+ diretamente. Caso contrário, é necessário uma ligação
entre as duas células que facilite todo o processo para que as células TCD8+ possam ser ativadas mediante co-
estimulação, assim também podendo usar a IL-2 dessa APC ou ela própria produzir IL-2 que age
autócrinamente fazendo expansão clonal. Quer dizer, a presença da célula TCD4+ neste contexto é
fundamental.

OS PRINCIPAIS COMPONENTES EXISTENTES NA CÉLULA TCD8+.

Uma das características da célula TCD8+ é a presença de pequenos grânulos específicos em seu citoplasma. A
célula TCD4+ não os têm. Ela não é uma célula granulocítica. Estes grânulos contêm três componentes:
Um destes componentes é a PERFORINA, cuja ação é muito parecida com o complexo de ataque à membrana do
sistema complemento, embora os grânulos produzam poros bem pequenos.
Outro componente é a GRANZIMA. As granzimas são um grupo de enzimas proteolíticas que podem ter acesso ao
interior celular precisamente utilizando esses poros ou por transporte ativo (sem a necessidade dos poros).
Compreendem serino proteases que tem efeito crucial na indução da apoptose. O mesmo acontece com outro
componente chamado GRANULISINA.
(ABBAS) "Uma outra proteína encontrada em grânulos de CLTs ( e células NK) humanos,chamada granulisina,
pode alterar a permeabilidade das membranas das células-alvo e microbianas".

(Janeway) Figura obtida de cinematografia. Ação citolítica contra uma célula-alvo.

Linfócito TCD8+ específico agindo contra uma célula-alvo (p.ex., infetada por um vírus). Em vermelho estão
representados grânulos da célula citotóxica. Observar-se que as superfícies de ambas as células estão
aderidas. Com um minuto de uma interação estável, já há movimentação dos grânulos citolíticos. Após quarenta
minutos, os grânulos já foram mobilizados de um pólo ao outro da célula. Todos os conteúdos desses grânulos
estão voltados para a área de contato com a célula-alvo, ocorrendo então a exocitose dos grânulos e indução
de apoptose das células-alvo.
PROCESSO DE INTERAÇÃO COM A CÉLULA-ALVO

O contato inicial da célula TCD8+ citotóxica com a célula-alvo se dá por um conjunto de moléculas de adesão
(LFA-1 e ICAM-1) que conferem os primeiros sinais para que haja uma interação estável entre a célula efetora
e a célula-alvo.

Caso a célula-alvo não esteja infectada (caso ela não tenha o peptídeo específico para o TCR da célula TCD8+),
mesmo que haja esta interação inicial, não haverá a etapa seguinte, que consiste na ligação TCR+MHC (sinal um)
e posterior conformação final mais ativa da integrina LFA-1 no Linfócito.

*A molécula ICAM-1 está presente (praticamente) em todas as células do organismo e várias células possuem
LFA-1 (principalmente leucócitos em geral), inclusive Linfócitos. Porém, somente Linfócitos ativados a possuem
em maior quantidade e com maior afinidade por moléculas ICAM-1.

Para a célula TCD8+, a diferença no processo de interação entre LT-CD (célula dendrítica) e LT-Célula-alvo
(respectivamente, no órgão linfóide secundário e no tecido-alvo) é que no órgão linfóide secundário se lida com
uma célula T virgem, sendo indispensável o segundo sinal mediado por B7. Assim, a célula-alvo não apresenta a
molécula B7, de forma que no tecido-alvo é necessária somente a interação LFA-1+ICAM-1 para que seja
disparado o sinal de morte celular.

EXEMPLO
Um vírus penetra no organismo e tem receptores nos hepatócitos, infectando-os. Uma Célula Dendrítica do
parênquima hepático faz a captura deste vírus e, ao amadurecer, segue até o órgão linfóide secundário.
Durante o processo de recirculação linfocitária, o LT específico para o vírus da Hepatite C precisa enxergar
este peptídeo viral na Célula Dendrítica e ser ativado. Sendo ativado, o LT segue até o tecido hepático, onde
acontece a interação com a célula-alvo.

Obs: Em micrografia eletrônica, é possível observar a movimentação dos grânulos citolíticos em direção ao pólo
onde está a célula-alvo (movimento este que acompanha todo o modelamento dos filamentos de tubulina).

