Você está na página 1de 140

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

Instituto de Ciências Biomédicas

Imunidade Humoral

na Toxoplasmose Ocular

Tese apresentada ao Departamento de


Imunologia do Instituto de Ciências Biomédicas
da Universidade de São Paulo, para obtenção de
título de Doutor em Ciências na área de
Imunologia.

Lília Rios Tsukuda


Orientador: Prof. Dr. Luiz Vicente Rizzo

São Paulo
2007
UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
Instituto de Ciências Biomédicas

Imunidade Humoral

na Toxoplasmose Ocular

Tese apresentada ao Departamento de


Imunologia do Instituto de Ciências Biomédicas
da Universidade de São Paulo, para obtenção de
título de Doutor em Ciências na área de
Imunologia.

Lília Rios Tsukuda


Orientador: Prof. Dr. Luiz Vicente Rizzo

São Paulo
2007
DADOS DE CATALOGAÇÃO NA PUBLICAÇÃO (CIP)
Serviço de Biblioteca e Informação Biomédica do
Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo

© reprodução total

Tsukuda, Lilia Rios.


Imunidade humoral na toxoplasmose ocular / Lilia Rios Tsukuda. --
São Paulo, 2007.

Orientador: Luiz Vicente Rizzo.

Tese (Doutorado) – Universidade de São Paulo. Instituto de Ciências


Biomédicas. Departamento de Imunologia. Área de concentração:
Imunologia. Linha de pesquisa: Imunologia da infecção pelo T. gondii.

Versão do título para o inglês: Humoral immune response in ocular


Toxoplasmosis.

Descritores: 1. Toxoplasma gondii 2. Toxoplasmose ocular 3.


Anticorpos 4. Formação de anticorpos 5. Retinocoroidite 6.
Sorotipagem do Toxoplasma gondii I. Rizzo, Luiz Vicente II.
Universidade de São Paulo. Instituto de Ciências Biomédicas.
Programa de Pós-Graduação em Imunologia. III. Título.

ICB/SBIB169/2007
UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOMÉDICAS

______________________________________________________________________________________________________________

Candidato(a): Lilia Rios Tsukuda.

Título da Tese: Imunidade humoral na toxoplasmose ocular.

Orientador(a): Luiz Vicente Rizzo.

A Comissão Julgadora dos trabalhos de Defesa da Tese de Doutorado, em sessão


pública realizada a ................./................./................., considerou

( ) Aprovado(a) ( ) Reprovado(a)

Examinador(a): Assinatura: ...............................................................................................


Nome: .......................................................................................................
Instituição: ................................................................................................

Examinador(a): Assinatura: ................................................................................................


Nome: .......................................................................................................
Instituição: ................................................................................................
Examinador(a): Assinatura: ................................................................................................
Nome: .......................................................................................................
Instituição: ................................................................................................

Examinador(a): Assinatura: ................................................................................................


Nome: .......................................................................................................
Instituição: ................................................................................................

Presidente: Assinatura: ................................................................................................


Nome: .......................................................................................................
Instituição: ................................................................................................
Este trabalho foi desenvolvido no “Laboratório de
Imunologia Clínica” do Departamento de Imunologia
do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de
São Paulo com bolsa da FAPESP (03/08586-2) e no
“Laboratório de Parasitologia Molecular” do
Departamento de Microbiologia e Imunologia da
University of British Columbia – Vancouver – Canadá
com bolsa da CAPES (PDEE: 1194 -05-4).
Resumo

O Toxoplasma gondii é um protozoário amplamente disseminado pelo


mundo que pode causar doença em animais e seres humanos. A
prevalência varia geograficamente. Em Erechim, Rio Grande do Sul -
Brasil, 88% da população é soropositiva e a toxoplasmose ocular acomete
18% destes indivíduos. A evolução e a gravidade da doença dependem de
características genéticas do parasita e do hospedeiro. A maioria dos
isolados do T. gondii é classificado em uma das três linhagens clonais
distintas (tipo I, II e III). Epitopos polimórficos destas linhagens são
altamente imunogênicos. A resposta imune humoral contra T. gondii é
cepa-específica e persistente em todas as fases da infecção. O objetivo
deste estudo foi correlacionar a imunidade humoral e a resposta contra
peptídeos cepa-específicos com a gravidade da toxoplasmose ocular em
pacientes de Erechim. Foram analisadas pelo método de ELISA 322
amostras de soro de indivíduos em diferentes fases da infecção, com ou
sem lesão ocular, para a pesquisa dos isótipos específicos e contra
peptídeos recombinantes de regiões polimórficas (GRA6 e GRA7) do
parasita. Nossos dados mostram que IgG1 é a subclasse predominante em
todos os grupos analisados; IgG2 e IgG3, além de IgA e IgE, estão
associados à infecção adquirida recente; seis diferentes padrões
sorotípicos do T. gondii parecem infectar esta população, sendo o sorotipo
I/III detectado em grande parte dos pacientes sem lesão ocular, enquanto
o sorotipo Atípico D foi detectado em 60% dos pacientes com a forma
grave da doença. Embora não tenha sido observada associação entre os
isótipos e a evolução clínica da TO, a utilização da análise sorológica com
peptídeos cepa-específicos, além de sugerir a diversidade de cepas
presentes nesta população, pode ser útil como marcador para o
prognóstico da toxoplasmose ocular.
Abstract

Toxoplasma gondii is a widespread protozoan parasite associated with a


large spectrum of pathology in both humans and animals. Prevalence
varies with geography. In the city of Erechim, in the state of Rio Grande
do Sul, Brazil, prevalence of the disease is 88% and related with a high
incidence (18%) of ocular toxoplasmosis (OT). The progression and
severity of the disease is quite variable probably due to some combination
of host and parasite genetics. Most of T. gondii strains are classified in one
of three distinct clonal lineages (type I, II, III). Strain polymorphic
epitopes are highly immunogenic. The humoral immune response against
T. gondii is strain-specific and effective at all stages of infection. The aim
of this study was to correlate the humoral immunity and response against
strain-specific peptides with the severity of OT in Erechim`s patients. Sera
of 322 individuals in different stages of infection, with or without ocular
lesion, were evaluated by ELISA to specific isotypes, IgG avidity and
serotyped with strain-specific polymorphic peptides (GRA6 and GRA7).
Our results show that IgG1 was predominant in all clinical groups,
whereas IgA, IgE, IgG2 and IgG3 were associated with recent acquired
infection. Our data identified six serotypes, four of which were new. One
of the atypical serotypes was strongly associated with severe ocular
disease in 60% of these patients and serotype I/III was detected in the
majority of the patients without ocular toxoplasmosis. Although there was
no association between isotypes and the clinical evolution of OT,
serological analysis with strain-specific peptides suggest that divergent T.
gondii strains have been infecting Erechim`s population. Moreover, this
methodology may be useful as a prognostic marker of the ocular
toxoplasmosis.
Dedicatória

Senhor!

É hora de dizer muito obrigada!

Mais uma etapa vencida, mais um trabalho cumprido, e acima


de tudo, mais um sonho realizado, ou por que não ratificar, vários sonhos
realizados?
Quantas coisas apreendi, quantos obstáculos superei, errei,
chorei e sorri! Aprendi a valorizar pequenas coisas, a olhar o tudo e o
nada, e a ver a complexidade do mais simples e a simplicidade do mais
complexo. É senhor, parece que entendi o que é ser Cientista!
Obrigada senhor, por todos que você colocou no meu caminho
nesta jornada. Quantos amigos conquistei e quantos me conquistaram! A
amizade perdida, pelas circunstâncias da vida, também quero agradecer,
pois também foi muito especial.
Em todo este tempo de trabalho, meu Grande Amigo,
compreendi que não precisamos de grandes coisas para buscar os nossos
objetivos, basta que tenhamos dedicação, respeito, fé e amor pelo que
fazemos. E por falar em AMOR, Senhor, queria lhe falar mais um muito
obrigada, por meus amores incondicionais – Silvio, meu marido, e
Edileuza, minha mãe, aos quais eu dedico este trabalho.

Lília Rios Tsukuda


AGRADECIMENTOS

Ao meu orientador, Dr. Luiz Vicente Rizzo, pela oportunidade, confiança,


credibilidade, amizade e por todos os ensinamentos como pessoa e
cientista;

Ao Dr. Michael E. Grigg por todos os ensinamentos e pela receptividade


em seu laboratório no University of British Columbia na Canadá;

Ao Dr. Cláudio Silveira e toda equipe da Clínica Silveira pelos


ensinamentos e dedicação para a realização deste estudo, sem o trabalho
de vocês muito menos se saberia sobre a toxoplasmose;

Ao oftalmologista Dr. Rubens Belfort Junior pela análise e caracterização


clínicas dos pacientes;

Aos Doutores Regina D`Lucca, Heitor Penna e Karina Bastos pelas


sugestões, elogios e críticas na banca de qualificação do doutorado;

Às Cientistas e amigas queridas, com as quais tanto aprendi nestes anos,


Dra. Luciana de Moraes (Lu de Deus) e Dra. Alessandra Commodaro (Ale),
muito obrigada pelas colaborações, ensinamentos e amizade;

À Professora e tia amada Cleuza Carneiro pela revisão deste trabalho;

À mestranda e amiga Natália Oliveira a quem ensinei e aprendi e que


colaborou diretamente deste estudo;

À amiga Cristina, técnica do laboratório, pela sua competência e


disponibilidade;

À Dra. Adriana Lima Vallochi que iniciou esta linha de pesquisa em nosso
laboratório;

Aos amigos queridos do Laboratório de Imunologia Clínica, Jean Pierre,


Ivo Marguti, Tatiana Takeshi, Julieta Jenre, Thais Boccia, Cris Moulin e
Áurea. E aqueles que não fazem mais parte do grupo, mas continuam
fazendo parte desta história, Gisele Baracho, Angela Falcai, Rafael Larocca
e Ulisses Rodrigues, tenham certeza que aprendi muito com cada um de
vocês;

Aos amigos do Laboratório de Biologia Molecular do Prof. Dr. Michael


Grigg, Erick James, Emily Jansen, Vanessa Lloyd, June Po e Amandeep
Nandra com os quais partilhei momentos de muito crescimento pessoal e
científico.
Ao Prof. João Gustavo Mendes e todos do seu laboratório, Ricardo
Weilinch, Jaqueline, Ana Elisa, Fabiola, Claudinha, Janine, Welbert e
Daniel pela excelente convivência nestes anos.

Às secretarias e amigas Jothelma e Valéria e toda equipe de funcionários


do ICB.

A todos os professores e colegas com os quais aprendi algo, quer seja nos
cursos realizados, quer seja na convivência durante estes anos de
doutorado, meu muito obrigada;

Às minhas irmãs queridas, Cíntia e Leila, que sempre contribuíram de


forma especial em tudo em minha vida, tenham todo o meu amor.

E, a você, que leu toda esta parte de agradecimentos e não encontrou o


seu nome, minhas sinceras desculpas e meu muito obrigado.
Abreviaturas

DNA Ácido desoxiribonucléico


D.O. Densidade óptica
ELISA Ensaio imunoenzimático (do Inglês: Enzyme Linked
Immunoabsorbant Assay)
GRA Proteína do grânulo denso (do inglês: Granule dense
protein
HIV Vírus da imunodeficiência humana
IFN-γ Interferon gama
Ig Imunoglobulina
IL Interleucina
M Molar
MHC Complexo principal de histocompatibilidade (do inglês:
Major Histocompatobility complex
N Normalidade
NK Célula matadora natural (do inglês: natural killer)
PBMC Célula mononuclear do sangue periférico
PBS Solução salina tamponada com fosfato
PCR Reação em cadeia da polimerase
RFPL Polimorfismo do comprimento dos fragmentos de restrição
(do inglês: Restriction Fragment Length Polymorphism)
Stag Antígeno de superfície do T. gondii
SAG Antígeno de superfície do T. gondii (do inglês: surface
antigen)
TMB 3,3’,5,5’ tetra-metilbenzidina
TO Toxoplasmose ocular
μg microgramas
μl microlitros
Sumário

1. INTRODUÇÃO
1.1. O parasito......... ..................................................................12
1.2. Transmissão e Epidemiologia .................................................15
1.3. Características genéticas do parasita ...................................... 19
1.4. Manifestações Clínicas da toxoplasmose ..................................25
1.5. Resposta imune ao T. gondii .................................................32
1.6. Diagnóstico da toxoplasmose .................................................40
1.7. Tratamento da toxoplasmose .................................................42

2. OBJETIVOS ..........................................................................45

3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. Casuística ............................................................................46
3.2. Reagentes e antígenos ..........................................................50
3.2.1. Antígenos do Toxoplasma gondii ....................................50
3.2.2. Reagentes ...................................................................51
3.3. Separação do plasma e PBMCs ...............................................51
3.4. Ensaios imunoenzimáticos para pesquisa dos isótipos
..............................................................................................52
3.5. Definição do índice de avidez de IgG .......................................56
3.6. Análise sorotípica de cepas do T. gondii ...................................57
3.6.1. Sequência dos peptídeos ...............................................57
3.6.2. Ensaios imunoenzimáticos cepa-específicos .....................59
3.6.3. Normalização dos resultados .........................................60
3.7. Análise Estatística ................................................................61

4. RESULTADOS
4.1. Avaliação da imunidade humoral na toxoplasmose ocular
..............................................................................................62
4.1.1. Características da população estudada ............................62
4.1.2. Correlação entre os isótipos e a toxoplasmose ocular
............................................................................................66
4.1.3. Determinação do índice de avidez ..................................71
4.1.4. Associação entre IgA, faixa etária e a lesão ocula .............75
4.1.5. Evolução clínica de pacientes com toxoplasmose ..............76
4.2. Análise sorotípica do T. gondii ................................................77
4.2.1. Novos padrões sorotípicos na população de Erechim .........77
4.2.2. Associação entre sorotipos e a toxoplasmose ocular .........82
4.2.3. Atípicos sorotipos em surtos no Sul do Brasil ...................86

5. DISCUSSÃO .........................................................................88

6. CONCLUSÕES .....................................................................110

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................111

8. ANEXOS .............................................................................127
8.1. Anexo A: Consentimento informado ......................................127
8.2. Anexo B: Descrição da população estudada ............................131
8.3. Anexo C: Definição do valor de corte do ELISA dos isótipos ......137
8.4. Anexo D: Definição do valor de corte do ELlSA dos sorotipos ....138
8.5. Anexo E: Análise da sensibilidade e especificidade dos ELISAs ..139
Introdução

1. INTRODUÇÃO

1.1. O Parasito

Toxoplasma gondii é um protozoário parasita intracelular obrigatório,

capaz de infectar e replicar dentro de qualquer célula nucleada de animais

homeotérmicos (WON e REMINGTON, 1993; DUBEY, 1998). Foi descrito em

1908 no Brasil por Splendore, a partir de coelhos (SPLENDORE, 1908) e, no

mesmo ano, na Tunísia por Nicole e Manceaux, em formas oriundas do

roedor Ctenodatylus gondii (NICOLLE e MANCEAUX, 1908). Esse protozoário

que pertence ao Filo Apicomplexa, subclasse Coccídea, tem extrema

importância médica e veterinária (LEVINE et al., 1977; TENTER et al., 2000).

T. gondii possui o ciclo de vida heteroxênico facultativo com três

estágios de vida infectantes: esporozoítas (presentes nos oocistos),

bradizoítas (formando cistos teciduais) e taquizoítas (intra e extracelulares).

Estas formas evolutivas compõem um complexo ciclo envolvendo

hospedeiros definitivos e intermediários (DUBEY, LINDSAY e SPEER, 1998)

(Figura 1).

O ciclo sexuado ocorre apenas no intestino de membros da família

Felidae, que são os hospedeiros definitivos. Após a ingestão de tecidos

contendo cistos, os bradizoítas liberados invadem os enterócitos,

multiplicam-se por uma série de esquizogonias, e se diferenciam em

gametas masculinos e femininos. A fusão do micro e macrogameta resulta na

formação de um zigoto diplóide (oocisto) que é liberado no ambiente,


12
Introdução

juntamente com as fezes, onde se divide em oito progênies haplóides

denominadas esporozoítas, as quais são formas infectantes para os

hospedeiros susceptíveis (DUBEY et al., 1970; SIBLEY et al., 1992; WONG e

REMINGTON, 1993). Os gatos podem infectar-se também através da ingestão

de oocistos esporulados liberados nas fezes de outros gatos (DUBEY, 1998;

2002). Após a esporulação, os esporozoítas podem ser ingeridos por outros

mamíferos (incluindo o homem), transformando-se em taquizoítas (DUBEY,

MILLER e FRENKEL, 1970; FRENKEL, 1973).

A forma taquizoíta mede cerca de 2 a 6 μm de comprimento, tem

formato de meia-lua, apresentando a região anterior afilada e a posterior

recurvada. Corresponde ao estágio de multiplicação rápida do parasito, tanto

em células do hospedeiro intermediário, quanto em células epiteliais

intestinais do hospedeiro definitivo (SHEFFIELD e MELTON, 1968; KOHLER et al.,

1997). Esta forma tem a capacidade de entrar em todas as células nucleadas

por penetração ativa e formar um vacúolo parasitóforo (DOBROWOLSKI e

SIBLEY, 1996). A propagação dos taquizoítas ocorre pelo rompimento das

células infectadas e invasão de células adjacentes ou por via hematogênica,

contaminando principalmente o sistema nervoso central, musculatura

esquelética e cardíaca. Como o T. gondii pode invadir todas as células e

tecidos do organismo, sua disseminação se estende por todo o corpo do

hospedeiro (WONG e REMINGTON, 1994). Esse estágio proliferativo caracteriza

a fase aguda da infecção.

13
Introdução

A entrada do T. gondii na célula do hospedeiro é um processo ativo,

envolvendo filamentos de actina e miosina do parasito e certas proteínas

transmembrânicas que se ligam a estes filamentos. A invasão do parasita é

semelhante à fagocitose, embora seja um processo mais rápido e polarizado,

pois ocorre a partir da região apical do parasita (HIRAI, HIRATO e YANAGAWA,

1966; AJIOKA et al., 1998), que atravessa a membrana da célula do

hospedeiro. Enquanto a fagocitose é lenta e depende do rearranjo do

citoesqueleto (JONES, YEH e HIRSCH, 1972; AIKAWA et al., 1977)

A proliferação dos taquizoítas diminui com o estabelecimento da

resposta imune do hospedeiro, contudo àqueles que escapam, evoluem para

a forma bradizoíta e, juntamente com proteínas do hospedeiro, formam os

cistos teciduais, os quais são incapazes de induzir inflamação (HUNTER e

REMINGTON, 1994). Há um equilíbrio dinâmico entre o parasita e o

hospedeiro, instalando-se assim a infecção crônica ou latente (DENKERS,

2003). Os cistos teciduais alojam-se, basicamente, no sistema nervoso

central, musculaturas esquelética e cardíaca e retina (JACOBS et al., 1960;

ISRAELSKI et al., 1989).

Sob determinadas condições, os bradizoítas, contidos nos cistos

teciduais, podem retornar às formas proliferativas – taquizoítas, reiniciando o

ciclo de parasitemia. Ainda hoje, são desconhecidos os fatores que induzem

esta mudança nos bradizoítas a reiniciar o ciclo assexuado. Em outros

membros dos Coccidia, somente os esporozoítas, provenientes do ciclo

14
Introdução

sexuado, possuem essa capacidade (Dubey, 1970). Todavia, esta capacidade

de interconversão do T. gondii, alarga as fontes de infecção para o homem,

dando a este protozoário notável importância em problemas da saúde

humana (LYONS, McLOEOD e ROBERTS, 2002).

1.2. Transmissão e Epidemiologia

A infecção pode ser adquirida por diversas formas, sendo que a via oral

é a mais importante forma de contaminação. Deste modo, os hospedeiros

podem infectar-se das seguintes maneiras: a) ingestão do oocisto, através

de frutas, verduras, legumes, água ou pelo contato com o solo; b) ingestão

de cistos teciduais, presentes em alimentos crus ou mal-cozidos; c) ingestão

de taquizoítas, através do leite não pasteurizado, ovos, saliva, perdigotos,

transfusões sanguíneas e órgãos transplantados (BONAMETTI et al., 1997;

GARCIA et al., 2003; MONTOYA e LIESENFELD, 2004).

A transmissão congênita é uma das formas mais importantes de

infecção. A gestante transmite a infecção para o feto quando se infecta

durante a gestação, através da passagem dos taquizoítas pela barreira

placentária (FIGURA 1). O parasito pode causar diferentes graus de

gravidade dependendo da virulência da cepa, da capacidade de resposta

imune da mãe e da idade gestacional (AJZENBERG et al., 2002).

Infecções causadas pelo T. gondii estão amplamente distribuídas

atingindo um terço da população mundial (TENTER, HECKEROTH e WEISS,

15
Introdução

2000). A prevalência da infecção varia com a região geográfica e a faixa

etária (DUBEY, 2004). Entre norte-americanos aproximadamente 15% da

população está cronicamente infectada (JONES et al.; 2001). Nas Américas

Central e Sul e na Europa continental estima-se que a prevalência alcance

50-80% (DUBEY e BEATTIE, 1988; TENTER et al., 2000). Em regiões específicas

do Brasil e França as taxas de soroprevalência atingem índices

extremamente elevados e pouco comuns, de aproximadamente 88%

(GLASNER et al., 1992). Devido à incidência da doença ser tão variável,

ressalta a necessidade de investigar a dinâmica da transmissão e/ou as

características das cepas do parasita que causam doença em comunidades

susceptíveis, como no Brasil, sobretudo na região Sul, na cidade de Erechim.

Erechim é um município localizado no Noroeste do estado do Rio

Grande do Sul, na região do Alto Uruguai, sobre a cordilheira da Serra Geral.

Colonizado basicamente por quatro etnias, polonesa, italiana, alemã e

israelita, o povoado se formou em 1908, à margem da estrada de ferro.

Ocupa uma área de 430,764 km2 com uma população de cerca de 98.288

habitantes (IBGE, 2005). A economia da região é basicamente focada na

pecuária, especialmente suínos, agricultura e o comércio local. Diveros

estudos vêm sendo realizados com o intuíto de entender a elevada

prevalência da toxoplasmose (88%) e, sobretudo, a alta incidência (18%) da

forma ocular da doença nesta região (SILVEIRA et al., 1988; GLASNER et al.,

1992; SILVEIRA et al., 2001)

16
Introdução

Hospedeiro definitivo
Fase Sexuada
Gametócitos
Cistos teciduais Zigoto

Intestino

Meio Ambiente
Oocisto

Contaminação de
Oocisto esporulado
água, solo e
(esporozoíto)
alimentos
Fase Assexuada

Hosp. Intermediário
Bradizoíta

Taquizoíta Taquizoíta

Ingestão de cistos em carnes Bradizoítas em Cisto


cruas ou mal-cozidas

Toxoplasmose Adquirida

Transmissão da
Taquizoítas
mãe para o feto
via placenta
Toxoplasmose Congênita

Figura 1. Ciclo evolutivo do Toxoplasma gondii. O ciclo sexuado ocorre


exclusivamente no intestino do hospedeiro definitivo - felinos. Após a ingestão de
bradizoítas, na forma de cistos teciduais, o parasita invade os enterócitos, sofre
processos de divisão celular até formar macro e microgametócitos. Os gametócitos
fundem-se para formar o zigoto ou oocisto, que são liberados no meio ambiente na
pelas fezes do gato. O oocisto no ambiente, através de meioses, evolui à forma de
esporozoíta, que é resistente por anos num ambiente úmido e infectante. Uma vez
ingerido, por um hospedeiro intermediário, o esporozoíto se diferencia à forma de
taquizoíta, extremamente proliferativa, a qual estabelece a infecção aguda. Passada
a fase aguda, os taquizoítas evoluem num lento processo de divisão para a forma
de bradizoíta. Neste estágio, o parasita pode permanecer latente por toda vida do
hospedeiro na forma de cisto tecidual, ou pode ser transmitido por carnivorismo
para outros hospedeiros, inclusive o gato, reiniciando o ciclo. Durante a infecção
aguda, os taquizoítas podem ser transmitidos da mãe para o feto, levando à
toxoplasmose congênita (Baseado em Dubey, 1986).
As linhas sólidas indicam os processos de diferenciação do parasita e as linhas
pontilhadas indicam os modos de transmissão.
17
Introdução

Através de estudo de caso-controle realizado em Erechim foram

verificados os principais fatores de risco e fontes de infecção do T. gondii

(Figura 2). Os dados do estudo apontam o contato direto no solo, seja ele

no campo ou em jardinagem domiciliar, e o hábito de comer carne de suínos

e ovinos mal-cozida, como principais fontes de infecção associadas às

infecções recentes. A pesquisa também revela que há maior soroprevalência

entre adultos e crianças do sexo masculino, mulheres multíparas e na

população da zona rural. Entre os indivíduos domiciliados na zona urbana foi

verificada baixa associação com a infecção (JONES et al., 2006). É provável

que as campanhas de saúde pública estejam educando e conscientizando a

população urbana, minimizando a exposição ao parasita.

Figura 2 - Representação
esquemática do ciclo da
infecção pelo T. gondii em
Erechim. Seres humanos se
infectam principalmente pelo
contato com o solo e pela ingestão
Ciclo da de carnes, frutas, legumes e
infecção
em verduras cruas ou mal-cozidas,
Erechim sendo a contaminação oral a
principal via de infecção. O ciclo de
transmissibilidade parece ser
independente da fase sexuada, que
ocorre nos felinos (setas cheias),.
Mulheres multíparas e indivíduos do
sexo masculino, adultos e crianças,
estão mais expostos à infecção
(Baseado em Jones et al., 2006).

18
Introdução

1.3 Características genéticas do parasita

Ainda que a infecção pelo T. gondii seja amplamente disseminada pelo

mundo, da grande variedade de hospedeiros intermediários e da capacidade

do parasita em se reproduzir sexualmente, análises filogenéticas revelaram

resultados surpreendentes. Este bem-sucedido parasita possui uma incomum

estrutura populacional, consistindo de três linhagens clonais, denominadas

Tipo I, II ou III, as quais foram detectadas em 94% dos isolados da Europa e

na América do Norte (HOWE e SIBLEY, 1995), diferindo-se geneticamente

entre si em apenas 1% ou menos (SU et al., 2003).

Diversos estudos têm postulado os possíveis motivos que justifiquem a

pequena variabilidade genética neste parasita. Estudos populacionais

sugerem que em todos os lócus há apenas dois alelos, indicando que estas

três linhagens tenham dois ancestrais comuns (denominadas “A” e “E”, de

Adão e Eva, respectivamente), com limitadas variações gênicas, que foram

cruzados recentemente na história evolutiva. Cada lócus genético desse

organismo haplóide possui um alelo derivado a partir de uma ou de outra das

cepas ancestrais, os três genótipos são definidos pela mistura destes alelos

(GRIGG et al., 2001a). Outra análise comparativa do genoma das cepas Tipo I,

II e III, mostrou que há um cromossomo idêntico – denominado

cromossomo Ia (chrIa) – comum às três linhagens (KHAN et al., 2006). Este

cromossomo parece ser o único que não é susceptível a polimorfismos, dado

19
Introdução

que corrobora a hipótese de um ancestral comum para as três linhagens

distintas (BOYLE et al., 2006).

O Toxoplasma não depende essencialmente da fase sexuada do seu

ciclo para sua sobrevivência e disseminação, ao contrário de outras espécies

do gênero Apicomplexa, tais como plasmodium spp. e a Eimeria spp, nas

quais a manutenção do ciclo sexual parece ser vital para a geração da

diversidade necessária à adaptação ao meio ambiente, sobrevivência no

hospedeiro, transmissibilidade e virulência (revisto por KYES et al., 2001). Na

fase assexuada do seu ciclo (ver Figura 1), desde a progênie (esporozoítas)

até a formação do cisto tecidual, todas as formas evolutivas são infectantes

para hospedeiros intermediários (DUBEY e BEATTLE, 1988). Deste modo, a

reprodução sexuada pode ser evitada, minimizando a possibilidade de

cruzamento entre os genótipos e garantindo a transmissão da espécie com

mínimo de recombinação meiótica (KHAN et al., 2006). Esta característica

biológica do parasita, denominada de transmissão oral assexuada, parece

determinar a estrutura da população clonal com apenas três linhagens

predominantes (DARDE et al., 1992; SIBLEY e BOOTHROYD, 1992; HOWE e

SIBLEY, 1995).

A virulência do Toxoplasma é normalmente definida com base na dose

letal 50 (DL50) em modelos murinos, porém pouco se sabe sobre a

virulência deste parasito em outras espécies. As três linhagens clonais

apresentam diferentes potencias para causar doença em modelos animais

20
Introdução

(SIBLEY e BOOTHROYD, 1992). A linhagem tipo I é altamente virulenta em

camundongos, com DL de apenas um parasita viável. Em contraste, as cepas

tipo II e tipo III têm a DL50 em mais que 10³ parasitas (HOWE e SIBLEY,

1995). Visando explicar as bases das diferenças na patogenicidade entre os

tipos de parasita, estudo de mapeamento genético identificou um lócus

comum na cepa tipo I que pode estar associado à maior virulência desta

linhagem em murinos (SU et al., 2002).

Os estudos até então publicados sobre a infecção pelo T. gondii em

humanos, atribuem à cepa tipo II como responsável (81%) pela

toxoplasmose congênita e em indivíduos imunocomprometidos na América

do Norte e Europa, principalmente na França (HOWE et al., 1997; HONORÉ et

al., 2000; FUENTES et al., 2001), enquanto os tipos I e III foram encontrados

em 10 e 9% dos isolados de seres humanos, respectivamente (HOWE et al.,

1997), porém há relatos do isolamento de cepas do tipo I em casos de

toxoplasmose congênita na Espanha e em Portugal (FUENTES et al., 2001). Há

uma tendência em associar a doença em seres humanos à linhagem tipo II,

já que parasitas deste tipo constituem pelo menos dois terços dos isolados

em humanos (HOWE e SIBLEY, 1995).

Diante dos estudos funcionais sobre as diferentes cepas do T. gondii,

pode-se concluir que são linhagens e não verdadeiras espécies, já que foram

identificados genótipos mistos. Todavia, o “clone” tipo é uma entidade

taxonômica importante, do ponto de vista médico, pois apresenta

21
Introdução

características biológicas diferentes (HOWE, 1995; SIBLEY, 1999). Embora

muitos estudos tenham sugerido que o genótipo do parasita pode definir a

apresentação clínica da toxoplasmose humana, diante da ampla

disseminação deste parasita, muitas outras pesquisa ainda são necessárias

em diversas populações, pois é possível que o padrão de doença seja

definido não só pelo T. gondii, mas também pela relação parasito-hospedeiro

e o meio-ambiente (HOWE, 1995; HOWE, 1997; SIBLEY, 1999; HOLLAND, 2004).

Algumas evidências da relação entre o genótipo do parasito e a

gravidade da doença ocular têm sido apresentadas na literatura. Grigg e

colaboradores (2001) mostraram que a cepa tipo I e algumas linhagens

atípicas foram isoladas em indivíduos imunocompetentes com TO grave nos

Estados Unidos (GRIGG et al., 2001b). No caso do Brasil, a caracterização de

parasitas presentes nas retinas de alguns indivíduos de São Paulo (SP) e de

Erechim (RS) também sugerem a presença do Tipo I (VALLOCHI et al., 2005a).

Linhagens de T. gondii com atípica ou nova combinação de alelos têm

sido isoladas de animais não domésticos, em alguns continentes como

América do Sul e África (DARDÉ et al., 1998; AJZENBERG et al., 2004; LEHMANN

et al., 2004; FERREIRA et al., 2004; MILLER et al., 2004). Todavia, a grande

maioria dos estudos de caracterização genotípica tem examinado apenas um

(SAG2) ou dois marcadores genotípicos do parasita (FUENTES et al., 2001;

DUBEY et al., 2004; VALLOCHI et al., 2005), como muitas linhagens dividem o

mesmo alelo de muitos loci, a correta caracterização genotípica da cepa deve

22
Introdução

ser feita através da genotipagem mutilocus ou multicromossômica (KHAN et

al., 2005).

No Brasil, estudos com amostras de animais provenientes de alguns

surtos ocorridos nos Estados do Rio de Janeiro, Paraná, Santa Catarina,

Minas Gerais e Amazonas também detectaram predominantemente parasitas

do tipo I, alguns casos do tipo III e raramente o tipo II (DUBEY et al., 2002;

DUBEY et al 2003 a; DUBEY et al., 2003b; DUBEY et al., 2004; DUBEY et al., 2005;

DA SILVA et al., 2005; BRANDÃO et al., 2006; DUBEY et al., 2006; DE MOURA et

al., 2006; FERREIRA et al., 2006; PENA et al., 2006).

KHAN e colaboradores (2006) genotiparam amostras de pacientes

provenientes de Erechim e de dois surtos de toxoplasmose que ocorreram no

Paraná (Santa Vitória do Pinhal) e Santa Catarina (Agronômica) e comparou

com amostras de isolados de animais provenientes de Minas Gerais e

Erechim. Os dados desse trabalho mostram que os isolados de T. gondii da

região de Erechim são genotipicamente divergentes dos padrões

convencionais previamente descritos para amostras da América do Norte e

Europa. De todas as amostras analisadas, animais e humanos, apenas uma

apresentou genótipo do Tipo I, as demais apresentaram padrões genotípicos

atípicos, que por análise foligenética, sugere o intercruzamento entre as três

linhagens clonais (KHAN et al., 2006).

As estratégias atuais para classificação da cepa do T. gondii são

tipicamente focadas em estabelecer diferenças inter-cepas via proteínas

23
Introdução

(DARDÉ, 1996) ou por classificação genômica (GRIGG e BOOTHROYD, 2001;

AJZENBERG et al., 2002). Para estas análises é necessário o isolamento de

grande quantidade de DNA do parasita ou a infecção de outros organismos

para obtenção de proteínas. Devido à dificuldade de obtenção deste tipo de

material biológico, há limitações técnicas para estes estudos em grandes

populações (HOLLAND, 2006).

Novas abordagens técnicas surgiram na tentativa de caracterizar as

linhagens do parasita e sua importância na patogenicidade aos seres

humanos. Utilizando seqüências de nucleotídeos das três linhagens, obtidas a

partir do GenBank, por ESTs (expressed sequence tags) do Toxoplasma ou

por sequenciamento direto de proteínas imunogênicas de antígenos do T.

gondii, KONG e colaboradores (2003) descrevam peptídeos recombinantes

contendo regiões polimórficas imunogênicas das linhagens tipo I, II, III.

Através da utilização destes peptídeos pela técnica de ELISA (do inglês,

Enzyme-Lynked Immunoabsorbant Assay), é possível detectar no soro ou

plasma anticorpos cepa-específicos e, desta forma, determinar qual a

linhagem infectante em hospedeiros humanos e animais.

O desenvolvimento do método de sorotipagem de cepas baseou-se no

fato de que o T. gondii estimula uma forte e persistente resposta humoral

em todos hospedeiros. Anticorpos contra proteínas do parasita permanecem

com títulos elevados por toda a vida do hospedeiro e estão presentes em

pacientes com essencialmente todas as manifestações clínicas da infecção

24
Introdução

(FRENKEL et al., 1991; ASAI et al., 1992). Dados na literatura mostram que a

resposta imune humoral contra o T. gondii é cepa-específica. Para

exemplificar, 5 de 5 anticorpos de monoclonais de camundongos (MAbs) para

SAG2A isolados depois de uma infecção natural eram alelo-específicos (i.e.,

os anticorpos reconhecem o alelo expresso por tipo I e III, mas não o tipo II,

embora todos os 3 tipos expressem níveis aproximadamente iguais da

proteína de SAG2A) (PARMLEY et al., 1994). Conseqüentemente, epitopos

polimórficos parecem ser altamente imunogênicos e, possivelmente,

imunodominantes (KONG et al., 2003). Em humanos, a presença de

anticorpos contra regiões específicas das proteínas do grânulo denso 6

(GRA6) (FAZAELI et al., 2000) e 7 (GRA7) (JACOBS et al., 1999) do

Toxoplasma, pode discriminar seguramente se a infecção é por uma cepa

Tipo II ou pelos Tipos I e III (KONG et al., 2003).

