TEMA 1.

EL MICROSCOPIO

Un microscopio es un instrumento que amplifica una imagen y permite la observación de

mayores detalles de los posibles a simple vista. El microscopio más simple es una lente de
aumento o un par de anteojos.

El poder de resolución del ojo humano es de 0,2 mm es decir que para ver dos objetos
separados, éstos deben estar como mínimo a esa distancia.

El microscopio aumenta la imagen hasta el nivel de la retina, para captar la información.

La resolución depende de la longitud de onda de la fuente luminosa, el espesor de la
muestra a observar, la calidad de la fijación y la intensidad de la coloración.

Teóricamente la máxima resolución que se puede alcanzar es de 0,2 µm, dada por una luz
con longitud de onda de 540 nm, la cual pasa por un filtro verde (muy sensible por el ojo
humano) y con objetos condensadores adecuados. El ocular aumenta la imagen producida
por el objetivo, pero no puede aumentar la resolución.

Podemos clasificar los microscopios según su descubrimiento:

Microscopio simple o lupa  lente convergente situada entre el ojo y el objeto.

Microscopio compuesto  formado por 2 sistemas de lentes: oculares y objetivos.
Microscopio moderno  produce una imagen aumentada e invertida. Formado por tres
sistemas de lentes.
- Condensador  situado entre la fuente de luz y la muestra. Concentra el haz
luminoso sobre la preparación.
- Objetivo  produce una imagen real y aumentada, situado entre el objeto y el
revolver.
- Ocular  formado por dos lentes convergentes, produce una imagen virtual y
aumentada, situados entre el ojo y el revolver.

HISTORIA

El microscopio se invento, hacia 1610, por Galileo, según los italianos, o

por Jansen, en opinión de los holandeses. La palabra microscopio fue
utilizada por primera vez por los componentes de la "Accademia dei
Lincei" una sociedad científica a la que pertenecía Galileo y que
publicaron un trabajo sobre la observación microscópica del aspecto
de una abeja.

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Sin embargo las primeras publicaciones importantes en el campo de la
microscopia aparecen en 1660 y 1665 cuando Malpighi prueba la
teoría de Harvey sobre la circulación sanguínea al observar al
microscopio los capilares sanguíneos y Hooke publica su obra
Micrographia.

A mediados del siglo XVII un comerciante holandés, Leenwenhoek,

utilizando microscopios simples de fabricación propia describió por
primera vez protozoos, bacterias, espermatozoides y glóbulos rojos.

Durante el siglo XVIII el microscopio sufrió diversos adelantos

mecánicos que aumentaron su estabilidad y su facilidad de uso aunque
no se desarrollaron mejoras ópticas. Las mejoras mas importantes de
la óptica surgieron en 1877 cuando Abbe publica su teoría del
microscopio y por encargo de Carl Zeiss mejora la microscopía de
inmersión sustituyendo el agua por aceite de cedro lo que permite
obtener aumentos de 2000A principios de los años 30 se habia
alcanzado el limite teórico para los microscopios ópticos no
consiguiendo estos, aumentos superiores a 500X o 1000X sin embargo
existia un deseo científico de observar los detalles de estructuras
celulares ( núcleo, mitochondria... etc.).

El microscopio electrónico de transmisión (T.E.M.) fué el primer tipo

de microscopio electrónico desarrollado este utiliza un haz de
electrones en lugar de luz para enfocar la muestra consiguiendo
aumentos de 100.000 X. Fue desarrollada por Max Knoll y Ernst Ruska
en Alemania en 1931. Posteriormente, en 1942 se desarrolla el
microscopio electrónico de barrido (SEM).

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FUNDAMENTOS DE LA MICROSCOPÍA

Cuando se acerca un observador a un objeto, crece el ángulo visual y ese objeto parece
ser mayor. Sin embargo, por debajo de una determinada distancia (unos 25 cm) entre el
ojo y el objeto, éste no se ve con claridad. Este límite se debe a la capacidad máxima de
deformación del cristalino. Si se sitúa entre le ojo y el objeto un sistema óptico capaz
de aumentar el ángulo visual, se podrá ver el objeto con mayor amplitud y claridad.