(JUNQUEIRA) "A polimerização de tubulinas para formar microtúbulos é dirigida por estruturas celulares
conhecidas como centros organizadores de microtúbulos - ou complexos organizacionais dependentes de
microtúbulos (MDOCs) - e incluem os centríolos, corpúsculos basais de cílios e flagelos, e centrômeros de
cromossomos".

(ABBAS) "A ativação do CTL induz tal reorganização do citoesqueleto que o centro organizador de
microtúbulos do CTL se move para a área do citoplasma perto do contato com a célula-alvo. Os grânulos
citoplasmáticos são transportados ao longo de microtúbulos e são concentrados na região de sinapse, e a
membrana dos grânulos se funde com a membrana plasmática no domínio secretório. A fusão das membranas
resulta em exocitose do conteúdo dos grânulos do CTL para dentro do espaço confinado dentro do anel
sináptico, entre as membranas plasmáticas do CTL e a célula-alvo".

A exocitose é focalizada para o ponto onde há as interações LFA-1+ICAM-1 e TCR+MHC. Desta forma, a
exocitose dos grânulos citolíticos ocorre somente para esta área de interação. A importância da focalização no
disparo consiste na capacidade tóxica do conteúdo dos grânulos, impedindo o espalhamento destes para células
vizinhas. Forma-se então uma SINAPSE IMUNOLÓGICA onde os conteúdos granulares são lançados de tal forma
que apenas a área adjacente dessa célula seja alvo da ação citolítica.
Neste momento, o que garante a integridade da célula T contra seus próprios grânulos é o movimento de
reorganização do citoesqueleto que focaliza o disparo em um ponto e usa o gradiente de concentração menor
na célula-alvo.
CÉLULA NATURAL KILLER

Age na imunidade natural, antes da resposta adaptativa. É uma célula que não tem especificidade no sistema,
pois não possui receptores antigênicos. São células "matadoras naturais", derivadas de um precursor linfóide,
parecida em micrografias com LTs CD8+, porém não são linfócitos. São células que matam outras células de
forma igual aos LTs CD8+, também possuindo grânulos, CD95L (FasL), etc, só faltando o TCR.

Exemplo:
Diante de uma infecção viral (que dura em torno de dez dias), há três principais fatores a serem discutidos:

1) A produção de várias citocinas fundamentais na resposta antiviral:

Interferons Tipo Um (alfa e beta), TNF-alfa e IL-12.

2) Produção de células NK.

3) Produção ou Ação da célula T citotóxica específica.

De início, há a produção de uma grande quantidade de citocinas inespecíficas (principalmente interferons do

tipo um) produzidas geralmente por células dendríticas ou por células do próprio parênquima infectado (células
do tecido conjuntivo, células epiteliais, etc).

Com poucos dias, observa-se uma clara e importante ação efetora da célula NK, pois esta célula não precisa de
especificidade no sistema. Ela precisa apenas de um sinal claro descrito mais adiante.

É importante lembrar que a resposta adaptativa começa a ser montada apenas em torno de 7 dias após o início
da infecção, sendo a resposta específica verdadeiramente efetora, diminuindo de fato a carga viral.
Interferons Tipo Um (principalmente) e células NK são importantes para controlar esta viremia, alcançando um
platô.

DIFERENÇA DA RESPOSTA ENTRE NK E CÉLULA TCD8+

A célula NK possui um conjunto de moléculas que interagem com outras moléculas presentes em células
infectadas por vírus. É importante entender que a célula NK só age quando reconhece algo anormal para si.
Assim, existe um conjunto de moléculas que inibem a ação das células NK, onde a principal delas é o MHC I.

A célula NK possui RECEPTORES INIBIDORES (grupo KIRs, CD94/NKG2, etc.) que interagem com o MHC I (sem
qualquer tipo de especifidade envolvida), gerando um sinal negativo para a si própria, inibindo naturalmente sua
ação efetora. Este sinal negativo dado por esta interação entre NK e MHC I é um sinal que inibe o sinal
ativador, ou seja, há um conjunto de sinais inibitórios que suprimem os sinais ativadores.

Duas situações cruciais em que as células NK são fundamentais são os casos de tumores e de infecções virais,
pois nestas duas situações as principais moléculas-alvo são as moléculas de MHC I, ocorrendo uma redução na
expressão destas moléculas.