1.4. Manifestações Clínicas da Toxoplasmose

A patogenicidade e o tropismo cerebral deste parasita no hospedeiro

imunocomprometido foram referidas por Vietzke em 1968. Até a década de

80, os casos de toxoplasmose referidos na literatura eram principalmente

relacionados às infecções congênitas (DESMONTS, 1966; 1975), mas a

expansão das técnicas de transplante e, sobretudo o avanço da pandemia da

AIDS identificaram esta parasitose como infecção emergente, sendo uma

25
Introdução

importante causa de morbidade e mortalidade nos imunodeficientes de

várias etiologias (LUFT e REMINGTON, 1992)

A infecção aguda adquirida no adulto imunocompetente é normalmente

assintomática, evoluindo rapidamente para a cronicidade (DENKERS, 2003).

Por outro lado, a infecção primária durante a gravidez, mesmo que

assintomática ou subclínica, pode ser transmitida ao feto originando uma

infecção congênita. A transmissão materno-fetal está relacionada ao aporte

sangüíneo para a placenta, sendo maior nas fases tardias da gestação. A

gravidade para o feto é maior quando a infecção ocorre entre a 10a e 24a

semanas. Neste período, os danos ao feto podem ser letais, podendo resultar

em aborto, ou lesões neurológicas e oftalmológicas com graves seqüelas

(TENTER, HECKEROTH e WEISS, 2000; GROSS, HOLPERT e GOEBEL, 2004) O feto

acometido no último trimestre da gravidez é geralmente assintomático ou

com manifestações discretas (KAPPERUD et al., 1996). A infecção fetal pode

ser atenuada ou prevenida quando o tratamento materno é iniciado

precocemente (JONES et al., 2001).

Em indivíduos imunodeprimidos, a encefalite toxoplásmica (ET) é uma

importante manifestação clínica (LUFT e REMINGTON, 1992; WONG e

REMINGTON, 1993; WONG e REMINGTON, 1994). A progressão e a gravidade da

doença é significativamente variável entre os casos relatados de

toxoplasmose, provavelmente estas variações possam ser relacionadas às

características do hospedeiro (MCLEOD et al., 1989; SUZUKI et al., 1996) e/ ou

26
Introdução

variações genéticas na cepa infectante (SIBLEY e BOOTHROYD, 1992; HOWE et

al., 1996). A ET foi considerada uma das mais comuns infecções oportunistas

de pacientes com o vírus da imunodeficiência humana (HIV) (LUFT e

REMNIGTON, 1992).

A retinocoroidite toxoplásmica (TO) é definida como a uveíte posterior

infecciosa mais comum, inclusive na população brasileira (HOLLAND, 2003;

GARCIA et al., 2003). As lesões oculares causadas pelo T. gondii podem ser

originadas tanto da infecção congênita, quanto da infecção adquirida após o

nascimento (SILVEIRA, et al., 1988, GLASNER et al., 1992). Na região Sul do

Brasil são muitos os casos de infecção pós-natal (SILVEIRA et al., 1988, 2001;

HOLLAND, 2000) e nos EUA um estudo dos riscos da infecção concluiu que

pelo menos dois terços dos casos de TO são causados por infecção adquirida

(GILBERT e STANFORD, 2000).

A TO é caracterizada por uma lesão cicatricial atrófica, geralmente

localizada na mácula. A lesão clássica inicia-se na retina neural e, após o

desenvolvimento da resposta inflamatória, passa a envolver as demais

camadas da retina, assim como a coróide (ROBERTS e MCLEOD, 1999). Na

fase aguda, há edema de retina e a lesão tem coloração creme. A reativação

da doença apresenta-se como uma retinite focal, de tamanho variável, com

forma ovalada ou circular. Pontos hemorrágicos e infiltrados inflamatórios

estão presentes na maioria dos casos. A presença de células inflamatórias na

câmara anterior do olho também pode ser observada.

27
Introdução

A fundoscopia ou exame de fundo de olho e a retinografia são

ferramentas diagnósticas para visualização das lesões oculares, que

permitem ao especialista visualizar as características da lesão e a sua

gravidade. Na Figura 3 apresentamos retinografias realizadas na Clínica

Silveira em indivíduos de Erechim. Para efeito de comparação, mostramos o

exame de um indivíduo saudável (Figura 3A). Na porção inferior da figura,

apresentamos retinografias dos dois olhos de um paciente imunocompetente

com toxoplasmose ocular adquirida. Uma característica da TO neste paciente

é o aparecimento de regiões cicatrizadas, conseqüentes da auto-resolução do

processo inflamatório local, que podem ser vistas em ambos os olhos.

Quando a lesão é reativada, normalmente pode ser vista a retinite focal, de

tamanho variável, a qual normalmente ocorre em apenas um olho (Figura

3B). Com a evolução da doença e a diminuição da resposta inflamatória,

ocorre o atrofiamento da lesão e as bordas tornam-se hiperpigmentadas,

provavelmente pelo dano tecidual (Figura 3C). SILVEIRA e colaboradores

(2001) relataram que lesões típicas da TO incluem minúsculos e não-

específicos focos pigmentados, que podem ser vistos em conjuntos de

pequenas cicatrizes retinocoroidais em qualquer parte da retina (SILVEIRA et

al., 2001).

28
Introdução

A
Disco óptico

Mácula

B OE C OD

a
b
c

Figura 3 – Retinografias de indivíduos de Erechim. (A) Retina normal


(B e C) de paciente com toxoplasmose ocular. (OE) olho esquerdo; (a)
recidiva ativa; (b) lesão cicatrizando; (OD) olho direito; (c) retinocoroidite
cicatrizada. (Fonte: Clínica Silveira)

As características das lesões podem variar de acordo com o estado

imunológico do indivíduo. Em pacientes com AIDS, as lesões comumente

descritas são múltiplas, ativas, porém pequenas e pouco espessas,

envolvendo camadas internas e externas, podendo acometer ambos os olhos

(HOLLAND et al., 1988; HOLLAND, 1989). Em indivíduos imunocompetentes,

aparece um foco com lesão ativa, mesmo que apresentem diversas áreas

cicatriciais aglomeradas. As lesões tipicamente apresentam diâmetro menor

que 1000μm e são encontradas no pólo posterior do olho (COCHEREAU-

29
Introdução

MASSIN et al., 1990; BEGER et al., 1993; DOFT e GASS, 1985; MATHEUS e

WEITTER, 1988).

Muitos trabalhos apóiam a hipótese de que a infecção pelo T. gondii

nos estágios iniciais de desenvolvimento da retina pode favorecer o

comprometimento da mácula. Diferenças anatômicas e micro vasculares

entre a mácula e a região periférica da retina poderiam criar um

microambiente que influência na localização da lesão (YANG et al., 2000;

BOSCH-DRIESSEN et al., 2002;). As lesões na região da mácula são mais

freqüentes em casos de toxoplasmose congênita (HORGAN et al., 1964;

FRIEDMANN e KNOX, 1969). Contudo, aproximadamente 38% dos pacientes de

Erechim com evidência sorológica para infecção adquirida apresentaram

lesões maculares (dado apresentado pelo Dr. Cláudio Silveira no

International Conference on Toxoplasmosis, Copenhague, Dinamarca, 23-25

de Junho de 2003).

A susceptibilidade ao desenvolvimento da lesão ocular grave pode

estar relacionada à virulência do parasita, inóculo infectante, meio-ambiente,

influenciando na relação parasito-hospedeiro, e ao hospedeiro. Embora não

tenha sido observada nenhuma associação entre etnias e a doença ocular,

hábitos alimentares de certas populações podem aumentar a exposição ao

agente infeccioso, tornando a população mais susceptível (revisado por

HOLLAND, 2004; JONES et al., 2006).

30
Introdução

No que se referem às características do hospedeiro, algumas

importantes associações já foram descritas: 1) Idade - na grande maioria

dos trabalhos publicados há um consenso de que entre 20 e 40 anos há

maior freqüência da doença ocular (FRIEDMANN e KNOW, 1969; BURNETT et al.,

1998; JONES et al., 2001; BOSCH-DRIESSEN et al., 2002); 2) Estado

imunológico - a epidemia da AIDS mostrou que o estado de imunodeficiência

torna o paciente extremamente vulnerável ao desenvolvimento de lesão

grave (REHDER et al., 1988; HOLLAND et al., 1988, HOLLAND et al., 1989;

BERGER et al., 1993; MOORTHY et al., 1993). Em pacientes idosos o

comprometimento na resposta imune inata e adaptativa induz alterações

funcionais em linfócitos, células matadoras naturais (NK, do inglês “natural

killer”) e macrófagos (JOHNSON et al., 1997); 3) Gestação – em gestantes há

significativa freqüência de recorrência da retinocoroidite toxoplásmica, é

possível que esta associação esteja relacionada às alterações imunológicas e

hormonais oriundas da própria gestação (HOLLAND et al., 1996; FRIEDMANN e

KNOX, 1969; O’CONNOR, 1983; HOLLAND, 2004).

A reativação das lesões na retina na TO pode também ocorrer pela

ruptura do cisto tecidual na fase crônica da infecção. Quando a supressão

imune por drogas ou por outras infecções permite a reversão da forma

bradizoíta para taquizoíta, reativa a replicação do parasita, estimulando o

sistema imune a um intenso processo inflamatório local, que pode levar à

necrose tecidual (HOLLAND et al., 1988).

31
Introdução

1.5. Resposta Imune ao T. gondii

Uma vez ingerido, pela via oral, em seu hospedeiro, o T. gondii invade

o trato gastrintestinal, penetra na mucosa do intestino, onde vai deparar-se

com a camada de células epiteliais - enterócitos. Estas células sofrem

mudanças morfofisiológicas, passam a secretar moléculas citotóxicas, como

o óxido nítrico e, paralelamente, secretam quimiocinas e citocinas que

atraem neutrófilos, macrófagos e células dendríticas para o sítio infeccioso.

Desta maneira, ainda na fase precoce da infecção, está desencadeada a

resposta imune inata contra T. gondii (PAVLI et al. 1993).

Neutrófilos, macrófagos e células dendríticas (DCs) são essenciais na

fase de indução da imunidade, pois são células secretoras de IL-12, uma

citocina fundamental na resistência à infecção na fase aguda (DENKERS,

CASPAR e SHER, 1994; DENKERS e GAZZINELLI, 1998). Através da produção de

IL-12 há estimulação das células NK a produzirem IFN-γ e promover o

desenvolvimento de células Th1 (do inglês, T helper) produtoras de IFN-γ

(GAZZINELLI et al., 1994).

Em modelos experimentais, in vivo e in vitro, os neutrófilos

estimulados com taquizoítas migram rapidamente, entre 2-3 horas, para o

sítio de inoculação do parasita e secretam IL-12 pré-armazenada. Apesar da

quantidade de IL-12 liberada por célula ser pequena, é possível que devido

ao grande número de células que migram para o sítio da infecção, a

liberação local de citocinas tenha função biológica e protetora na infecção

32
Introdução

recente (BLISS et al., 2000). A depleção de neutrófilos torna o hospedeiro

mais suscetível à infecção (BLISS et al., 2001).

A ativação dos macrófagos inibe ou mata o parasita intracelular

(DENKERS e GAZZINELLI, 1998; DENKERS, 2003). BUTCHER & DENKERS (2002)

demonstraram que macrófagos podem induzir a imunidade adquirida através

da liberação de citocinas, como IL-12, e pela apresentação de antígenos

peptídicos aos linfócitos T, via o complexo de histocompatibilidade (MHC) e

co-estimulação de moléculas. No entanto, o T. gondii inibe a produção de NO

pelo macrófago infectado, através da redução da expressão de NO sintase

indutível (iNOS); estimula a produção de TGF-β1 (fator transformador de

crescimento- beta 1) e IL-10, diminuindo a ativação destas células e a sua

atividade anti-protozoária (SEABRA, SOUZA e DAMATTA, 2002). Além disso, há

diminuição da produção de citocinas pró-inflamatórias como, IL-12 e TNF-α

(fator de necrose tumoral – alfa), devido à inibição da translocação para o

núcleo do fator de transcrição (NF-κB) (BUTCHER e DENKERS, 2002) e STAT 1

(do inglês, signal transducer and activator of transcription ) (LUDER et al.,

2001).

As DCs são uma fonte importante de secreção de IL-12 e

desempenham um papel de maior relevância na imunidade celular em

resposta à patógenos intracelulares (ALIBERTI et al.; 2000) e na resposta

imune específica tipo I. A interação de antígenos do parasita via receptor de

quimiocina CCR5 (do inglês, C-C chemokine rececptor- 5) induz a síntese de

33
Introdução

IL-12 em DCs maduras, sendo esta uma das principais vias de indução de

resistência dependente de IFNγ na infecção (ALIBERTI et al., 2000).

DCs imaturas são alvos preferenciais para a invasão do T. gondii

(McKEE et al., 2004). Após a penetração na célula, o parasita suprime a

capacidade celular de participar da resposta imune inata e induzir a resposta

adaptativa. A inibição da maturação das DCs é, provavelmente, por uma via

semelhante a que ocorre nos macrófagos, por inibição de NF-κB e STAT1

(LUDER et al., 2001; DENKERS et al., 2003). A inabilidade de maturação das

DCs compromete a ativação de linfócitos T, sugerindo que haja

comprometimento da capacidade de apresentação antigênica por estas

células, facilitando a disseminação do parasita no hospedeiro (McKEE et al.,

2004). Por outro lado, a produção de TNF-α por neutrófilos parece ser um

mecanismo fundamental para estimular a maturação das DCs e,

consequentemente, o desenvolvimento da resposta imune (DENKERS et al.,

2003).

FUX e colaboradores (2003) mostraram que em modelos murinos a

susceptibilidade e resistência à infecção dependem de fatores genéticos do

parasita e do hospedeiro. Neste estudo, camundongos de diferentes

linhagens foram infectados com uma cepa clássica Tipo II (Me-49) e uma

cepa recombinante tipo I-III (P-Br), observando que a resistência à infecção

com ambas as cepas é dependente da produção de IL-12, TNF-α e IFN-γ. Por

outro lado, a resistência à formação de cistos teciduais e o desenvolvimento

34
Introdução

da ET parece estar associado ao haplótipo do MHC do hospedeiro e ao

arquétipo clonal do parasita (FUX et al., 2003).

Estudos da infecção com alguns microorganismos mostram a

correlação entre as citocinas produzidas pelos linfócitos T, especialmente o

IFN-γ, e a indução da imunidade protetora contra microorganismos

intracelulares, inclusive o T. gondii (HEINZEL et al., 1989; KAUFMANN, 1993

SUBAUSTE e REMINGTON, 1993; GAZZINELLI e DENKERS, SHER, 1993).

SUBAUSTE & WESSENDRAP (2000) demonstraram que a sinalização CD28-

CD80/CD86 regula a produção de IFN-γ, e que a interação CD40 ligante

(CD40L)-CD40 regula a secreção de IL-12 e IFN-γ, durante o contato entre

células T e monócitos infectados com T. gondii (SUBAUSTE, DE WALL MALEFYT

e FUH, 1998; SUBAUSTE et al., 1999).

Os linfócitos T são os principais mediadores da imunidade adquirida,

sendo o padrão Th1 elegido na resposta ao T.gondii (GAZZINELLI et al., 1991;

1992). Diversos experimentos mostram que camundongos atímicos são

extremamente susceptíveis às linhagens virulentas e avirulentas do parasita

(LINDBERG e FRENKEL, 1977; SCHLUTER et al., 1995). A resistência à infecção

em camundongos é dependente tanto dos linfócitos T CD4+ quanto dos T

CD8+. Contudo, em alguns modelos murinos, linfócitos T CD8+ produtores de

IFN-γ são os principais efetores da imunidade in vivo (DENKERS et al., 1993).

A depleção in vivo dos linfócitos T CD8+ converteu camundongos resistentes

em susceptíveis à infecção (GAZZINELLI et al., 1993).

35
Introdução

Anticorpos contra o parasita são prontamente sintetizados em resposta

à infecção, tanto nos seres humanos quanto nos modelos experimentais

(FRENKEL et al., 1991; ASAI et al., 1992). A supressão da produção de

anticorpos através do tratamento com anticorpos anti-μ resultou na

exacerbação da infecção, enquanto a transferência passiva de soro de

camundongos cronicamente infectados para camundongos deficientes de

células B controlou a infecção em 50% dos animais infectados (FRENKEL e

TAYLOR, 1982).

Embora seja controversa a participação dos anticorpos na resistência à

infecção, modelos experimentais com camundongos, ratos e cobaias têm

produzido diferentes resultados a respeito do potencial protetor dos

anticorpos, que pode ser devido ao basal genético dos hospedeiros e/ou do

parasita. A transferência passiva do soro imune ou de anticorpos

monoclonais anti- T. gondii não foi efetiva na proteção à infecção com cepas

virulentas (FOSTER e MCCULLOCH, 1968; GIL e PRAKASH, 1970), porém foi

protetora para camundongos infectados com cepas de virulência moderada

(MASIHI e WERNER, 1978; JOHNSON et al., 1983; SHARMA et al., 1984).

Citocinas são essenciais na diferenciação das células B e na troca de

isótipos de imunoglobulinas (SUZUKI e KOBAYASHI, 1983). Na presença de IL-

4 e anti-CD40, células B humanas secretam IgG4 in vitro (GASCAN et al.,

1991) e na presença de IL-4 e do vírus Epstein Barr (EBV), IL-4 e anti-CD40

36
Introdução

ou anti-CD40L estas células secretam IgA. IL-4 e IL-13 parecem estar

envolvidas na troca de isótipo para IgE (JABARA et al., 1990).

Embora IFN-γ estimule a troca de classe para IgG2a em camundongos,

a única evidência da influência desta citocina na troca de isótipo de

imunoglobulinas humanas é o aumento seletivo da expressão de mRNA da

cadeia γ2 nas células B (IgM+/IgG-) em repouso, porém não há correlação

entre a troca para IgG2 (KITANI et al., 1993). Ainda que IFN-γ aumente e

anti-IFN-γ iniba a expressão espontânea de IgG2 pelos PBMC in vitro, este

efeito é abolido pela depleção de células que expressam IgG2+. Isto sugere

que o IFN-γ atua seletivamente nas células B, as quais já realizaram troca de

classe para IgG2, não agindo como um fator responsável para esta mudança

de isótipo (KOU et al., 1994).

A participação das subclasses de IgG em resposta a agentes

infecciosos tem sido associada à gravidade dos sintomas clínicos e a resposta

inflamatória (HUSSIAN et al., 1995; ASHBEE et al., 1997; LAGACE et al., 1995;

ANDERSON e GAARSLEV, 1992). Estes isótipos exercem funções biológicas

efetoras especificas. Assim, sabe-se que a IgG1 e a IgG3 atuam como

opsoninas, uma vez que se ligam fortemente aos receptores Fc nos

fagócitos, porém a ligação da IgG2 e IgG4 a estes receptores é fraca (ROITT,

BROSTOFF e MALE, 1999).

IgG1 e a IgG3 ativam também o sistema complemento através da

proteína plasmática C1 da via clássica (ABBAS, LICHTMAN e POBER, 2003).

37
Introdução

IgG3 constitui cerca de 4 a 8% das IgG no soro humano. Juntamente com

IgG1, este é o principal isótipo envolvido na resposta a antígenos virais

(STEINBERG et al., 1973). Pacientes deficientes de IgG3 são mais susceptíveis

às infecções recorrentes, embora muitos indivíduos não desenvolvam doença

(BJORKANDER et al., 1985; OXELIUS et al 1986; LINDE et al., 1988). A razão pela

qual estes indivíduos permanecem saudáveis ainda não está esclarecida.

Contudo, o aumento das taxas de infecção pode ser relacionado a outras

desordens da imunidade humoral, inclusive na resposta de IgG2 (LINDE et. al,

1996).

A presença e o perfil de subclasse de IgG intra-ocular foi verificada

através de dosagens no humor vítreo e humor aquoso em indivíduos

normais, sendo IgG1 predominante (WALDREP e SCHULTE, 1989). Em casos de

TO a produção destas subclasses parece não se alterar, provavelmente

devido à inflamação local e a quebra da barreira hemato-retiniana, a invasão

de anticorpos séricos neste orgão imuno-privilegiado, iniba a síntese local

dos isótipos (BLOCH-MICHEL et al., 1998)

A toxoplasmose ocular é caracterizada por um processo inflamatório

intra-ocular, que ocorre em episódios recorrentes (NUSSENBLATT, WHITCUP e

PALESTINE, 1996). Alterações imunológicas observadas na retina são devido à

invasão, replicação e destruição de células da retina, conseqüentes da

reativação do parasita, bem como por antígenos da retina liberados pelo

dano tecidual. A resposta imune contra antígenos da retina na TO, não

38
Introdução

protege para o desenvolvimento da lesão, mas parece minimizar o

desenvolvimento de lesões graves (VALLOCHI et al., 2005b). Taquizoítas e

cistos são encontrados no epitélio de camada única presente entre a coróide

e a neuroretina (Epitélio Pigmentar da Retina – RPE) de pacientes com

toxoplasmose ocular (NICHOLSON e WOLCHOK, 1976).

O RPE é secretor de citocinas como IL-6 (LYONS et al., 2001), IL-8

(ELNER et al., 1990) e NO em resposta a citocinas pró-inflamatórias e LPS.

Além destas, IFN-γ (GAZZINELLI et al., 1994) e TGF-β (NAGINENI, DETRIC e

HOOKS, 2002) também estão envolvidas na imunopatogênese da TO. A

presença de mediadores inflamatórios neste tecido estimula a expressão de

moléculas do MHC classe I e II e participa da apresentação antigênica intra-

ocular (DETRICK et al., 1985). Um dos mecanismos propostos, é que produção

de TGF-β pelo RPE regule negativamente a ativação de células NK em

resposta a antígenos do T. gondii e, conseqüentemente, inibe a produção de

IFN-γ (HAUSMANN et al., 1994). Em outra via, o TGF-β inibe a indução da

enzima indolamina (IDO) nas células humanas, favorecendo a replicação do

parasita e a imunopatogênese à retina (NAGINENI et al., 2002)

A produção intra-ocular de anticorpos ocorre em casos de TO ativa,

podendo ser determinada pela detecção dos isótipos no humor aquoso e

comparação com os títulos séricos. No entanto, o uso desta pesquisa só

deverá ser considerada em casos de retinocoroidite ativa de etiologia

39
Introdução

desconhecida, quando o diagnóstico clínico é pouco elucidativo (revisto por

HOLLAND, 2004).

1.6. Diagnóstico da Toxoplasmose

Grande parte das infecções pelo toxoplasma são sub-clínicas e o

diagnóstico é usualmente baseado no critério imunológico.

Convencionalmente, os estudos se baseiam na detecção de especificas IgG,

IgM (DANNEMANN et al., 1990; REMINGTON e DESMONTS, 1990) e IgA,

associando-os à pesquisa de avidez de IgG (BESSIERES et al., 1992;

DECOSTER et al., 1991; PINON et al., 1986; STEPICK-BIEK et al., 1990). Embora

seja considerado um bom marcador da fase aguda, a detecção de IgE

específica raramente tem sido utilizada na rotina diagnóstica (VILLENA et al.,

1999).

A presença de anticorpos específicos no soro ou a presença do parasita

no humor aquoso, detectada pela PCR, ainda é utilizada como a modalidade

primária de diagnóstico laboratorial da TO (SANTORO et al., 1985; SUZUKI et

al., 1990; HOLLIMAN et al., 1994), entretanto não existe nenhum teste que, de

forma única, suporte ou afaste o diagnóstico de infecção recente ou tardia

(ROBERTS et al., 2001). A definição de uma infecção aguda ou recente é

também extremamente importante, nos casos de infecção em gestantes,

diante dos riscos que a infecção representa para o feto, inclusive a

retinocoroidite (REMINGTON e DESMONTS, 1990; HOLLAND, 1999)

40
Introdução

Anticorpos IgM surgem a partir do 5º dia de infecção podendo diminuir

em poucas semanas ou meses., podendo persistir por até 18 meses, não

significando necessariamente infecção recente (HALL et al., 1983). Anticorpos

IgA são detectados em infecções agudas, na doença congênita e podem ser

detectáveis por meses ou até mais de 1 ano. Normalmente estes anticorpos

são mais sensíveis que IgM na infecção congênita (ASHBURN et al., 1998,

FOULON et al. 1999). A pesquisa de IgE também está relacionada com

toxoplasmose aguda, uma vez que sua detecção é possível na fase inicial da

infecção e perdura por um curto período de tempo, porém ainda não é de

uso corrente na prática clínica (PINON et al., 1990).

Anticorpos IgG surgem em 1 a 2 semanas, têm pico em 1 ou 2 meses

e caem variavelmente, podendo persistir por toda vida. Valores elevados de

IgG com IgM negativo não descartam a possibilidade de infecção recente

(HAYDE et al., 1995). Em pacientes com comprometimento ocular por T.

gondii o diagnóstico sorológico disponível ainda é pouco elucidativo. Títulos

baixos de IgG são freqüentes e IgM geralmente não é detectável. Assim, o

diagnóstico baseia-se, na maioria das vezes, no exame oftalmológico. A PCR

pode detectar o T. gondii no humor aquoso e vítreo (MONTOYA et al., 1997),

porém é uma coleta invasiva para o paciente.

Foi demonstrado que a maturação da resposta de IgG após a infecção

primária, definida como a afinidade de ligação deste anticorpo ao seu

antígeno específico (índice de avidez), varia consideravelmente entre

41
Introdução

indivíduos (JENUN et al., 1997). O baixo índice de avidez de IgG é detectado

após os primeiros contatos com o antígeno, consecutivamente, após algumas

semanas, há o aumento da afinidade, através da seleção clonal de células B.

A proporção de alta avidez aumenta progressivamente depois de uma

imunização primária, embora a baixa avidez de IgG possa persistir por longo

período (LAPPALAINEN e HEDMAN, 2004).

Durante a gestação, a detecção de alta avidez no soro materno no

primeiro trimestre, é um forte indicador contra infecção materna primária.

Todavia, ainda que seja sugestivo de baixo risco de transmissão para o feto

(LAPPALAINEN e HEDMAN, 2004; REMINGTON, THULLIEZ e MONTOYA, 2004), o

monitoramento da infecção deve ser continuado, pois pode ocorrer a

toxoplasmose congênita (SILVEIRA et. al, 2003).

1.7. Tratamento da Toxoplasmose

A profilaxia e tratamento da toxoplasmose ocular são usualmente

feitos pela combinação de duas drogas - sulfadiazina e pirimetamina

(HOLLAND e LEWIS, 2002), que agem promovendo o efeito sinérgico do

bloqueio da via de biosíntese do folato através da inibição da dihidropteroato

sintetase (DHPS) e dihidrofolato redutase (DHFR), respectivamente (WONG e

REMINGTON, 1993; STRAY-PEDERSON, 1992). Cofatores de folato reduzido são

essenciais para diversos processos bioquímicos, incluindo a formação de

DNA. O T. gondii, como muitos microrganismos, sintetiza folatos de novo,

42
Introdução

pois se imagina que sejam incapazes de usar folatos pré-formados presentes

na dieta. As enzimas desta via são, portanto, bons alvos para a

quimioterapia anti-microbiana.

O tratamento no recém-nascido e em crianças de até um ano de idade

(infecção congênita) é também realizado com agentes anti-folato,

pirimetamina e sulfadiazina, mesmo sem manifestações clínicas. Ácido fólico

associado à pirimetamina também é utilizado para reduzir a toxicidade à

medula óssea. Infecção ocular ativa é tratada com as mesmas medicações

até a cicatrização das lesões. Outras drogas, como atovaquona e antibióticos

macrolídeos (clindamicina) são usados para tratar a toxoplasmose em casos

de tolerância à sulfadiazina. Corticosteróides orais são administrados quando

a mácula e disco ótico são afetados, havendo riscos à visão pela inflamação.

Entretanto, há poucos dados demonstrando a eficácia do uso de

corticosteróides. A imunossupressão pode potencializar a divisão do T.gondii

e exacerbar as lesões oculares (SILVEIRA, 2002; ROBERTS e MCLEOD, 1999).

Tratamentos prolongados com sulfametoxazol e trimetoprim retardam

ou reduzem as freqüências das recidivas (SILVEIRA et al., 2002). Esta terapia

não deve eliminar os cistos do olho, porém pode suprimir a proliferação

ocasional dos taquizoítas, permitindo o estabelecimento das defesas efetivas

do hospedeiro, antes da ocorrência de lesões clinicamente importantes.

Diversos estudos têm sido realizados sobre a imunidade celular,

contribuindo para o entendimento da imunopatogênese da toxoplasmose,

43
Introdução

porém, este conhecimento ainda não é utilizado para manejo clínico da

doença. Em contraste, pouco conhecimento se detém sobre a resposta imune

humoral, que é uma importante ferramenta diagnóstica. Abordagens mais

aprofundadas sobre a participação dos anticorpos no curso da infecção,

persistência da produção de determinados isótipos e especificidade da

resposta humoral frente a diferentes cepas do parasita, ainda são

necessárias. Buscando melhor entender a dinâmica da infecção, nós

hipotetizamos que diferenças na produção sistêmica dos isótipos poderiam

refletir variabilidades inter-indivíduos associadas à proteção ou gravidade da

toxoplasmose ocular.

Em nosso estudo longitudinal que mostramos a associação entre a

cepa do parasita, a resposta imune humoral dos pacientes e as diferentes

manifestações clínicas da toxoplasmose ocular. Avaliamos aspectos

fundamentais para o entendimento da relação parasito-hospedeiro em uma

população de valiosa importância epidemiológica, na qual a incidência da

doença ocular é uma das maiores do mundo.

44
Objetivo

2. Objetivo

O objetivo deste trabalho foi investigar aspectos do parasita e do

hospedeiro associados à gravidade da toxoplasmose ocular. Para isso,

caracterizamos a reposta imune humoral e a resposta aos peptídeos cepa-

específicos, em amostras de pacientes com toxoplasmose adquirida em

diversas fases da infecção e com diferentes formas clínicas da doença.

45
Material e Métodos

3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1. Casuística

Foi avaliado em um estudo longitudinal o total de 322 (trezentos e

vinte e dois) indivíduos, provenientes da Clínica Silveira, região de Erechim –

Rio Grande do Sul e de surtos de toxoplasmose no Sul do Brasil, dos quais,

05 (cinco) pacientes vieram da cidade de Santa Vitória do Palmar, Rio

Grande do Sul e 05 (cinco) do município de Agronômica, em Santa Catarina.

Todos foram avaliados clinicamente pela equipe da Clínica Silveira. O número

de pacientes incluídos em cada metodologia utilizada neste estudo foi

variável e será especificado na sessão de resultados. Dentre os pacientes

analisados: 166 apresentavam lesão ocular, 106 indivíduos eram

soropositivos para T. gondii e sem lesão ocular e 40 indivíduos saudáveis,

com sorologia negativa para Toxoplasma. Amostras de 20 pacientes foram

coletadas em diferentes tempos para o acompanhamento da evolução

sorológica da infecção. Todos os pacientes avaliados passaram por uma

triagem sorológica para IgG e IgM anti- T. gondii, no Laboratório Fleury –

São Paulo. Os voluntários avaliados tinham idade entre 01 e 60 anos, de

ambos os sexos. Em relação à etnia, todos os voluntários são descendentes

de caucasianos europeus, principalmente poloneses e italianos. Os grupos

analisados estão sumarizados na Tabela1.

46
Material e Métodos

Os protocolos descritos foram previamente aprovados pela comissão

de ética em pesquisa com seres humanos do Instituto de Ciências

Biomédicas da Universidade de São Paulo. Os voluntários assinaram o termo

de consentimento livre e esclarecido, concordando com a participação no

estudo (Anexo A).

O diagnóstico clínico da TO foi feito pelo Dr. Cláudio Silveira utilizando

critérios previamente descritos (SILVEIRA et al., 1988; SILVEIRA et al., 2001).

Resumidamente, o diagnóstico da infecção foi feito baseado na história e no

exame clínico do paciente, retinografia e perfil sorológico (Laboratório Fleury

– São Paulo – SP). As lesões brandas foram definidas como: lesões

superficiais, pequenas, com menos de 1/4 do tamanho do disco óptico; com

pouco ou rara inflamação intra-ocular, localizadas em regiões da retina sem

o comprometimento da mácula e/ou do disco óptico. As lesões graves foram

assim definidas: baixa da acuidade visual do paciente, lesões localizadas

próximas da mácula ou disco óptico, presença de processos inflamatórios

(retinite, vasculite, papilite, vitreíte, edema de mácula e disco óptico),

tamanho equivalente a metade ou mais do disco óptico, bordas bem

definidas, pigmentadas e profundas, em alguns casos, atingindo a coróide.

Foram critérios de exclusão sorologia positiva para sífilis, HIV e tuberculose.

De acordo com estes critérios foram estabelecidos seis grupos de

estudo, sendo:

™ Grupo Soronegativo: 40 indivíduos IgM-/IgG- para T. gondii;

47
Material e Métodos

™ Grupo Soropositivo sem lesão ocular (TO): 50 indivíduos

com infecção crônica (IgM-/IgG+ anti- T. gondii) há mais de 05

anos, sem lesão ocular ou qualquer outra manifestação de

toxoplasmose;

™ Grupo IgM+ sem TO: 56 indivíduos com toxoplasmose

adquirida apresentando sorologia positiva para IgM/IgG anti- T.

gondii, mas sem lesão ocular;

™ Grupo IgM+ com TO: 20 indivíduos com toxoplasmose adquirida

apresentando IgM+/IgG+ anti- T. gondii e com lesão ocular em

estágios precoces, sem definição de gravidade;

-
™ Grupo TO branda: 27 indivíduos com infecção crônica (IgM

/IgG+ anti- T. gondii) e com lesão ocular branda;

™ Grupo TO grave - 119 indivíduos com infecção crônica e com

lesão grave.

Os pacientes cujos soros foram reativos para IgM anti- T. gondii no

início deste estudo, ou seja, pacientes com confirmação sorológica para a

toxoplasmose adquirida, foram seguidos clinicamente pela equipe médica da

Clínica Silveira, para avaliação da evolução da toxoplasmose e medidas

terapêuticas apropriadas. Os resultados deste seguimento e um sumário com

os resultados obtidos neste estudo estão descritos no Anexo B.

48
Material e Métodos

Tabela 1. Distribuição por grupos clínicos dos indivíduos de Erechim- RS


avaliados neste estudo.
Sorologia
Idade Sexo (anti-T.
Descrição n gondii)
Grupo (anos)
Masculino Feminino IgG IgM
30
1 Soronegativo 40 20 20 NEG NEG
(21-51)
28
2 Soropositivo sem TO 50 13 38 POS NEG
(7-60)
34
3 IgM+ sem TO 56 27 28 POS POS
(10-51)
28
4 IgM+ com TO 20 10 10 POS POS
(5-58)
30
5 TO branda 28 18 10 POS NEG
(17-55)
29
6 TO grave 119 69 49 POS NEG
(4-68)
24
Total 313 157 155
(4-68)
Abreviações: TO, toxoplasmose ocular; POS, positivo; NEG, negativo; n, número de
indivíduos. A idade está representada pela mediana, valor mínimo e valor máximo em cada
grupo.

Camundongos

Para o estudo de sorotipagem de cepas do T. gondii utilizamos 20

camundongos Swiss provenientes do biotério do Vancouver General Hospital

da University of British Columbia – Vancouver – Canadá. Os camundongos

foram oralmente infectados com aproximadamente10 cistos a partir das

seguintes cepas do T. gondii: Tipo I – CAST; Tipo II - Me49; Tipo III - C56 e

VEG.

Devido ao fato da cepa RH (tipo I) não evoluir à forma de cisto

rapidamente, os camundongos infectados com esta cepa receberam 100

taquizoítas intra-peritonealmente. Os camundongos inoculados com RH,

CAST, C57 ou VEG foram submetidos à dose de 200mg/kg de sulfadiazina

49
Material e Métodos

adicionados na água dos animais no terceiro ou quarto dia, permanecendo

até o décimo dia após a inoculação. Este tratamento foi instituído para

prevenir a morte durante a fase aguda da infecção. A coleta de sangue dos

animais foi feita entre quatro e oito semanas após a infecção. Foram

utilizadas amostras de 3 camundongos não infectados, como controle

negativo nos testes de ELISA, para sorotipagem das cepas.

