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Tanques (vidro – pequena escala): aço inox de elevado grau com superfície interna muito polida para minimizar a

adesão microbiana às paredes.

 A mistura e a dispersão de bolhas são conseguidas por agitação mecânica (STR), o que requer elevada
entrada de energia por unidade de volume.
 Vaso cilíndrico com fundo hemisférico e topo plano.
 Design deve evitar espaço morto ou zona estagnante.
 Frequência da amostragem (não mais de 10% do volume original).
 Controlo de espumas (mecânico ou químico).
 Condensador associado à saída do gás e filtros de saída.

Serpentinas internas: oferecem maior área de transferência de calor mas podem interferir com a mistura; tornam a
limpeza do reator mais difícil; biofilme pode afetar transferência.

O permutador de calor externo é independente do reactor, fácil de scale-up, fornece melhores transferências de
calor. Contudo, i) as condições de esterilidade devem ser conseguidas, ii) as células devem ser capazes de suportar
as forças de atrito durante a bombagem e, iii) em fermentações aeróbias o tempo de residência no permutador de
calor deve ser baixo para assegurar que o meio não fica esgotado em oxigénio.

Mistura – é o processo que promove a homogeneidade de um sistema. Num sistema bem misturado (homogéneo)
não encontramos variações espaciais nas variáveis que o descrevem.
Pode ser feita através de:
 Convecção ou movimento em massa – homogeneidade a escala macroscópica (macromistura);
 Dispersão ou turbulência - pequenas fracções autónomas defluido em remoinho (vórtices) se
interpenetram devido à variação aleatória do valor e direcção da sua velocidade, produzindo
homogeneidade a uma escala intermédia
 Difusão - homogeneidade é produzida por interpenetração à escala molecular (micromistura) e
independentemente do regime (turbulento, laminar ou mesmo em repouso).
Embora estes 3 mecanismos possam ser simultâneos, a sua escala de tempo é diferente, sendo a micromistura a
mais rápida e a macromistura a mais lenta e, por isso, limitante.
Para conseguir uma rápida mistura num tanque agitado, o agitador deve fornecer uma boa circulação global ou
macroscópica. A verificação da eficiência da mistura pode assim ser reduzida à medida da velocidade de fluxo global.
O tempo de mistura (tm) é um parâmetro útil para verificar a eficiência da mistura e é aplicado para caracterizar o
fluxo global em fermentadores e reactores. É o tempo necessário para atingir um certo grau de homogeneidade
partindo de um estado de segregação completo.
Para medir este parâmetro pode ser injetado um tracer no tanque e ser feito o seguimento da sua concentração
num ponto fixo do tanque. Tracers mais comuns: ácidos, bases e soluções concentradas de sais. Receptores:
electrodos de pH e células de condutividade.
Também pode ser determinado através da resposta à temperatura após adição de uma pequena quantidade de
líquido quente.

Normalmente é definido como o tempo após o qual a concentração do tracer difere da concentração final menos de
10% da diferença de concentração total.
Para t=tm, a concentraão do tracer é relativamente estável e a composição do fluido é aproximadamente uniforme.
Utilidade: fornecer informação acerca da eficácia do grau da mistura, isto é, se heterogeneidades indesejáveis
criadas no sistema são ou não eliminadas antes de produzirem efeitos nefastos sobre o bioprocesso.
Os STR são usados quer para reacções enzimáticas (livres ou imobilizadas) quer para cultura de células (suspensas ou
imobilizadas).
É preciso ter cuidado com catalisadores particulares que podem ser afectados ou destruídos pelas velocidades
elevadas da turbina. Elevadas tensões de corte podem afectar células sensíveis (caso de culturas de células animais).