Então, nestes momentos, antes da célula TCD8+ específica (que será fundamental em controlar o processo
infeccioso como um todo), este processo de infecção viral só não é maior, pois se tem outros componentes
inespecíficos que ajudam no controle da replicação viral: Interferons Tipo Um e células NK.
Estes componentes estabilizam a janela imunológica (um dado momento da infecção em que não há resposta
efetiva de controle da replicação, fenômeno do qual o vírus faz uso para se disseminar).

O mecanismo efetor de células NK é o mesmo de CTLs, mas uma diferença crucial é que, na maior parte das
vezes onde as células NK estão agindo, há também a participação de IgG, ou seja, do braço adaptativo da
resposta imunológica. Este é um fenômeno conhecido como ADCC, sigla que significa: citotoxicidade mediada
por células e dependente de anticorpos.
Se há a participação de anticorpos IgG, significa que houve: ativação da célula B, transformação em plasmócito
e geração de anticorpos dependentes da interação CD40-CD40L. Estes anticorpos, em algum momento, ligam-se
na célula-alvo e daí então estimulam a ação efetora da célula NK. Isso porque a célula NK, assim como o
macrófago e o neutrófilo, possui receptores para a porção Fc de IgG.

Assim, se há uma Ig que reconhece algum componente de uma célula tumoral ou de uma célula infectada por
vírus, a célula NK aproxima-se e induz a apoptose desta célula infectada. Assim, nesta situação, existe um
mecanismo de reconhecimento fundamental pela célula NK, mas que certamente ocorrerá em uma etapa mais
tardia da resposta imunológica.

Alguns tumores chegam a extinguir a expressão de MHC I. E a redução prolongada na expressão da molécula
MHC I tornaria ineficiente a resposta TCD8+. Porém, em exemplo de boa parte das infecções virais, a célula
TCD4+ também pode agir, já que também possui FasL e assim pode matar células infectadas (não tão
eficientemente quanto o LT CD8+). Além do mais, uma única célula TCD8+ pode conseguir reconhecer o
complexo específico (mesmo com expressão reduzida) e expandir.

(ABBAS). "Sob ativação, os CTLs expressam uma proteína de membrana, chamada FasL, que se liga ao
receptor de morte Fas (CD95), o qual é expresso em muitos tipos celulares. Essa interação também resulta na
ativação de caspases e apoptose de alvos". "Algumas células TCD4+ são também capazes de eliminar células-
alvo (as quais, logicamente, devem expressar peptídeos associados ao MHC de classe II para serem
reconhecidas pelas células CD4+). As células T CD4+ são deficientes em perforina e granzimas, e os FasL pode
ser mais importante para sua atividade de morte".

(ABBAS) Quadro 11.1

Figura que mostra a interação entre o receptor trimérico de Fas e o seu contra-receptor ou ligante, o FasL.

Após a ligação de FASL à molécula FAS, esta última interage através de seu domínio de morte com o domínio
de morte da molécula FADD ( ou seja, há interação de forma homóloga) e leva à formação de uma pró-enzima,
a PRÓ-CASPASE 8. Esta pró-caspase 8 passa a ser ativada, transformando-se na CASPASE 8, que então age na
pró-caspase 3 (que se torna caspase 3), até culminar num complexo enzimático cuja ação principal é a geração
de endonucleases, enzimas que chegam ao núcleo e cortam o DNA em pontos específicos, condensando a
cromatina e depois desagregação desses núcleos em pequenos corpos apoptóticos.

"A porção intracelular de Fas contém um domínio de interação proteína-proteína conhecido como domínio de
morte. Uma proteína adaptadora contendo domínio de morte chamada FADD (domínio de morte associado à
Fas) liga Fas a outra caspase iniciadora, pró-caspase 8, na face interna da membrana plasmática. A ligação de
Fas por FasL leva à ativação de caspase 8 e, consequentemente, à indução de apoptose".

Obviamente, nós temos vários mecanismos da REGULAÇÃO DA APOPTOSE. Há outros conjuntos de moléculas,
como a BCL (e outras moleculas associadas, como a Bax, etc.), que contrapõem o efeito de apoptose. São
moléculas que tendem a nos proteger da apoptose.