CÓDIGO:

SGC.DI.505
GUIA PARA LAS PRÁCTICAS DE VERSIÓN: 2.0
FECHA ULTIMA REVISIÓN:

LABORATORIO, TALLER O CAMPO. 12/04/2017

Ciencias de la Vida y de la
DEPARTAMENTO: CARRERA: Biotecnologia
Agricultura
PERíODO Octubre – Febreo
ASIGNATURA: Inmunologia NIVEL: 7mo
LECTIVO: 2019
PRÁCTICA
DOCENTE: Marbel Torres, PhD NRC: 5302 1
N°:
LABORATORIO DONDE SE
Laboratorio de docencia de Biotecnología
DESARROLLARÁ LA PRÁCTICA
TEMA DE LA
PRÁCTICA:
Prueba de ELISA/ Prueba de Torch
INTRODUCCIÓN:
Torch es test para detectar una infección materna que afecta al feto en
gestación: Este síndrome corresponde a un conjunto de signos y
síntomas que presenta el recién nacido afectado por la infección
congénita y que es producida por diversos agentes etiológicos tanto
virales como parasitarios y micóticos que se han agrupado en la sigla
TORCH. Esta sigla fue creada por Nehmias en 1971 para designar a
este grupo de agentes causales. Entre estos se cuentan: Toxoplasma
gondii, virus Rubéola, Citomegalovirus, virus Herpes simplex y Otros
(virus hepatitis B y C, retrovirus, enterovirus, adenovirus, treponema
pallidum, M. Tuberculosis, virus varicela-zoster, virus Epstein-Barr, parvovirus B19, virus de la
inmunodeficiencia humana, cándida, etc.).

ELISA es una de las técnicas más utilizadas para identificar o confirmar la especificidad de los anticuerpos
presentes en las muestras de los pacientes con enfermedades autoinmunes. Además, por su fácil
estandarización, manejo y variedad de antígenos
disponibles, ha desplazado notablemente a otras
técnicas como el radioinmunoensayo para la detección
de anticuerpos anti-DNAcd (conocido también como
prueba de Farr), ya que no utiliza radionúclidos, lo que
hace que sea una técnica accesible y de bajo riesgo. Si
bien existen diferentes tipos de ELISA, el más utilizado
en el laboratorio de diagnóstico de autoinmunidad es el
ELISA indirecto, el cual se fundamenta en el
reconocimiento de los anticuerpos específicos presentes
en las muestras de los pacientes, mediante un anticuerpo dirigido contra la región Fc humana de cualquier
isotipo (IgG, IgA o IgM) e inclusive de cualquier subclase (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 o IgA2). Los
anticuerpos anti-Fc están unidos a enzimas como la peroxidasa o la fosfatasa alcalina. Los antígenos
utilizados en las placas de ELISA pueden ser nativos, recombinantes (antígeno completo o epítopo
específico) o sintéticos (epítopo específico).

OBJETIVOS:
1. Desarrollar de un Elisa indirecto para detección de antígeno en suero.
2. Identificar como funciona la prueba de antígeno anticuerpo en membrana por flujo lateral

MATERIALES:
REACTIVOS: INSUMOS:
100ml Alcohol, 2ug Antichicken igG, Anticuerpos 10 Pipetas desechables, 15 Tubos de 50ml, 15 Tubos de
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contra E coli, 5ml PBS Tween 20, 200ul Triton
1x, , 4ml Cloroformo, 100ml Alcohol a 70%,,
10gr Leche descremada, 1ml PNNP, 1ml Sustrato,
1ml NaOH, 5ml Acetona, 10ml Bicarbonate de
sodio, 10ml Nacl, 1ml Dietiletanolamine
15ml, 10 Cajas Petri plásticas, 50 Viales de 2ml, 500ul,
5 Gradillas de tubos de 15ml; 50ml, 4 cajas puntas de
micropipetas 1000ul, 200ul, 10ul
5 placas de Elisa, 2 Kit de torch IgG, IgM

EQUIPOS 1 Incubadora, , 5 juegos micropipetas, 1 pipeteador automatico, 2 pipetas muiticanal , 1 lector

Elisa
MUESTRA: Anticuerpos contra E coli, antígenos de E. Coli, suero de humano
INSTRUCCIONES:
- Vacunación previa de acuerdo al MSP con el manejo de animales y muestras biologicas
- Mandil y medidas de precaucion
- Manejo de desechos biologicos
ACTIVIDADES POR DESARROLLAR:
Torch

Se colocó 5 µl de suero en cada una de las cinco pocillos destinados a cada prueba (TOXO, CMV, RUB,
HSV1 y HSV2). Luego de 30 s. se añadieron 2 gotas de Buffer del kit. La prueba se lee a los 10 min.
ELISA
Preparación del antígeno.

• Sembrar la bacteria xx en medio de cultivo .

• Incubar el cultivo durante 24h a 37ºC en agitación
• Colocar los tubos a 65ºC por 30 minutos (baño maría) y a 0ºC en baño de hielo y cuantificar la
concentración de proteínas.
Sensibilización de placa con el antígeno.

• Realizar diluciones seriadas de la concentración de bacteria en buffer de sensibilización

(Carbonato-Bicarbonato 0.05M a pH 9.6).
• Colocar 100uL de cada dilución en las filas de la placa como muestra Cubrir la placa e Incubar la
placa una noche a 4ºC. luego lavar la placa tres veces (PBS – Tween )
Bloqueo.

• Colocar 200uL de la solución de bloqueo (PBS- Leche 5%) e incubar a 37ºC por una hora
• Lavar la placa tres veces con (PBS – Tween 0.05%).
Anticuerpo primario.

• Realizar diluciones seriadas del anticuerpo utilizando como diluyente PBS – Leche 2,5%.
• Colocar 100uL de cada dilución, cubrir la placa e incubar durante 2h a 37ºC
• Luego Lavar la placa tres veces con (PBS – Tween 0.05%).
Anticuerpo secundario (conjugado).

• Realizar una dilución de 1/30 000 del anticuerpo secundario en PBS – Leche 2,5% (dilución
recomendada por la casa comercial). Colocar 100uL de la dilución en toda la placa.
• Cubrir la placa e incubar durante 1h a 37ºC y Lavar la placa tres veces (PBS – Tween 0.05%).
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Sustrato.

• Colocar 50uL del sustrato ABTS Peroxidasa en cada pocillo e incubar a temperatura ambiente
por 15 minutos protegido de la luz. Leer la absorbancia de la placa a una longitud de onda de
405nm en el espectrofotómetro.

RESULTADOS OBTENIDOS:

1. Capacitación en técnicas de Elisa casero indirecto

2. Manejar la prueba de toch como prueba Ag- Ac por flujo lateral
CONCLUSIONES:
Obtencion de absorvancias de muestras para detecion de anticuerpos producidos en animales
RECOMENDACIONES:
Los tiempos de incubacion, cantidades de las micropipetas, cuidado en el momento de lavar
FIRMAS

F: …………………………………
Nombre: MARBEL TORRES, PhD
DOCENTE RESPONSABLE
F: …………………………………
F: ………………………………………
Nombre: VALERIA OCHOA, PhD Nombre: Patricia Jiménez, PhD
COORDINADOR DE ÁREA DE COORDINADOR/JEFE DE
CONOCIMIENTO LABORATORIO DE DOCENCIA