Bubble columns: estrutura muito simples, baixo custo capital, ausência de partes movéis, desempenho satisfatório
na transferência de massa e calor (pratos perfurados para quebrar bolhas coalescentes; existem problemas de
espumas).
Ocorrem diferentes regimes de fluxo que dependem de: caudal de gás, desenho do sparger, diâmetro da coluna e
propriedades do meio (p.e. viscosidade).
Fluxo homogéneo – ocorre apenas a baixos caudais de gás e quando as bolhas que deixam o sparger são
igualmente distribuídas por toda a secção recta da coluna. Em fluxo homogéneo, todas as bolhas sobem com a
mesma velocidade e não há backmixing da fase gasosa. A mistura do líquido neste regime de fluxo é limitada e
apenas resulta do remoinho das bolhas.
Fluxo heterogéneo – ocorre em condições normais de operação a altas velocidades do gás, desenvolvem-se
células de fluxo circulatório, altamente caóticos. Neste regime as bolhas e o líquido tendem a subir pelo centro da
coluna, enquanto o líquido desce junto às paredes. A circulação do líquido arrasta as bolhas pelo que já ocorre algum
backmixing do gás.
Stirred versus Air-driven reactors
Tanques agitados, colunas de bolhas e vasos air-lift são as configurações de biorreactores mais usadas para cultura
aeróbia; para fluidos de baixa viscosidade permitem mistura e transferência de massa adequada.
Sendo necessário um grande fermentador (50-500 m3) para cultura de baixa viscosidade, a coluna de bolhas é
simples e barato de instalar e operar.
Se a cultura tem elevada viscosidade a agitação mecânica fornece uma maior potência (volumes < 500 m3); contudo
as velocidades de transferência massa decrescem rapidamente para m > 50-100 cP.

Desintegração Celular:
A parede celular, bioquimicamente é o agente regulador e controlador
de troca de nutrientes e metabolitos com o ambiente. Mecanicamente
protege a célula de agressões físicas devido à agitação, tensões de corte,
pressões hidrostáticas e osmóticas.

Os polissacarídeos, as proteínas e os lípidos


entram nas paredes celulares das bactérias em
associações macromoleculares;
O peptidoglicano, mucopéptido ou mureína é
constituído por N-acetil-glucosamina [NAG] e
ácido N-acetil murâmico [NAM]);
Paredes das bactérias Gram+ são mais
espessas do que nas Gram- (com 3 camadas);
Camada de fora das Gram- tem: proteínas e
lipopolissacarídeos;
Camada de dentro (membrana plasmática) é
constituída por fosfolípidos com proteínas e
iões metálicos dispersos.
As 3 camas possuem diferentes funções. As membranas exteriores e as camadas de peptidoglicano providenciam força
mecânica, sendo a sua rutura o objetivo principal na desintegração celular.

A membrana plasmática mais fraca (a camada mais interior) controla a permeabilidade da célula, incluindo o transporte
de nutrientes para o seu interior e saída de metabolitos para a solução circundante.
Os métodos mecânicos são mais agressivos, mais
rápidos e mais económicos em grande escala—
Homogeneizador de Alta Pressão;

Fenómenos que contribuem para a rutura da parede


celular: turbulência, tensão de corte por parte do
líquido e cavitação;

Grau de desintegração é afetado por: nº de passagens,


pressão, concentração de células, temperatura e
geometria da válvula de entrada.

Homogeneizador de alta pressão Cinética de 1ª ordem em relação ao nº de


passagens, N;

R- quantidade de composto libertado para


o meio;

Mais passagens dá suspensões mais


viscosas e perda de actividade devido ao
atrito e temperatura.

Método mais eficaz e o equipamento mais usado na indústria


devido à facilidade de aumento de escala e de operação em
Moinho de Bolas (Bead Mill)
contínuo;

Mecanimos de desintegração são as colisões e as tensões de


corte. O rendimento de desintegração é afetado pela velocidade
de agitação. Bolas de vidro < 1.5mm; sistema de arrefecimento.

K depende do tipo de células, agitador, velocidade de agitação,


tamanho das bolas e temperatura. Caudais processados < aos do
homogeneizador, mas são necessárias várias passagens.
Os métodos mecânicos de ruptura celular têm desvantagens: i) requerem elevada energia; ii) são não selectivos; iii)
promovem elevadas temperaturas e tensões de corte que desnaturam compostos sensíveis; iv) a presença de ácidos
nucleicos promove aumento de viscosidade.

Alternativa: métodos de permeabilização física, química e enzimática.

Os métodos de permeabilização física (choque osmótico, ciclos de congelamento/descongelamento e choque


térmico) são usados para bactérias Gram-, cuja camada de peptidoglicano é mais fina.