3.2. Reagentes e antígenos

3.2.1. Antígenos do Toxoplasma gondii

Taquizoítas da cepa RH foram utilizados como fonte de antígenos

solúveis. Os parasitas foram mantidos em cultura de LLC-MK2 (American

Type Culture Collection ATCC CCL7.1) a 37oC. Para a preparação dos

antígenos solúveis, os parasitas foram recuperados das culturas e passados

várias vezes por uma seringa com agulha gauge 27. Os taquizoítas foram

separados das eventuais células LLC-MK2 em suspensão por centrifugação

de baixa velocidade (70g por 5 minutos) e o sobrenadante foi novamente

centrifugado a 590g por 10 minutos. Os parasitas no precipitado foram

lisados por ciclos de congelamento e de descongelamento (-196oC e 37oC,

respectivamente). A lise foi completada após 4 ciclos de ultra-som usando

uma micro-sonda (MicrosonTM, Misonix Inc., Farmingdale, NY, EUA). O

homogenato resultante foi centrifugado a 10.000g por 5 minutos. O

sobrenadante obtido contém as proteínas solúveis do parasita e é

50
Material e Métodos

denominado STAg (Soluble Toxoplasma Antigen – antígenos solúveis de

Toxoplasma). A concentração protéica foi determinada pelo kit da Pierce

(Rockford, IL, USA) utilizando albumina sérica bovina (BSA, Sigma Chemicals

Company, St. Louis, MO, EUA) como padrão. As amostras foram filtradas

usando microfiltros de 0,22µm (Millipore), aliquotadas e acondicionadas a –

80oC até o uso.

3.2.2. Reagentes

Foram utilizados anticorpos monoclonais anti-IgA anti-IgE humanas e

anticorpos monoclonais biotinilados anti-IgG, -IgG1, -IgG2, -IgG3 e -IgG4

humana (Pharmingen, San Diego, CA, EUA), estreptovidina HRP

(Pharmingen), o substrato 3, 3’, 5, 5’ tetrametilbenzidina (TMB,

Pharmingen), PBS 0,01M pH 7,2, Tween 20 (polietileno 20 surbital

monolauril, Research Organics, Cleveland, Ohio, USA), tampão

carbonato/bicarbonato de sódio 0,5M, pH 9,6 (Synth, São Paulo, Brasil),

H3PO4 1M (Synth), kits IgM (Toxonostika IgM II, Biomérieux, França) e IgG

(ETI-TOXOK-G PLUS, Dia Sorin, Itália).

3.3. Separação do plasma e de células mononucleares do sangue

periférico (PBMC)

Foram coletadas amostras de sangue venoso, em tubos vacuntainer,

contendo ácido cítrico 0,105M (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). A

51
Material e Métodos

partir destas amostras, foi realizada a centrifugação (500 g/ 5 minutos) para

separação de plasma que foi aliquotado e congelado (-20º C) até o uso.

PBMCs foram separadas por gradiente de densidade em solução de Isolymph

(Gallard-Schleisinger Industries - Carle Place, NY, EUA). Após a separação,

as células foram lavadas 3 vezes em meio de cultura suplementado e

preservadas para extração de DNA genômico.

3.4. Ensaios Imunoenzimáticos para pesquisa dos isótipos

A detecção das subclasses de IgG (IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4) anti-T.

gondii foi realizada pelo método de ELISA indireto. Placas de 96 poços, de

fundo chato e alta afinidade (Costar, Cambridge, MA, EUA) foram

sensibilizadas com 10μg/ml de STAg, em tampão carbonato/bicarbonato de

sódio 0,5M, pH 9,6 e incubadas por 18 horas a 4ºC. As placas então foram

lavadas 5 vezes com Solução de Lavagem [PBS-Tween: PBS 0,01M , pH 7,2,

0,05% Tween 20 (polietileno 20 surbital monolauril)] e submetidas ao

bloqueio de regiões nos poços não cobertos pelo STAg com 200μl de PBS-

Tween + 3% gelatina (Synth, São Paulo, Brasil) por poço e incubação, por

três horas em estufa seca a 37ºC. As placas foram então lavadas com PBS-

Tween e as amostras diluídas foram adicionadas em duplicata. A diluição dos

plasmas foi em tampão carbonato/bicarbonato de sódio 0,5M, pH 9,6, sendo

IgG1 e IgG2 na razão de 1:50 e IgG3 e IgG4 na razão 1:25. Após incubação

de duas horas em estufa seca a 37ºC, as placas foram novamente lavadas

52
Material e Métodos

com PBS-Tween e 200μl do anticorpo de detecção biotinilado (anti- IgG1,

anti- IgG2, anti- IgG3, e anti- IgG4) foram adicionados na concentração de

5μg/ml. As placas foram incubadas em estufa seca a 37ºC por uma hora,

novamente lavadas com PBS-Tween 0.05% e adicionados 200μl da

estreptovidina HRP (horseradish peroxidase; Pharmingen, San Diego, EUA)

diluída em 1:4000 em PBS-Tween. Após incubação de uma hora à

temperatura ambiente (TA), as placas foram lavadas e 100μl do substrato -

3, 3’, 5, 5’ tetrametilbenzidina (TMB, Pharmingen) foram adicionados por

poço. Em seguida, as placas foram mantidas ao abrigo da luz por 5 minutos

e a reação interrompida com a adição de 50μl de H3PO4 (1M). A leitura das

absorbâncias, a 450nm, foi obtida com leitor de ELISA SpectraMax 190 da

Molecular Devices (Mountain View, CA, EUA) utilizando o programa

SOFTMaxPro 5.1.

A detecção de IgA e IgE específico para T. gondii nas amostras dos

voluntários foi realizada pelo método de ELISA de captura. Placas de 96

poços de fundo chato e alta afinidade (Costar) foram sensibilizadas com

10µg/ml de anti-IgA ou IgE humana diluída em PBS-Tween e incubadas a

4ºC por 18 horas. As placas foram então lavadas 5 vezes com PBS-Tween e

bloqueadas com 200μl de gelatina 3% (PBS-Tween). As placas foram

incubadas em estufa seca a 37ºC por três horas e, então, novamente

lavadas 5 vezes com PBS-Tween. Em seguida, foram adicionados 200µl das

duplicatas das amostras, diluídas na razão 1:25 em PBS-Tween, e incubadas

53
Material e Métodos

em estufa seca a 37ºC por duas horas. As placas foram lavadas (5 vezes

com PBS-Tween) e adicionado 100µl do conjugado composto por antígeno de

Toxoplasma e anti-Toxoplasma de ovelha marcado com HRP (Biomérieux,

França). Após incubação em estufa seca por uma hora, as placas foram

lavadas e foi adicionado o substrato TMB. As placas foram mantidas ao

abrigo da luz e, após 15 minutos da adição do substrato, a reação foi

interrompida adicionando-se 50μl de H3PO4 1M. A leitura das absorbâncias, a

450nm, foi obtida com leitor de ELISA SpectraMax 190 da Molecular Devices

(Mountain View, CA, EUA) utilizando o programa SOFTMaxPro 5.1.

Os resultados foram definidos pelo valor de corte (cut-off), que foi

estabelecido como a média dos controles negativos adicionados 2 vezes o

desvio padrão. Em seguida estabelecido o Índice, obtido pela divisão do valor

da absorbância de cada amostra pelo cut-off. Os Índices superiores a 1,11

foram considerados positivos, entre 0,91 e 1,10 foram considerados

indeterminados e inferiores a 0.90 foram considerados negativos (ANEXO

C).

Para a determinação de anticorpos da classe IgM anti-T. gondii em

plasma dos voluntários, foi utilizado um kit comercial de ELISA, de captura

(Biomérieux, França). Amostras em duplicatas diluídas (1:100) em PBS

0,01M foram adicionadas. Os controles (negativo, positivo e fortemente

positivo) foram diluídos em tampão fosfato 1:10 e também adicionados em

duplicata. Em seguida, as tiras foram incubadas a 37ºC durante 1 hora,

54
Material e Métodos

seguido da lavagem (4 vezes) com tampão fosfato. A solução antífen

(antígeno de Toxoplasma e anti-Toxoplasma de ovelha marcado com HRP)

foi adicionada em cada poço e então as tiras foram incubadas a 37ºC por 1

hora. Em seguida, as tiras foram lavadas 4 vezes com PBS 0,01M e foi

adicionado substrato TMB (200μl). Após incubação a TA por 30 minutos, a

reação foi interrompida com ácido sulfúrico 1M. A leitura das absorbâncias, a

450nm, foi obtida com leitor de ELISA SpectraMax 190 da Molecular Devices

(Mountain View, CA, EUA) utilizando o programa SOFTMaxPro 5.1.

A detecção de IgG específica para T. gondii, em plasma de voluntários

foi obtida utilizando-se um kit comercial baseada no princípio do ELISA

indireto (DiaSorin, Itália). Às tiras de microelisa, cada uma com oito poços

recobertos com Toxoplasma gondii inativado (cepa RH), foram adicionadas

duplicatas das amostras diluídas (1:100) em solução tampão, com albumina

bovina sérica (BSA) Controles positivos e negativos (100μl de cada) foram

utilizados. Em seguida, as tiras foram incubadas a 37ºC durante 1 hora, e

imediatamente após a incubação, foram lavadas 4 vezes com PBS-Tween.

Foi adicionada 100μL do conjugado enzimático (solução de IgG monoclonal

de camundongo anti-IgG humana conjugada com HRP) por poço e incubados

a 37ºC por 1 hora. Em seguida, as placas foram lavadas 4 vezes com PBS-

Tween e o substrato (TMB) foi adicionado. Após incubação a TA por 30

minutos, a reação foi interrompida com ácido sulfúrico 1M. A leitura das

absorbâncias, a 450nm, foi obtida com leitor de ELISA SpectraMax 190 da

55
Material e Métodos

Molecular Devices (Mountain View, CA, EUA) utilizando o programa

SOFTMaxPro 5.1. Todas as amostras foram avaliadas em triplicatas, valores

de densidade óptica variando em mais de 15% para uma mesma amostra

foram descartados.

3.5. Definição do índice de avidez para IgG anti- T. gondii

A determinação da avidez dos anticorpos IgG específicos para o T.

gondii foi realizada com kits comerciais Vidas Toxo IgG Avidy (BioMérieux –

França) no equipamento Mini-Vidas (BioMérieux – França) em colaboração

com o Laboratório Clínicos Associados – São Paulo – SP. O princípio associa o

método ELISA sanduíche, em duas etapas, com uma detecção final em

fluorescência (ELFA).

O cone de utilização única serve tanto para a fase sólida, como de

suporte de pipetagem. Os outros reagentes estão prontos para uso e

repartidos numa barrete/tira. Todas as etapas do teste foram realizadas

automaticamente no equipamento. O Vidas Toxo IgG Avidy utiliza uma

barrete dupla, composta por uma barrete de referência, a lavagem permite

eliminar anticorpos não específicos. 100 μL da amostra, previamente diluída

(soro humano + albumina+ azida sódica 1 g/l), foi colocada em cada poço

das duas barretes. As IgG anti–toxoplásmicas da amostra formam complexos

com o antígeno, fixado à fase sólida. Na barrete de referência, a lavagem

permite eliminar os anticorpos inespecíficos. Na barrete teste, a lavagem

56
Material e Métodos

com o agente dissociante modifica as ligações antígeno-anticorpo. Somente

os anticorpos de alta avidez permanecem ligados na fase sólida, enquanto os

de baixa avidez são eliminados. Os anticorpos anti- IgG humanos conjugados

com fosfatase alcalina foram aspirados e dispensados várias vezes no interior

do cone, fixando-se assim às IgG humanas, eventualmente, presentes na

parede do cone. Durante a etapa final de revelação, o substrato (4-Metil-

Umbeliferil Fosfato) é aspirado e dispensado pelo cone. A enzima do

conjugado catalisa a reação de hidrólise deste substrato num produto (4-

Metil-Umbeliferona) cuja fluorescência é medido a 450nm. Esta é

proporcional à concentração dos anticorpos presente na amostra. A relação

entre a quantidade de anticorpos de alta avidez (barrete teste) e a

quantidade de anticorpos totais (barrete referência) fornece um índice que

demonstra a avidez dos anticorpos presentes na amostra analisada. O índice

superior a 31% é considerado de alta avidez, índices iguais ou entre 31% e

29% são considerados indeterminados e índices menores que 29% foram

considerados de baixa avidez.

3.6. Análise sorotípica de cepas de T. gondii

3.6.1. Seqüência de peptídeos

Os peptídeos selecionados foram obtidos e utilizados no Laboratório de

Biologia Molecular do Dr. Michael Grigg da British Columbia University –

Vancouver – Canadá. As seqüências de nucleotídeos foram selecionadas dos

57
Material e Métodos

arquétipos das cepas tipo I (RH), tipo II (Me49 e Prugniaud) e tipo III (VEG e

CEP) descritas no GenBank de seqüências expressadas pelo Toxoplasma ou

por sequenciamento direto dos 14 imunógenos do Toxoplasma, que são:

proteínas do grânulo denso GRA1 (BEGHETTO et al., 2001), GRA3 (ROBBEN et

al., 2002), GRA4 (MEVELC et al., 1998), GRA6 (FAZAELI et al., 2000), GRA7

(JACOB et al., 1999); NTPase I e III (BERMUDES et al., 1994; JOHNSON et al.,

1999); antígenos de superfície (SAG)-1, SAG2, SAG3, SAG4, BSR4 e SRS2

(HOWE et al.,1997; GRIGG et al., 2001; GRIGG, BOOTHROYD, 2001); e as

proteínas da róptria ROP1 (KONG et al., 2003). Todas as seqüências de

peptídeos já foram previamente descritas (KONG et al., 2003). Dois peptídeos,

ctrl-1 (CEVVHDYRLFNP) e ctrl-2 (CENFSPHFVGLD), foram usados como

controles negativos.

Os peptídeos foram produzidos pelo método de fase-sólida com um

sintetizador automático de peptídeos e a pureza foi avaliada por

espectroscopia de massa na Stanford Protein e Nucleotide facility (Stanford,

CA). Um resíduo de cisteína foi adicionado na região C ou N terminal de cada

peptídeo para facilitar o acoplamento à proteína carreadora “keyhole limpet

hemocyanin” (KLH; Pierce by maleimide chemistry), de acordo com as

especificações do fabricante. As seqüências dos peptídeos utilizados neste

estudo estão descritas no QUADRO I.

58
Material e Métodos

QUADRO I. Peptídeos alelo- específicos, derivados de imunógenos do Toxoplasma, os quais


são fortemente reconhecidos por anticorpos alelos-específicos em soros de animais ou
humanos infectados pelo Toxoplasma gondii.
Lócus genético Nome Seqüência dos peptídeos
GRA6-I/III 6-I/III CLHPERVNVFDY
220
dGRA6-I/III d6I/III CLHPERVNVFD
220
GRA6-II 6-II CLHPGSVNEFDF
214
dGRA6-II d6-II CLHPGSVNEFD
214
GRA7-II 7-II CVPESGKDGEDARQ
225

Nota: "I," "II," e "III" referem-se ao arquétipo da cepa que inclui a seqüência de peptídeo, os números
seguintes indicam a posição na seqüência código do primeiro aminoácido de cada peptídeo. A cisteína
(C) nas regiões amino (N) e carboxi (C) terminais eram acrescentadas para estabilizar o peptídeo e
não estão presentes na proteína. As letras em negrito indicam os sítios polimórficos.

3.6.2. Ensaios imunoenzimáticos cepa-específicos

Peptídeos ligados a KLH foram diluídos para 10 µg/mL em 0,1M de

tampão carbonato (pH 8,5). Como controle positivo para cada amostra de

soro, 1% Nonidet P-40 (Calbiochem; NP-40), lisado de Toxoplasma – STAg -

foram preparados e diluídos para o equivalente de 1000 parasitas. 50µL de

cada peptídeo ou do lisado (i.e., ~50 parasitas) foi adicionado em cada poço

da placa de poliestireno de ELISA (Falcon flat-bottom - Becton Dickinson –

Le Pont de Claix - França) para sensibilização a 4°C por 12 horas. Cada poço

foi então bloqueado com 200 µL de solução de caseína 2% (purificada de leite

bovino - Sigma) em PBS com 0,01% timerosol e incubado a TA por 2 horas.

Na etapa seguinte, 50µL de soro infectado diluído 1:100 em solução de

caseína 1% foi adicionado em cada poço, as placas foram incubadas a TA por

3 horas. Após o período de incubação, as placas foram lavadas 4 vezes com

59
Material e Métodos

solução de caseína 1% e então, adicionado 50 µL do anticorpo monoclonal

anti- IgG humana (1:1000) ou camundongo (1:3000) conjugado com HRP

(horseradish peroxidase) (BD Pharmigen). Os anticorpos conjugados foram

diluídos em solução de caseína 1% e 0,1% de Tween 20. As placas foram

incubadas durante 2 horas à TA. As placas foram novamente lavadas (PBS e

0,1% Tween 20) por 5 vezes e em seguida, foi adicionado 150µL do

cromógeno ABTS (Kirkegaard e Perry Laboratories – Maryland - EUA),

incubado por 15 minutos. A absorbância foi medida no comprimento de onda

de 405nm, nos tempos 15, 60, 120, 240 minutos e em 24 horas. no leitor de

ELISA SpectraMax 190 da Molecular Devices (Mountain View, CA, EUA)

utilizando o programa SOFTMaxPro 5.1. Amostras de soro de pacientes não-

infectados serviram como controles negativos, para estabelecer a reatividade

basal do ELISA e os resultados estão descritos no Anexo D.

3.6.3. Normalização dos resultados dos ELISAs

Todas as amostras foram analisadas em triplicatas, em experimentos

independentes. Para cada experimento as absorbâncias (D.O.) de cada

amostra eram normalizadas utilizando como referência a média aritmética

das D.O. de cada amostra em relação as D.O. dos peptídeos controles (P/E e

Ctrl2). Os valores de densidade ótica para cada amostra foram então

normalizados com a seguinte fórmula:

D.O.normalizada
D.O. normalizada =
= D.O amostra
D.O. (amostra) Onde O
X nde
= (D.O
X= D.O + D.O.
P/E. P/E + D.OCtrl2 )
. ctrl.
X X 2 2
60
Material e Métodos

Os resultados apresentados neste trabalho representam a média de

três experimentos da densidade óptica normalizada detectado para cada

amostra, com leituras no tempo de 24 horas.

3.7. Análise Estatística

Foram determinados parâmetros estatísticos (média, mediana, desvio

padrão, valor mínimo e valor máximo) dos índices de IgM, IgA e IgE e dos

valores de densidade ótica de IgG total e dos subtipos de IgG utilizando o

programa GraphPad Prism versão 4.00 (GraphPad Software, Incorporated),

para e definição dos valores de corte dos isótipos. Uma vez definido o cut-

off, utilizamos a análise da área sobre a curva ROC (do inglês, receiver

operating characteristics) (HANLEY e McNEIL, 1984; GREINER et al., 1995) para a

definição da sensibilidade, especificidade para cada isótipo. A descrição

destas análises encontra-se no Anexo E.

As variáveis categorizadas foram representadas em gráficos por índice

ou densidade ótica, onde os grupos controles e experimentais foram

comparados pelos testes ANOVA e o teste de múltiplas comparações de

Tukey e teste T, para dados não pareados e não-paramétricos, utilizando o

programa GraphPad Prism versão 4.00. O intervalo de confiança adotado foi

de 95%, onde os valores descritivos (p) inferiores a 0,05 foram considerados

significantes.

61
Resultados

4. Resultados

4.1. Avaliação da imunidade humoral na toxoplasmose ocular

4.1.1. Características da população estudada em relação à faixa etária


e sexo

Inicialmente analisamos a correlação entre toxoplasmose ocular, idade,

e sexo na população estudada, para investigar se haveria alguma correlação

entre à faixa etária e o gênero com o desenvolvimento da TO.

Representamos na Figura 4, a distribuição da população em relação à faixa

etária e a presença ou ausência da lesão ocular. Os dados representam

indivíduos sem lesão ocular (n=110) e com lesão ocular (n= 167). O número

de indivíduos avaliados em cada grupo, por faixa etária, encontra-se descrito

na tabela sob a figura.

Baseados na análise da Figura 4, algumas observações devem ser


ressaltadas:

a) o percentual de indivíduos com lesão ocular é crescente com a faixa


etária, sugerindo que a ocorrência da TO aumenta da idade;

b) indivíduos soropositivos sem lesão ocular estão predominantemente


na faixa de 21 a 30 anos;

c) a toxoplasmose ocular foi detectada em 69% dos indivíduos da faixa


de 31 a 40 anos;

d) entre os indivíduos acima de 51 anos, a freqüência da TO parece


ser alta, ainda que o número de indivíduos avaliados neste grupo foi
pequeno;

62
Resultados

e) em relação à faixa de 0 a 10 anos, embora o número de indivíduos


esteja no mesmo patamar que o item anterior, parece que a freqüência da
lesão ocular é baixa nesta faixa etária.

Diante do dado que a freqüência da TO aumenta com a faixa etária,

podemos dizer que na população estudada, a forma adquirida é prevalente

que a forma congênita, uma vez que indivíduos com TO congênita

desenvolvem a lesão nos primeiros anos de vida (HOLLAND, 2004).


S e m le s ã o o c u la r
C o m le s ã o o c u la r
100

75
%

50

25

0
0-10 11-20 21-30 31-40 41-50 >50
F a ixa e tá ria (a n o s )

Faixa etária (anos)


0 a 10 11 a 20 21 a 30 31 a 40 41 a 50 >50
Grupos Clínicos
Soropositivo sem lesão 5 11 17 9 9 3
IgM+ sem lesão 4 17 14 13 8 2
IgM+ com lesão 1 2 1 6 6 2
Lesão Branda 6 11 17 5 1
Lesão grave 3 40 23 39 32 16

Figura 4 – Distribuição da população estudada de acordo com a faixa etária e a


toxoplasmose ocular. Gráfico representa o percentual de indivíduos classificados pela
presença ou ausência da TO, em relação à faixa etária. A tabela representa o número
absoluto destes indivíduos em cada grupo clínico por faixa etária, que está representada em
anos.

63
Resultados

Uma vez caracterizada a população em relação à faixa etária,

verificamos também se havia diferença entre freqüência da toxoplasmose

ocular e o sexo. Avaliamos 372 indivíduos, sendo: 135 do sexo feminino e

137 do sexo masculino.

Conforme apresentamos na Figura 5A, há maior percentagem de

indivíduos do sexo masculino com lesão ocular, totalizando 58% (97/166), e

maior percentagem de indivíduos do sexo feminino sem lesão ocular (66% -

66/106). Com base nesta observação, verificamos se havia diferença na

distribuição por sexo e faixa etária.

Os dados representados na Figura 5B, mostram que há maior número

de indivíduos do sexo masculino entre crianças (0-10 anos) e adolescentes

(11-20 anos), enquanto, a grande maioria (60%) das mulheres soropositivas

está acima dos 21 anos.

Ainda em relação ao sexo, verificamos se havia alguma diferença entre

a produção dos isótipos nestes grupos. A produção de subclasses de IgG é

semelhante em ambos os grupos, porém foi detectada a produção

significativamente maior de IgA e IgE (p< 0,001), entre os indivíduos do

sexo masculino, como dispõem os dados na Figura 5C. Além disso,

verificamos que 78% dos pacientes com baixo índice de avidez eram do sexo

masculino (dado não mostrado). Estes dados sugerem que há maior

incidência da infecção entre homens.

64
Resultados

Masculino

A) 100 Feminino

Número de indivíduos
80

60

40

20

0
Ausente Presente

Toxoplasmose ocular

B) 80

60

% 40

20

0
0-10 11- 20 21- 30 31- 40 41- 50 >50

Faixa etária

6
***
C) 5

4
Índice

2
***

0
IgA IgA IgE IgE

Isótipos

Figura 5 - Distribuição da população estudada de acordo com o sexo, toxoplasmose


ocular, faixa etária e produção dos isótipos. A) representação gráfica do número de
indivíduos do sexo masculino e feminino em relação à toxoplasmose ocular; B) representa o
percentual de indivíduos de ambos os sexos distribuídos por faixa etária em anos; C)
representa a produção individual de IgA e IgE anti- T. gondii em índice por indivíduos
Soropositivo de ambos os sexo. As linhas vermelhas representam as medianas dos grupos.
*** representam as diferenças estatísticas (p<0,001) através do teste T para análises não-
pareadas, com 95% de intervalo de confiança.

65
Resultados

4.1.2. Correlação entre os isótipos e a toxoplasmose ocular

Após as correlações feitas anteriormente, analisamos possíveis

diferenças na produção dos isótipos entre os indivíduos com e sem TO. A

Figura 6 representa a produção dos isótipos IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA e

IgE específicos para T. gondii nestes grupos. Observamos que em ambos os

grupos houve produção de IgG1 (cut-off = 0,50), porém sem diferenças

estatísticas. Em relação ao IgG2, a média de detecção nos mesmos grupos

ficou abaixo do valor de corte (cut-off= 0,80). Entretanto, quando avaliamos

a produção de IgG3, IgA, IgG4 e IgE observamos que houve produção

significativamente maior (p< 0,0001 e p< 0,01, respectivamente) entre os

indivíduos sem lesão ocular. Com base nestes dados, decidimos avaliar a

produção dos isótipos nos diferentes grupos clínicos e sorológicos.

Avaliamos a produção dos isótipos com os voluntários categorizados,

de acordo com o perfil sorológico e apresentação clínica da toxoplasmose

ocular. Os resultados que estão demonstrados na Figura 7 nos comprovam

que o isótipo IgG1 foi detectado em todos os grupos analisados. Houve

produção significativamente maior de IgG2 (p< 0,001) no grupo IgM+ sem

lesão, quando comparado com os grupos soropositivo sem TO e TO grave

(p< 0,01) e soronegativo (p< 0,001).

66
Resultados

A)
C O M TO
SEM T O
2.5

2.0 ** **
D.O. (450nm)

1.5

1.0

0.5

0.0
IgG 1 IgG2 IgG3 IgG 4

Isó t ip o s a n t i- T . g o n d ii

5.0
B) ***
Índice

2.5

**

0.0
I gA I gE

Isó tip o s a n ti- T . go n d ii

Figura 6 – Detecção de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA e IgE anti- T. gondii no plasma
de indivíduos de Erechim-RS de acordo com a toxoplasmose ocular. Representação
individual dos isótipos detectados por (A) ELISA indireto (IgG1-4) e por (B)ELISA de captura
(IgA e IgE) de acordo com a presença (IgG1-4, n=156; IgA, n= 85; IgE, n= 52) ou ausência
para (IgG1-4, n= 106; IgA, n= 60; IgE, n= 49) da lesão ocular. Os resultados estão
expressos em densidade óptica (D.O) obtida a 450nm e em índice. Os dados estão
representados em “Box plot” com distribuição em valor máximo, segundo percentil,
mediana, terceiro percentil e valor mínimo para cada isótipo. (*** e **) representam as
diferenças estatísticas (p<0,0001 e p<0,01, respectivamente) através do Anova seguido de
Tukey para análises não-pareadas, num intervalo de confiança de 95%.

67
Resultados

Ainda em relação ao grupo IgM+ sem TO, a produção de IgG3 foi,

segundo a análise estatística, significativamente maior quando comparado

com os grupos TO branda, TO grave, soronegativo (p< 0,001) e soropositivo

sem lesão (p< 0,01). Este dado nos levou a pensar que a presença do IgG3

no início da infecção pudesse prevenir o desenvolvimento da lesão ocular.

Analisando os dados apresentados na Tabela II, observamos que entre os

indivíduos sem toxoplasmose ocular 53% produziram IgG3 específica,

enquanto na grande maioria (72%) dos indivíduos com lesão ocular este

isótipo não foi detectado. Por outro lado, não houve diferença significativa na

produção deste isótipo em relação ao grupo IgM+ com lesão, sugerindo a

participação deste isótipo em infecções recentes.

Embora a produção do isótipo IgG4 tenha sido baixa na maioria das

amostras analisadas, no grupo soropositivo a produção desta imunoglobulina

foi significativamente maior do que nos grupos com lesão oculares, incluindo

IgM+ com TO e TO grave (p< 0,01) e TO branda (p< 0,001) e soronegativo

(p< 0,001). Estes dado nos levaram a pensar, se haveria alguma relação

entre a presença deste anticorpo e a proteção para o desenvolvimento da

toxoplasmose ocular.

Na Figura 7 representamos os resultados da pesquisa de IgA e IgE

específicas, detectados no soro dos voluntários dos diferentes grupos. No

que diz respeito à detecção de IgA, verificamos que houve produção

68
Resultados

significativamente maior deste isótipo nos indivíduos IgM+ com e sem lesão

ocular em relação aos demais grupos. Outro dado interessante, agora em

relação à presença de IgE, em todos os grupos as médias ficaram abaixo do

valor de corte (índice= 1), porém no grupo IgM+ sem TO foi detectado maior

produção de IgE em relação aos demais grupos (p< 0,001).

Tabela II – Avaliação da produção de IgG3 anti- T. gondii em pacientes infectados


em Erechim. Os valores representam o número de indivíduos produtores de IgG3 específica
classificados de acordo com a manifestação clínica da toxoplasmose ocular
Toxoplasmose ocular
Ausente Presente
Valor de corte IgM+ Soropositivo IgM+ Lesão branda Lesão grave
IgG3 ≤ 0,80 17 30 7 23 87
IgG3 ≥ 0,81 45 27 12 7 50
Observação: o valor de corte definido para o isótipo IgG3 pelo método ELISA foi 0,8 de densidade
óptica no comprimento de onda de 450nm. Valores iguais ou superiores a 0,81 foram considerados
positivos.

69
Resultados

IgM+ com T.O. IgM+ sem T.O.


2 5.0 2 5.0
D.O. (450nm)

Índice
1 2.5 1 2.5

0 0.0 0 0.0

T.O. branda T.O. grave


2 5.0 2 5.0
D.O. (450nm)

Índice
1 2.5 1 2.5

0 0.0 0 0.0

Soropositivo Soronegativo
2 5.0 2 5.0
D.O. (450nm)

Índice
1 2.5 1 2.5

0 0.0 0 0.0
IgG1 IgG2 IgG3 IgG4 IgA IgE IgG1 IgG2 IgG3 IgG4 IgA IgE

Figura 7 – Detecção de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA e IgE anti- T. gondii no plasma de
indivíduos de Erechim-RS de acordo com o diagnóstico clínico. Representação dos isótipos
detectados por ELISA indireto (IgG1-4) e por ELISA de captura (IgA e IgE) de acordo com a
classificação clínica dos indivíduos: IgM+ sem toxoplasmose ocular (TO) (n=56) – indivíduos com lesão
adquirida sem lesão ocular; IGM+ com TO (n=20) - paciente com infecção adquirida com lesão ocular;
T.O branda (n=27) – indivíduos com infecção crônica e lesão ocular branda; TO grave (n=118, para
subclasses de IgG; n= 54 para IgA e n= 35 para IgE) – indivíduos com infecção crônica e com lesão
grave; Soropositivo (n= 50)- paciente com infecção crônica há mais de dois anos e sem lesão ocular;
Soronegativo (n= 35, para subclasses de IgG e n= 30 para IgA e IgE) - indivíduos sorologia negativa
para T. gondii. Os resultados estão expressos em densidade óptica (D.O) obtida a 450nm e em índice.
Os dados estão representados em “Box plot” com distribuição dos dados em valor máximo, segundo
percentil, mediana, terceiro percentil e valor mínimo para cada isótipo e as linhas pontilhadas
determinam o valor de corte. Os resultados acima ou baixo do valor de corte e do índice são
considerados positivos ou negativos, respectivamente.

70
Resultados

Diante dos dados mostrando diferenças na produção dos isótipos nos

grupos clínicos, investigamos se haveria correlação entre a produção destas

imunoglobulinas e o tempo de infecção. Para isso, fizemos análises para

correlacionar à presença do isótipo IgM, a produção dos outros isótipos

(IgG1-4, IgA, IgE) e a avidez de IgG específica.

A Figura 8 é a representação gráfica da análise ultra mencionada, na

qual podemos observar que nos indivíduos IgM positiva há produção

significativamente maior de IgG2, IgG (p< 0,001) e IgA (p< 0,0001) em

relação aos indivíduos IgM negativa. A presença do IgM não exclui uma

infecção latente, contudo nó prediz que estes indivíduos têm infecção

adquirida Para investigar casos de infecção adquirida recente na população

estudada, nós também analisamos a avidez de IgG.

4.1.3. Determinação do índice de avidez de IgG anti- T. gondii

Dando continuidade a caracterização da resposta imune humoral nesta

população, a nossa próxima investigação foi para verificar, se os pacientes

dos grupos IgM+ tinham infecção recente ou IgM persistente. Para isso,

determinamos o índice de avidez de IgG anti-T. gondii, o qual é considerado

um marcador sorológico para diferenciar uma infecção recente ou crônica

(HEDMAN et al., 1989). Foram analisados 69 soros de indivíduos para a

determinação do índice de avidez, sendo destes: 25 (36%) apresentaram

índice de avidez baixa e 44 (64%) apresentaram avidez alta.

71
Resultados

IgM negativo
IgM positivo
2 ** ** *** 5

4
D.O. (450nm)

Índice
1
2

0 0
IgG1 IgG2 IgG3 IgG4 IgA IgE

Figura 8 – Relação entre a produção dos isótipos (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA e
IgE) anti- T. gondii e a presença de IgM específica no plasma de indivíduos de
Erechim-RS. Representação gráfica dos isótipos detectados por ELISA indireto (IgG1-4) e
por ELISA de captura (IgA e IgE) no plasma de indivíduos soropositivo para T. gondii
classificados por IgM positiva (IgG1-4, n= 138; IgA, n= 102; IgE, n= 64) para ou IgM
negativa (IgG1-4, n= 52; IgA, n= 42; IgE, n= 37). Os resultados estão expressos em
densidade óptica (D.O) obtida a 450nm para as subclasses de IgG e em índice para IgA e
IgE. Os dados estão representados em “Box plot” com distribuição dos dados em valor
máximo, segundo percentil, mediana, terceiro percentil e valor mínimo para cada isótipo.
*** e ** representam as diferenças estatísticas (p<0,0001 e p<0,01, respectivamente)
através do teste T para análises não-pareadas, num intervalo de confiança de 95%.

Na Figura 9 representamos os resultados individuais da pesquisa de

subclasses de IgG, IgA e IgE no soro dos indivíduos em relação à avidez.

Observamos que nas amostras com alto índice de avidez há produção

substancialmente maior de IgG1 (p< 0,001). Enquanto, conforme esperado,

há maior produção de IgA e IgE (p< 0,01) nas amostras com baixa avidez.

Outra observação, nos indivíduos com infecção adquirida há predomínio dos

isótipos IgG1 e IgG3, embora não seja significativa esta diferença. IgG1 é

72
Resultados

produzida em maior quantidade nas amostras com alta avidez. Por outro

lado, foi detectada a presença de IgG2 nas amostras dos indivíduos com alta

avidez. Este dados em conjunto sugerem um padrão diferente de resposta na

infecção adquirida recente.

Baixo Í ndice da av idez


Alto Í ndice de av idez

2.5 8
**
***
2.0
6
D.O. (450nm)

1.5

Índice
4
1.0
** 2
0.5

0.0 0
IgG1 IgG2 IgG3 IgG4 IgA IgE

I sótipos anti- T. gondii

Figura 9 - Pesquisa da avidez de IgG anti-T. gondii em relação à detecção dos


isótipos anti-T. gondii em soro de indivíduos de Erechim. Representação individual dos
isótipos detectados por ELISA indireto (IgG1-4), expressos em densidade óptica, e por
ELISA de captura (IgA e IgE), expressos em índice, o gráfico representa os resultados
obtidos no plasma dos indivíduos com baixo (n=25) e alto índice de avidez (n=44) para IgG
anti-T.gondii. ** e *** representam da diferença estatística (p<0,01 e p< 0,001,
respectivamente) pelo teste T não-pareado num intervalo de confiança de 95%.