Ese sistema óptico es el MICROSCOPIO. Produce una imagen aumentada de un objeto no

visible de forma que sea perceptible por el ojo humano. Se consigue mediante el uso de
lentes u otros sistemas.
Esta ampliación de la imagen se puede conseguir de dos formas:
- ondas luminosas  m. Óptico
- haz de electrones (é)  m. Electrónico

TÉRMINOS QUE DESCRIBEN LAS CARACTERÍSTICAS ÓPTICAS DEL

MICROSCOPIO

AUMENTO  relación entre el tamaño a simple vista y el tamaño observado con el

microscopio (es el número de veces que se ve el tamaño de un objeto por encima de su
valor real). En el microscopio compuesto se calcula multiplicando el aumento individual
del objetivo por el aumento individual del ocular. Se expresa mediante un número
seguido del signo “por” (x).

CONTRASTE  diferencia en la absorción de luz entre el objeto estudiado y el medio

que lo rodea. Puede aumentarse mediante procedimientos de tinción.

PODER DE RESOLUCIÓN  capacidad de mostrar distintos y separados dos puntos muy

cercanos. Determina la máxima amplificación útil del microscopio. Depende de la
longitud de onda (λ) y de la apertura numérica (AN): cuanto menor es λ y/o mayor la AN,
mayor es la resolución. La resolución máxima de un microscopio óptico es de 200 nm.

d = (0,5 x λ) / AN

APERTURA NUMÉRICA  capacidad de la lente para juntar los rayos de luz

proyectados hacia ella. Determina la eficacia del condensador y del objetivo. La AN
depende del índice de refracción del medio que hay entre la muestra y la lente (IR), y
del seno de la mitad del ángulo del cono de luz que penetra en la lente (sen α).

AN = IR x senα

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Si se rellena el espacio existente entre la muestra y el objetivo no con aire, sino con una
sustancia de mayor IR (p.e. aceite), se consigue que la mayor parte de los rayos perdidos
por los fenómenos ópticos ocasionados en el condensador y en el portaobjetos, se
refracten y penetren en el objetivo, con lo que se incrementa la resolución del
microscopio.

PROFUNDIDAD DE CAMPO  espesor de la preparación enfocada en cualquier

momento. Será mayor cuanto menor sea el aumento.

ÁREA DEL CAMPO  es el diámetro de la parte de la preparación que se está viendo.

Será mayor cuando menor sea el aumento.

TIPOS DE MICROSCOPIOS

Microscopios Ópticos

- M. Simple  El microscopio más simple es una lente convergente, la lupa (o

microscopio estereoscópico). El objeto se coloca entre la lente y el foco, de modo
que la imagen es virtual y está a una distancia que es la distancia mínima de visón
nítida, alrededor de 25 cm. Consta de una base, en la que se sitúa la pletina, y de
la que emerge una columna que soporta las lentes y el mando de enfoque. Sólo
sirve para exámenes superficiales (disección de animales, observación de
colonias, detección de quistes de parásitos,…). Se consigue un número de
aumentos entre 4 y 60.
- M. Campo luminoso u óptico compuesto  imágenes oscuras frente al campo
luminoso. Permite el estudio de las estructuras internas de la muestra, para lo
cual ésta debe ser dispuesta en una fina capa que puede ser atravesada por la luz.
- M. Campo oscuro  fondo oscuro sobre el que se ven los objetos intensamente
iluminados.
o Permite ver el contorno de las bacterias y su movilidad
o Permite ver los microorganismos sin teñir
o Permite ver el Treponema pallidum, bacteria espiroqueta de la sífilis.
Consta de un condensador especial que debe estar muy cercano a la preparación y
que lanza sobre la muestra un cono hueco de luz. Con esto se logra que, solamente
los rayos que chocan con las estructuras sometidas a estudio y son reflejados
hacia arriba, puedan ser visualizados a través del objetivo.

- M. Contraste de fases  produce variaciones de luminosidad de forma que sean

visibles las distintas partes de una muestra. Para ver parásitos y bacterias en
cortes histológicos, y para objetos transparentes y no coloreados (sedimento
urinario).

