Prác

ctica II: ESTUDIO

O ES
SPECTROFOTOMÉT
TRICO Y
ESPPECTROFL
LUORIMÉT
TRICO DDE LA TRANSICIÓN ALC
CALINA DEL
CITO
OCROMO C

Intro
oducción

El ciitocromo c humano, es una pro oteína que juega un doble papeel en diferentes
comp partimentoss celulares s. Por una a parte, transfiere
t electrones
e en la ca adena
respiiratoria mittocondrial y por otraa actúa como inducto or de la aapoptosis en e el
citop
plasma. En el intervaloo de pH de 1 a 12, el citocromo c oxidado eexhibe al menos
m
o conformacciones diferrentes debiidas a cambios en los ligandos aaxiales del grupo
cinco g
hemo o y/o al propio plegamiento de la proteína.

La trransición alcalina del citocromo

c c supone la n de la mettionina 80 como
a sustitución
ligan
ndo axial del d grupo hemo po r una lisin na, fenóme eno que ppuede seg guirse
espeectrofotométtricamente (observand do la bandaa de absorc ción a 699 nnm) al registrar
espeectros entrre 600 y 750 nm. El estudio de e este cambio estructuural, que podría
p
tenerr un efecto directo sobbre la funció
ón de la pro
oteína se muuestra comoo ejemplo de
d las
múltiiples aplicacciones de la
as técnicas espectrofotométricas.

Figurra 1. Esqu uemas de los ligando os del gruppo hemo (p parte supeerior) y modelos
estru
ucturales (pparte inferio
or) del ferri
ricitocromo c en el es A), en el estado
stado III (A
alcallino (estado
o IV) (B) y en
e el estado o V o despplegado (C) (Tomado dde Perroud et al.
PNAS 2005, 102: 17570-17 7575),

La práctica

En eesta prácticca, el objettivo es detterminar el pH al que

e se produuce la trans
sición
alcalina de citoccromo c, re
ealizando m
medidas de Absorbanci
A m variando el pH
a a 699 nm
de la
a muestra problema.

erial
Mate

- Muestra de cittocromo c de d corazón de caballo

o a 300 μM en tampónn fosfato 5 mM
m a
pH 66.5.
- Disolución ferrricianuro 50
0 mM
- Disolución de NaOH 0.2 M
- Disolución de HCl 0.2 M
- Tira
as indicadorras de pH
- Vidrios de reloj (para depositar trozos de 5 mm de tiras de pH)
- Parafilm (mezclar reactivos en la cubeta por inversión, no agitar)

Procedimiento

- Programar el espectrofotómetro en modalidad de espectro (scan), con un rango entre

750 nm y 600 nm, una escala en el eje Y (Absorbancia) entre 0 y 0.5 y modalidad
“OVERLAY” o SUPERPOSICIÓN DE ESPECTROS (Tecla 6), para ir acumulando los
distintos espectros y visualizar así mejor la transición.

- Hacer un blanco muestra omitida (sin cit c) con 996 µL de tampón fosfato y 4 µl de
ferricianuro. Realizar un espectro entre 600 y 750 nm: TECLA F1 (CORRECCIÓN DE
LÍNEA DE BASE). De esta forma se salva y almacena este espectro como blanco para
que el espectrofotómetro lo sustraiga de las medidas posteriores con muestra
(citocromo c).

- Para mantener el citocromo c totalmente oxidado, añadir a la muestra de citocromo c

(pipetear 996 µl en la cubeta reducida de plástico) 4 μl de la disolución de ferricianuro,
de manera que la concentración final será 200 μM de ferricianuro y el volumen final de
muestra 1mL. Mezclar la muestra por inversión tapando con un Parafilm la cubeta.

- Registrar el espectro de absorción entre 600 y 750 nm (OJO: UTILIZAR LA MISMA

CUBETA QUE PARA EL BLANCO!!!). A continuación, teclear el botón de cursor y
desplazarse con él hasta λ = 699 nm. Medir A699 nm de la muestra problema a pH 6.5.

- Adicionar la cantidad de NaOH 0.2 M propuesta en la tabla a continuación,

comprobar el pH y registrar de nuevo el especto y luego la A699 nm de la muestra.

-Comprobar que el pH es el correcto pipeteando 4 µl de la muestra depositada

en la cubeta sobre una tira indicadora de pH. Evaluar visualmente con la gama
de colores del indicador que el pH es coherente. Realizar estas
comprobaciones sólo a los valores de pH indicados en la Tabla siguiente.

- Repetir el paso anterior a los pH: 7; 8; 9; 9.2; 9.4; 9.6; 9.8; 10; 10.5; 11.

     
Volumen añadido NaOH 0.2 M  pH  A699 
(μL) 
     
0  6.5 
6  7   
12  8   
4  9   
1  9.2   
1  9.4   
1  9.6   
1.5  9.8   
1.5  10   
6  10.5   
8  11   
 
- Representar las absorbancias medidas frente al pH y determinar el pH al que
se produce la transición alcalina.

-Realizar espectros de emisión de fluorescencia intrínseca del citocromo c a pH

6.5 y pH 11 para evaluar cambios conformacionales en la proteína inducidos
por el pH (λexc = 295 nm; λem = 320-360 nm). El citocromo c de corazón de
caballo tiene 1 Trp y 4 Tyr.

Referencias

- Perroud et al. PNAS USA 102, 49 (2005) 17570–17575.

- García-Heredia et al. Biochimica et Biophysica Acta 1797 (2010) 981–993.

- Folding of Horse Cytochrome c in the reduced state. Bhuyan A.K. y

Udgaonkar, J.B. Journal of Molecular Biology 312 (2001) 1135-1160.