73
Resultados

Para melhor entender a dinâmica da infecção, analisamos a correlação

entre a produção dos isótipos. Conforme representado na Figura 10, há

uma correlação negativa entre a produção de IgM e IgG1, enquanto que com

o IgG3 esta correlação é positiva. Neste mesmo grupo, há correlação positiva

entre IgG1 e IgG3 (dado não apresentados). Não foram observadas

correlações em relação aos outros isótipos.

2
IgG3

IgG1
D.O. (450nm)

2
r = 0,20

2.5 5.0 7.5 10.0

IgM

Figura 10 – Correlação entre IgM, IgG1 e IgG3 anti-T. gondii detectado em soro de
indivíduos de Erechim. Representação da regressão linear dos isótipos detectados por
ELISA indireto (IgG1 e IgG3), expressos em densidade óptica, e por ELISA de captura (IgM),
expressos em índice.

74
Resultados

4.1.4. Relação entre a produção de IgA, faixa etária e lesão ocular

Na infecção pelo toxoplasma, IgA sérica pode ser detectada no início ou

em casos de recidiva. Há indícios de que a produção deste isótipo esteja

associada com a ocorrência da toxoplasmose ocular em outras populações

brasileiras (Portela et al., 2004). Avaliamos a produção de IgA anti- T. gondii

no plasma de indivíduos da cidade de Erechim, categorizados de acordo com

a faixa etária e a presença ou ausência de lesão ocular, com o objetivo de

associar a presença deste anticorpo com o comprometimento ocular.

A Figura 11 representa graficamente o percentual dos indivíduos

produtores do isótipo IgA por faixa etária. Nossos resultados mostram que

entre os indivíduos sem TO a produção de IgA foi maior (28%) entre

adolescentes, na faixa entre 11 e 20 anos de idade. Nas faixas etárias entre

21 até 50 anos de idade a produção de IgA específica foi uniforme (21%),

enquanto entre crianças e indivíduos acima de 60 anos a detecção foi menor,

entre 6% e 2%, respectivamente. Destarte, entre os indivíduos com

toxoplasmose ocular foi detectado IgA em 38% dos indivíduos na faixa entre

41 e 50 anos de idade, 18% nas faixas de 11 a 20, 31 a 40 e 50 a 60 anos;

2% entre os indivíduos com 21 a 30 anos, enquanto que em crianças este

isótipo não foi detectado.

75
Resultados

40 Sem lesão ocular


com lesao ocular

30
%

20

10

0
0-10 11-20 21-30 31-40 41-50 51-60
Faixa etária (anos)

Figura 11 – Produção de IgA anti- T. gondii em indivíduos com ou sem


lesão ocular distribuídos em faixas etárias. As barras representam o percentual
de indivíduos com produção de IgA específica em cada faixa etária em anos de
acordo com a ausência ou presença da lesão ocular.

4.1.5. Evolução clínica dos pacientes com toxoplasmose adquirida

Para estabelecer se a resposta imune humoral estava implicada na

proteção ou gravidade da toxoplasmose ocular, realizamos o seguimento

clínico dos indivíduos com toxoplasmose adquirida, ou seja, dos grupos IgM+

com e sem lesão ocular. Estes indivíduos foram avaliados clínica e

sorologicamente. Ao primeiro exame clínico, foi feita a avaliação

oftalmológica para investigar o comprometimento ocular e a coleta de

sangue para exames sorológicos. A coleta dos dados clínicos foi feita a partir

76
Resultados

da re-avaliação entre dois a três anos após o primeiro exame. Estes dados

encontram-se descritos no ANEXO B.

Dentre os 20 indivíduos que apresentaram a lesão ocular no início da

infecção, 9 evoluíram para lesão branda e 8 evoluíram para lesão grave. Vale

ressaltar, entre os indivíduos do grupo IgM+ sem TO ao primeiro exame,

algumas características clínicas são interessantes e devem ser mencionadas,

tais como: a) 9 indivíduos apresentaram doença sistêmica exacerbada, com

febre alta e intermitente, linfadenopatia, dores de cabeça fortes, porém não

desenvolveram a toxoplasmose ocular; b) 2 indivíduos evoluíram para uma

toxoplasmose branda; c) 3 indivíduos apresentaram lesão ocular grave; d) 5

indivíduos apresentaram uma toxoplasmose ocular atípica, com discreto ou

raro processo inflamatório, com lesões praticamente imperceptíveis; e) A

grande maioria do grupo (31 pacientes) não desenvolveu TO ou qualquer

outro sintoma da toxoplasmose; f) 15 indivíduos não retornaram para

avaliação clínica. Não foi encontrada associação entre a produção de

anticorpos e a evolução da doença ocular.

4.2. Análise sorotípica do T. gondii

4.2.1. Novos padrões sorotípicos na população estudada

Com o intuito de investigar a relação entre cepa do parasita e o

desenvolvimento da toxoplasmose, avaliamos a presença de anticorpos

contra peptídeos cepa-específicos (Quadro I), em 249 soros provenientes de

77
Resultados

indivíduos soropositivos para T. gondii. Através da sorotipagem (ELISA)

avaliamos a presença de anticorpos contra peptídeos cepa-específicos

(Quadro I) em 249 soros provenientes de indivíduos soropositivos para T.

gondii.

De acordo com a reatividade contra os peptídeos, detectamos seis

consistentes padrões sorotípicos nas amostras analisadas, conforme

descrição a seguir: a) Tipo I/III– 52 amostras com reatividade contra os

peptídeos 6I/III e/ou d6I/III; b) Atípico A – 10 amostras reagiram contra os

peptídeos 6I/III e 7II; c) Atípico B - 9 amostras fortemente reativas contra

os peptídeos 6I/III e/ou d6I/III, 6II e 7II; d) Tipo II – 35 amostras

mostraram um padrão reativo compatível com infecção pelo Tipo II contra os

peptídeos 6II, d6II e/ou 7II; e) Atípico C – 24 soros reagiram contra 6I/III,

6II e 7II; f) Atípico D (n= 119) – praticamente na maioria das amostras

analisadas - 49% - não foi detectada reatividade contra os peptídeos

estudados. Todas as amostras avaliadas reagiram positivamente contra o

lisado do T. gondii e o SAG1, os quais foram usados como controles

positivos. Os dados destas análises estão sumarizados na Figura 12.

Para validação dos nossos resultados, analisamos 40 amostras

provenientes de 20 indivíduos obtidas a partir de diferentes coletas, num

ensaio duplo-cego, utilizando a mesma metodologia para a sorotipagem da

cepa. Os resultados apresentados na Tabela III mostram que o padrão de

78
Resultados

resposta aos peptídeos se mantêm nas diferentes amostras, como por

exemplo nas amostras nº. 297, 129 e 134, que foram coletadas com

intervalo de quase dois anos. Em 3 de 20 indivíduos obtivemos reatividade

compatível com infecção pela cepa do Tipo II, sendo que um paciente

respondeu apenas para os peptídeos do GRA-6 e os outros somente para

GRA-7. Em 5 pacientes detectamos reatividade característica para infecção

pelo tipo I/III. Os padrões de resposta atípicos se mantêm, inclusive em 8

indivíduos permaneceu a ausência de reatividade aos peptídeos, que é

definida como sendo infecção pelo sorotipo atípico D.

Também apresentamos na Tabela III, a evolução clínica da infecção

nestes pacientes, mostrando que a maioria (5/9) dos pacientes infectados

com o sorotipo Atípico D, evoluiu para a forma grave da doença ocular. Estes

dados sugerem que a ausência de resposta nestes indivíduos para os

peptídeos é uma característica da infecção e não do estado imunológico do

paciente.

79
Resultados

Figura 12 – Análise sorotípica do Toxoplasma gondii. Sorotipos detectados em 249 soros dos
pacientes de Erechim- RS em resposta aos peptídeos cepa específicos: 6I/III, d6I/III, 6II, d6II, 7II e
SAG1. O eixo Y de cada gráfico representa o valor da densidade ótica normalizado para os peptídeos
(esquerda) e SAG1 (direita). As linhas pontilhadas representam os valores de cut-off . Cada gráfico
representa um perfil detectado de acordo com a reatividade dos soros contra os peptídeos 6I/III e
d6I/III (tipo I); 6I/III e 7II (Atípico A); 6II, d6II e 7II (Tipo II), 6I/III, d6I/III, 6II, d6II e 7II (Atípico
B); 6I/III, d6I/III, 6II, d6II (Atípico C); Atípico D significa que não foi detectada reatividade positivo
contra nenhum dos peptídeos analisados. A media de cada grupo está representada por linhas cheias.

80
Resultados

Tabela III. Avaliação duplicada de Indivíduos de Erechim- Rs. Amostras de soro ou


plasma de coletas diferentes de indivíduos da Clínica Silveira foram avaliadas para pesquisa
de anticorpos cepa-específicos. As amostras foram coletadas em intervalos de meses ou
anos. Os valores representam a média da triplicata da densidade óptica normalizada
detectada no soro dos indivíduos por ELISA indireto para cada um dos peptídeos cepa-
específicos (6/I/III, d6I/III, 6II, d6II, 7II).
Peptídeos cepa-específicos
N0 Data da Grupo
GRA-6 GRA7 Sorotipo da
Paciente coleta clínico
6I/III d6I/III 6II d6II 7II cepa
Maio-03 10,9 1,2 7,3 1,1 2,1 Atípico A
00297 Soropositivo sem TO
Mar-o5 11,5 1,4 9,3 1,6 2,8
00129 Maio-03 10.9 1.2 7.3 1.1 2.1 Atípico B
Soropositivo sem TO
Mar-05 11.5 1.4 9.3 1.6 2.8
Out.-02 3.7 1.6 1.7 1.2 1.3
00223 TO Grave Atípico C
Jul.-04 Over 7.1 6.0 4.1 1.0
Jan.-05 6.4 1.5 2.3 1.4 1.1
00241 TO Grave Atípico C
Mar-05 5.6 1.1 2.0 1.4 1.0
Abril-03 1.2 1.0 1.1 1.1 0.9
00134 TO Grave ATÍPICO D
Jun.-05 1.2 1.1 0.9 1.0 1.1
Ago.-02 IgM+ sem TO 1.2 1.1 1.1 1.1 1.0
00015 ATÍPICO D
Out.-02 Soropositivo sem TO 1.3 0.9 1.0 1.0 0.9
Abril-02 1.4 1.0 1.0 1.1 0.8
00003 Soropositivo sem TO ATÍPICO D
Dez-02 1.1 1.1 1.1 1.1 0.9
Maio-01 IgM+ com TO 1.2 1.1 1.0 1.2 1.1
00269 ATÍPICO D
Fev.-03 TO Grave 0.8 1.0 0.9 1.1 0.8
Maio-03 1.3 1.0 1.0 1.4 1.3
00238 TO Grave ATÍPICO D
Jan.-05 1.2 1.1 1.0 1.6 1.2
Out.-02 1.0 1.0 1.0 1.1 1.1
00024 TO Branda ATÍPICO D
Maio-03 1.2 0.9 0.9 1.3 1.1
Mar-03 0,9 1,0 0,9 1,0 1,0
00080 TO Grave ATÍPICO D
Jun.-03 1,0 1,2 1,2 1,2 1,2
Dez.-04 IgM+ com TO 1.1 0.9 0.9 1.0 1.0
00236 ATÍPICO D
Fev.-05 TO Grave 1.0 1.0 1.0 1.2 1.0
Nov.-02 4.9 1.1 1.1 1.1 1.1
00113 Soropositivo sem TO Tipo I/III
Out.-02 2.4 1.0 1.0 1.2 0.9
Jul.-02 3.1 1.0 1.0 1.3 1.0
00275 TO Grave Tipo I/III
Jun.-05 2.6 0.8 0.8 1.1 0.8
Ago.-02 2,3 1,1 1,0 1,1 1,0
00072 Soropositivo sem TO Tipo I/III
Mar-03 2,4 1,1 1,0 1,1 1,0
Mar-05 12,0 1,0 1,4 1,1 1,3
00280 TO Branda Tipo I/III
Maio-05 11,8 1,3 1,1 1,0 1,3
Jul.-03 2.5 1.3 1.2 1.0 0.9
00087 IgM+ sem TO Tipo I/III
Ago.-03 3.2 1.5 1.2 1.1 1.1
Jul.-02 IgM+ com TO 1.3 1.1 2.0 1.3 1.4
00005 Tipo II
Abril-03 TO Grave 1.1 1.1 1.9 1.8 1.0
Dez.-00 1.5 1.0 1.1 1.5 3.3
00268 TO Grave Tipo II
Maio-02 1.3 1.2 1.0 1.3 1.7
Out.-02 1.0 0.9 0.9 0.9 1.5
00052 TO Branda Tipo II
Fev.-03 0.9 1.0 0.9 1.1 1.7
Abreviações: TO: toxoplasmose ocular; GRA: proteína do grânulo denso

81
Resultados

4.2.2. Associação entre os sorotipos e a toxoplasmose ocular.

Diante da observação de que diferentes cepas poderiam ser

responsáveis pela infecção dos indivíduos estudados, nós investigamos se

havia alguma correlação entre a gravidade da toxoplasmose e a cepa

infectante. A Figura 13 mostra a relação entre o número de indivíduos,

classificados de acordo com o sorotipo do T. gondii, ou seja, de acordo com o

padrão de resposta detectado para cada peptídeo cepa-específico, e a

apresentação clínica da toxoplasmose ocular. Nesta análise foram incluídas

235 amostras de pacientes soropositivos, assim distribuídos: IgM+ sem TO -

46 amostras; IgM+ com TO - 17 amostras; soropositivo sem TO - 46

amostras; TO branda - 24 amostras; TO grave - 102 amostras.

Em relação à gravidade da doença ocular, nossos dados mostram que

entre indivíduos com TO grave a grande maioria (61%) não reagiu contra os

peptídeos, sugerindo um padrão de infecção pelo sorotipo Atípico D. Há de

se verificar que, entre os indivíduos com infecção adquirida sem lesão ocular

(IgM+ sem TO) detectamos o sorotipo I/III em 41% das amostras. Quando

comparamos os sorotipos em relação à presença ou ausência de

toxoplasmose ocular, verificamos que 55% dos indivíduos com lesão ocular

estão infectados com o sorotipo Atípico D e 33% dos indivíduos sem lesão,

estão infectados pelos sorotipo I/III (ver Tabela na Figura 13).

Nossa próxima avaliação foi verificar se entre os 57 indivíduos dos

grupos IgM+ com e sem TO que foram clinicamente acompanhados (ANEXO

82
Resultados

III) esta correlação entre a clínica e os sorotipos também prevaleceria. Os

resultados estão representados graficamente na Figura 14, mostram que 10

de 20 (50%) indivíduos que evoluíram para toxoplasmose ocular grave

estavam infectados pelo sorotipo Atípico D. Enquanto, 11 de 24 (46%)

indivíduos que não desenvolveram lesão ocular estavam infectados pelo

sorotipo I/III do T. gondii. Outro dado interessante, entre os indivíduos

infectados pelo Atípico D, 71% desenvolveram lesão grave, 21% lesão

branda e 8% não desenvolveu lesão ocular. Em contrapartida, entre os

indivíduos infectados pelo Tipo I/III, 64% não desenvolveram TO, 23%

desenvolveram lesão branda e, apenas, 13% lesão grave. Não foi encontrada

nenhuma relação entre os demais sorotipos e a doença ocular. Este conjunto

de dados sugere que além da caracterização da cepa, o método da

sorotipagem pode sugerir o prognóstico da infecção.

83
Resultados

A)

Tipo I/III
Tipo II
70
Atípico A
60 Atípico B
Atípico C

Número de Pacientes
50
Atípico D
40

30

20

10

0
Soropositivo IgM+ IgM+ Branda Grave
Ausente Presente
Toxoplasmose ocular

B)
Toxoplasmose ocular
Ausente Presente
Sorotipo (%) (%)
Tipo I/III 31,5 14,0
Tipo II 13,0 15,4
Atípico A 6,5 2,8
Atípico B 16,7 2,1
Atípico C 6,5 11,9
Atípico D 33,7 55,2

Figura 13. Associação entre a cepa infectante e a toxoplasmose. A) Representação


gráfica do número de indivíduos por grupo estudado (soropositivo (n=46), IgM+ sem TO
(n=46), IgM+ com TO (n=17), TO branda (n= 24), TO grave (n= 102) e a classificação do
sorotipo infectante do T. gondii. B) Representação tabular do percentual de pacientes
infectados pelos sorotipos de acordo com a presença ou ausência da lesão ocular. A
descrição dos sorotipos encontra-se na Figura 12.

84
Resultados

60

50
Tipo I/III
40 Tipo II
Atípico A
30 %
Atípico B
20 Atípico C
Atípico D
10

0
Soropositivo Branda Grave

Ausente Presente
Toxoplasmose ocular

Figura 14. Associação entre a evolução clínica das pacientes com


toxoplasmose adquirida e cepa infectante. Representação gráfica do percentual
de indivíduos dos grupos IgM+ com e sem lesão ocular de acordo com a evolução
clínica após 3 anos de infecção e o sorotipo da cepa. Do total de 57 pacientes, 20
são soropositivos sem TO, 13 desenvolveram leão ocular branda e 20
desenvolveram lesão grave. A descrição dos sorotipos encontra-se na Figura 12.

85
Resultados

4.2.3. Atípicos sorotipos do Toxoplasma gondii infectam indivíduos no Sul do


Brasil

No decorrer deste trabalho ocorreram dois surtos de toxoplasmose no

Sul do Brasil, tivemos a oportunidade de fazer o estudo de sorotipagem com

o plasma de 14 indivíduos provenientes dos lugarejos chamados:

Agronômica, em Santa Catarina e Santa Vitória do Palmar, Rio Grande do

Sul. Os resultados destas análises, que estão sumarizados na Tabela IV,

nos mostram que na maioria das amostras dois sorotipos atípicos foram

predominantemente detectados. Em Agronômica em 5 das 7 amostras foi

detectado o padrão - Atípico A - como responsável pela infecção, enquanto

que nas amostras de Santa Vitória do Palmar em 5 dos 7 indivíduos

detectamos o sorotipo Atípico B. Nas duas populações foram detectados

sorotipos II, mas não foi detectado o tipo I/III. Amostras de DNA destes

pacientes foram avaliadas por KHAN e colaboradores (2006), e neste estudo

também foram detectadas cepas atípicas como responsáveis pela infecção

em ambos os lugares. Correlacionamos as amostras analisadas por Khan e

colaboradores (2006), para genotipagem àquelas analisadas em nosso

estudo. Segunda a classificação da Clínica Silveira, as amostras 413 e 418

(Tabela IV), correspondem, respectivamente, aos números 2644 e 2712

analisadas genotipicamente.

O estudo de genotipagem destas amostras, também sugere que há

padrões genéticos atípicos nas amostras do sul do Brasil. Na amostra nº. 413

(Tabela IV), na qual detectamos o Atípico A, foi detectado o genótipo I, II

86
Resultados

ou III, enquanto na amostras nº. 418 (Tabela IV), cujo sorotipo é o Atípico

B, foi detectado o genótipo I ou II (KHAN et al., 2006).

Tabela IV. Avaliação sorotípica das cepas de T. gondii a partir de


indivíduos infectados em surtos na Região Sul do Brasil. Amostras de
soro, provenientes de 7 indivíduos de Agronômica – Santa Catarina e Santa
Vitória do Palmar – Rio Grande do Sul, foram avaliadas pelo método ELISA
para a resposta contra peptídeos cepa-específicos do T. gondii. Os resultados
estão representados em densidade óptica normalizada. Valores superiores a
1,5 são considerados reagentes.
n◦ Peptídeos
Origem Sorotipo
Paciente 6I/III d6I/III 6II d6II 7II SAG1
410 8,7 1,1 1,0 1,3 2,1 Over Atp A
411 1,9 1,1 1,0 1,5 2,0 13,2 Atp A
Agronômica

412 1,4 1,1 18,2 17,4 1,1 Over II


413 1,8 1,2 1,0 1,0 1,7 19,7 Atp A
414 1,9 1,0 1,1 1,0 1,9 20,1 Atp A
415 1,1 1,0 4,8 1,1 1,0 19,7 II
416 3,3 1,0 1,1 1,0 1,9 8,7 Atp A
417 2,0 1,2 1,7 1,6 1,9 13,8 Atp B
Santa Vitória do

418 11,2 4,7 8,0 2,0 3,9 20,6 Atp B


419 1,3 1,2 1,8 3,2 1,1 6,3 II
Palmar

420 3,1 2,5 2,3 1,9 1,7 20,3 Atp B


421 1,1 1,0 3,6 1,3 1,2 9,1 II
422 2,6 1,7 1,8 1,5 2,7 Over Atp B
423 7,0 2,1 3,7 1,7 4,0 Over Atp B
Abreviações: Over: resultado superior ao limite de detecção do método; Atp A:
sorotipo atípico A; II: sorotipo II; Atp B: sorotipo atípico B.

87
Discussão

5. Discussão

A retinocoroidite toxoplásmica é uma doença que pode levar a

seqüelas graves em indivíduos imunodeficientes e imunocompetentes. A

resposta imune é capaz de controlar a proliferação do T. gondii, porém

restam os cistos que são resistentes a estas defesas. A resistência do

hospedeiro à infecção pelo T. gondii é criticamente dependente de IFN-γ,

produzidos por células NK e linfócitos T CD4+ e T CD8+ (YAP e SHER,

1999). Assim sendo, esta parece depender também da resposta humoral.

Anticorpos contra o parasita são prontamente sintetizados em resposta à

infecção, tanto nos seres humanos como nos modelos experimentais

(FRENKEL et al., 1991; ASAI et al., 1992).

A diferenciação entre as fases aguda e crônica da infecção sistêmica

é crucial para o entendimento da dinâmica da doença e para a

identificação de pacientes com risco para o desenvolvimento da

retinocoroidite toxoplásmica. Permitindo, desta maneira, estabelecer

estratégias preventivas e terapêuticas, minimizando os riscos para o

paciente (HOLLAND et al., 1996; MONTOYA e REMINGTON, 1996). Neste

estudo, fizemos uma abrangente caracterização da resposta imune

humoral de indivíduos infectados com diferentes classificações clínicas e

sorológicas. Dois objetivos principais nortearam esta etapa da

investigação: 1) associação entre a produção dos isótipos e a evolução

clínica da toxoplasmose ocular; 2) estabelecer a dinâmica da resposta

88
Discussão

imune humoral na infecção recente e crônica, através da detecção de

anticorpos no plasma de indivíduos com diferentes tempos de infecção.

O principal indicador da fase aguda da toxoplasmose é a

soroconversão, definida a partir de um título negativo de IgM ou IgG para

um título positivo do anticorpo ou pelo aumento de quatro vezes do título

de IgG, num intervalo de pelo menos três semanas (WALLACH, 1996).

Alguns estudos sugerem a determinação consecutiva dos níveis séricos de

IgM, durante algumas semanas, para observar se foi estabelecida à

resposta imune específica neste período. Entretanto, eventuais variações

individuais na resposta imune, podem levar à produção persistente de IgM

e IgA anti-toxoplásmicas por longos períodos, comprometendo o

diagnóstico preciso (STEPICK-BIEK et al., 1990, TURUNEM et al., 1983;

LIESENFELD et al., 1997).

Anticorpos IgG são geralmente detectáveis a partir da segunda

semana (HAYDE et al., 1995), após este período mantêm-se elevados,

com ou sem diminuição de IgM. Em nosso estudo, dos 76 indivíduos com

IgM positiva, apenas 23 apresentaram baixo índice de avidez, sugerindo

que a grande maioria destes pacientes apresenta IgM persistente. Glasner

e colaboradores (1992) observaram na população de Erechim uma

correlação positiva entre presença de IgG anti-T. gondii e a toxoplasmose

ocular. Nestes indivíduos a prevalência da toxoplasmose ocular aumenta

com a idade e a principal forma de infecção é pela via adquirida e não pela

forma congênita (SILVEIRA et al., 1988).

89
Discussão

Na toxoplasmose adquirida a combinação da análise dos três

isótipos (IgG, IgM e IgA) e a cinética destes (TURUNEN et al., 1983)

podem, em alguns casos, diferenciar entre uma infecção recente ou

antiga. Curiosamente, em casos de toxoplasmose ocular por infecção

congênita, são detectados baixos títulos de IgG, principalmente na

retinocoroidite ativa, devido à reativação da infecção congênita pelo T.

gondii, enquanto a IgM é usualmente não detectado (MONTOYA et al.,

2002).

Visando entender, de que maneira a resposta imune dos pacientes

poderia estar implicada com a proteção ou desenvolvimento da lesão

ocular, pesquisamos a resposta imune humoral em amostras de plasma

de 327 indivíduos, classificados em: infecção adquirida recente, com e

sem lesão ocular e infecção crônica com lesão grave, branda e sem lesão.

Para isto, desenvolvemos em nosso laboratório ensaios de ELISA para

detecção de subtipos de IgG (IgG, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4), IgA e IgE

específicos contra antígenos do T. gondii. Além da pesquisa de IgM e

avidez de IgG com kits comerciais.

As análises pelo método ELISA para os diferentes isótipos foram

padronizados utilizando-se como antígeno as proteínas solúveis do extrato

protéico da forma taquizoíta (STAg). Embora alguns trabalhos da

literatura discutam a necessidade de utilizar diferentes componentes

antigênicos do parasita para a pesquisa dos isótipos, nós optamos pelo

uso do supracitado por ser a forma antigênica mais utilizada nas

pesquisas laboratoriais clínicas. O STAg contém várias proteínas, sendo

90
Discussão

que a principal delas é uma proteína de peso molecular entre 25 a 32 Kda

(p30) ou SAG1 (do inglês, surface antigen -1). O SAG1 é uma das cinco

proteínas de superfície de membrana ancoradas na camada lipídica -

glicofosfatidilinositol (GPI) descrita com um dos principais alvos para a

produção de anticorpos, durante as fases aguda e crônica da infecção em

seres humanos e, por isso, é a proteína mais utilizada em pesquisas

sorológicas (MINEO, CAMARGO e FERREIRA, 1980; HANDMAN e REMINGTON,

1980). Em modelos experimentais, a imunização com a p30 ou a

transferência de células que reconhecem esta proteína confere imunidade

em infecções posteriores com o parasita intacto (PAVIA et al., 1992; KASPER

et al., 1993; KHAN et al., 1994). Anticorpos anti-p30 inibem a infecção de

células do hospedeiro in vivo (SANTORO et al. 1985).

Durante o processo de padronização dos ELISAs dos isótipos,

tivemos dificuldades para estabelecer os valores de corte para cada teste,

uma vez que a definição destes valores recai no estabelecimento de

sensibilidade e especificidade da metodologia testada. O nosso maior

desafio foi estabelecer os verdadeiros positivos, uma vez que a produção

dos isótipos varia individualmente e de acordo com os estágios da

infecção.

Para superar esta dificuldade, analisamos amostras de 35

voluntários soronegativos provenientes de Erechim. Estas amostras foram

analisadas em triplicata por ELISA, indireto e de captura, para cada

isótipo, para assim definirmos a média, desvio padrão, valor mínimo e

máximo. Com base nestas definições, decidimos que o valor de corte,

91
Discussão

para cada isótipo, seria a média mais duas vezes o desvio padrão das

densidades óticas obtidas (Anexo C). Uma vez definidos os valores de

corte, verificamos através da aplicação de análises estatísticas e da curva

ROC, qual seria a sensibilidade e especificidade do nosso método para

cada isótipo (Anexo E). A sensibilidade e a especificidade são critérios de

validade resultantes da comparação do teste com a verdade. Portanto,

para se expressar objetivamente os dois critérios, com relação a um teste,

é preciso comparar seus resultados com aqueles obtidos por um exame de

referência. Em nosso caso, por não haver um teste de referência para fins

comparativos, principalmente no caso das subclasses de IgG, a nossa

definição foi baseada nos controles negativos, priorizando-se a

especificidade em relação à sensibilidade.

Em concordância com os dados da literatura, os resultados

apresentados neste estudo mostram que o anticorpo IgG1 foi a subclasse

de IgG predominante em todos os grupos analisados. Dentre as

subclasses, IgG1 é a subclasse mais abundante no soro humano normal e

já foi demonstrado que na toxoplasmose a produção deste anticorpo

também se mantém elevada (HUSKINSON et al., 1989; PORTELA et al.,

2004). Entre os indivíduos IgM positivo, nós observamos uma correlação

negativa entre IgG1 e IgM. Além disso, há produção significativamente

maior deste anticorpo nos pacientes com alta avidez de IgG (Figura 8).

Sugerindo que a produção deste isótipo aumenta com a evolução da

infecção.

92
Discussão

Em relação aos outros isótipos, foi detectada correlação positiva

entre IgG3 e IgM (Figura 9), houve produção significativamente maior de

IgG2 e IgG3 entre os indivíduos com IgM positiva em relação aos

indivíduos IgM negativa, sugerindo que os isótipos IgG2 e IgG3 são mais

precocemente produzidos do que IgG1. Em infecções congênitas, os

recém-nascidos produzem primeiramente IgG2 e IgG3 contra antígenos

recombinantes do T. gondii, enquanto o IgG1 é predominante entre

isótipos transferidos maternalmente (BUFFOLANO et al., 2005).

Alguns resultados importantes devem ser ressaltados em relação ao

grupo IgM+ sem TO. Primeiro, quando comparamos a produção de IgG3

em relação à presença da TO, verificamos que nos indivíduos sem lesão

ocular a produção deste anticorpo foi significativamente maior. Segundo,

neste mesmo grupo a produção de IgG3 foi estatisticamente maior em

relação à produção deste isótipo nos grupos lesão grave, branda (p<

0,001) e soropositivo. Terceiro, a produção de IgG2 também foi

significativamente maior nos grupos IgM+ sem TO em relação aos grupos

de infecção crônica com lesão e sem lesão (p< 0,001). Quarto, quando

avaliamos individualmente os pacientes em que foram coletadas mais de

uma amostra, observamos que na maioria dos pacientes foi detectado

IgG3 e/ou IgG2 e, raramente, IgG1 na primeira coleta, porém na segunda

amostra, IgG3 diminui ou desaparece, IgG2 permanece e IgG1 é

predominante (dado apresentado no ANEXO B). Apesar do número de

pacientes ser pequeno para este tipo de análise, esta observação nos

sugere a dinâmica da produção dos isótipos na infecção. Ainda que

93
Discussão

investigações mais aprofundadas sejam necessárias, estes dados sugerem

a importância destes isótipos nas infecções recentes.

É importante relembrar que o nosso critério para estabelecer

infecção foi a presença de IgM e baixa avidez. Embora tenha sido

detectada a presença de anticorpos IgM em todos os pacientes dos grupos

IgM+, vale ressaltar que nem todos os indivíduos têm infecção recente.

Em infecções pelo T. gondii a presença deste isótipo pode persistir por

longos períodos e, portanto, o uso exclusivo deste parâmetro não seria

um marcador para infecção aguda (HALL et al., 1983).

Observamos que nos indivíduos com infecção crônica sem lesão

ocular houve produção de IgG1 (92%) e, curiosamente, a produção de

IgG4 foi significativamente maior em relação aos grupos lesão grave e

branda (p< 0,01). A produção do isótipo IgG4 na resposta imune humoral

em humanos está associada à exposição repetida ao antígeno ou infecções

crônicas (AALBERSE et al., 1983; HUSKINSON et al., 1989). A presença deste

anticorpo foi detectada em pacientes com outras infecções crônicas, como

esquistossomose (ISKANDER et al., 1981) e filariose (OTTESEN et al., 1985) e

em diversos casos de doenças alérgicas (BRUYNZEEL e BERRENS, 1979;

GWYNN et al., 1982). No entanto, em nosso estudo este anticorpo não foi

detectado no soro da maioria dos pacientes.

Biologicamente, os anticorpos IgG1 e IgG3 se distinguem de IgG2 e

IgG4 pela alta eficiência na fixação do complemento e na capacidade de

interação com receptores Fc de macrófagos, sendo, portanto, efetivas

opsoninas. O anticorpo IgG3, em relação as demais subclasses, apresenta

94
Discussão

alta taxa catabólica fracionada e baixa meia-vida (GIAMMANCO et al.,

2003). A produção do IFN-γ por células Th1 é responsável pela troca de

classes e produção de IgG1 e IgG3 em humanos em pacientes

lepromatosos (HUSSIAN et al., 1999). IgG1 e IgG3 são as mais freqüentes

subclasses detectadas no soro humano em resposta a antígenos protéicos.

A deficiência de IgG3 está associada à história de infecções recorrentes,

levando à doença pulmonar crônica, além disso, a diminuição dos níveis

de IgG3 freqüentemente está associada à deficiência de IgG1 (HERROD et

al., 1993).

Estudos prévios com a população de Erechim, sugerem que a

resistência à infecção está relacionada à habilidade de secreção de IL-12 e

IFN-γ, como observado nos indivíduos soropositivos sem lesões oculares.

Em contrapartida, nos indivíduos com toxoplasmose ocular adquirida há

maior secreção de IL-1, TNF-α e IL-10 em resposta a antígenos de

T.gondii quando comparados com indivíduos soropositivos sem lesão

ocular. Estas informações nos sugerem, que a susceptibilidade ao

desenvolvimento de lesões oculares está associada a mecanismos que

culminam com a produção destas citocinas, as quais podem contribuir

para o dano da retina e/ou da coróide. Mostrando assim, a participação de

diferentes mecanismos no desenvolvimento das lesões oculares nos

pacientes com lesão adquirida e congênita (YAMAMOTO et al., 2000).

Em nosso estudo, o padrão IgG1 e IgG3 foi predominante nos

indivíduos IgM+ sem lesão e com lesão, por isso não é possível associar

este padrão, supostamente Th1, como protetor à lesão ocular. A presença

95
Discussão

destes isótipos na infecção recente, pode estar associada à atividade anti-

parasitária via receptor Fc nos macrófagos, como uma tentativa do

organismo para o controle da parasitemia. Estes isótipos podem também

servir como marcadores auxiliares do diagnóstico da toxoplasmose

adquirida e congênita.

Entre os pacientes com lesão grave e branda não houve diferença

significativa na produção dos isótipos. Nestes grupos o IgG1 foi a

subclasse predominante, com menor produção dos demais isótipos.

GÓMEZ-MARÍN e colaboradores (2000) reportam que em casos de re-

infecção pode haver produção dos isótipos IgM ou IgA anti- T. gondii

separadamente ou em associação com o anticorpo IgE. IgA específica tem

sido detectado também em casos de infecção recidiva ou em re-infecção,

podendo ser encontrado em pacientes com infecção crônica (FORTIER et

al., 1997).

Em estudos anteriores mostrou-se uma relação funcional entre IgE e

IgG4 em infecções em humanos (HUSSAIN e OTTESEN, 1986). Foi

demonstrado em modelos animais que IgE anti- T. gondii poderia

desempenhar função protetora na infecção pelo toxoplasma (RIDEL et al.,

1988). Em nosso estudo foi detectada a presença de IgE em apenas oito

pacientes, sendo que dois destes produziram IgG4. Em termos de

evolução clínica, um paciente desenvolveu lesão grave, dois apresentaram

lesão branda e cinco não desenvolveram lesão ocular, em até três anos

após o primeiro exame. Não foi possível correlacionar a produção de IgE

com a proteção à lesão, pois o número de pacientes é muito pequeno. Por

96
Discussão

outro lado, nossos dados mostram a presença deste anticorpo apenas em

pacientes com infecção recente, pois não foi detectado IgE em nenhum

paciente com infecção crônica.

Anticorpos IgE são detectáveis por ELISA no soro de adultos

infectados, crianças com infecção congênita e crianças com

retinocoroidite. A duração de soropositividade para IgE é menor do que

IgM e IgA e, conseqüentemente, parece ser um método para identificar

infecções recentes (PINON et al., 1990). Interessante, é que embora

tenhamos detectado a presença deste anticorpo, exclusivamente, em

pacientes com infecção recente (IgA positiva e baixa avidez), observamos

uma limitação técnica para a detecção deste anticorpo através da técnica

ELISA, visto que em amostras confirmadamente positivas os resultados

não foram reprodutivos em experimentos diferentes, provavelmente

houve desnaturação protéica no processo de conservação das amostras.