Os métodos químicos alteram a permeabilidade da célula sem afectar a sua morfologia (tensioactivos – SDS, Triton
X-100; solventes orgânicos – tolueno; quelantes – EDTA; NaOH para fragilizar levedura de padeiro).

Os métodos enzimáticos são atractivos: - aumentam a selectividade do produto libertado (facilita o isolamento e
purificação); - aumentam a velocidade e rendimento de extracção; - minimizam os danos nso produtos; - requerem
condições moderadas de pH e T.

Necessidade da acção sinergética de várias enzimas. Para bactérias: glycosidases, N-acetylmuramyl-L-alanine


amidase e peptidases ajudam a degradação do peptidoglicano, mas nas Gram- é necessário um pré-tratamento com
agente tensioactivo para remover a dupla camada lipídica.

O peptidoglicano é um heteropolímero com cadeias compridas com aminoácidos enxertados, que estabelecem
ligações covalente com outros a.a. de outras cadeias, dando origem a uma rede resistente à volta da célula.

A lisozima (lágrimas, saliva) hidrolisa as paredes das bactérias por quebra da ligação entre os dois monómeros.

A penicilina impede as ligações covalentes entre os a.a. das várias cadeias.

 Nas células de leveduras as enzimas de lise usadas são proteases, glucanases, manases, quitinases, …
 O custo elevado das enzimas.
 Capacidades autolíticas das células, usando um factor ambiental como controlo externo (T, indução
 química, infecção por bacteriófagos).
 Clonagem de enzimas líticas, com um promotor controlável.
 Libertação diferencial de produtos.
 Em tecnologia do DNA recombinante, provocar a excreção da proteína recombinada por manipulação do
gene que a codifica.

A desnaturação compreende a destruição da estrutura terciária de uma molécula de proteína e a formação de


cadeias polipeptídicas ao acaso.
- as variáveis pH, temperatura e solventes orgânicos, dependendo dos valores, causam desnaturação das proteínas.
A precipitação compreende a modificação da estrutura tridimensional da molécula de proteína.
- as mesmas variáveis, dependendo dos valores, causam precipitação das proteínas.
A precipitação deve permitir que a conformação adequada da proteína seja recuperada, para que esta possa
“exercer” sua função bioquímica após o processo.
A precipitação de proteínas constitui um dos primeiros métodos de concentração, separação e purificação de
bioprodutos. Depois da precipitação, segue-se uma separação sólido-líquido.
Positiva: precipita o bioproduto e reduz o volume a ser processado (evitar contaminação);
Negativa- precipitam as impurezas (evitar perda de proteína).
Na recuperação de enzimas intracelulares, a precipitação vem antecedida da rotura celular e da remoção de ácidos
nucleicos (viscosidade).
A precipitação de proteínas é induzida pela adição de um reagente ou pela variação das condições ambientais. A
acção dos reagentes de precipitação tem de ser explicada pela estrutura das proteínas e pelas suas propriedades de
superfície.
A solubilidade das proteínas em diferentes solventes é determinada pela distribuição de resíduos hidrófilos e
hidrófobos à superfície das moléculas. Balanço de forças electrostáticas e hidrofóbicas. É afetada por: temperatura,
pH, força iónica e constante dieléctrica.
Pretende-se uma precipitação fraccionada, isto é, selectiva de proteína para proteína.
O grande obstáculo à utilização de processos de precipitação é
a baixa concentração dos produtos de fermentação.
Vantagens: fácil aumento de escala, operação em contínuo,
equipamento simples, uso de diferentes agentes e condições
precipitantes.
Classificação das proteínas quanto à solubilidade: albuminas
(água); globulinas (solução salina; prolaminas (solução
alcoólica); glutelinas (solução alcalina).

Quando adicionamos sais neutros a uma solução, ocorre um


aumento da força iônica do sistema. Assim, quando adicionamos
pequenas quantidades de sal a uma solução contendo proteínas,
as cargas provenientes da dissociação do sal passam a interagir
com as moléculas protéicas, diminuindo a interação entre elas.
Conseqüentemente, temos um aumento da solubilidade da
proteína no meio aquoso. as interações proteína - proteína,
favorecendo a solubilidade das mesmas. A esse fenômeno dá-se
o nome de "salting-in".