Diante disso, é importante ter certeza que a ausência deste isótipo seja

realmente representativa de infecção tardia e não por limitação

experimental (metodológica).

Avaliamos 67 pacientes com evidências sorológicas de toxoplasmose

adquirida, dentre os quais 17 apresentavam lesão ocular no primeiro

exame clínico (Tabela II). Entre os indivíduos com lesão ocular, 53%

apresentaram lesão ocular branda e 47% evoluíram para a forma grave.

Dentre os indivíduos que, inicialmente, não apresentavam lesão ocular,

cerca de 80% destes não desenvolveram toxoplasmose ocular, em até

três anos após o primeiro exame; 17% evoluíram para lesão branda e 8%

97
Discussão

para lesão grave. Este grupo é raro entre as populações com

toxoplasmose ocular já estudadas, por tratar-se de um grupo com

confirmação sorológica e clínica para a toxoplasmose adquirida. Em

Erechim a via adquirida se sobrepõe em importância clínica à via

congênita (SILVEIRA et al., 1988). A doença ocular aparece normalmente

entre a segunda e quarta década de vida do paciente, isso se aplica tanto

para a doença primária quanto a recorrente. A toxoplasmose se manifesta

geralmente na fase aguda da infecção (IgM positivo), mas há relatos da

ocorrência na fase crônica, em casos de infecção congênita e adquirida

(HOLLAND et al., 1996; MONTOYA et al., 1996; BURNETT et al., 1998).

Avaliamos a presença dos isótipos em relação à faixa etária e o

sexo. Em relação a produção de IgA anti- T. gondii, entre os indivíduos

que não têm toxoplasmose ocular, a maior produção de IgA está entre os

pacientes na faixa de 10 a 20 anos de idade. Por outro lado, dentre os

pacientes com toxoplasmose ocular, a detecção de IgA foi maior na faixa

etária entre 41 e 50 anos.

Em um estudo numa população do Estado de Minas Gerais, na

cidade de Melquíades, PORTELA e colaboradores (2004) também não

encontraram correlação entre a presença de isótipos anti-T. gondii e a

ocorrência de lesão ocular. Neste estudo, foi utilizado como antígeno o

glicosilsinositol fosfolipídeo do taquizoíta (GIPL) que é uma forma

antigênica diferente da utilizado em nossos experimentos. No trabalho

deste grupo foi demonstrado que há correlação positiva entre a produção

de IgA anti-GIPL e o tamanho da lesão ocular. Em nosso estudo

98
Discussão

obtivemos resultados diferentes: do total de indivíduos produtores de IgA

85% não desenvolveram lesão ocular, 29% apresentaram lesão branda e

15% evoluiu para a lesão grave. Estas diferenças podem ser devido a

diferença populacional, uma vez que estamos estudando uma região

endêmica, cuja população pode estar sendo cronicamente re-infectada,

pode ser que a produção deste isótipo esteja associada à resposta

sistêmica na infecção e não ao dano ocular. Além disso, utilizamos

diferentes formas antigênicas nos testes sorológicos e, ainda, pode ser

que a população clonal do parasita seja diferente entre duas regiões do

país.

Em um estudo recente sobre os fatores de risco associados à

infecção pelo T. gondii em Erechim, JONES e colaboradores (2006)

mostraram que o trabalho com o solo, seja no campo ou em jardinagem

domiciliar, representa um importante fator de risco. Esta forma de

infecção é muito importante nos indivíduos do sexo masculino. Neste

mesmo estudo foi demonstrado que tanto crianças menores de 18 anos,

quanto adultos do sexo masculino são mais vulneráveis à infecção (JONES

et al., 2006).

Embora a abordagem epidemiológica não seja o principal objeto do

nosso estudo, tivemos a oportunidade de avaliar uma coorte de 272

indivíduos soropositivos para T. gondii, divididos em: 135 mulheres e 137

homens. Verificamos a freqüência da lesão ocular em relação ao sexo,

idade e produção de IgA específica. Esta análise nos mostrou que 58%

dos pacientes com lesão ocular são do sexo masculino e 62% dos

99
Discussão

indivíduos sem lesão são do sexo feminino. Também observamos que a

freqüência de indivíduos do sexo masculino soropositivo é maior entre

crianças e adolescentes. Enquanto para as mulheres, está freqüência é

maior acima dos 30 anos de idade. Apesar de não ter sido detectada

diferença nas subclasses de IgG, verificamos que indivíduos do sexo

masculino produzem mais IgA e IgE do que o sexo feminino (Figura 4).

Entre os indivíduos com infecção recente (baixo índice de avidez), 78%

eram do sexo masculino (dado não apresentado).

Embora em um estudo anterior tenha sido demonstrado que não há

diferença na susceptibilidade à TO entre os sexos e que a prevalência da

toxoplasmose ocular aumenta com a idade em Erechim (Silveira et al.,

1988), Nossos dados corroboram com Jones e colaboradores (2006),

sugerindo que indivíduos do sexo masculino para contraem a infecção

mais precocemente e, consequentemente, desenvolvem a TO. Todavia,

não observamos diferenças na resposta imune humoral em relação ao

sexo. Outro importante estudo com indivíduos de Erechim mostrou que

indivíduos com toxoplasmose adquirida desenvolvem lesões oculares

tardiamente, em alguns casos anos após a primo-infecção (SILVEIRA et

al., 2001).

A literatura tradicionalmente descreveu que a toxoplasmose ocular

raramente ocorre em casos de doença adquirida, baseado no fato de que

o desenvolvimento da lesão ocular só seria possível simultaneamente ou

logo após o aparecimento da doença sistêmica pós-infecção pelo T. gondii

(NUSSENBLATT e BELFORT Jr., 1994; HOLLAND et al. 1996; HOLLAND et

100
Discussão

al., 1999). Estes dados mostram que a população de Erechim apresenta

peculiaridades em relação à toxoplasmose, que podem ser relacionados

com características epidemiológicas, ambientais, individuais e, sobretudo,

com a genética do parasita.

Embora seja controversa a participação dos anticorpos na

resistência à infecção pelo Toxoplasma, modelos experimentais em

camundongos, ratos e cobaias têm produzido diferentes resultados a

respeito do potencial protetor dos anticorpos anti-T. gondii que pode

variar devido ao basal genético dos hospedeiros e/ou do parasita. A

proteção à infecção foi demonstrada pela transferência passiva do soro

imune ou de anticorpos monoclonais específicos a proteínas do T.gondii

para camundongos infectados com cepas de virulência moderada (MASIHI

e WERNER, 1978; JOHNSON, MCDONALD e NEOH, 1983; SHARMA et al., 1984).

Além disso, a supressão da produção de anticorpos, através do

tratamento com anticorpos anti-μ, resultou na exacerbação da infecção e

a transferência passiva de soro de camundongos cronicamente infectados

para camundongos deficientes de células B recuperou metade dos animais

infectados (FRENKEL e TAYLOR, 1982).

O melhor entendimento da correlação entre a produção de

determinado isótipo e a manifestação clínica, pode servir como

diagnóstico, e também como prognóstico da Toxoplasmose ocular. Este

estudo também pode contribuir para o entendimento da resposta imune

humoral na infecção em seres humanos envolvidas na infecção dos

indivíduos com toxoplasmose ocular. Diante da dificuldade em definir uma

101
Discussão

infecção adquirida recente, a pesquisa de subclasses de IgG nesta

população sugere a dinâmica da resposta imune humoral em indivíduos

com infecção adquirida recente e crônica. Portanto, a pesquisa destes

isótipos pode ser mais um parâmetro sorológico para a caracterização de

infecção recente em indivíduos imunocompetentes.

O desencadeamento da doença ocular com maior ou menor

gravidade, parece depender de três aspectos fundamentais diretamente

ligados à infecção, que são: as características do hospedeiro, com especial

importância para a resposta imune; do meio-ambiente, que pode

contribuir para a disseminação do parasita; e por fim, a virulência da cepa

infectante, que parece estar relacionada à patogenicidade. O nosso

próximo objetivo, foi estabelecer a relação entre a cepa infectante e as

manifestações clínicas da toxoplasmose ocular. Para isso utilizamos teste

sorológico para definir o sorotipo da cepa do T. gondii, baseada no fato de

que a resposta imune ao parasita é cepa-específica (PARMLEY et al., 1994).

Avaliamos pelo método ELISA a presença de anticorpos em

amostras de soro de 249 indivíduos soropositivos, provenientes de

Erechim, contra peptídeos polimórficos recombinantes de regiões

altamente imunogênicas do parasita (proteínas GRA6 e GRA7), os quais

são capazes de diferenciar entre a linhagem II das linhagens I e III (KONG

et al., 2003).

A tipagem sorológica de cepas é possível devido a pequena variação

entre as três linhagens clonais do T. gondii. Estudos desta natureza

permitem uma avaliação retrospectiva sobre a dinâmica da infecção em

102
Discussão

populações de áreas endêmicas e em casos específicos de surtos, pois a

técnica é capaz de detectar a resposta contra os peptídeos recombinantes

tanto em pacientes agudos, quanto em pacientes crônicos (Kong et al.,

2003).

Neste estudo caracterizamos sorotipos do T. gondii que infectam

pacientes de Erechim e associamos à forma clínica da doença. Nossos

dados claramente mostram que há uma diversidade das cepas infectantes

nesta população. Diante do fato de que foi detectado um número

significativo de pacientes infectados com os sorotipos I/III ou II.

Naturalmente, isto sugere que a resposta imune destes indivíduos não é

diferente dos norte-americanos e europeus, nos quais o tipo II está

associado com a maioria dos casos de toxoplasmose ocular (HOWE e

SIBLEY, 1995; HOWE et al., 1997; HONORÉ et al., 2000; FUENTES et al., 2001).

Ademais, caracterização genotípica em amostras de pacientes de Erechim

sugeriu a presença de cepas do Tipo I (VALLOCHI et al., 2005a).

Em contrapartida, nós também observamos sorotipos atípicos, os

quais não haviam sido detectados em estudos semelhantes com amostras

da Polônia - Europa (NOWAKOWSKA et al., 2006) e Colômbia - América do

Sul (PEYRON et al., 2006). Detectamos anticorpos contra peptídeos

específicos tanto para tipo I/III quanto para o tipo II, sugerindo a

presença de cepas divergentes (isto é, apresentam alelos polimórficos em

outras regiões que não os presentes nos peptídeos recombinantes do

GRA6 e GRA7) ou cepas mistas. Coincidentemente, recente estudo de

genotipagem de amostras de suínos coletadas em pocilgas e abatedouros

103
Discussão

de Erechim detectou genótipos mistos ou divergentes – tipo I/III ou tipo

I/II/III – nas amostras analisadas (BELFORT-NETO et al., 2007).

Um dos resultados mais surpreendentes deste trabalho, é

exatamente mostrar que há um grande número de pacientes infectados,

mas que não respondem contra qualquer um dos peptídeos cepa-

específicos (Atípico D) e que a maioria deles apresenta a forma grave da

doença ocular. Este é primeiro estudo de clara associação entre os

sorotipos do parasita e a manifestação clínica da toxoplasmose ocular.

A presença de variações sorotípicas do T. gondii na população de

Erechim e esta associação de uma destas cepas com a TO grave, nós

sugere que estas cepas geneticamente divergentes dos padrões

previamente descritos tenham maior tropismo para a retina e, por isso, a

elevada incidência da TO. Diante da elevada endemicidade para esta

infecção em Erechim, é possível que a variabilidade genética seja

conseqüente de recombinações sexuais no ciclo de vida do parasita, como

já foi sugerido para outras partes do Brasil (FERREIRA et al., 2006).

Um paciente (#20) incluído neste estudo, apresentou sorologia

positiva (IgM-/IgG+) para T.gondii ao primeiro exame, mas não

apresentou toxoplasmose ocular. Depois de dois anos, o referido paciente

retornou a Clínica Silveira com quadro de toxoplasmose sistêmica e, neste

momento, foi detectada a presença de anticorpo IgM, sugerindo a

reativação da doença. Infelizmente não tivemos acesso ao soro deste

paciente na primeira amostra, mas na segunda amostra detectamos um

sorotipo sugestivo de uma cepa mista (Atípico C). O que sugere que esta

104
Discussão

paciente tenha sido infectada por diferentes cepas, fato que pode ser

justificado pela alta taxa de carnes de suínos infectadas com cepas

atípicas em Erechim (BELFORT-NETO et al., 2007).

Avaliamos a relação entre a produção das subclasses de IgG e o

sorotipo do T.gondii com o objetivo de verificarmos se diferentes cepas

seriam capazes de estimular diferenças na resposta imune humoral.

Observamos diferenças na produção de isótipos para cada sorotipo, sendo

que a produção de IgG3 foi significativamente maior nos sorotipos I/III e

Atípico A. Apenas IgG1 foi detectada nas amostras dos indivíduos

infectados com o sorotipo Atípico D. O dado não foi apresentado, pois a

pesquisa de subclasses foi feita com o STAg e não com peptídeos cepa-

específicos, mesmo assim, os dados são sugestivos de que diferenças na

resposta imune podem ser observadas na infecção por diferentes cepas e,

este poderia ser um dos mecanismos envolvidos no desenvolvimento ou

proteção à doença.

A validação dos nossos dados foi feita com a análise de amostras

dos mesmos indivíduos em diferentes coletas. Conforme apresentamos na

Tabela 6, avaliamos a presença de anticorpos cepa-específicos no soro de

alguns pacientes com intervalos de meses ou anos e o sorotipo detectado

permanece o mesmo. Estes dados foram fundamentais para sabermos se

a ausência de reatividade frente aos peptídeos do GRA6 e GRA7 seria

devida má qualidade da amostra, dos peptídeos ou por falta de

especificidade dos peptídeos. A detecção do mesmo padrão de resposta

em ambas as amostras do mesmo paciente, sugere que não há

105
Discussão

reconhecimento antígeno-específico pelos anticorpos do paciente frente

aos peptídeos. Paralelamente, as amostras com diversos padrões de

resposta, incluindo as supostamente não respondedoras e aquelas com

forte reatividade, foram testadas pela mesma metodologia em diluições

seriadas (1:40 até 1:640) e os resultados foram reproduzidos (dado não

mostrado). Desta maneira, descartamos a possibilidade de resultados

falso-positivos ou negativos.

Duas amostras avaliadas neste estudo para sorotipagem foram

também avaliadas em outro estudo para genotipagem (KHAN et al., 2006).

Em nossos resultados, a sorotipagem sugere a presença da infecção com

cepas atípicas. KHAN e colaboradores (2006) também detectaram cepas

atípicas como responsáveis pela infecção em ambos os lugares.

Correlacionamos as amostras analisadas na genotipagem e àquelas

analisadas em nosso estudo. Segunda a classificação da Clínica Silveira,

as amostras 413 e 418, correspondem respectivamente aos números

2644 e 2712 analisadas genotipicamente. Amostra em que detectamos o

sorotipo Atípico A, foi detectado um genótipo misto tipo I, II e III,

enquanto na amostra que detectamos o Atípico B, foi detectado um

genótipo misto, porém diferente do anterior, definido como tipo I e II.

Tanto em nossos resultados quanto naqueles apresentados por

KHAN e colaboradores (2006), fica claro que há uma diversidade genética

na cepa que infecta indivíduos de Erechim e em outras partes do Brasil.

De fato, tanto a sorotipagem quanto à genotipagem das cepas são

106
Discussão

técnicas que devem ser utilizadas para complementação de resultados. A

primeira, pela facilidade de acesso ao material biológico e sensibilidade e,

a segunda, pela possibilidade de caracterização mais completa do

genótipo da cepa, aliando-se, inclusive, o seqüenciamento para

determinação de regiões polimórficas, possivelmente relacionadas à

virulência.

Em modelos murinos as cepas tipo I estão associadas às formas

graves de doença (SIBLEY e BOOTHROYD, 1992). A virulência é, em parte,

resultado da diferenciada capacidade de migração do parasita, através das

barreiras fisiológicas no hospedeiro, fato que possibilita a rápida

disseminação e aumento da carga parasitária na infecção (BARRAGAN e

SIBLEY, 2002), quando, finalmente, libera a cascata de mediadores pro -

inflamatórios que induzem a patologia (GRAVRILESCU e DENKERS, 2001).

Em isolados de pacientes de Erechim, foi detectada a presença da cepa

Tipo I (VALLOCHI et al., 2005), porém neste estudo não foi feita a

associação com a gravidade da doença.

Outra parte dos nossos pacientes apresentou a forma grave da

toxoplasmose, mas não desenvolveram lesão ocular em até três anos

após a primeira infecção. Estes pacientes apresentaram quadros com

febre alta e persistente, linfadenopatia, dor de cabeça. Curiosamente,

quase 40% destes pacientes estavam infectados pela cepa tipo II. Nossos

dados são bastante sugestivos de que, em contraste com o que ocorre na

Europa e Estados Unidos (HOWE et al., 1997; FUENTES et al., 2001; HONORÉ

107
Discussão

et al., 2000), a cepa tipo II não é a linhagem responsável pela

toxoplasmose ocular em Erechim.

Entre os pacientes do grupo IgM+ que foram seguidos clinicamente,

não foi encontrada associação entre a produção dos isótipos e a evolução

da toxoplasmose, contudo nós observamos que 60% dos indivíduos que

evoluíram para a forma grave da doença ocular estavam infectados pelo

sorotipo D. Curiosamente, o sorotipo I/III foi detectado em 45% dos

pacientes que não desenvolveram doença ocular e não foi detectado nos

pacientes com TO grave. Em conjunto com as nossas observações

anteriores, estes dados sugerem que há correlação entre os sorotipos e

desenvolvimento da doença ocular. Sugerindo que o sorotipo I/III parece

estar relacionado com menor possibilidade para o desenvolvimento da

lesão, enquanto o Atípico D, fortemente associado à forma grave da

doença ocular.

O estudo da imunidade humoral em pacientes com TO nos mostra

que não há um padrão de isótipos associado ao desenvolvimento da

toxoplasmose ocular, porém sugere que a presença de IgG2 e IgG3, além

de IgA e IgE, podem estar associadas com infecção adquirida recente.

Nossos dados também mostram que há uma grande diversidade de cepas,

com diferentes formas de virulência, parasitando a população de Erechim

e outras partes do Brasil. A utilização dos peptídeos cepa-específicos nas

investigações sorológicas, além de sugerir aspectos da cepa do parasita,

parece ser útil como um marcador para estabelecermos o prognóstico

108
Discussão

para a evolução da TO, servindo como referência para nortear o clínico

nas condutas terapêuticas em benefício do paciente.

Nossos dados são importantes também por re-inserirem as

características da resposta imune nos fatores responsáveis pela

susceptibilidade ao aparecimento de TO. Desde que nós demonstramos

que as cepas responsáveis por grande parte das infecções oculares no

Brasil apresentavam um padrão genético diferente daquele descrito no

Hemisfério Norte, a discussão sobre o aparecimento de TO ficou centrada

exclusivamente em aspectos do parasita. Os dados aqui apresentados,

mostram que a resposta imune contra estes parasitas “atípicos”

geneticamente é centrada em epitopos diferentes daqueles que

observamos em resposta aos parasitas que se encontram dentro dos

padrões quase clonais das 3 famílias descritas na literatura. Sendo assim,

passa a ser pertinente a discussão se, alem da diferença genética entre as

cepas ser responsável por maior óculo-tropismo das mesmas, ela também

parece resultar em uma resposta imune para diferentes alvos, podendo

desta maneira contribuir para a maior freqüência de lesões oculares, seja

por resultar em uma resposta não protetora, seja por selecionar cepas

que escapem para o ambiente altamente imuno-privilegiado do olho.

109
Conclusão

6. Conclusão

Nossos resultados sugerem:

„ IgG1 é a subclasse envolvida na resposta imune ao T. gondii


em indivíduos com infecção aguda e crônica;

„ IgG1 e IgG3 parecem estar associados à infecção adquirida


recente;

„ IgA e IgE estão presentes na infecção aguda;

„ Diferentes cepas do T. gondii são responsáveis pela


toxoplasmose na população de Erechim;

„ A gravidade da toxoplasmose ocular em Erechim parece ser


dependente da cepa infectante, sendo o sorotipo I/III, relacionado à lesão
ocular branda, um novo sorotipo - Atípico D, associado com a forma
grave da toxoplasmose ocular;

„ Investigações sorológicos com peptídeos cepa-específicos


(GRA-6 e GRA-7) do T. gondii podem ser utilizadas tanto para a
caracterização das cepas do parasita, quanto para o estabelecimento do
prognóstico da toxoplasmose ocular.

110
Referências Bibliográficas

AALBERSE, RC; VAN DER GAAG, R; VAN LEEUWEN J. Serologic aspects of IgG4 - restricted
response. J. Immunol. v. 130, p. 722-726, 1983.

ABBAS, AK; LICHTMAN, AH; POBER, JS. Imunologia Celular e Molecular, 4ªed., Rio de Janeiro,
Ed. Revinter, p. 41-60/309-333, 2003.

AIKAWA, M; KOMATA, Y; ASAI, T; MIDORIKAWA, O. Transmission and scanning electron


microscopy of host cell entry by Toxoplasma gondii. Am J Pathol. v. 87, p. 285-296, 1977.

Ajioka, JW; Boothroyd, JC; Brunk, BP; Hehl, A; Hillier, L; Manger, ID; Marra, M; Overton, GC;
Roos, DS; Wan, KL; Waterston, R; Sibley, LD. Gene discovery by EST sequencing in
Toxoplasma gondii reveals sequences restricted to the Apicomplexa. Genome Res. v. 8, p.
18-28, 1998.

AJZENBERG, D; BANULS, AL; TIBAYRENC, M; DARDE, ML; Microsatellite analysis of Toxoplasma


gondii shows considerable polymorphism structured into two main clonal groups. Int J
Parasitol. v.32, p. 27 38, 2002A.

AJZENBERG, D; COGNÉ N; PARIS L; BESSIERES MH; THULLIEZ P; FILLISETTI D; PELLOUX H;


MARTY P; DARDÉ ML; Genotype of 86 Toxoplasma gondii isolates associated with human
congenital toxoplasmosis and correlation with clinical findings. J. Infect. Dis. v.186, p. 684-
689, 2002B.

AJZENBERG, D; BANULS, AL; SU, C; DUMETRE, A; DEMAR, M; CARME, B; DARDÉ, ML. Genetic
diversity, clonality and sexuality in Toxoplasma gondii. Int J Parasitol. v.34, p. 1185-1196.
2004.

ALIBERTI J, REIS E SOUSA C, SCHITO M, HIENY S, WELLS T, HUFFNAGLE GB, SHER A. CCR5
provides a signal for microbial induced production of IL-12 by CD8 alpha+ dendritic cells. Nat
Immunol. v. 1, p 83-77, 2000.

ANDERSEN, LP; GAARSLEV, K. IgG subclass antibodies against Helicobacter pylori heat-stabile
antigens in normal persons and dyspeptic patients. APMIS. v. 100, p. 747–751, 1992.

ASAI, T; MIZUNO, F; KOJIMA, S; TAKEUCHI, T; KOBAYASHI, A; SUZUKI, EY. High correlation in


antibody titers between the Sabin-Feldman dye test and an enzyme-linked immunosorbent
assay detecting immunoglobulin G antibodies to the nucleoside triphosphate hydrolase of
Toxoplasma gondii. J Clin Microbiol. v. 30, p. 1291-1293, 1992.

ASHBEE, HR; MUIR, SR; CUNLIFFE, WJ; INGHAM, E. IgG suclasses specific to Staphylococcus
epidermidis and Propionibacterium acnes in patients with acne vulgaris. Br J Dermatol. v.
136, p. 730–733, 1997.

ASHBURN, D; DAVIDSON, MM; JOSS, AW; PENNINGTON, TH; HO-YEN, DO. Improved diagnosis of
reactivated toxoplasmosis. Mol Pathol. v. 51, p. 105-109, 1998.

BAHIA-OLIVEIRA, LM; JONES, JL; AZEVEDO-SILVA, J; ALVES, CC; OREFICE, F; ADDISS, DG.
Highly endemic, waterborne toxoplasmosis in north Rio de Janeiro state, Brazil. Emerg Infect
Dis. v. 9, p. 55-62, 2003.

BARRAGAN, A; SIBLEY, LD. Transepithelial migration of Toxoplasma gondii is linked to parasite


motility and virulence. J Exp Med. v. 195, p. 1625-1633, 2002.

111
Referências Bibliográficas

BELFORT-NETO, R; NUSSENBLATT, V; RIZZO, L; MUCCIOLI, C; SILVEIRA, C; NUSSENBLATT, R;


KHAN, A; SIBLEY, LD; BELFORT, R JR. High prevalence of unusual genotypes of Toxoplasma
gondii infection in pork meat samples from Erechim, Southern Brazil. An Acad Bras Cienc. v.
79, p. 111-114, 2007.

BERGER, BB; EGWUAGU, CE; FREEMAN, WR; WILEY, CA; MILIAR, Y. Toxoplasmic Retinitis in
acquired immunodeficiency syndrome. Arch Ophthamol. v. 111, p. 373-376, 1993.

BERTOZZI, LC; SUZUKI, LA; ROSSI, CL. Serological diagnosis of Toxoplasmosis: usefulness of IgA
detection and IgG avidity determination in a patient with a persistent IgM antibody response to
Toxoplasma gondii.Rev Inst Med Trop Sao Paulo. v. 41, p. 175-177, 1999.

BESSIERES, MH; ROQUES, C; BERREBI, A; BARRE, V; CAZAUX, M; SEGUELA, JP. IgA antibody
response during acquired and congenital toxoplasmosis. Clin Pathol. v. 45, p. 605–608, 1992.
BJORKANDER, J; BENGTSSON, U; OXELIUS, VA; HANSON, LA. Symptoms in patients with lowered
levels of IgG subclasses, with or without IgA deficiency, and effects of immunoglobulin
prophylaxis. Monogr Allergy. v. 20, p. 157–163, 1986.

BLISS, SK; BUTCHER BA; DENKERS, EY. Rapid recruitment of neutrophils containing pre-stored IL-
12 during microbial infection, J Immunol. v. 165, p. 4515–4521, 2000.

BLISS, SK; GAVRILESCU, LC; ALCARAZ, A; DENKERS, EY. Neutrophil depletion during Toxoplasma
gondii infection leads to impaired immunity and lethal systemic pathology. Infect Immun. v.
69, p. 4898-4905, 2001.

BLOCH-MICHEL E, LAMBIN P, DEBBIA M, TOUNSI Y, TRICHET C, OFFRET H. Local roduction of IgG


and IgG subclasses in the aqueous humor of patients with Fuchs heterochromic cyclitis,
herpetic uveitis and toxoplasmic chorioretinitis. Int Ophthalmol. V. 21, p. 187-194, 1998.

BONAMETTI, AM; PASSOS, JN; KOGA DA SILVA, EM; MACEDO, ZS. Probable transmission of acute
toxoplasmosis through breast feeding. J Trop Pediatr. v. 43, p. 116, 1997.

BOOTHROYD, JC; GRIGG, ME. Population biology of Toxoplasma gondii and its relevance to human
infection: do different strains cause different disease? Curr Opin Microbiol. v. 5, p. 438-442,
2002.

BOSCH-DRIESSEN, LH; VERBRAAK, FD; SUTTORP-SCHULTEN, MS; VAN RUYVEN, RL; KLOK, AM;
HOYNG, CB; ROTHOVA, A. A prospective, randomized trial of pyrimethamine and azithromycin
vs pyrimethamine and sulfadiazine for the treatment of ocular toxoplasmosis. Am J
Ophthalmol. v. 134, p. 34-40, 2002.

BOYLE, JP; SAEIJ, JP; CLEARY, MD; BOOTHROYD, JC. Analysis of gene expression during
development: lessons from the Apicomplexa. Microbes Infect. v. 8, p. 1623-1630, 2006.

BRANDAO, GP; FERREIRA, AM; MELO, MN; VITOR, RW. Characterization of Toxoplasma gondii
from domestic animals from Minas Gerais, Brazil. Parasite. v. 13, p. 143-149, 2006.

BRUYNZEEL, PLB; BERRENS, L. IgE and IgG4 antibodies in specific human allergies. Int Arch
Allergy Appl Immunol. v. 58, p. 344-350, 1979.
Buffolano, W; Beghetto, E; Del Pezzo, M; Spadoni, A; Di Cristina, M; Petersen, E; Gargano, N. Use
of recombinant antigens for early postnatal diagnosis of congenital toxoplasmosis. J Clin
Microbiol. v. 43, p. 5916-5924, 2005.

112
Referências Bibliográficas

BURNETT, AJ; SHORTT, SG; ISAAC-RENTON, J; KING, A; WERKER, D; BOWIE, WR. Multiple cases
of acquired toxoplasmosis retinitis presenting in an outbreak. Ophthalmology. v. 105(6), p.
1032-1037, 1998.

BUTCHER, BA; DENKERS, EY. Mechanism of entry determines the ability of Toxoplasma gondii to
inhibit macrophage proinflammatory cytokine production. Infect Immun. v. 70(9), p. 5216-
5224. 2002.

COCHEREAU-MASSIN, I; LE HOANG, P; LAUTIER-FRAU, M; ZAZOUN, L; MARCEL, P; ROBINET, M;


BESINGUE, A; ROUSSELIE, F. Cytomegalovirus retinitis in AIDS. Treatment with intravitreal
injections of ganciclovir. Presse Med. v. 19(28), p. 1313-1316, 1990.

DA SILVA, AV; PEZERICO, SB; DE LIMA, VY; D'ARC MORETTI, L; PINHEIRO, JP; TANAKA, EM;
RIBEIRO, MG; LANGONI, H. Genotyping of Toxoplasma gondii strains isolated from dogs with
neurological signs. Vet Parasitol. v. 127(1), p. 23-27, 2005.

DANNEMANN, BR; VAUGHAN, WC; THULLIEZ, P; REMINGTON, JS. Differential agglutination test for
diagnosis of recently acquired infection with Toxoplasma gondii. J Clin Microbiol. v. 28, p.
1928–1933, 1990.

DARDE, ML; BOUTEILLE, B; PESTRE-ALEXANDRE, M. Isoenzyme analysis of 35 Toxoplasma gondii


isolates and the biological and epidemiological implications. J Parasitol. v. 78, p. 786-794,
1992.

DARDE, ML. Biodiversity in Toxoplasma gondii. Curr Top Microbiol Immunol. v. 219, p. 2741,
1996.

DARDE, ML; VILLENA, I; PINON, JM; BEGUINOT, I. Severe toxoplasmosis caused by a Toxoplasma
gondii strain with a new isoenzyme type acquired in French Guyana. J Clin Microbiol. v.
36(1), p. 324, 1998.

DE MOURA, L; BAHIA-OLIVEIRA, LM; WADA, MY; JONES, JL; TUBOI, SH; CARMO, EH; RAMALHO,
WM; CAMARGO, NJ; TREVISAN, R; GRACA, RM; DA SILVA, AJ; MOURA, I; DUBEY, JP;
GARRETT, DO. Waterborne toxoplasmosis, Brazil, from field to gene. Emerg Infect Dis. v.
12(2), p. 326-329, 2006.

DECOSTER, A; SLIZEWICS, B; SIMON, J; BAZIN, C; DARCY, F; VITTU, G; BOULANGER, C;


CHAMPEAU, Y; DEMORY, JL; DUHAMEL, M; CAPRON, A. Platelia Toxo IgA, a new kit for early
diagnosis of congenital toxoplasmosis by detection of anti-P30 immunoglobulin A antibodies. J
Clin Microbiol. v. 29, p. 2291–2295, 1991.

DENKERS, EY; GAZZINELLI, RT; HIENY, S; CASPAR, P; SHER, A. Bone marrow macrophages
process exogenous Toxoplasma gondii polypeptides for recognition by parasite-specific cytolytic
T lymphocytes. J Immunol. v. 150(2), p. 517-526, 1993.

DENKERS, EY; SHER, A; GAZZINELLI, RT. CD8+ T-cell interactions with Toxoplasma gondii,
implications for processing of antigen for class-I-restricted recognition. Res Immunol. v.
144(1), p. 51-57, 1993.

DENKERS, EY; CASPAR, P; SHER, A. Toxoplasma gondii possesses a superantigen activity that
selectively expands murine T cell receptor V beta 5 chain of the mouse T cell receptor. J
Immunol. v. 180; p. 985-994, 1994.

113
Referências Bibliográficas

DENKERS, EY; GAZZINELLI, RT. Regulation and function of T-cell mediated immunity during
Toxoplasma gondii infection. Clin Microbiol Rev. v. 11, p. 569-588, 1998.

DENKERS, EY. From cells to signaling cascades, manipulation of innate immunity by Toxoplasma
gondii. Immunology and Medical Microbiology. v. 39; p. 193-220, 2003.

DESMONTS, G. Definitive serological diagnosis of ocular toxoplasmosis. Arch Ophthalmol. v. 76,


p. 839-851, 1966.

DESMONTS, G. Some remarks on the immunopathology of toxoplasmic uveitis. Mod Probl


Ophthalmol. v. 16, p. 228-232, 1976.

DETRICK, BD; NEWSOME, D; PERCOPO, C; HOOKS, JJ. Class II antigen expression and gamma
interferon modulation of monocytes and retinal pigment epithelial cells from patients with
retinitis pigmentosa. Clin Immunol Immunopathol. v. 36, p. 201–211, 1985.

DOBROWOLSKI, JM; SIBLEY, LD. Toxoplasma invasion of mammalian cells is powered by the actin
cytoskeleton of the parasite. Cell. v. 84(6), p. 933-939, 1996.

DOFT, BH; GASS, DM. Punctate outer retinal toxoplasmosis. Arch Ophthalmol. v. 103(9), p.
1332-1336, 1985.

DUBEY, JP; MILLER, NL; FRENKEL, JK. Toxoplasma gondii life cycle in cats. J Am Vet Med Assoc.
v. 157(11), p. 1767-1770, 1970.

DUBEY, JP. Toxoplasmosis. J Am Vet Med Assoc. v. 189(2), p. 166-170, 1986.

DUBEY, JP; BEATTIE, CP. Toxoplasmosis of animals and man. Florida: Boca Raton: CRC Press.
p.55, 1988.

DUBEY, JP. Long-term persistence of Toxoplasma gondii in tissues of pigs inoculated with T gondii
oocysts and effect of freezing on viability of tissue cysts in pork. Am J Vet Res. v. 49(6), p.
910-913, 1988.

DUBEY, JP; LINDSAY, DS; SPEER, CA. Structures of Toxoplasma gondii tachyzoites, bradyzoites,
sporozoites and biology and development of tissue cysts. Clin Microbiol Rev. v. 11(2), p. 267-
299, 1998.

DUBEY, JP. Comparative infectivity of Toxoplasma gondii bradyzoites in rats and mice. J Parasitol.
v. 84(6), p. 1279-1282, 1998.

DUBEY, JP. Tachyzoite-induced life cycle of Toxoplasma gondii in cats. J Parasitol. v. 88(4), p.
713-717, 2002.

DUBEY, JP; GRAHAM, DH; BLACKSTON, CR; LEHMANN, T; GENNARI, SM; RAGOZO, AM; NISHI,
SM; SHEN, SK; KWOK, OC; HILL, DE; THULLIEZ, P. Biological and genetic characterisation of
Toxoplasma gondii isolates from chickens (Gallus domesticus) from Sao Paulo, Brazil:
unexpected findings. Int J Parasitol. v. 32(1), p. 99-105, 2002.

DUBEY, JP; GRAHAM, DH; DA SILVA, DS; LEHMANN, T; BAHIA-OLIVEIRA, LM. Toxoplasma gondii
isolates of free-ranging chickens from Rio de Janeiro, Brazil: mouse mortality, genotype, and
oocyst shedding by cats. J Parasitol. v. 89(4), p. 851-853, 2003.

114
Referências Bibliográficas

DUBEY, JP; NAVARRO, IT; GRAHAM, DH; DAHL, E; FREIRE, RL; PRUDENCIO, LB; SREEKUMAR C;
VIANNA, MC; LEHMANN, T. Characterization of Toxoplasma gondii isolates from free range
chickens from Paraná, Brazil. Vet Parasitol. v. 117(3), p. 229-234, 2003.

DUBEY, JP; NAVARRO, IT; SREEKUMAR, C; DAHL, E; FREIRE, RL; KAWABATA, HH; VIANNA, MC;
KWOK, OC; SHEN, SK; THULLIEZ, P; LEHMANN, T. Toxoplasma gondii infections in cats from
Paraná, Brazil: seroprevalence, tissue distribution, and biologic and genetic characterization of
isolates. J Parasitol. v. 90(4), p. 721-726, 2004.

DUBEY, JP; GOMEZ-MARIN, JE; BEDOYA, A; LORA, F; VIANNA, MC; HILL, D; KWOK, OC; SHEN,
SK; MARCET, PL; LEHMANN, T. Genetic and biologic characteristics of Toxoplasma gondii
isolates in free-range chickens from Colombia, South America. Vet Parasitol. v. 134, p. 67-72,
2005.

DUBEY, JP; GENNARI, SM; LABRUNA, MB; CAMARGO, LM; VIANNA, MC; MARCET, PL; LEHMANN, T.
Characterization of Toxoplasma gondii isolates in free-range chickens from Amazon, Brazil. J
Parasitol. v. 92(1), p. 36-40, 2006.

DUBEY, JP; GRAHAM, DH; DA SILVA, DS; LEHMANN, T; BAHIA-OLIVEIRA, LM. Toxoplasma gondii
isolates of free-ranging chickens from Rio de Janeiro, Emerg Infect Dis. v. 12(4), p. 582-587,
2006.

DUBEY, JP; SUNDAR, N; GENNARI, SM; MINERVINO, AH; FARIAS, NA; RUAS, JL; DOS SANTOS,
TR; CAVALCANTE, GT; KWOK, OC; SU, C. Biologic and genetic comparison of Toxoplasma
gondii isolates in free-range chickens from the northern Para state and the southern state Rio
Grande do Sul, Brazil revealed highly diverse and distinct parasite populations. Vet Parasitol.
v. 142, p. 47-53, 2006

ELNER, VM; STRIETER, RM; ELNER, SG; BAGGIOLINI, M; LINDLEY, I; KUNKEL, SL. Neutrophil
chemotactic factor (IL-8) gene expression by cytokine- treated retinal pigment epithelial cells.
Am. J. Pathol. v. 136, p. 745–750, 1990.

FAZAELI, A; CARTER, PE; DARDE, ML; PENNINGTON, TH. Molecular typing of Toxoplasma gondii
strains by GRA6 gene sequence analysis. Int J Parasitol. v. 30(5), p. 637-642, 2000.

FERREIRA, AM; VITOR RW; CARNEIRO, AC; BRANDAO, GP; MELO, MN. Genetic variability of
Brazilian Toxoplasma gondii strains detected by random amplified polymorphic DNA-
polymerase chain reaction (RAPD-PCR) and simple sequence repeat anchored-PCR (SSR-PCR).
Infect Genet Evol. v. 4(2), p. 131-142, 2004.

FERREIRA, AM; VITOR, RW; GAZZINELLI, RT; MELO, MN. Genetic analysis of natural recombinant
Brazilian Toxoplasma gondii strains by multilocus PCR-RFLP. Infect Genet Evol. v. 6(1), p.
22-31, 2006.

FORTIER, B; COIGNARD-CHATAIN, C; DAO, A; ROULAND, V; VALAT, AS; VINATIER, D; LEBRUN, T.


Study of developing clinical outbreak and serological rebounds in children with congenital
toxoplasmosis and follow-up during the first 2 years of life. Arch Pediatr. v. 4, p. 940-946,
1997.

FOSTER, BG; MCCULLOCH, WF. Studies of active and passive immunity in animals inoculated with
Toxoplasma gondii. Can J Microbiol. v. 14, p. 103-110, 1968.

115
Referências Bibliográficas

FOULON, W; VILLENA, I; STRAY-PEDERSEN, B; et al. Treatment of toxoplasmosis during


pregnancy: a multicenter study of impact on fetal transmission and children's sequelae at age 1
year. Am J Obstet Gynecol. v. 180, p. 410-415, 1999.

FRENKEL, JK. Pathogenesis of toxoplasma with a consideration of cyst rupture in besnoitia


infection. Surv. Ophthalmol..v. 6, p. 799-825, 1961.

FRENKEL, JK; DUBEY, JP. Effects of freezing on the viability of toxoplasma oocysts. J Parasitol. v.
59(3), p. 587-588, 1973.

FRENKEL, JK; TAYLOR, DW. Toxoplasmosis in immunoglobulin M-suppressed mice. Infect


Immun. v. 38, p. 360-367, 1982.

FRENKEL, JK. Toxoplasmosis in human beings. J Am Vet Med Assoc. v. 196(2), p. 240-248,
1990.

FRENKEL, JK; PFEFFERKORN, ER; SMITH, DD; FISHBACK, JL. Prospective vaccine prepared from a
new mutant of Toxoplasma gondii for use in cats. Am J Vet Res. v. 52(5), p. 759-63, 1991.

FRIEDMANN, CT; KNOX, DL. Variations in recurrent active toxoplasmic retinochoroiditis Arch
Ophthalmol. v. 81(4), p. 481-493, 1969.

FUENTES, I; RUBIO, JM; RAMIREZ, C; ALVAR, J. Genotypic characterization of Toxoplasma gondii


strains associated with human toxoplasmosis in Spain: direct analysis from clinical samples. J
Clin Microbiol. v. 39(4), p. 1566-1570, 2001.

FUX, B; RODRIGUES, CV; PORTELA, RW; SILVA, NM; SU, C; SIBLEY, D; VITOR, RW; GAZZINELLI,
RT. Role of cytokines and major histocompatibility complex restriction in mouse resistance to
infection with a natural recombinant strain (type I-III) of Toxoplasma gondii. Infect Immun.
v. 71, p. 6392-6401, 2003.

GARCIA, JL; NAVARRO, IT; OGAWA, L; OLIVEIRA, RC; GARCIA, SMF; LEITE, J. Soroepidemiologia
da toxoplasmose e avaliação ocular pela Tela de Amslerr, em pacientes da zona rural,
atendidos na unidade de saúde do município de Jaguapitã, PR, Brasil. Rev Inst Med Trop.
v.45, p. 147-151, 2003.

GASCAN, H; GAUCHAT, JF; RONCAROLO, MG; YSSEL, H; SPITS, H; DE VRIES, JE. Human B cell
clones can be induced to proliferate and to switch to IgE and IgG4 synthesis by interleukin 4
and a signal provided by activated CD4+ T cell clones. J Exp Med. v. 173, p. 747-750, 1991.

GAVRILESCU, LC; DENKERS, EY. IFN-gamma overproduction and high level apoptosis are
associated with high but not low virulence Toxoplasma gondii infection. J Immunol. v. 167, p.
902-909, 2001.

GAZZINELLI, RT; HAKIM, FT; HIENY, S; SHEARER, GM; SHER A. Synergistic role of CD4+ and
CD8+ T lymphocytes in IFN-gamma production and protective immunity induced by an
attenuated Toxoplasma gondii vaccine. J Immunol. v. 1;146, p. 286-292, 1991.

GAZZINELLI, R; XU, Y; HIENY, S; CHEEVER, A; SHER, A. Simultaneous depletion of CD4+ and


CD8+ T lymphocytes is required to reactivate chronic infection with Toxoplasma gondii. J
Immunol. v. 149, p. 175-180, 1992.

116
Referências Bibliográficas

GAZZINELLI, RT; DENKERS, EY; SHER, A. Host resistance to Toxoplasma gondii: model for
studying the selective induction of cell-mediated immunity by intracellular parasites. Infect
Agents Dis. v. 2, p. 139-149, 1993.

GAZZINELLI, RT; BREZIN, A; LI, Q; NUSSENBLATT, RB; CHAN, CC. Toxoplasma gondi. Aquired
ocular toxoplasmosis in the murine model, protective role of TNF-α and IFN-γ. Exp Parasitol.
v. 78, p. 217–229, 1994.

GIAMMANCO, A; TAORMINA, S; CHIARINI, A; DARDANONI, G; STEFANELLI, P; SALMASO, S;


MASTRANTONIO, P. Analogous IgG subclass response to pertussis toxin in vaccinated children,
healthy or affected by whooping cough. Vaccine. v. 16, p. 1924-1931, 2003.

GILBERT, RE; STANFORD, MR. Is ocular toxoplasmosis caused by prenatal or postnatal infection?
Br J Ophthalmol. v. 84, p. 224-226, 2000.

GLASNER, PD; SILVEIRA, C; KRUSZON-MORAN, D; MARTINS, MC; BURNIER, M; SILVEIRA, JR;


CAMARGO, ME; NUSSENBLATT, RB; KASLOW, RA; BELFORT, R. JR. An unusually high
prevalence of ocular toxoplasmosis in southern Brazil. Am J ophthalmol. v.114, p. 136-144,
1992.

GOMEZ-MARIN, JE; MONTOYA-DE-LONDONO, MT; CASTANO-OSORIO, JC; HEINE, FA; DUQUE,


AM; CHEMLA, C; AUBERT, D; BONHOMME, A; PINON, JM. Frequency of specific anti-
Toxoplasma gondii IgM, IgA and IgE in Colombian patients with acute and chronic ocular
toxoplasmosis. Mem Inst Oswaldo Cruz. v. 95, p. 89-94, 2000.

GREINER, M; SOHR, D; GOBEL, P. A modified ROC analysis for the selection of cut-off values and
the definition of intermediate results of serodiagnostic tests. Journal of Immunological
Methods. v. 185, p. 123-132, 1995.

GRIGG, ME; BOOTHROYD, JC. Rapid identification of virulent type I strains of the protozoan
pathogen Toxoplasma gondii by PCRrestriction fragment length polymorphism analysis at the
B1 gene. J Clin Microbiol. v. 39, p. 398-400, 2001a.

GRIGG, ME; GANATRA, J; BOOTHROYD, JC; Margolis, TP. Unusual abundance of atypical strains
associated with human ocular toxoplasmosis. J Infect Dis. v. 184, p. 63-69, 2001b.

GROSS, U; HOLPERT, M; GOEBEL, S. Impact of stage differentiation on diagnosis of toxoplasmosis.


Ann Ist Super Sanita. v. 40, p. 65-70, 2004.

GWYNN, CM; ALMOSAWI, T; STANWORTH, DR. Clinical associations with serum allergen-specific
IgG4 antibodies. Clin. Allergy. v. 12, p. 459-464, 1982.

HALL, AV; JOHNSON, JD; STEVENS, PJ; RENTON, NE; HOLLIMAN, RE. Measurement of Toxoplasma
IgM by a microparticle capture enzyme immuno-assay. J Med Microbiol. v. 38, p. 34-37,
1993.

HANDMAN, E; REMINGTON, JS. Antibody responses to toxoplasma antigens in mice infected with
strains of different virulence. Infect Immun. v. 29, p. 215-220, 1980.

HANLEY, JA; McNEIL, BJ. The meaning and use of the area under a receiver operating
characteristic (ROC) curve. Radiology. v. 143, p. 29-36, 1982.

117
Referências Bibliográficas

HAUSMANN, EH; HAO, SY; PACE, JL; PARMELY, MJ. Transforming growth factor beta 1 and gamma
interferon provide opposing signals to lipopolysaccharide-activated mouse macrophages.
Infect Immun. v. 62, p. 3625-3632, 1994.

HAYDE, M; SALZER, HR; GITTLER, G; ASPOCK, H; POLLAK, A. Microparticle enzyme immunoassay


(MEIA) for toxoplasma specific immunoglobulin G in comparison to the Sabin-Feldman dye test.
A pilot study. Wien Klin Wochenschr. v. 107, p. 133-136, 1995.

HEDMAN, K; LAPPALAINEN, M; SEPPAIA, I; MAKELA, O. Recent primary toxoplasma infection


indicated by a low avidity of specific IgG. J Infect Dis. v. 159, p. 736-740, 1989.

HEINZEL, FP; SADICK, MD; HOLADAY, BJ; COFFMAN, RL; LOCKSLEY, RM. Reciprocal expression of
interferon gamma or interleukin 4 during the resolution or progression of murine leishmaniasis.
Evidence for expansion of distinct helper T cell subsets. J Exp Med. v. 169, p. 59-72, 1989.

HERROD, HG. Management of the patient with IgG subclass deficiency and/or selective antibody
deficiency. Ann Allergy. v. 70, p. 3-8, 1993.

HIRAI, K; HIRATO, K; YANAGAWA, R. A cinematographic study of the penetration of cultured cells


by Toxoplasma gondii. Jpn J Vet Res. v. 14, p. 81-90, 1966.

HOLLAND, GN; ENGSTROM, RE JR; GLASGOW, BJ; BERGER, BB; DANIELS, SA; SIDIKARO, Y;
HARMON, JA; FISCHER, DH; BOYER, DS; RAO, NA; et al. Ocular toxoplasmosis in patients with
the acquired immunodeficiency syndrome. Am J Ophthalmol. v. 106, p. 653-667, 1988.

HOLLAND, GN. Ocular toxoplasmosis in the immunocompromised host. Int Ophthalmol. v. 13, p.
399-402, 1989.

HOLLAND, GN; O’CONNOR, GR; BELFORT, JR; REMINGTON, JS. Toxoplasmosis. In PEPOSE, JS;
HOLLAND, GN; WILHELMUS, KR. editors. Ocular Infection & Immunity. St Louis, Missouri:
Mosby-Year Book, Inc. p. 1183-1223. 1996.

HOLLAND, GN. New issues in the management of patients with AIDS-related cytomegalovirus
retinitis. Arch Ophthalmol. v. 118, p. 704-706, 2000.

HOLLAND, GN; LEWIS, KG. An update on current practices in the management of ocular
toxoplasmosis. Am J Ophthalmol. v. 134, p. 102-114, 2002.

HOLLAND, GN. Ocular toxoplasmosis: a global reassessment. Part I: epidemiology and course of
disease. Am J Ophthalmol, v. 136, p.973-988, 2003.

HOLLAND, GN. Ocular toxoplasmosis, a global reassessment. Part II: disease manifestation sand
management. Am J Ophthalmol. v. 137, p. 1-17, 2004.

HOLLIMAN, RE; RAYMOND, R; RENTON, N; JOHNSON, JD. The diagnosis of toxoplasmosis using
IgG avidity. Epidemiol Infect. v. 112, p.399-408, 1994.

HONORE, S; COUVELARD, A; GARIN, YJ; BEDEL, C; HENIN, D; DARDE, ML; DEROUIN, F.


Genotyping of Toxoplasma gondii strains from immunocompromised patients. Pathol Biol. v.
48, p. 541-547, 2000.

HOWE, DK; SIBLEY, LD. Toxoplasma gondii comprises three clonal lineages, correlation of parasite
genotype with human disease. J Infect Dis. v. 172, p. 1561-1566, 1995.

118
Referências Bibliográficas

HOWE, DK; SUMMERS, BC; SIBLEY, LD. Acute virulence in mice is associated with markers on
chromosome VIII in Toxoplasma gondii. Infect Immun. v. 64, p. 5193-5198, 1996.

HOWE, DK; HONORE, S; DEROUIN, F; SIBLEY, LD. Determination of genotypes of Toxoplasma


gondii strains isolated from patients with toxoplasmosis. J Clin Microbiol. v. 35, p. 1411-
1414, 1997.

HUNTER, CA; REMINGTON, JS. Immunopathogenesis of toxoplasmic encephalitis. J Infect Dis. v.


170, p. 1057, 1994.

HUSKINSON, J; STEPICK-BIEK, PN; ARAUJO, FG; THULLIEZ, P; SUZUKI, Y; REMINGTON, JS.


Toxoplasma antigens recognized by immunoglobulin G subclasses during acute and chronic
infection. J Clin Microbiol. v. 27, p. 2031-2038, 1989.

HUSSAIN, R; OTTESEN, EA. IgE responses in human filariasis. IV. Parallel antigen recognition by
IgE and IgG4 subclass antibodies. J Immunol. v. 136, p. 1859-1863, 1986.

HUSSAIN, R; KIFAYET, A; CHIANG, TJ. Immunoglobulin G1 (IgG1) and IgG3 antibodies are
markers of progressive disease in leprosy. Infect Immun. v. 63, p. 410–415, 1995.

ISKANDER, R; DAS, PK; AALBERSE, RC. IgG4 antibodies in Egyptian patients with schistosomiasis.
Int. Arch.Allergy Appl Immunol. v. 66, p. 200-207, 1981.

ISRAELSKI, DM; ARAUJO, FG; CONLEY, FK; SUZUKI, Y; SHARMA, S; REMINGTON, JS. Treatment
with anti-L3T4 (CD4) monoclonal antibody reduces the inflammatory response in toxoplasmic
encephalitis. J Immunol. v. 142, p. 954-958, 1989.

JABARA, HH; FU, SM; GEHA, RS; VERCELLI, D. CD40 and IgE: synergism between anti-CD40
monoclonal antibody and interleukin 4 in the induction of IgE synthesis by highly purified
human B cells. J Exp Med. v. 172, p. 1861-1864, 1990.

JACOBS, L. The resistance of the encysted form of Toxoplasma gondii. J.Parasitol. v. 46, p. 11-
21, 1960.

JACOBS, D; VERCAMMEN, M; SAMAN, E. Evaluation of recombinant dense granule antigen 7


(GRA7) of Toxoplasma gondii for detection of immunoglobulin G antibodies and analysis of a
major antigenic domain. Clin Diagn Lab Immunol. v. 6, p. 24-29, 1999.

JENUM, PA; STRAY-PEDERSEN, B; GUNDERSEN, AG. Improved diagnosis of primary Toxoplasma


gondii infection in early pregnancy by determination of antitoxoplasma immunoglobulin G
avidity. J Clin Microbiol. v. 35, p. 1972-1977, 1997.

JOHNSON, AM; MCDONALD, PJ; NEOH, SH. Monoclonal antibodies to Toxoplasma cell membrane
surface antigens protect mice from toxoplasmosis. J Protozool. v. 30, p. 351-356, 1983.

JOHNSON, MW; GREVEN, GM; JAFFE, GJ; SUDHALKAR, H; VINE, AK. Atypical, severe toxoplasmic
retinochoroiditis in elderly patients. Ophthalmology. v. 104, p. 48-57, 1997.

JONES, JL; LOPEZ, A; WILSON, M; SCHULKIN, J; GIBBS, R. Congenital Toxoplasmosis: a review.


Obstet Gynecol Surv. v. 56, p. 296-305, 2001.

JONES, JL; MUCCIOLI, C; BELFORT, R JR; HOLLAND, GN; ROBERTS, JM; SILVEIRA, C. Recently
acquired Toxoplasma gondii infection, Brazil. Emerg Infect Dis. v. 12, p. 582-587, 2006.

119
Referências Bibliográficas

JONES, TC; YEH, S; HIRSCH, JG. The interaction between Toxoplasma gondii and mammalian
cells. I. Mechanism of entry and intracellular fate of the parasite. J Exp Med. v. 136, p. 1157-
1172, 1972.

KAPPERUD, G; JENUM, PA; STRAY-PEDERSEN, B. Risk factors for Toxoplasma gondii infection in
pregnancy. Results of a prospective case-control study in Norway. Am J Epidemiol. v. 144, p.
405–412, 1996.

KASPER, LH; KHAN, IA. Role


of P30 in host immunity and pathogenesis of T. gondii infection. Res Immunol. v. 144, p. 45-48,
1993.

KAUFMANN, SH; BLUM, C; YAMAMOTO, S. Crosstalk between alpha/beta T cells and gamma/delta
T cells in vivo: activation of alpha/beta T-cell responses after gamma/delta T-cell modulation
with the monoclonal antibody GL3. Proc Natl Acad Sci. v. 90, p. 9620-9624, 1993.

KHAN, IA; MATSUURA, T; KASPER, LH. Interleukin-12 enhances murine survival against acute
toxoplasmosis. Infect Immun. v. 62, p. 1639-1642, 1994.

KHAN, A; SU, C; GERMAN, M; STORCH, GA; CLIFFORD, DB; SIBLEY, LD. Genotyping of
Toxoplasma gondii strains from immunocompromised patients reveals high prevalence of type I
strains. J Clin Microbiol. v. 43, p. 5881-5887, 2005.

KHAN, A; JORDAN, C; MUCCIOLI, C; VALLOCHI, AL; RIZZO, LV; BELFORT, R JR; VITOR, RW;
SILVEIRA, C; SIBLEY, LD. Genetic divergence of Toxoplasma gondii strains associated with
ocular toxoplasmosis, Brazil. Emerg Infect Dis. v. 12, p. 942-949, 2006.

KOHLER, S; DELWICHE, CF; DENNY, PW; TILNEY, LG; WEBSTER, P; WILSON, RJ; PALMER, JD;
ROOS, DS. A plastid of probable green algal origin in Apicomplexan parasites. Science. v. 275,
p. 1485-1489, 1997.

KONG, JT; GRIGG, ME; UYETAKE, L; PARMLEY, S; BOOTHROYD, JC. Serotyping of Toxoplasma
gondii infections in humans using synthetic peptides. J Infect Dis. v. 187, p. 1484-1495,
2003.

KOU, K; KAWANO, Y; YOSHIZAWA, I; NOMA, T. Analysis and regulation of interferon-gamma


production by peripheral blood lymphocytes from patients with bronchial asthma. Arerugi, v.
43, p. 482-491, 1994.

KYES, S; HORROCKS, P; NEWBOLD, C. Antigenic variation at the infected red cell surface in
malaria. Annu Rev Microbiol. v. 55, p. 673-707, 2001.

LAGACE, J; PELOQUIN, L; KERMANI, P; MONTIE, T. IgG subclass responses to Pseudomonas


aeruginosa a- and b- type flagellins in patients with cystic fibrosis. J Med Microbiol. v. 43, p.
270–276, 1995.

LAPPALAINEN, M; HEDMAN, K. Serodiagnosis of toxoplasmosis. The impact of measurement of IgG


avidity. Ann Ist Super Sanita. v. 40, p. 81-88, 2004.

LEHMANN, T; GRAHAM, DH; DAHL, ER; BAHIA-OLIVEIRA, LM; GENNARI, SM; DUBEY, JP. Variation
in the structure of Toxoplasma gondii and the roles of selfing, drift, and epistatic selection in
maintaining linkage disequilibria. Infect Genet Evol. v. 4, p. 107-114, 2004.

120
Referências Bibliográficas

LEVINE, ND. Tazonomy of Toxoplasma. J Protozool. v. 24, p. 36-41, 1997.

LIESENFELD, O; PRESS, C; MONTOYA, JG; GILL, R; ISAAC-RENTON, JL; HEDMAN, K; REMINGTON,


JS. False-positive results in immunoglobulin M (IgM) toxoplasma antibody tests and importance
of confirmatory testing: the Platelia Toxo IgM test. J Clin Microbiol. v. 35, p. 174-178, 1997.

LINDBERG, RE; FRENKEL, JK. Toxoplasmosis in nude mice. J Parasitol. v. 63, p. 219-21, 1977.

LINDE, A; HAMMARSTROM, L; SMITH, CI. IgG subclass deficiency and chronic fatigue syndrome.
Lancet. v. 1, p. 885–886, 1988.

LINDE, A; SODERSTROM, R; SMITH, CI; SALBERG, M; DAHL, H; GRUBB, R; BJORKANDER, J;


HAMMARSTROM, L. Herpesvirus serology, aberrant specific immunoglobulin G2 and G3 subclass
patterns and Gm allotypes in individuals with low levels of IgG3. Clin Exp Immunol. v. 90, p.
199–203, 1992.

LUDER, CG; WALTER, W; BEUERLE, B; MAEURER, MJ; GROSS, U. Toxoplasma gondii down-
regulates MHC class II gene expression and antigen presentation by murine macrophages via
interference with nuclear translocation of STAT1alpha. Eur J Immunol. v. 31, p. 1475-1484,
2001.

LUFT, BJ; REMINGTON, JS. Toxoplasmic encephalitis in AIDS. Clin Infect Dis. v. 15, p. 211-222,
1992.

LYONS, RE; ANTHONY, JP; FERGUSON, DJP; BYRNE, N; ALEXANDER, J; ROBERTS, F; ROBERTS,
CW. Immunological studies of chronic ocular toxoplasmosis: up-regulation of major
histocompatibility complx class I and transforming growth factor B and a protective role for
interleukin-6. Infect Immun. v. 69, p. 2589–2595, 2001.

LYONS, RE; MCLEOD, R; ROBERTS, CW. Toxoplasma gondii tachyzoite-bradyzoite interconversion.


Trends Parasitol. v. 18, p. 198-201, 2002.

MASIHI, KN; WERNER, H. The effect of passively transferred heterologous serum on Toxoplasma
gondii in NMRI mice. Influence of the treatment on course of infection and cyst formation.
Zentralbl Bakteriol. v. 240, p. 135-142, 1978.

MATTHEWS, JD; WEITER, JJ. Outer retinal toxoplasmosis. Ophthalmology. v. 95, p. 941-946,
1988.

MCKEE, AS; DZIERSZINSKI, F; BOES, M; ROOS, DS; PEARCE, EJ. Functional inactivation of
immature dendritic cells by the intracellular parasite Toxoplasma gondii. J Immunol. v. 173,
p. 2632-2640, 2004.

MCLEOD, R; EISENHAUER, P; MACK, D; BROWN, C; FILICE, G; SPITALNY, G. Immune responses


associated with early survival after peroral infection with Toxoplasma gondii. J Immunol. v.
142, p. 3247-3255, 1989.

MCNEIL, BJ; HANLEY, JA. Statistical approaches to the analysis of receiver operating characteristic
(ROC) curves. Med Decis Making. v. 4, p. 137-150, 1984.

MILLER, MA; GRIGG, ME; KREUDER, C; JAMES, ER; MELLI, AC; CROSBIE, PR; JESSUP, DA;
BOOTHROYD, JC; BROWNSTEIN, D; CONRAD, PA. An unusual genotype of Toxoplasma gondii is

121
Referências Bibliográficas

common in California sea otters (Enhydra lutris nereis) and is a cause of mortality. Int J
Parasitol. v. 4, p. 275-284, 2004.

MINEO, JR; CAMARGO, ME; FERREIRA, AW. Enzyme-linked immunosorbent assay for antibodies to
Toxoplasma gondii polysaccharides in human toxoplasmosis. Infect Immun. v. 27, p. 283-
287, 1980.

MONTOYA, JG; REMINGTON, JS. Toxoplasmic chorioretinitis in the setting of acute acquired
toxoplasmosis. Clin Infect Dis. v. 23, p. 277-282, 1996.

MONTOYA, JG; JORDAN, R; LINGAMNENI, S; BERRY, GJ; REMINGTON, JS. Toxoplasmic


myocarditis and polymyositis in patients with acute acquired toxoplasmosis diagnosed during
life. Clin Infect Dis. v. 24, p. 676-683, 1997.

MONTOYA, JG. Laboratory diagnosis of Toxoplasma gondii infection and toxoplasmosis. J Infect
Dis. v. 185(1), p. 73-82, 2002.

MONTOYA, JG; LIESENFELD, O. Toxoplasmosis. Lancet. v. 363, p. 1965-1976, 2004.

MOORTHY, RS; SMITH, RE; Rao, NA. Progressive ocular toxoplasmosis in patients with acquired
immunodeficiency syndrome. Am J Ophthalmol. v. 115, p. 742-747, 1993.

NAGINENI, CN; PARDHASARADHI, K; MARTINS, MC; DETRICK, B; HOOKS, JJ. Mechanisms of


interferon-induced inhibition of Toxoplasma gondii replication in human retinal pigment
epithelial cells. Infect Immun. v. 64, p. 4188-4196, 1996.

NAGINENI, CN; DETRICK, B; HOOKS, JJ. Transforming growth factor-beta expression in human
retinal pigment epithelial cells is enhanced by Toxoplasma gondii, a possible role in the
immunopathogenesis of retinochoroiditis. Clin Exp Immunol. v. 228, p. 372-378, 2002.

NICHOLSON, DH; WOLCHOK, EB. Ocular toxoplasmosis in an adult receiving long-term


corticosteroid therapy. Arch Ophthalmol. v. 94, p. 248-254, 1976.

NICOLLE C; MANCEAUX, L. Sur une infection à corps de leishman (ou organisms voisins) de
Gondii. Compt Rend Acad Sci. v. 147, p. 763-766, 1908.

NUSSENBLATT, RB ; BELFORT, R JR. Ocular toxoplasmosis. An old disease revisited. JAMA. v. 271,
p. 304-307, 1994.

NUSSENBLATT, RB, WHITCUP, SM; PALESTINE, AG. OCULAR TOXOPLASMOSIS. IN:


NUSSENBLATT, RB; WHITCUP, SM; PALESTINE, AG. editors. Uveitis Fundamentals and clinical
practice. St Louis: Mosby Yearbook. p. 211–28, 1996.

NOWAKOWSKA D, COLON I, REMINGTON JS, GRIGG M, GOLAB E, WILCZYNSKI J, SIBLEY LD.


Genotyping of Toxoplasma gondii by multiplex PCR and peptide-based serological testing of
samples from infants in Poland diagnosed with congenital toxoplasmosis. J Clin Microbiol. v.
44, p. 1382-1389, 2006.

O'CONNOR, GR. Factors related to the initiation and recurrence of uveitis. XL Edward Jackson
memorial lecture. Am J Ophthalmol. v. 96, p. 577-599, 1983.

OTTESEN, EA; SKVARIL, F; TRIPATHY, SP; POINDEXTER, RW; HUSSAIN, R. Prominence of IgG4 I
the IgG antibody response to human filariasis. J. Immunol. v. 134, p. 2707-2712, 1985.

122
Referências Bibliográficas

PARMLEY, SF; GROSS, U; SUCHARCZUK, A; WINDECK, T; SGARLATO, GD; REMINGTON, JS. Two
alleles of the gene encoding surface antigen P22 in 25 strains of Toxoplasma gondii. J
Parasitol. v. 80, p. 293-301, 1994.

PASHLEY, TV; VOLPE, F; PUDNEY, M; HYDE, JE; SIMS, PF; ELVES, CJ. Isolation and molecular
characterization of the bifunctional hydroxymethyldihydropterin pyrophosphokinase-
dihydropteroate synthase gene from Toxoplasma gondii. Mol Biochem Parasitol. v. 86, p.
37-47, 1992.

PAVIA, CS; BITTKER, SJ; CURNICK, KE. Passive immunization protects guinea pigs from lethal
Toxoplasma infection. FEMS Microbiol Immunol. v. 4, p. 97-104, 1994.

PAVLI, P; HUME, DA; VAN DE POL, E; DOE, WF. Dendritic cells, the major antigen-presenting cells
of the human colonic lamina propria. Immunology. v. 78, p. 132-141, 1993.

PENA, HF; SOARES, RM; AMAKU, M; DUBEY, JP; GENNARI, SM. Toxoplasma gondii infection in cats
from Sao Paulo state, Brazil: seroprevalence, oocyst shedding, isolation in mice, and biologic
and molecular characterization. Res Vet Sci. v. 81, p. 58-67, 2006.

PEYRON F, LOBRY JR, MUSSET K, FERRANDIZ J, GOMEZ-MARIN JE, PETERSEN E, MERONI V,


RAUSHER B, MERCIER C, PICOT S, CESBRON-DELAUW MF. Serotyping of Toxoplasma gondii in
chronically infected pregnant women: predominance of type II in Europe and types I and III in
Colombia (South America). Microbes Infect. V. 8, p. 2333-2340, 2006.

PINON, JM; TOUBAS, D; MARX, C; MOUGEOT, G; BONNIN, A; BONHOMME, A; VILLAUME, M;


FOUDRINIER, F; LEPAN, H. Detection of specific immunoglobulin E in patients with
toxoplasmosis. J Clin Microbiol. v. 28, p. 1739-1743, 1990.

PORTELA, RW; BETHONY, J; COSTA, MI; GAZZINELLI, A; VITOR, RW; HERMETO, FM; CORREA-
OLIVEIRA, R; GAZZINELLI, RT. A multihousehold study reveals a positive correlation between
age, severity of ocular toxoplasmosis, and levels of glycoinositolphospholipid-specific
immunoglobulin A. J Infect Dis. v. 190, p. 175-183, 2004.

RAMALHO, WM; CAMARGO, NJ; TREVISAN, R; GRACA, RM; DA SILVA, AJ; MOURA, I; DUBEY, JP;
GARRETT, DO. Waterborne toxoplasmosis, Brazil, from field to gene. Emerg Infect Dis. v. 12,
p. 326-329, 2006.

REHDER, JR; BURNIER, MB JR; PAVESIO, CE; KIM, MK; RIGUEIRO, M; PETRILLI, AM; BELFORT, R
JR. Acute unilateral toxoplasmic iridocyclitis in an AIDS patient. Am J Ophthalmol. v. 106, p.
740-741, 1988.

REMINGTON, JS; DESMONTS, G. Toxoplasmosis, In Remington, JS; & Klein, JO. (ed.), Infectious
diseases of the fetus and newborn infant, 3rd ed. The W. B. Saunders Co., Philadelphia, Pa.
p. 89–195, 1990.

REMINGTON, JS; THULLIEZ, P; MONTOYA, JG. Recent developments for diagnosis of


toxoplasmosis. J Clin Microbiol. v. 42, p. 941-945, 2004.

RIDEL, PR; AURIAULT, C; DARCY, F; PIERCE, RJ; LEITE, P; SANTORO, F; NEYRINCK, JL;
KUSNIERZ, JP; CAPRON, A. Protective role of IgE in immunocompromised rat toxoplasmosis. J
Immunol. v. 141, p. 978-983, 1988.

123
Referências Bibliográficas

ROBERTS, A; HEDMAN, K; LUYASU, V, et al. Multicenter evaluation of strategies for serodiagnosis


of primary infection with Toxoplasma gondii. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. v. 20, p. 467-
474, 2001.

ROBERTS, F; & MCLEOD, R. Pathogenesis of toxoplasmic retinochoroiditis. Parasitol Today. v. 15,


p. 51-57, 1999.

ROITT, I; BROSTOFF, J; MALE, D. Imunologia. 5ªed., São Paulo, Ed. Manole, p. 71-80, 1999.

SANTORO, FD; AFCHAIN A; PIERCE, R. Serodiagnosis of Toxoplasma infection using a purified


parasite protein (p30). Clin Exp Immunol. v. 62, p. 262-269, 1985.

SCHLUTER, D; HEIN, A; DORRIES, R; DECKERT-SCHLUTER, M. Different subsets of T cells in


conjunction with natural killer cells, macrophages, and activated microglia participate in the
intracerebral immune response to Toxoplasma gondii in athymic nude and immunocompetent
rats. Am J Pathol. v. 146, p. 999-1007, 1995.

SEABRA, SH; DE SOUZA, W; DAMATTA, RA. Toxoplasma gondii partially inhibits nitric oxide
production of activated murine macrophages. Exp Parasitol. v. 100, p. 62-70, 2002.

SHARMA, SD; ARAUJO, FG; REMINGTON, JS. Toxoplasma antigen isolated by affinity
chromatography with monoclonal antibody protects mice against lethal infection with
Toxoplasma gondii. J Immunol. v. 133, p. 2818-2820, 1984.

SHEFFIELD, HG, MELTON, ML. The fine structure and reproduction of Toxoplasma gondii. J
Parasitol. v. 54, p. 209-226, 1968.

SIBLEY, LD; BOOTHROYD, JC. Virulent strains of Toxoplasma gondii comprise a single clonal
lineage. Nature. v. 359, p. 825, 1992.

SIBLEY, LD; BOOTHROYD, JC. Virulent strains of Toxoplasma gondii comprise a single clonal
lineage. Nature. v. 3, p. 82-95, 1992.