Precipitação com sais – “Salting-Out”: Neutralização das cargas superficiais com redução da camada de hidratação
Numa solução aquosa de proteína, quando se adiciona uma determinada quantidade de sal neutro, a água (que
apresenta um elevado poder de solvatação), passa a interagir com as duas espécies presentes na solução – as proteínas
e os iões provenientes da dissociação do sal adicionado. Uma vez que as moléculas de água apresentam uma maior
tendência de solvatação de partículas menores (os iões), estas “abandonam” a estrutura proteica, permitindo
interações hidrófobas proteína-proteína. Este fenómeno conduz a uma menor solubilidade em meio aquoso e,
consequentemente, leva à precipitação da proteína. (A camada de hidratação é parcialmente removida e as interações
proteína-proteína tornam-se relevantes, principalmente no que diz respeito à interações hidrofóbicas). A este
fenómeno de insolubilização da proteína devido a um considerável aumento da força iônica do meio dá-se o nome de
"salting-out".
-Sulfato de amónio entre 40 a 60% da saturação; Os sais mais
eficazes são os aniões multivalentes, citratos, fosfatos e sulfatos da
série Hoffmeister.
Selecção do sal: poucas impurezas; dissolução pouco exotérmica (desnaturação); máxima diferença de densidades
entre solução e sal (centrifugação); sais de K– pouco solúveis; Na2SO4 só é solúvel próximo de 35- 40ºC (cristalização);
citratos só para pH>7; NH4+ só para pH<8; (NH4)2SO4 é barato, solúvel, contém poucas impurezas mas é corrosivo e
difícil de remover (diálise, ultrafiltração ou filtração gel).
Ammonium Sulfate is the preferred salt because it is high on the Hofmeister series and has a high solubility rate. It
can either be added to the protein solution, or the solution can be poured onto a measured amount of ammonium
sulfate. The process takes about a half hour to an hour before the mixture is sent to the centrifuge. Dentre os sais
utilizados para promover a precipitação de proteínas, o sulfato de amônio destaca-se por ser altamente solúvel,
forma soluções de baixa densidade e seus iões possuem posição favorável na série de Hofmeister com relação à
efetividade de precipitação. Além disso, o sal apresenta baixo custo, alta pureza, impede a proliferação de bactérias
na solução e não apresenta efeitos desnaturantes
Quando ocorre a precipitação de proteínas por sais, é formado um sistema bifásico constituído de uma fase líquida
concentrada em eletrólito e uma fase composta contendo a proteína precipitada e uma grande quantidade de fase
líquida salina, ou sal ligado intrinsecamente à proteína. Isto constitui uma desvantagem, pois são necessários
tratamentos subsequentes como diálise ou diafiltração para a eliminação do sal presente no precipitado e o
processamento da fase líquida para sua reutilização ou descarte. Esses tratamentos limitam em parte as aplicações do
processo de precipitação por “salting-out” devido ao custo dos mesmos. Outra técnica para promover a precipitação
de proteínas é a adição de solventes orgânicos, como o etanol e a acetona.
Variação de Temperatura
Além do pH, outro parâmetro que influencia a precipitação de proteínas em soluções de sais é a temperatura.
Mantendo a concentração de sal constante e variando a temperatura é possível fracionar uma solução contendo
proteínas. Após a precipitação por qualquer um dos métodos apresentados, as proteínas são geralmente recuperadas
por centrifugação e utilizadas nas etapas seguintes de concentração e purificação.

 0 – 40ºC – solubilidade aumenta;


 40 – 50ºC – desnaturação (menos solúveis e precipitam – “cozimento” das proteínas; “fouling”)

Variação de pH

A precipitação isoelétrica é uma técnica que explora o fato das proteínas apresentarem baixa solubilidade no seu
ponto isoelétrico. Nesta técnica, ajusta-se o pH do meio até que este seja igual ao ponto isoelétrico (pI) da proteína.
Neste pH, a carga líquida da molécula é nula, e a repulsão eletrostática entre as moléculas é mínima, prevalecendo
as interações hidrofóbicas proteína-proteína. Em alguns casos, podem ocorrem desnaturação e inativação da
proteína precipitada, o que torna esse processo útil na remoção de proteínas indesejáveis da solução que contém a
proteína-alvo, desde que nas condições de precipitação a proteína alvo seja estável.