SIBLEY, LD; MORDUE, D; HOWE, DK. Experimental approaches to understanding virulence in


toxoplasmosis. Immunobiology. v. 201, p. 210-224, 1999.

SILVEIRA, C; BELFORT, R JR; BURNIER, M JR; NUSSENBLATT, R. Acquired toxoplasmic infection as


the cause of toxoplasmic retinochoroiditis in families. Am J Ophthalmol. v. 106, p. 362-364,
1988.

SILVEIRA, C; BELFORT, R JR; MUCCIOLI, C; ABREU, MT; MARTINS, MC; VICTORA, C;


NUSSENBLATT, RB; HOLLAND, GN. A follow-up study of Toxoplasma gondii infection in
southern Brazil. Am J Ophthalmol. v. 131, p. 351-354, 2001.

SILVEIRA, C; BELFORT, R JR; MUCCIOLI, C; et al, The effect of long-term intermittent


trimethoprim/sulfamethoxazole treatment on recurrences of toxoplasmic retinochoroiditis. Am
J Ophthalmol. v. 134, p. 41-46, 2002.

SILVEIRA, C; FERREIRA, R; MUCCIOLI, C; NUSSENBLATT, R; BELFORT, R JR. Toxoplasmosis


transmitted to a newborn from the mother infected 20 years earlier. Am J Ophthalmol. v.
136, p. 370-371, 2003.

124
Referências Bibliográficas

SPLENDORE, A. Un nuovo protozoa parassita dei conigli: incontrato nell lesioni anatomiche d’une
malattia che ricorda in molti punti kala-azar dell’uommo. Rev Soc Sci São Paulo. v. 3, p. 109-
112, 1908.

STEINBERG, AG; MORELL, A; SKVARIL, F; LOGHEM, EV: The effect of Gm(23) on the
concentration of IgG2 and IgG4 in normal human serum. J Immunol. v. 110, p. 1642– 1645,
1973.

STEPICK-BIEK, P; THULLIEZ, P; ARAUJO, FG; REMINGTON, JS. IGA antibodies for diagnosis of
acute congenital and acquired toxoplasmosis. J. Infect. Dis. v. 162, p. 270–273, 1990.

STRAY-PEDERSEN, B. Treatment of toxoplasmosis in the pregnant mother and newborn child.


Scand J Infect Dis. v. 84, p. 23-31, 1992.

SU, C; HOWE, DK; DUBEY, JP; AJIOKA, JW; SIBLEY, LD. Identification of quantitative trait loci
controlling acute virulence in Toxoplasma gondii. Proc Natl Acad Sci. v. 99, p. 10753-10758,
2002.

SUBAUSTE, CS; REMINGTON, JS. Immunity to Toxoplasma gondii. Curr Opin Immunol. v. 5, p.
532, 1993.

SUBAUSTE, CS; deWALL; MALEFYT, R; FUH, F. Role of CD80 (B7.1) and CD86 (b7.2) in the
immune response toa n intracellular pathogen. J. Immunol. v. 160, p. 1831, 1998.

SUBAUSTE, CS; WESSENDARP, M; SORENSEN, RU; LEIVA, LE. CD40-CD40 ligand interaction is
central to cell-mediated immunity against Toxoplasma gondii, patients with hyper IgM
syndrome have a defective type 1 immune response that can be restored by soluble CD40
ligand trimer. J Immunol. v. 162,p. 6690-6700, 1999.

SUBAUSTE, CS; WESSENDARP, M. Human dendritic cells discriminate between viable and killed
Toxoplasma gondii tachyzoites: dendritic cell activation alter infection with viable parasites
results in CD28 and CD40 ligand signaling that controls IL-12-dependent and –independent T
cell production of IFN-γ. J Immunol. v. 165,p. 1498-1505, 2000.

SUZUKI, Y; KOBAYASHI, A. Suppression of unprimed T and B cells in antibody responses by


irradiation-resistant and plastic-adherent suppressor cells in Toxoplasma gondii-infected mice.
Infect Immun. v. 40, p. 1-7, 1983.

SUZUKI, Y; REMINGTON, JS. The effect of anti-IFN-gamma antibody on the protective effect of
Lyt-2+ immune T cells against toxoplasmosis in mice. J Immunol. v. 144, p. 1954-1956,
1990.

SUZUKI, Y; YANG, Q; YANG, S; NGUYEN, N; LIM, S; LIESENFELD, O; KOJIMA, T; REMINGTON, JS.


IL-4 is protective against development of toxoplasmic encephalitis. J Immunol. v. 157, p.
2564-2569, 1996.

TENTER, AM; HECKEROTH, AR; WEISS, LM. Toxoplasma gondii: from animals to humans. Int J
Parasitol. v. 30, p. 1217-1258, 2000.

TENTER, AM; HECKEROTH, AR; WEISS, LM. Toxoplasma gondii: from animals to humans. Int J
Parasitol. v. 30, p. 1217-58, 2000. Review. Erratum in: Int J Parasitol. v. 31, p. 217-220,
2001.

125
Referências Bibliográficas

TURUNEN, H; VUORIO, KA; LEINIKKI, PO. Determination of IgG, IgM and IgA antibody responses
in human toxoplasmosis by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Scand J Infect Dis.
v. 15, p. 307–311, 1983.

VALLOCHI, AL; NAKAMURA, MV; SCHLENSINGER, D; MARTINS, M; SILVEIRA C; BELFORT, JR C;


RIZZO, LV. Ocular Toxoplasmosis: More Than Just What Meets the Eye. Scand J. Immunol. v.
55, p. 324-328, 2002.

VALLOCHI, AL; MUCCIOLI, C; MARTINS, MC; SILVEIRA, C; BELFORT, R JR; RIZZO, LV. The
genotype of Toxoplasma gondii strains causing ocular toxoplasmosis in humans in Brazil. Am J
Ophthalmol. v. 139, p. 350-351, 2005a.

VALLOCHI, AL; DA SILVA RIOS, L; NAKAMURA, MV; SILVEIRA, C; MUCCIOLI, C; MARTINS, MC;
BELFORT, R JR; RIZZO, LV. The involvement of autoimmunity against retinal antigens in
determining disease severity in toxoplasmosis. J Autoimmun. v. 24(1), p. 25-32, 2005b.

VIETZKE, WM; GELDERMAN, AH; GRIMLEY, PM; VALSAMIS, MP. Toxoplasmosis complicating
malignancy. Experience at the National Cancer Institute. Cancer. v. 21, p. 816-827, 1968.

VILLENA, D; AUBERT, V; BRODARD, C; QUEREUX, B; LEROUX, D; DUPOUY, G; REMY, F;


FOUDRINIER, C; CHEMLA, JE; GOMEZ-MARIN, PINON, JM. Detection of Specific
Immunoglobulin E during Maternal, Fetal, and Congenital Toxoplasmosis. Journal of Clinical
Microbiology. v. 37, p. 3487–3490, 1999.

WALDREP JC, SCHULTE JR. Characterization of human IgG subclasses within intraocular
compartments. Reg Immunol. v. 2 p,22-32, 1989.

WALLACH, J. Interpretation of diagnostic tests, 6th ed. Bostons: Little Brown & Co, 1996.

WONG, SY; HAJDU, MP; RAMIREZ, R; THULLIEZ, P; MCLEOD, R; REMINGTON, JS. Role of specific
immunoglobulin E in diagnosis of acute toxoplasma infection and toxoplasmosis. J Clin
Microbiol. v. 31, p. 2952-1959, 1993.

WONG, SY; REMINGTON, JS. Biology of Toxoplasma gondii. AIDS. v. 7, p. 299-316, 1993.

WONG, SY; REMINGTON, JS. Toxoplasmosis in pregnancy. Clin Infect Dis. v. 18, p. 853-861,
1994.

YAMAMOTO, JH; VALLOCHI, AL; SILVEIRA, C; FILHO, J; NUSSENBLATT, K; CUNHA-NETO, RB;


GAZZINELLI, AE; BELFORT, JR RT; RIZZO, LV. Discrimination between Pacients with Acquired
Toxoplasmosis and Congenital Toxoplasmosis on the Basis of the Immune Response to Parasite
Antigens. J Infect Dis. v. 181, p. 2018-2022, 2000.

YANG, P; DAS, PK; KIJLSTRA, A. Localization and characterization of immunocompetent cells in the
human retina. Ocul Immunol Inflamm. v. 8, p. 149-157, 2000.

YAP, GS; SHER, A. Cell-mediated immunity to Toxoplasma gondii: initiation, regulation and
effector function. Immunobiology. v. 201, p. 240-247, 1999.

126
Anexos

ANEXO A

TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO


GRUPO EXPERIMENTAL

ESTUDO: CARACTERIZAÇÃO DA RESPOSTA HUMORAL AO Toxoplasma gondii,


SUA RESISTÊNCIA À SULFA E ASSOCIAÇÃO À FORMA CLÍNICA DA DOENÇA
Você está sendo convidado(a) a participar do projeto de pesquisa acima citado. O
documento abaixo contém todas as informações necessárias sobre a pesquisa que
estamos fazendo. Sua colaboração neste estudo será de muita importância para nós,
mas se desistir a qualquer momento, isso não causará nenhum prejuízo a você.

Eu, (nome e profissão)........................................................................................,


residente e domiciliado na
............................................................................................................, portador
da Cédula de identidade, RG .................................... , e inscrito no
CPF/MF......................................... nascido(a) em _____ / _____ /______ , abaixo
assinado(a), concordo de livre e espontânea vontade em participar como voluntário(a) do
estudo “Caracterização da resposta humoral ao Toxoplasma gondii, sua resistência à
sulfa e associação à forma clínica da doença” . Declaro que obtive todas as informações
necessárias, bem como todos os eventuais esclarecimentos quanto às dúvidas por mim
apresentadas.
O principal objetivo deste estudo é estudar a imunidade (defesas do organismo)
contra o parasita Toxoplasma gondii, que está presente em diversas carnes e
que pode ser o causador da doença ocular. Você está sendo convidado a
participar deste estudo, pois apresenta problemas no olho devido ao
Toxoplasma. Visamos estabelecer a relação entre a produção de anticorpos
(proteínas de defesa do organismo) e as várias formas clínicas da toxoplasmose,
além de procurarmos definir as características do parasita que fazem com que
haja falha no tratamento com a sulfadiazina, permitindo assim um melhor
entendimento para o tratamento ideal da doença.

Estou ciente que:


I) O estudo se faz necessário para que se possam descobrir as possíveis causas da doença
denominada “toxoplasmose ocular”;
II) Serão realizados:
a) exame oftalmológico completo que consistirá de um exame externo do olho, medida da
pressão intra-ocular e exame de fundo de olho. Este exame faz parte da rotina numa
consulta oftalmológica.
b) exame de sangue consistirá de não mais de 450 ml de sangue a serem extraídos em
um período de vários meses, sendo que cada amostra será de não mais de 50 ml. Os
riscos da retirada de sangue são hematoma local (rouxidão), algum desconforto e,
raramente, tontura.
III) Essa(s) coleta(s) será(ao) feita(s) apenas para este estudo e em nada influenciará
(influenciarão) o meu tratamento; não vai (vão) me curar; não vai (vão) me causar
nenhum problema, exceto o pequeno incômodo de dor no momento da coleta (introdução
da agulha para retirada do sangue). Os riscos na coleta de humor vítreo (líquido contido no
olho) são os próprios da própria cirurgia. Todos os procedimentos para a coleta deste
material estão normalmente incluídos nas etapas da cirurgia. A diferença é que o material
será coletado em recipiente próprio para a sua análise. Assim, não há riscos introduzidos
pela coleta do material.

127
Anexos

IV) A participação neste projeto não tem objetivo de me submeter a um tratamento, bem
como não me acarretará qualquer ônus pecuniário com relação aos procedimentos médico-
clínico-terapêuticos efetuados com o estudo ;
V) Tenho a liberdade de desistir ou de interromper a colaboração neste estudo no momento
em que desejar, sem necessidade de qualquer explicação;
VI) A desistência não causará nenhum prejuízo à minha saúde ou bem estar físico. Não virá
interferir no atendimento ou tratamento médico;
VII) Os resultados obtidos durante este ensaio serão mantidos em sigilo, mas concordo que
sejam divulgados em publicações científicas, desde que meus dados pessoais não sejam
mencionados;
VIII) Caso eu desejar, poderei pessoalmente tomar conhecimento dos resultados, ao final desta
pesquisa

( ) Desejo conhecer os resultados desta pesquisa.


( ) Não desejo conhecer os resultados desta pesquisa.
Estes estudos podem melhorar o entendimento da doença levando a formas mais
eficazes de diagnóstico e tratamento no futuro. É provável que o voluntário em questão
não seja beneficiário direto destes avanços.
A adoção de alguns cuidados específicos para prevenção da toxoplasmose é
vantajosa para você. Estes cuidados consistem em: ingestão de carnes cozidas ou bem
passadas, leite pasteurizado e fervido, água filtrada e tratada, lavagem de verduras e
frutas, bem como evitar a criação de gatos, o hospedeiro definitivo da toxoplasmose.
________________________________________________________________________
Quaisquer  dúvidas,  que  possam  ocorrer  com  relação  a  esse  estudo,  poderão  ser 
contatados:  Dr.  Cláudio  Silveira  na  Clínica  Silveira,  Avenida  sete  de  setembro,  1502  Erechim  – 
RS, telefone (54) 321‐1900. Dr. Luiz Vicente Rizzo na Universidade de São Paulo, Laboratório de 
Imunologia Clínica, Av. Prof. Lineu Prestes 1730, São Paulo –SP 05508‐900, telefone (11) 3091 
7394. 

São Paulo, de de 200 .

( ) Paciente / ( ) Responsável
...................................................................................................
Testemunha 1 : ________________________________________________
Nome / RG / Telefone
Testemunha 2 : ___________________________________________
Nome / RG / Telefone
Responsável pelo Projeto: __________________________________________
Lília Rios Tsukuda

128
Anexos

ANEXO A

TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO


GRUPO CONTROLE

ESTUDO: CARACTERIZAÇÃO DA RESPOSTA HUMORAL AO Toxoplasma


gondii, SUA RESISTÊNCIA À SULFA E ASSOCIAÇÃO À FORMA CLÍNICA
DA DOENÇA

Você está sendo convidado(a) a participar do projeto de pesquisa acima


citado. O documento abaixo contém todas as informações necessárias
sobre a pesquisa que estamos fazendo. Sua colaboração neste estudo
será de muita importância para nós, mas se desistir a qualquer momento,
isso não causará nenhum prejuízo a você.

Eu, (nome e profissão)........................................................................................, residente e


domiciliado a ............................................................................................................,
portador da Cédula de identidade, RG .................................... , e inscrito no
CPF/MF.................................... nascido(a) em ___ /____/___ , abaixo assinado(a), concordo de
livre e espontânea vontade em participar como voluntário(a) do estudo “Caracterização da resposta
humoral ao Toxoplasma gondii, sua resistência à sulfadiazina e associação à forma clínica da
doença”. Declaro que obtive todas as informações necessárias, bem como necessárias, bem como
todos os eventuais esclarecimentos quanto às dúvidas por mim apresentadas.

O principal objetivo deste estudo é estudar a imunidade (defesas do organismo) contra o parasita
Toxoplasma gondii, que está presente em diversas carnes e que pode ser o causador da doença
ocular. Você está sendo convidado a participar deste estudo, pois apresenta problemas no olho
devido ao Toxoplasma. Visamos estabelecer a relação entre a produção de anticorpos (proteínas de
defesa do organismo) e as várias formas clínicas da toxoplasmose, além de procurarmos definir as
características do parasita que fazem com que haja falha no tratamento com a sulfadiazina,
permitindo assim um melhor entendimento para o tratamento ideal da doença.

Estou ciente que:


IX) O estudo se faz necessário para que se possam descobrir as possíveis causas da doença
denominada “toxoplasmose ocular”;
X) Serão realizados:
c) exame oftalmológico completo que consistirá de um exame externo do olho, medida da
pressão intra-ocular e exame de fundo de olho. Este exame faz parte da rotina numa
consulta oftalmológica.
d) exame de sangue consistirá de não mais de 450 ml de sangue a serem extraídos em
um período de vários meses, sendo que cada amostra será de não mais de 50 ml. Os
riscos da retirada de sangue são hematoma local (rouxidão), algum desconforto e,
raramente, tontura.
e) APENAS para indivíduos com problemas no olho, mas não devido ao Toxoplasma:
análise do líquido que está contido no olho (humor vítreo), que normalmente seria
desprezado durante a cirurgia (se esta for necessária) para correção de complicações
da doença ocular, como descolamento de retina, glaucoma, catarata.
XI) Essa(s) coleta(s) será(ao) feita(s) apenas para este estudo e, para os indivíduos com
problemas no olho, mas não devido ao Toxoplasma, em nada influenciará (influenciarão) o
meu tratamento; não vai (vão) me curar; não vai (vão) me causar nenhum problema,
exceto o pequeno incômodo de dor no momento da coleta (introdução da agulha para
retirada do sangue). Os riscos na coleta de humor vítreo (líquido contido no olho) são os
próprios da própria cirurgia. Todos os procedimentos para a coleta deste material estão
normalmente incluídos nas etapas da cirurgia. A diferença é que o material será coletado

129
Anexos

em recipiente próprio para a sua análise. Assim, não há riscos introduzidos pela coleta do
material.
XII) A participação neste projeto não tem objetivo de me submeter a um tratamento, bem
como não me acarretará qualquer ônus pecuniário com relação aos procedimentos médico-
clínico-terapêuticos efetuados com o estudo ;
XIII) Tenho a liberdade de desistir ou de interromper a colaboração neste estudo no momento
em que desejar, sem necessidade de qualquer explicação;
XIV) A desistência não causará nenhum prejuízo à minha saúde ou bem estar físico. Não virá
interferir no atendimento ou tratamento médicos;
XV) Os resultados obtidos durante este ensaio serão mantidos em sigilo, mas concordo que
sejam divulgados em publicações científicas, desde que meus dados pessoais não sejam
mencionados;
XVI) Caso eu desejar, poderei pessoalmente tomar conhecimento dos resultados, ao final desta
pesquisa:

( ) Desejo conhecer os resultados desta pesquisa.


( ) Não desejo conhecer os resultados desta pesquisa.

Estes estudos podem melhorar o entendimento da doença levando a formas mais eficazes
de diagnóstico e tratamento no futuro. É provável que o voluntário em questão não seja
beneficiário direto destes avanços.
A adoção de alguns cuidados específicos para prevenção da toxoplasmose é vantajosa para
você. Estes cuidados consistem em: ingestão de carnes cozidas ou bem passadas, leite
pasteurizado e fervido, água filtrada e tratada, lavagem de verduras e frutas, bem como evitar a
criação de gatos, o hospedeiro definitivo da toxoplasmose.

Quaisquer dúvidas, que possam ocorrer com relação a esse estudo, poderão ser
contatados:
Dr. Cláudio Silveira na Clínica Silveira, Av. Sete de setembro, 1502 Erechim – RS, telefone (54)
321-1900. Dr. Luiz Vicente Rizzo na Universidade de São Paulo, Laboratório de Imunologia Clínica,
Av. Prof. Lineu Prestes 1730, São Paulo –SP 05508-900, telefone (11) 3091 7394.

São Paulo, de de 200 .

( ) Paciente ...................................................................................................

Testemunha 1 : ______________________________________________________
Nome / RG / Telefone
Testemunha 2 : ________________________________________________
Nome / RG / Telefone
Responsável pelo Projeto: ______________________________________________
Lília Rios tsukuda

130
ANEXO B

Quadro II - Resumo dos dados coletados e obtidos na população estudada oredenados por grupo clínico
Nº Sexo Idade Data Grupo Evolução Isótipos IgG subclasses Peptídeos Sorotipo
(anos) Coleta Clínico Clínica IgG IgM IgA IgE 1 2 3 4 I.A. 6I/III d6I/III 6II d6II 7II
257 M 5 jan-99 IgM sem TO SP sem TO 1,43 1,0 0 0 1,4 0,5 1,5 1,0 14,3 1,5 1,0 1,4 1,3 I/III
11 F 25 ago-02 IgM sem TO 1,17 1,00 0,47 0,62 1,5 1,0 0,9 0,4 Forte 1,4 1,2 1,0 1,0 1,0 Atp. D
15 F 27 ago-02 IgM sem TO SP sem TO 2,00 1,00 0,55 0,32 1,5 0,6 0,7 0,3 1,2 1,1 1,1 1,1 1,0 Atp. D
132 M 10 abr-03 IgM sem TO SP sem TO 1,13 1,00 0,69 0,00 1,8 0,6 1,7 0,3 2,8 1,1 1,1 1,1 1,0 I/III
156 F 12 set-03 IgM sem TO 0,20 1,00 0,70 0,44 0,3 0,6 0,6 0,3 0,9 1,0 1,0 1,1 1,0 Atp. D
305 F 13 mar-05 IgM sem TO 1,65 1,0 0,00 1,2 0,4 0,6 0,5 1,4 1,2 1,0 1,2 1,2 Atp. D
310 M 17 mar-05 IgM sem TO 1,81 1 0,00 1,1 0,8 1,3 0,4 4,1 0,9 1,2 1,2 2,3 Atp. A
312 M 44 abr-05 IgM sem TO TO branda 1,05 1,00 0,00 0 1,1 1,0 1,5 1,1 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

313 F 23 mai-05 IgM sem TO SP sem TO 1,75 1,00 0,00 1,2 0,7 1,3 0,2 2,8 1,0 1,1 1,1 1,3 I/III
324 F 14 abr-05 IgM sem TO 1,70 1,00 0,00 0,7 0,4 1,3 0,2 1,5 1,0 1,0 1,0 1,1 I/III
331 F 31 20/0405 IgM sem TO SP sem TO 1,81 1,00 0,00 1,1 1,6 0,7 0,6 2,0 1,0 0,9 1,0 1,1 I/III
334 F 58 mai-05 IgM sem TO SP sem TO 1,92 1,00 0,00 1,2 1,5 1,3 1,4 4,6 1,1 1,5 1,0 1,1 I/III
336 F 11 out-04 IgM sem TO SP sem TO 1,82 1,00 0,00 1,1 0,5 1,6 0,8 8,8 0,9 1,0 0,9 1,3 I/III
338 F 41 fev-05 IgM sem TO SP sem TO 1,66 1,00 0,00 1,0 0,7 0,4 0,2 2,0 1,1 1,0 1,0 1,0 I/III
348 F 27 abr-05 IgM sem TO TO grave 1,87 1,00 0,00 0,9 0,8 0,5 0,3 1,2 1,0 1,0 1,0 0,9 Atp. D
349 F 38 abr-05 IgM sem TO SP sem TO 1,88 1,00 0,00 1,0 0,5 1,1 0,4 1,1 1,0 0,9 1,1 1,5 Atp. D
69 M 15 fev-03 IgM sem TO SP sem TO 1,06 1,01 0,29 0,00 1,6 1,2 1,3 0,3 Forte 3,4 1,2 1,1 1,2 1,6 Atp. A
114 F 25 dez-02 IgM sem TO SP sem TO 2,00 1,03 0,69 0,49 1,5 1,5 1,6 0,3 Forte 3,5 1,0 1,8 1,1 1,0 Atp. C
204 F 16 mar-04 IgM sem TO SP sem TO 2,15 1,05 0,36 0,52 0,8 0,6 1,1 0,3 FRACA 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

188 F 39 nov-03 IgM sem TO SP sem TO 1,90 1,10 0,80 0,22 1,2 0,8 0,5 0,5 Forte 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

154 M 43 set-03 IgM sem TO SP sem TO 1,05 1,11 1,09 1,2 0,6 0,5 0,3 11,9 1,2 2,2 1,6 3,0 Atp. B
219 M 24 jun-04 IgM sem TO SP sem TO 0,87 1,24 2,14 0,43 1,4 1,3 1,2 0,7 FRACA 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

178 F 37 jun-05 IgM sem TO TO branda 2,14 1,28 0,33 1,1 0,8 1,3 0,2 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

30 F 21 fev-03 IgM sem TO SP sem TO 1,77 1,31 0,48 0,27 1,6 0,9 1,1 0,3 Forte 1,1 1,2 6,0 2,3 1,4 II
208 M 11 mar-04 IgM sem TO SP sem TO 3,00 1,44 0,33 0,81 1,4 1,0 0,5 0,4 Forte 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

72 F 32 mar-03 IgM sem TO SP sem TO 2,94 1,48 0,69 1,6 1,1 0,5 0,7 Forte 2,3 1,1 1,0 1,1 1,0 I/III
125 F 57 mar-03 IgM sem TO SP sem TO 0,89 1,52 0,52 0,84 1,6 1,6 0,9 1,1 Forte 2,0 1,5 1,8 2,0 1,0 Atp. C
68 M 32 fev-03 IgM sem TO SP sem TO 1,13 1,78 2,55 0,44 1,6 1,3 1,4 0,3 Forte 3,1 0,9 1,0 1,1 1,8 Atp. A
6 M 16 jul-02 IgM sem TO SP sem TO 1,09 1,92 1,08 0,85 1,9 0,8 1,6 0,6 Forte 1,5 1,2 4,4 1,2 1,5 II
74 M 38 nov-02 IgM sem TO TO grave 1,56 1,95 0,84 0,83 1,5 0,7 1,2 0,3 FRACA 1,0 1,0 1,0 1,2 1,2 Atp. D
150 M 17 ago-03 IgM sem TO TO branda 0,90 1,95 1,13 0,68 0,5 0,5 0,5 0,3 FRACA 1,4 1,2 1,0 1,3 0,9 Atp. D
197 M 19 fev-04 IgM sem TO SP sem TO 1,43 2,07 0,71 0,79 0,7 0,5 0,6 0,5 FRACA 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

221 M 29 jun-04 IgM sem TO SP sem TO 0,93 2,24 4,19 1,04 0,7 0,6 0,5 0,5 FRACA 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

181 F 26 out-03 IgM sem TO 1,19 2,27 0,36 0,37 1,3 1,1 1,0 0,2 Forte 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

120 M 34 abr-03 IgM sem TO TO branda 0,85 2,30 1,39 0,45 0,7 0,9 1,0 0,4 FRACA 1,5 1,2 3,8 1,2 1,0 II
299 M 34 mar-05 IgM sem TO SP sem TO 1,64 2,5 0,00 0,00 1,4 0,8 1,1 0,8 Forte 5,1 1,1 1,2 1,1 1,0 I/III
164 F 24 set-03 IgM sem TO SP sem TO 2,00 2,57 1,67 0,28 1,3 0,4 1,7 0,2 4,0 1,0 1,1 1,2 1,0 I/III
8 M 18 jun-05 IgM sem TO SP sem TO 2,00 2,73 0,43 0,58 1,7 1,1 1,0 0,3 Forte 10,0 1,1 1,0 1,2 1,0 I/III
258 F 10 jan-99 IgM sem TO TO branda 1,88 3,1 0 0 1,4 1,0 1,8 1,3 Forte 15,7 4,9 4,2 1,5 2,1 Atp. B
14 F 25 ago-02 IgM sem TO TO branda 2,00 3,30 0,43 0,37 1,6 0,9 0,7 0,3 Forte 16,9 2,1 2,1 1,4 1,7 Atp. B
259 F 38 jan-99 IgM sem TO SP sem TO 1,76 3,8 0 1,3 1,2 1,2 0,5 Forte 9,7 2,5 1,4 1,5 1,2 I/III
141 M 14 jul-03 IgM sem TO SP sem TO 2,15 3,98 4,12 0,56 1,4 1,0 1,3 0,7 FRACA 2,1 1,2 1,4 1,0 1,2 I/III
2 M 35 abr-02 IgM sem TO TO branda 0,99 4,07 0,50 1,41 1,2 0,7 1,0 0,7 FRACA 6,8 5,2 4,2 3,7 0,9 Atp. C
128 F 41 mar-03 IgM sem TO TO branda 1,02 4,09 1,29 0,57 1,4 1,2 1,1 0,4 Forte 2,1 2,0 1,4 1,2 1,3 I/III
146 M 35 ago-03 IgM sem TO SP sem TO 0,73 4,12 1,22 0,56 1,2 1,1 0,5 0,5 FRACA 1,9 1,0 1,0 1,0 1,6 Atp. A
18 M 16 set-02 IgM sem TO SP sem TO 1,71 4,49 1,82 0,95 1,3 0,8 1,7 0,6 FRACA 7,3 1,0 1,1 1,1 1,3 I/III
300 F 27 mar-05 IgM sem TO SP sem TO 1,75 4,8 0,00 1,2 0,8 1,7 1,3 Forte 9,2 1,3 1,5 1,4 1,3 I/III
285 F 50 mai-04 IgM sem TO SP sem TO 1,65 4,8 0,00 0,00 1,3 1,2 1,8 0,6 Forte 7,6 1,2 1,1 1,3 4,0 Atp. A
26 M 15 out-02 IgM sem TO TO grave 0,84 5,30 1,00 0,74 1,2 0,4 0,6 0,6 FRACA 0,9 1,1 1,1 1,1 1,0 Atp. D
283 M 44 mar-04 IgM sem TO TO grave 0,42 5,4 0,00 0,00 0,3 1,0 0,8 1,1 FRACA 1,1 1,1 1,0 1,1 1,0 Atp. D
143 M 7 jul-03 IgM sem TO SP sem TO 1,52 6,11 1,56 0,72 0,7 0,7 1,2 0,5 FRACA 1,3 1,1 4,1 1,6 1,4 II
9 M 29 abr-02 IgM sem TO SP sem TO 1,61 6,14 0,81 1,15 1,1 0,9 1,6 0,2 FRACA 2,4 1,0 1,1 1,0 1,0 I/III
67 M 26 fev-03 IgM sem TO SP sem TO 1,74 6,44 3,11 0,75 1,4 1,3 1,4 0,8 FRACA 2,8 0,9 1,4 1,0 1,3 I/III
191 M 12 fev-04 IgM sem TO SP sem TO 1,7 6,50 3,64 0,84 0,6 0,4 1,2 0,5 FRACA 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

87 F 50 jul-03 IgM sem TO TO branda 0,91 9,06 2,99 1,68 0,3 0,4 0,8 0,5 FRACA 2,5 1,3 1,2 1,0 0,9 I/III
ANEXO B

168 F 35 set-03 IgM sem TO SP sem TO 0,86 11,00 3,12 0,46 0,4 0,5 1,0 0,8 3,4 1,3 2,4 1,5 1,2 Atp. C
240 F 59 jan-05 SP sem TO 1,86 0,76 0,00 1,4 1,4 0,6 0,7 3,5 1,3 1,7 1,1 3,5 Atp. B
315 M 8 mai-05 SP sem TO 1,81 0,76 0,00 0 1,1 0,5 0,6 0,2 5,6 1,1 0,9 1,2 1,3 I/III
351 M 44 abr-05 SP sem TO 1,77 0,76 0,00 0 1,2 0,8 0,6 0,4 1,0 1,0 1,0 1,5 1,0 Atp. D
355 F 19 jun-05 SP sem TO 1,62 0,76 0,00 1,0 0,5 0,3 0,3 0,9 1,3 1,0 1,0 0,9 Atp. D
360 F 47 jun-05 SP sem TO 1,79 0,76 0,00 1,4 1,1 1,5 1,6 2,5 1,0 1,1 1,1 1,8 Atp. A
368 F 30 jun-05 SP sem TO 1,78 0,76 0,00 1,4 0,7 0,7 0,3 1,2 1,1 1,4 1,2 1,7 II
372 F 30 jun-05 SP sem TO 1,81 0,76 0,00 1,4 0,7 0,5 0,4 5,3 1,2 1,3 1,6 1,1 I/III
374 M 11 jun-05 SP sem TO 1,89 0,76 0,00 0 1,5 0,9 0,6 0,4 7,4 1,6 5,5 1,5 1,1 Atp. C
376 F 24 jun-05 SP sem TO 1,65 0,76 0,00 1,3 0,6 0,9 0,5 1,0 0,9 0,9 0,9 1,1 Atp. D
384 F 24 jun-05 SP sem TO 1,61 0,76 0,00 1,2 1,0 0,6 0,3 1,2 1,1 1,1 1,3 1,3 Atp. D
290 F 12 jan-05 SP sem TO 1,71 0,2 0 1,2 0,4 1,3 0,9 4,5 1,1 1,3 1,5 1,3 I/III
287 F 17 fev-05 SP sem TO 0,89 0,2 0 0,5 0,9 1,2 1,1 Forte 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 Atp. D
298 F 25 mar-05 SP sem TO 1,65 0,2 0,00 0,8 0,4 1,0 1,2 1,8 1,2 1,1 1,0 1,1 I/III
281 F 30 jul-03 SP sem TO 1,56 0,2 0,00 0,6 0,5 1,5 0,5 1,5 1,0 1,1 1,2 1,0 I/III
303 F 60 mar-05 SP sem TO 0,61 0,2 0,00 0,9 0,3 1,2 0,4 Forte 1,1 1,1 1,0 1,3 1,0 Atp. D
292 F 30 fev-05 SP sem TO 0,76 0,2 0 0,7 0,4 0,5 0,8 1,4 1,2 1,1 1,5 1,1 Atp. D
295 F 42 fev-05 SP sem TO 1,79 0,2 0 1,3 1,1 1,4 0,6 1,1 1,1 1,1 1,4 2,4 II
262 F 34 jan-99 SP sem TO 1,41 0,3 0 1,2 1,3 1,5 0,7 forte 4,6 1,1 8,1 8,3 0,9 Atp. C
291 F 22 fev-05 SP sem TO 1,48 0,3 0 0,9 0,6 1,1 1,7 forte 1,2 1,0 2,0 1,1 1,0 II
79 F 25 abr-03 SP sem TO 0,90 0,35 0,60 0,62 0,6 0,2 1,1 0,3 Forte 1,0 1,1 1,6 2,5 1,0 II
255 F 25 dez-98 SP sem TO 1,17 0,4 0 0,9 0,9 1,6 0,6 forte 1,3 1,0 1,0 1,4 1,2 Atp. D
175 F 42 nov-04 SP sem TO 1,33 0,37 0,45 0,54 1,5 0,5 1,2 0,2 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

288 F 39 fev-05 SP sem TO 1,66 0,4 0,45 0,54 1,1 0,5 0,9 0,4 forte 1,0 1,0 1,0 1,1 1,3 Atp. D
260 F 66 jan-99 SP sem TO 1,38 0,4 0 0,9 0,8 1,2 1,9 forte 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

167 F 27 set-03 SP sem TO SP sem TO 1,06 0,43 0,27 0,32 1,2 0,9 0,5 0,6 FORTE 1,9 0,9 2,3 1,3 2,6 Atipico B
293 M 10 fev-05 SP sem TO 1,79 0,5 0,27 0,32 1,3 0,7 1,2 1,8 FORTE 1,3 1,1 1,0 1,3 1,0 Atp. D
266 F mar-99 SP sem TO 1,57 0,5 0 1,2 0,5 1,3 0,9 Forte 3,4 1,1 1,0 1,3 1,1 I/III
119 F 18 abr-03 SP sem TO 0,92 0,50 0,62 1,1 0,6 0,7 0,6 1,0 1,2 1,0 1,1 1,0 Atp. D
133 M 17 abr-03 SP sem TO 1,03 0,50 0,56 0,00 0,9 0,4 0,6 0,4 1,5 1,6 1,3 1,2 1,1 I/III
263 F 30 fev-99 SP sem TO 1,18 0,5 0 0,8 0,8 0,4 0,6 Forte 1,2 1,2 0,9 1,1 0,9 Atp. D
73 F 34 fev-03 SP sem TO 1,13 0,54 0,61 1,2 1,1 0,8 0,5 1,5 1,2 1,6 2,0 4,2 II
210 M 12 mar-04 SP sem TO 0,95 0,54 0,60 0,06 1,2 0,5 0,6 0,6 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

180 F 41 nov-04 SP sem TO 1,88 0,55 0,83 0,56 1,9 1,1 1,7 0,2 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

215 F 31 mar-04 SP sem TO 0,85 0,55 0,30 0,06 0,5 0,4 0,4 0,4 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

65 M 20 mar-03 SP sem TO 1,59 0,59 0,60 0,00 1,3 0,2 0,9 0,4 2,2 1,2 1,1 1,3 1,1 I/III
3 F 48 abr-02 SP sem TO 0,94 0,60 0,22 0,63 1,1 0,8 0,5 0,6 1,4 1,0 1,0 1,1 0,8 Atp. D
58 M 25 fev-03 SP sem TO 0,97 0,60 0,92 0,54 1,2 0,7 0,6 0,6 1,2 1,1 1,2 1,1 1,7 II
296 F 19 fev-05 SP sem TO 1,72 0,6 0,00 1,1 0,6 1,6 0,4 1,3 1,2 1,1 1,3 1,0 Atp. D
77 F 48 dez-02 SP sem TO 1,00 0,63 0,40 0,4 0,4 0,5 0,6 1,1 1,1 1,1 1,1 0,9 Atp. D
199 F 32 fev-04 SP sem TO 1,676 0,63 0,60 0,70 0,6 0,5 0,5 0,4 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

34 F 13 out-02 SP sem TO 2,15 0,70 0,36 0,26 1,3 1,2 0,6 0,3 1,3 1,1 1,1 1,1 1,1 Atp. D
200 F 32 fev-04 SP sem TO 1,815 0,71 0,68 0,53 0,9 0,4 0,6 0,5 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

177 F 30 out-03 SP sem TO 1,12 0,74 0,31 0,05 1,1 0,4 0,5 1,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

301 F 37 mar-05 SP sem TO 1,73 0,8 0,00 1,2 0,7 1,4 0,7 1,0 1,1 2,7 2,8 1,3 II
151 M 5 ago-03 SP sem TO 0,20 0,77 0,65 0,93 0,2 0,3 0,4 0,4 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

60 M 42 fev-03 SP sem TO 1,02 0,77 0,36 0,33 1,2 0,5 0,6 0,6 1,0 1,1 1,0 1,2 1,0 Atp. D
25 F 30 out-02 SP sem TO SP sem TO 1,04 0,78 0,77 0,45 1,1 0,6 0,6 0,9 2,4 1,0 1,0 1,2 0,9 I/III
152 M 21 ago-03 SP sem TO 0,99 0,79 0,76 0,30 0,7 0,6 0,8 1,0 0,8 0,9 0,9 0,8 1,0 Atp. D
129 M 7 mai-03 SP sem TO SP sem TO 1,07 0,84 0,62 0,00 1,3 0,5 0,6 0,9 10,9 1,2 7,3 1,1 2,1 Atp. B
286 F 46 fev-05 SP sem TO 0,76 0,9 0,00 1,0 0,8 1,5 0,6 1,3 1,1 1,0 1,2 1,0 Atp. D
159 M 10 set-03 IgM com TO TO branda 3,00 1,00 0,76 0,50 1,1 0,3 0,5 0,8 1,1 1,0 1,1 1,0 1,1 Atp. D
236 M 44 dez-04 IgM com TO TO grave 1,55 1 0,00 0,00 0,6 0,8 0,5 0,6 1,1 0,9 0,9 1,0 1,0 Atp. D
250 M 11 mar-05 IgM com TO TO branda 1,86 1 0,00 0,00 1,3 1,0 1,2 0,2 5,8 1,9 1,2 0,8 3,1 Atp. A
311 M 45 mar-05 IgM com TO TO grave 1,70 1 0,00 0,00 0,7 0,6 1,3 0,9 1,3 0,9 1,0 1,1 0,9 Atp. D
314 M 16 mai-05 IgM com TO TO branda 1,77 1,00 0,00 0 1,2 0,9 1,1 0,2 1,4 1,0 5,6 2,7 3,5 II
317 F 37 abr-05 IgM com TO 1,57 1,00 0,00 0 0,7 0,5 0,6 0,2 1,1 0,9 1,0 1,2 1,3 Atp. D
377 F 21 jun-05 IgM com TO 1,70 1,00 0,00 0 1,2 0,8 0,8 0,3 9,5 1,0 8,9 1,1 1,1 Atp. C
ANEXO B

378 F 48 jun-05 IgM com TO TO branda 1,71 1,10 0,00 0 0,8 0,7 0,7 0,2 FRACA 3,4 1,9 1,3 1,6 0,8 I/III
5 M 36 jul-02 IgM com TO TO grave 0,94 1,20 2,61 0,73 1,0 0,5 0,6 0,3 Forte 1,3 1,1 2,0 1,3 1,4 II
38 F 46 fev-03 IgM com TO TO branda 2,00 1,27 0,45 0,32 1,7 1,9 1,1 0,4 Forte 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 Atp. D
176 M 54 out-03 IgM com TO TO grave 0,93 1,34 1,66 0,00 1,8 0,5 1,9 0,3 Forte 0,0 0,0 0,0 0,0 0

162 F 33 set-03 IgM com TO TO grave 1,62 1,70 0,75 0,36 0,8 0,7 0,8 0,2 1,2 0,9 1,0 1,2 1,0 Atp. D
20 F 31 set-02 IgM com TO TO grave 2,00 2,09 0,46 0,47 1,6 1,7 0,9 1,0 Forte 9,3 1,0 3,0 1,0 0,8 Atp. C
134 F 31 abr-03 IgM com TO TO grave 0,86 2,10 0,35 0,47 1,7 1,0 1,2 0,3 Forte 1,2 1,0 1,1 1,1 0,9 Atp. D
130 M 35 mai-03 IgM com TO TO branda 1,00 2,12 1,20 0,49 0,9 0,5 1,0 0,6 Forte 11,8 1,3 1,1 1,0 1,3 I/III
17 F 43 set-02 IgM com TO TO branda 1,56 3,48 1,31 0,63 1,1 1,2 0,8 0,3 FRACA 0,9 1,0 1,9 1,1 1,0 II
112 M 48 out-02 IgM com TO TO branda 1,07 4,59 4,76 0,75 1,1 0,5 0,9 0,5 FRACA 2,2 1,1 1,0 1,1 1,0 I/III
270 F 51 ago-01 IgM com TO TO grave 1,23 5,2 0,00 0,00 1,0 1,0 1,7 0,4 FRACA 2,0 1,0 1,2 1,1 1,7 Atp. A
277 F 14 out-02 IgM com TO TO grave 1,57 5,3 0 0 1,2 0,3 1,7 0,3 FRACA 3,7 1,6 1,7 1,2 1,5 Atp. B
306 M 52 mar-05 IgM com TO TO grave 1,46 5,6 0 0 1,1 0,5 1,7 1,1 FRACA 0,8 0,9 1,2 1,7 2,1 II
243 M 33 jan-05 TO branda 1,82 0,9 0,00 0,00 1,3 0,7 0,5 1,1 2,0 1,2 1,2 1,1 1,3 I/III
251 M 31 abr-97 TO branda 1,70 0,9 0,00 0,00 1,1 0,6 0,8 0,2 1,9 1,0 1,4 1,0 0,9 I/III
319 F 28 mai-05 TO branda 1,28 0,9 0,00 0,6 0,5 0,4 0,2 1,1 1,1 1,7 1,1 1,0 II
340 M 26 mai-05 TO branda 1,77 0,9 0,00 0 0,8 0,4 0,7 0,2 1,0 1,0 0,9 1,3 0,9 Atp. D
344 M 17 mai-05 TO branda 1,41 0,9 0,00 0 0,6 0,4 0,7 0,2 1,1 1,0 1,0 1,2 1,2 Atp. D
347 M 24 mai-05 TO branda 1,75 0,9 0,00 0 1,1 0,9 1,3 0,3 1,1 1,1 1,1 1,2 1,0 Atp. D
362 M 37 jun-05 TO branda 1,68 0,9 0,00 0 1,2 1,0 0,7 0,4 1,4 1,1 1,1 1,1 1,1 Atp. D
363 M 28 jun-05 TO branda 1,43 0,9 0,00 0 0,9 0,5 1,2 0,3 1,0 1,0 1,0 1,2 1,0 Atp. D
364 M 18 jun-05 TO branda 1,91 0,9 0,00 0 1,5 1,4 1,3 0,3 1,6 1,0 3,1 1,2 1,0 II
370 M 27 jun-05 TO branda 1,83 0,9 0,00 0 1,5 0,5 1,2 0,3 1,4 0,9 0,9 1,3 2,2 II
382 M 42 jun-05 TO branda 1,26 0,9 0,00 0 0,9 1,3 0,3 0,6 1,2 1,0 1,2 1,0 0,9 Atp. D
88 F 17 jul-03 TO branda 1,94 0,12 0,44 1,6 0,7 0,5 0,3 2,1 1,1 1,3 1,2 1,1 I/III
148 F 29 ago-03 TO branda 2,30 0,44 0,31 0,22 1,5 1,4 0,7 0,3 1,6 1,1 1,0 1,4 1,0 I/III
75 M 38 fev-03 TO branda 2,88 0,47 0,40 0,00 1,5 1,3 1,4 0,3 2,2 1,2 1,4 1,2 1,1 I/III
158 M 29 set-03 TO branda 1,78 0,47 0,70 0,57 1,1 0,6 0,5 0,6 1,0 0,8 1,1 0,7 1,0 Atp. D
230 F 45 nov-04 TO branda 1,77 0,47 0,50 1,5 0,4 0,5 0,4 1,7 0,9 1,6 1,8 0,9 Atp. C
85 F 44 out-02 TO branda 0,91 0,50 0,34 1,1 0,9 1,5 0,2 1,0 1,1 1,0 1,0 1,7 II
45 F 34 fev-03 TO branda 1,62 0,57 0,61 0,32 1,8 0,5 0,8 0,2 1,7 1,4 1,1 1,4 1,5 Atp. A
59 M 20 fev-03 TO branda 1,04 0,57 0,63 0,41 1,3 0,6 0,6 0,6 0,9 1,2 0,9 1,1 0,9 Atp. D
183 F 41 out-05 TO branda 1,13 0,58 0,45 0,61 1,3 0,9 1,3 0,4 0,0 0,0 0,0 0,0 0

50 M 17 fev-03 TO branda 1,07 0,62 0,68 0,38 1,4 1,0 0,7 0,8 1,6 0,9 0,9 1,0 1,0 I/III
224 F 29 jul-04 TO branda 0,66 0,62 0,50 0,5 0,4 0,6 0,5 0,9 0,9 0,9 1,1 1,0 Atp. D
116 M 55 out-02 TO branda TO branda 1,17 0,65 0,61 0,25 1,4 1,0 0,7 0,4 1,0 0,9 0,9 0,9 1,5 II
173 F 15 out-03 TO branda 1,03 0,69 0,26 0,06 0,9 0,6 0,4 0,5 0,0 0,0 0,0 0,0 0

24 F 32 out-02 TO branda TO grave 0,95 0,71 0,60 0,91 0,9 0,7 0,4 0,5 1,0 1,0 1,0 1,1 1,1 Atp. D
179 M 29 out-03 TO branda 1,06 0,73 0,26 0,06 0,9 0,6 0,5 0,4 0,0 0,0 0,0 0,0 0

163 M 26 set-03 TO branda 0,97 0,76 0,27 0,28 1,1 0,7 0,6 0,7 Forte 1,2 1,3 1,1 1,2 1,0 Atp. D
142 M 33 jul-03 TO grave TO grave 1,60 0,76 0,43 0,00 0,5 0,4 1,2 0,2 1,9 1,2 1,0 1,4 1,1 I/III
237 M 33 jan-05 TO grave 1,78 0,76 0,00 0,00 1,2 0,4 0,5 1,2 1,3 1,0 1,0 1,0 1,3 Atp. D
238 M 21 mai-03 TO grave TO grave 1,76 0,76 0,00 0,00 1,3 0,7 0,9 0,5 1,3 1,0 1,0 1,4 1,3 Atp. D
241 F 39 jan-05 TO grave TO grave 1,84 0,76 0,00 0,00 1,4 0,5 0,2 0,7 6,4 1,5 2,3 1,4 1,1 Atp. C
244 F 42 ago-05 TO grave 1,73 0,76 0,00 0,00 0,7 0,5 0,8 0,8 1,2 1,0 2,7 1,2 1,1 II
246 M 29 ago-03 TO grave 1,64 0,76 0,00 0,00 0,8 1,4 0,7 0,2 1,2 1,0 1,0 1,4 1,0 Atp. D
247 F 31 mar-05 TO grave 1,54 0,76 0,00 0,00 0,7 0,5 0,6 0,2 5,6 1,0 1,1 1,4 1,1 I/III
248 F 12 mar-03 TO grave 1,75 0,76 0,00 0,00 1,0 0,7 0,8 0,5 1,0 1,0 1,2 1,5 1,0 Atp. D
249 M 21 mar-05 TO grave 1,74 0,76 0,00 0,00 1,1 0,6 0,7 0,5 1,1 1,0 1,2 1,3 1,1 Atp. D
252 M 36 mar-05 TO grave 1,73 0,76 0,00 0,00 1,2 0,5 0,6 0,2 2,4 0,9 1,9 1,2 1,0 Atp. C
316 M 18 mai-05 TO grave 1,60 0,76 0,00 0 0,8 0,3 0,5 0,2 Forte 1,3 1,0 1,0 1,3 1,1 Atp. D
318 M 15 mai-05 TO grave 1,54 0,76 0,00 0 1,0 0,9 0,9 0,5 4,5 0,9 2,3 1,2 0,9 Atp. C
320 M 16 abr-05 TO grave 1,77 0,76 0,00 0 1,0 0,3 0,4 0,2 1,4 1,1 1,0 1,3 1,9 II
321 M 18 mai-05 TO grave 1,60 0,76 0,00 0 1,0 1,0 1,1 0,7 1,1 1,1 1,0 1,2 1,0 Atp. D
322 M 17 abr-05 TO grave 1,49 0,76 0,00 0 0,6 0,5 0,5 0,4 1,0 1,0 1,0 1,1 1,0 Atp. D
323 M 17 abr-05 TO grave 1,77 0,76 0,00 0 1,1 0,4 0,5 0,2 1,3 1,0 3,3 3,7 0,9 II
325 F 12 mai-05 TO grave 1,83 0,76 0,00 0 1,1 0,5 0,4 0,3 1,2 1,0 1,0 1,3 0,9 Atp. D
326 F 28 mai-05 TO grave 1,83 0,76 0,00 0 1,1 0,6 0,8 0,5 6,4 4,8 2,9 1,2 1,0 Atp. C
ANEXO B

327 M 50 mai-05 TO grave 1,77 0,76 0,00 0 1,0 1,2 0,4 0,2 2,2 2,2 1,9 1,0 1,2 Atp. C
328 F 18 mar-04 TO grave 1,79 0,76 0 1,1 0,6 0,8 1,8 1,2 1,0 1,5 1,4 1,3 Atp. D
329 M 56 abr-05 TO grave 1,62 0,76 0,00 0 1,0 0,8 0,6 0,2 1,5 1,5 1,7 1,7 1,3 II
330 M 38 mai-05 TO grave 1,42 0,76 0,00 0 1,0 0,6 0,4 0,2 1,3 1,1 1,1 1,5 1,0 Atp. D
332 M 25 mai-05 TO grave 1,73 0,76 0,00 0 1,0 0,9 0,4 0,3 2,2 1,0 0,9 1,4 1,3 I/III
337 M 34 jun-03 TO grave 1,53 0,76 0,00 0 0,9 0,6 0,5 0,2 9,8 1,1 3,9 1,2 1,0 Atp. C
339 F 22 abr-05 TO grave 1,44 0,76 0,00 0 0,5 0,3 0,4 0,2 1,2 1,1 1,0 1,4 1,1 Atp. D
341 F 12 mai-05 TO grave 1,75 0,76 0,00 0 0,8 0,3 0,6 0,4 7,6 2,5 2,6 1,3 0,9 Atp. C
345 F 29 mar-05 TO grave 1,49 0,76 0,00 0 0,5 0,6 0,9 0,3 0,9 1,0 1,0 1,3 1,0 Atp. D
346 F 20 mai-05 TO grave 1,80 0,76 0,00 0 1,4 0,6 0,5 0,4 1,1 1,0 1,0 1,2 0,9 Atp. D
350 M 40 abr-05 TO grave 1,70 0,76 0,00 0 0,7 0,5 0,5 0,4 1,1 1,0 1,0 1,3 0,9 Atp. D
352 F 44 mai-05 TO grave 1,85 0,76 0,00 0 1,7 1,0 0,5 0,4 1,3 1,1 1,0 1,3 0,9 Atp. D
353 M 17 jun-05 TO grave 1,82 0,76 0,00 0 1,6 0,8 0,6 0,4 1,5 1,1 1,3 1,0 2,1 II
356 F 9 jun-05 TO grave 1,77 0,76 0,00 0 1,2 1,2 1,1 0,3 7,7 1,0 1,3 1,0 1,3 I/III
357 F 58 jun-05 TO grave 1,91 0,76 0,00 0 1,6 0,9 0,9 0,3 9,8 1,1 1,0 1,4 1,0 I/III
359 M 39 jun-05 TO grave 1,67 0,76 0,00 0 1,2 0,7 1,0 0,3 9,5 1,0 7,0 1,3 0,9 Atp. C
361 M 48 jun-05 TO grave 1,66 0,76 0,00 0 1,3 1,2 0,9 0,4 2,9 2,7 2,2 3,0 1,2 Atp. C
365 F 26 jun-05 TO grave 1,86 0,76 0,00 0 1,4 0,9 1,0 0,5 1,3 1,1 1,3 1,1 0,9 Atp. D
366 M 27 jun-05 TO grave 1,14 0,76 0,00 0 1,0 0,5 1,3 0,3 1,0 1,0 0,9 1,2 1,0 Atp. D
367 M 17 jun-05 TO grave 1,85 0,76 0,00 0 1,5 1,0 0,7 0,9 2,4 1,0 3,4 1,2 1,3 Atp. C
369 F 45 jun-05 TO grave 1,59 0,76 0,00 0 1,4 0,6 1,2 0,3 1,0 1,0 1,0 1,4 0,9 Atp. D
371 F 53 jun-05 TO grave 1,80 0,76 0,00 0 1,3 1,1 1,1 0,2 1,5 1,3 0,9 1,3 1,0 Atp. D
379 F 4 jun-05 TO grave 1,91 0,76 0,00 0 1,5 0,9 0,6 0,8 1,2 1,1 1,1 1,1 1,1 Atp. D
380 F 23 jun-05 TO grave 1,66 0,76 0,00 0 1,3 1,3 0,6 1,0 9,3 1,0 15,7 1,1 3,0 Atp. B
381 F 40 jun-05 TO grave 1,64 0,76 0,00 0 1,3 1,5 0,5 0,3 1,1 1,1 1,0 1,0 1,0 Atp. D
123 F 50 abr-03 TO grave 0,91 0,76 0,41 0,00 1,5 1,1 1,0 0,4 1,7 1,0 1,3 1,1 1,1 I/III
276 M 31 out-02 TO grave 1,68 0,76 0 0 1,1 0,3 1,2 0,5 1,1 1,1 1,2 1,4 0,9 Atp. D
268 M 15 dez-00 TO grave TO grave 0,89 0,76 0,45 0,32 1,2 0,4 0,5 0,7 1,5 1,0 1,1 1,5 3,3 II
254 M 23 dez-98 TO grave 1,06 0,76 0 0 1,0 0,5 0,7 0,5 Forte 1,3 1,1 1,0 1,2 1,0 Atp. D
282 M 39 mar-04 TO grave 1,75 0,76 0,00 0,00 1,2 0,8 1,5 1,3 1,1 1,1 1,0 1,3 1,2 Atp. D
273 M 23 jul-02 TO grave 1,42 0,76 0 0 1,5 0,4 0,8 1,3 1,4 1,2 1,3 1,4 3,7 II
121 M 16 abr-03 TO grave 2,15 0,76 0,48 0,00 1,5 1,6 0,7 0,3 0,9 1,1 1,0 1,2 1,0 Atp. D
122 M 33 mar-03 TO grave 0,97 0,76 0,47 0,00 1,6 1,2 1,0 0,4 0,9 1,0 0,9 1,0 1,0 Atp. D
269 F 14 mai-01 TO grave 1,28 0,76 0,5 0,5 1,4 0,4 0,4 1,0 forte 1,2 1,1 1,0 1,2 1,1 Atp. D
274 F jul-02 TO grave 1,33 0,76 0,5 0,5 0,9 0,6 0,6 1,2 forte 2,3 1,9 1,5 1,1 1,1 I/III
308 M 36 mar-05 TO grave 1,85 0,76 0,5 0,5 1,4 0,6 0,3 0,9 forte 3,1 1,1 2,1 1,1 1,0 Atp. C
265 F 43 mar-99 TO grave 1,73 0,76 0 0 1,2 0,4 0,4 0,4 forte 1,2 1,3 1,0 1,5 1,1 Atp. D
275 F 27 jul-02 TO grave TO grave 0,92 0,76 0,5 0,5 0,8 0,5 0,7 0,7 forte 3,1 1,0 1,0 1,3 1,0 I/III
279 M 31 mai-03 TO grave TO grave 1,76 0,76 0,5 0,5 1,1 0,3 1,2 0,5 forte 1,2 1,2 1,1 1,5 1,7 II
302 M 14 mar-05 TO grave 1,56 0,76 0,5 0,5 1,1 0,5 0,9 1,0 forte 1,1 0,9 0,9 1,1 1,1 Atp. D
264 F 30 mar-99 TO grave TO grave 1,16 0,76 0 0 1,3 0,9 1,0 0,5 forte 1,3 1,0 0,9 1,4 1,0 Atp. D
43 F 19 fev-03 TO grave 1,07 0,76 0,29 0,27 1,3 1,1 0,7 0,2 forte 3,3 1,2 0,9 1,0 0,9 I/III
64 M 20 mar-03 TO grave 1,00 0,76 0,37 0,75 1,8 0,4 0,9 0,2 1,2 1,3 1,1 1,2 0,9 Atp. D
231 F 16 nov-04 TO grave 1,28 0,76 0,70 0 1,0 0,5 0,6 0,5 0,9 1,5 0,9 1,0 1,1 Atp. D
256 M 14 jan-99 TO grave 1,41 0,76 0 0 1,4 0,6 1,7 1,4 forte 1,2 1,3 1,6 1,3 1,0 II
144 M 19 ago-03 TO grave 2,00 0,76 0,39 0,00 0,6 0,7 0,6 0,4 1,2 1,2 1,1 1,7 1,2 II
39 M 24 fev-03 TO grave 0,88 0,76 0,60 0,34 1,0 0,4 0,4 0,4 1,1 1,1 1,0 1,1 0,9 Atp. D
220 M 29 jun-04 TO grave 0,91 0,76 0,40 0,00 1,0 0,5 0,4 0,8 0,0 0,0 0,0 0,0 0

198 M 46 fev-04 TO grave 0,876 0,76 0,93 0,37 0,4 0,5 0,7 0,4 0,0 0,0 0,0 0,0 0

271 M 27 out-01 TO grave 1,77 0,76 0,9 0,9 1,2 0,5 1,3 0,7 forte 1,3 1,1 1,0 1,3 0,9 Atp. D
209 M 15 mar-04 TO grave 0,87 0,76 0,90 0,00 0,7 0,4 0,5 0,7 0,0 0,0 0,0 0,0 0

46 M 32 fev-03 TO grave 1,12 0,76 0,30 0,28 1,7 0,7 0,8 0,3 1,0 1,1 1,0 0,9 0,9 Atp. D
61 M 35 fev-03 TO grave 0,75 0,76 0,32 0,34 0,6 0,1 0,4 0,2 1,6 1,0 0,9 0,9 0,9 I/III
174 M 34 out-03 TO grave 1,03 0,76 0,38 0,58 1,8 1,3 1,2 0,2 0,0 0,0 0,0 0,0 0

226 M 37 nov-04 TO grave 1,68 0,76 0,50 0,00 0,9 0,5 0,6 0,5 1,9 0,9 0,9 1,0 0,9 I/III
203 F 34 mar-04 TO grave 1,13 0,76 0,35 0,61 1,8 0,9 1,3 0,2 0,0 0,0 0,0 0,0 0

211 F 30 mar-04 TO grave 1,01 0,76 0,60 0,00 1,6 0,6 0,6 0,3 0,0 0,0 0,0 0,0 0

206 M 16 mar-04 TO grave 1,00 0,76 0,45 0,67 1,8 0,9 1,3 0,2 0,0 0,0 0,0 0,0 0
ANEXO B

157 M 20 set-03 TO grave 1,07 0,76 0,71 0,54 1,1 1,0 0,6 0,6 1,0 1,2 1,0 1,2 1,0 Atp. D
184 M 43 out-03 TO grave 1,739 0,76 0,62 0,46 1,0 0,7 0,5 0,5 0,0 0,0 0,0 0,0 0

145 F 14 ago-03 TO grave 2,12 0,76 0,28 0,00 0,9 0,8 0,6 0,3 1,4 1,2 1,1 1,4 1,0 Atp. D
171 F 51 out-03 TO grave 0,84 0,76 0,26 0,58 0,4 0,3 0,4 0,7 0,0 0,0 0,0 0,0 0

62 F 17 mar-03 TO grave 1,95 0,76 0,89 0,28 0,5 1,1 1,3 2,0 1,0 1,1 1,0 1,1 0,9 Atp. D
212 M 35 mar-04 TO grave 0,91 0,76 0,28 0,00 1,0 0,4 0,4 0,5 0,0 0,0 0,0 0,0 0

33 F 43 out-02 TO grave 0,95 0,76 0,31 0,26 0,7 0,5 0,1 0,2 1,0 1,1 0,9 1,0 0,8 Atp. D
229 F 37 nov-04 TO grave 0,85 0,76 0,50 0 0,4 0,3 0,5 0,5 0,9 0,9 0,9 1,2 0,9 Atp. D
205 F 59 mar-04 TO grave 1,30 0,76 0,44 0,39 0,6 0,6 0,5 0,6 Forte 0,0 0,0 0,0 0,0 0

222 F 20 jul-04 TO grave 0,93 0,76 0,50 0,00 0,7 0,5 0,3 0,4 0,0 0,0 0,0 0,0 0

82 M 28 mai-03 TO grave 1,10 0,76 0,31 0,00 1,4 0,1 0,3 0,2 1,1 1,1 1,1 1,1 1,0 Atp. D
228 F 38 nov-04 TO grave 1,83 0,76 0,60 0,00 1,7 0,5 0,5 0,5 3,0 0,9 1,7 1,0 0,9 Atp. C
31 F 27 out-02 TO grave 1,28 0,76 0,94 0 1,5 1,4 1,2 0,6 1,1 1,1 0,9 1,1 0,9 Atp. D
136 M 50 abr-03 TO grave 1,10 0,76 0,54 0,00 1,7 0,8 1,3 0,3 1,7 1,2 1,0 1,2 1,1 I/III
202 M 43 mar-04 TO grave 1,10 0,76 0,40 0,58 1,7 0,5 1,2 0,3 0,0 0,0 0,0 0,0 0

16 M 22 set-02 TO grave 1,04 0,76 0,65 1,2 0,7 0,5 1,6 2,5 1,0 2,4 1,0 0,9 Atp. C
81 F 57 mai-03 TO grave TO grave 1,13 0,76 0,39 0,00 1,3 0,6 0,5 0,6 1,0 1,0 1,0 1,1 1,0 Atp. D
76 M 17 dez-02 TO grave 1,20 0,76 0,78 0,00 1,5 1,0 0,9 0,4 1,2 1,1 0,9 1,3 4,7 II
115 M 31 nov-02 TO grave 1,02 0,76 0,60 0 1,0 0,7 0,6 0,5 1,5 1,1 1,0 1,1 1,0 Atp. D
207 F 47 mar-04 TO grave 0,99 0,76 0,50 0,41 0,9 0,5 1,0 0,3 0,0 0,0 0,0 0,0 0

194 M 19 fev-04 TO grave 1,812 0,76 0,49 0,59 1,0 0,7 0,8 0,4 0,0 0,0 0,0 0,0 0

47 F 34 fev-03 TO grave 1,08 0,64 0,30 0,31 1,3 0,6 0,5 0,2 1,0 1,3 1,0 1,0 1,1 Atp. D
49 F 18 fev-03 TO grave 0,88 0,65 0,72 0,31 1,0 1,1 0,6 0,5 0,9 1,1 1,0 1,2 1,0 Atp. D
57 M 12 fev-03 TO grave 1,06 0,65 0,60 0,91 1,2 0,5 0,6 0,5 1,0 1,2 1,2 1,2 0,9 Atp. D
155 M 32 set-03 TO grave 0,93 0,65 0,72 0,29 0,7 0,4 0,6 0,4 1,1 1,1 0,9 1,0 1,0 Atp. D
70 M 38 fev-03 TO grave 0,73 0,66 0,62 0,00 0,5 0,5 0,4 0,6 1,1 1,3 1,1 1,2 0,9 Atp. D
187 M 41 nov-04 TO grave 1,66 0,67 0,56 0,78 1,6 0,7 1,3 0,5 0,0 0,0 0,0 0,0 0

284 F 53 abr-04 TO grave 1,84 0,7 0 0 1,3 0,9 1,6 0,6 4,1 1,4 1,1 1,4 3,3 Atp. A
54 M 58 fev-03 TO grave 0,96 0,68 0,60 0,34 0,8 1,0 0,7 0,7 0,9 1,0 1,0 1,0 1,0 Atp. D
53 F 26 fev-03 TO grave 1,00 0,68 0,28 0,27 1,1 0,4 0,6 0,6 1,0 1,3 1,1 1,2 1,1 Atp. D
166 M 40 set-03 TO grave 1,04 0,69 0,26 0,65 0,8 0,5 0,5 0,4 0,9 0,9 0,9 1,3 1,0 Atp. D
172 F 39 out-03 TO grave 1,01 0,69 0,43 0,00 1,6 0,5 1,3 0,3 0,0 0,0 0,0 0,0 0

160 M 28 set-03 TO grave 1,00 0,72 0,69 0,54 1,0 0,6 0,5 0,4 1,5 1,2 1,7 1,0 0,9 II
161 M 39 set-03 TO grave 0,99 0,72 0,32 0,55 0,9 0,3 0,5 0,3 Forte 0,9 0,9 1,0 1,1 1,0 Atp. D
309 F 12 mar-05 TO grave 1,80 0,7 0 0 1,2 0,6 0,4 0,6 1,5 1,0 1,0 1,0 1,0 Atp. D
44 F 15 fev-03 TO grave 0,90 0,74 0,28 0,36 1,0 0,6 0,7 0,2 1,7 1,1 1,0 1,0 0,8 I/III
1 M 35 abr-02 TO grave 1,06 0,75 0,23 0,69 1,0 0,5 0,6 0,4 0,8 1,0 0,8 1,1 0,8 Atp. D
41 M 59 fev-03 TO grave TO grave 0,90 0,77 0,42 0,00 0,7 0,5 0,8 0,3 0,0 0,0 0,0 0,0 0

80 M 67 mar-03 TO grave TO grave 1,05 0,78 0,62 0,00 1,3 0,9 0,8 0,5 0,9 1,0 0,9 1,0 1,0 Atp. D
124 M 9 abr-03 TO grave 1,03 0,82 0,43 0,00 1,2 0,6 1,0 0,9 0,8 0,9 1,0 1,1 0,8 Atp. D
196 F 58 fev-04 TO grave 1,57 0,82 0,52 0,32 0,6 0,6 0,6 0,4 0,0 0,0 0,0 0,0 0

289 M 16 fev-05 TO grave 1,74 0,9 0 0 1,3 0,9 1,0 1,7 1,3 1,0 1,0 1,0 1,1 Atp. D
Abreviaturas: I.A.: índice de avidez de IgG; M: masculino; F: feminino; TO: toxoplasmose ocular; SP: soropositivo; Atp.: Atípico

Reagente Alta avidez Reagente (>1,5)


Não reagente Baixa avidez Não reagente (<1,5)
Não testado
Anexos

Anexo C

Definição dos valores do corte (cut off para o ELISA dos isótipos)
A Tabela V mostra os dados da análise estatística realizada com os

valores em densidade ótica obtidos do plasma de voluntários

soronegativos obtidos a partir da pesquisa dos isótipos (IgG1-4) anti-

T.gondii pela técnica de ELISA indireta. A média e o desvio padrão da

densidade ótica do plasma de 40 voluntários em cada teste foram obtidos

e utilizados como referência para a definição dos valores de corte (cut off)

de cada teste. O cut-off foi determinado pela média mais duas vezes o

desvio padrão de cada parâmetro. Para melhor visualização dos valores

considerados negativos e positivos o valor de corte de cada teste está

representado nos gráficos como uma linha pontilhada (Figura 7).

Tabela V – Definição de cut off. Valores de Média, desvio padrão, valor mínimo,
mediana, valor máximo da densidade ótica de IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 anti-T. gondii
obtidas pelo teste ELISA em amostras de plasma de voluntários soronegativos utilizados
para a definição do cut off de isótipo.
Isótipos

IgG1 IgG2 IgG3 IgG4

Parâmetros estatísticos Densidade ótica (D.O.)


n 40 40 40 40
Média 0,30 0,52 0,51 0,38
Desvio Padrão (SD) 0,10 0,16 0,16 0,20
Valor mínimo 0,10 0,11 0,04 0,20
Mediana 0,28 0,57 0,43 0,53
Valor máximo 0,49 0,90 0,89 0,86
Cut- off * 0,50 0,84 0,83 0,78
*Cut- off = Média+ 2 x DP

137
Anexos

Anexo D

Definição do valor de corte em reposta a cada um dos peptídeos

específicos das diferentes cepas do T. gondii

Para definição do valor do cut-off avaliamos amostras de 35

indivíduos soronegativos provenientes da cidade de Erechim- RS- Brasil.

Cada amostra foi analisada 3 vezes pelo método ELISA, contra os

peptídeos 6I/III, d6I/III, 6II, d6II, 7II, CTRL, PE e SAG1, descritos na

Quadro I. Para obtenção do valor de corte (cut-off), foi estabelecida a

média da densidade óptica obtida em todas as amostras na presença de

cada peptídeo somado a duas vezes o desvio padrão . Os resultados

obtidos encontram-se descritos na Tabela VI.

Tabela VI. Definição do valor de cut off para cada peptídeo analisado.
Peptídeos 6I/III d6I/III 6II d6II 7II SAG1

Media 1.0 1.0 1.0 1.1 0.9 1.2

Desvio Padrão 0.25 0.25 0.25 0.34 0.20 0.40

Media + DP 1.23 1.26 1.23 1.35 1.14 1.59

Media + 2DP 1.47 1.51 1.48 1.66 1.34 2.0

Cut-off 1.5 1.5 1.5 1.8 1.3 2.0

Abreviações: Desvio Padrão, DP

138
Anexos

Anexo E
IgG1
100 IgG3
100
Sensibilidade

Sensibilidade
50
50

0
0 25 50 75 100 0
0 25 50 75 100
100% - Especificidade (%)
100% - Especificidade (%)

IgA IgG2
100 100
Sensibilidade (%)

Sensibilidade

50 50

0 0
0 25 50 75 100 0 25 50 75 100
100% - Especificidade (%) 100% - Especificidade (%)

IgG4 IgE
100 100
Sensibilidade

Sensibilidade

50 50

0 0
0 25 50 75 100 0 25 50 75 100
100% - Especificidade (%) 100% - Especificidade (%)

Figura 14 - Representaçãp gráfica da análise por curva ROC dos isótipos anti- T. gondii no
plasma de indivíduos soronegativos (negativos) e IgM+ sem lesão ocular (positivos).

TABELA VII – Análise dos valores de corte (cut-off) para cada isótipo específico em
função da curva ROC.
Isótipos n Sensibilidade Especificidade p
anti- T. gondii cut-off AUC (%) (%)
Con. Pat.
IgG1 40 46 0,50 0,97 95 98 0,0001
IgG2 40 46 0,80 0,75 48 95 0,0001
IgG3 40 46 0,80 0,89 25 95 0,0001
IgG4 40 46 0,70 0,67 35 94 0.001
IgA 35 35 1,0 0,69 48 100 0,003
IgE 35 35 1,0 0,80 24 100 0.0001
Abreviações: Con.: controles; Pat.: pacientes; AUC: área sobre a curva ROC; p: probabilidade (significante p<
0,05)

139