- Precipitação isoeléctrica – proteínas têm solubilidade mínima no seu ponto isoeléctrico – hidratação mínima,
maiores interacções hidrofóbicas e precipitam, ex caseína.

- A variação de pH é um método de precipitação fraccionada com interesse industrial, dado o baixo custo e os ácidos
fosfórico, hidroclórico e sulfúrico serem aceitáveis nas proteínas para alimentação.

- A gama de pH para a estabilidade das proteínas é limitada; extremos de pH desnaturam rápida e irreversivelmente
as proteínas. Técnica usada em conjunto com solventes orgânicos.
Adição de solventes - orgânicos
+ Região
+
- Hidrofóbica
+
+ Solvente
--
- Orgânico
-

+
+
- + -
-
-
- -
+ - ++ +
- + - -
-
+ -

A adição de solventes orgânicos promove a precipitação de proteínas devido à diminuição da atividade da água na
solução, pois a água é substituída pelo solvente orgânico. A adição do solvente provoca a diminuição da constante
dielétrica da solução, intensificando as forças de atração entre as cargas opostas das moléculas de proteína, reduzindo
o poder de solvatação destas moléculas pela água, uma vez que há o deslocamento e imobilização parcial das
moléculas de água para a hidratação do solvente orgânico. Nesse processo, as variáveis: concentração do solvente
orgânico, concentração de proteína, pH, força iônica e temperatura são mantidas sob controle. É imprescindível que
as operações de precipitação com solvente sejam feitas a baixa temperatura, para evitar a desnaturação das proteínas.
Como a adição de um solvente orgânico diminui o ponto de congelamento da solução, podem ser utilizadas
temperaturas inferiores a 0 °C.

(Este tipo de solvente apresenta valor de constante dielétrica bem inferior à da água, a interação proteína-proteína
"vence" o poder de solvatação da água (interação água-proteína). A proteína precipita. A precipitação por solventes
orgânicos depende muito da temperatura. Os solventes orgânicos, quando utilizados a temperaturas baixas, são
bastante úteis na separação de misturas de proteínas. A temperaturas mais elevadas esses solventes podem levar à
desnaturação por rompimento das pontes de hidrogênio e estabelecimento de interações apolares, importantes na
manutenção da conformação protéica.)

- A pH e força iónica fixas, a solubilidade de uma proteína é função da constante dieléctrica do meio e da tendência
do solvente acrescentado a diminuir a hidratação dos grupos iónicos.
- Os solventes devem ser miscíveis em água: álcoois (metanol, etanol, isopropanol), cetonas ou éteres (éter dietílico);
hidrofílicos para evitar a desnaturação das proteínas e ter constante dieléctrica menor que a da água para tornar a
solução menos polar. O poder solvente da água é reduzido, diminui a ionização das proteínas e a sua coalescência é
favorecida.
A quantidade de solvente é inversamente proporcional ao peso molecular da proteína.
- A precipitação de proteínas acídicas é melhorada com a adição de iões divalentes (Ca2+, Ba2+, Zn2+ e Mg2+) que
complexam com a proteína reduzindo a sua carga global.
- Evitar a desnaturação irreversível operando a baixas temperaturas.
- Problemas de preço, segurança (flamabilidade), remoção dos solventes.
- Usado em conjunto com variações de pH, T e força iónica.

Precipitação com polímeros


- Polímeros hidrofílicos, como o polietileno glicol (PEG),
diminuem a desnaturação das proteínas comparado com
os solventes orgânicos;
- O PEG não é tóxico, é biodegradável e estabiliza as
proteínas à temperatura ambiente.

Polymers, such as dextrans and polyethylene glycols, are


frequently used to precipitate proteins because they have
low flammability and are less likely to denature
biomaterials than isoelectric precipitation. These polymers
in solution attract water molecules away from the
solvation around the protein.