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 Consta de un dispositivo, situado dentro o debajo del condensador, que produce
diferencias de longitud de onda en los distintos rayos.
- M. Fluorescencia  la fluorescencia es la propiedad que tienen ciertas sustancias
de emitir, cuando son iluminadas por una radiación de λ corta, otra radiación de λ
más larga.
Consta de una fuente de luz muy potente y un filtro de excitación que sólo deja
pasar la radiación UV deseada. Ésta, tras interaccionar con la muestra, es de
nuevo filtrada, dejando pasar solamente la luz fluorescente hacia los oculares.
La principal aplicación es en inmunofluorescencia, es decir, reacciones de
antígenos con anticuerpos.
o Fuente de luz  la λ va desde la luz ultravioleta hasta los infrarrojos.
o Filtro de excitación delimita la banda de excitación, generalmente
ultravioleta.
o Muestra  fluorescente por sí misma (microscopia primaria) o marcada
con fluorocromos (microscopia secundaria).
o Filtro de barrera  deja pasar sólo la fluorescencia.

TÉCNICA DIRECTA DE LA INMUNOFLUORESCENCIA

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 El microscopio de luz ultravioleta utiliza una λ entre 180 – 400 nm
o Ventaja  tiene mayor PR
o Inconvenientes:
 Lentes de cuarzo más caras
 Imagen invisible al ojo humano, hay que utilizar fotografías,
fluorescencias o cualquier otra técnica de foto-emisión.

Microscopios Electrónicos

La luz es un haz de electrones. Utilizado en investigación. Los é son propagados a

través de un tubo, inciden sobre el objeto y son refractados y recogidos en una
pantalla. Se utiliza para conocer el tamaño, estructura y morfología de los seres
vivos.
- M. E. de transmisión (muestra muy fina, gran amplificación, no observación de
elementos vivos, alto coste).
- M. E. de barrido (congelación especial de la muestra y recubrimiento con metal,
menor poder de resolución, tridimensionalidad).

PARTES DE UN MICROSCOPIO ÓPTICO

REVÓLVER

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PARTE MECÁNICA
- Sistema de soporte o estativo
o Pie
o Brazo
o Tubo
o Platina
o Revolver
- Sistema de ajuste
o Tornillo macrométrico
o Tornillo micrométrico

PARTE ÓPTICA
- Fuente de iluminación
- Condensador y diafragma
- Lentes  oculares (10x y 12x) y objetivos (4x, 10x, 40x y 100x).

* PIE: Sirve como base del microscopio y tiene un peso suficiente para dar estabilidad al
aparato. En los microscopios antiguos tenía forma de herradura o de trípode pero en la
actualidad suele ser una plataforma rectangular. En él se integra la fuente luminosa.

*BRAZO: Es una columna perpendicular al pie. Puede ser arqueado o vertical y une al pie
con el tubo.

*TUBO: Es una cámara oscura unida al brazo mediante una cremallera. Tiene el revolver
con los objetivos en su parte inferior y los oculares en el extremo superior.

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* PLATINA: Es una plataforma horizontal con un orificio central, sobre el que se coloca
la preparación, que permite el paso de los rayos procedentes de la fuente de iluminación
situada por debajo. Dos pinzas sirven para retener el portaobjetos sobre la platina y un
sistema de cremallera guiado por dos tornillos de desplazamiento permite mover la
preparación de delante hacia atrás o de izquierda a derecha y viceversa. En la parte
posterior de uno de los laterales se encuentra un nonius que permite fijar las
coordenadas de cualquier campo óptico; de esta forma se puede acudir a el cuando
interesa.

* REVOLVER: Es un sistema que coge los objetivos, y que rueda para utilizar un objetivo
u otro.

* TORNILLOS MACRO Y MICROMÉTRICO: Son tornillos de enfoque, mueven la platina

hacia arriba y hacia abajo. El macrométrico lo hace de forma rápida y el micrométrico de
forma lenta. Llevan incorporado un mando de bloqueo que fija la platina a una
determinada altura.

* FUENTE DE ILUMINACIÓN: Se trata de una lámpara halógena de intensidad

graduable. Esta situada en el pie del microscopio. Se enciende y se apaga con un
interruptor y en su superficie externa puede tener una especie de anillo para colocar
filtros que facilitan la visualización.

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* CONDENSADOR Y DIAFRAGMA: El condensador es un sistema de lentes situadas
bajo la platina su función es la de concentrar la luz generada por la fuente de iluminación
hacia la preparación. En el interior del condensador existe un diafragma (iris) cuya
función es limitar el haz de rayos que atraviesa el sistema de lentes eliminando los rayos
demasiado desviados (regula la cantidad de luz y
ajusta la Apertura Numérica).

* OCULARES:

Están colocados en la parte superior del tubo. Se denominan así, porque están muy
cercanos al ojo. Su función es la de captar y ampliar la imagen formada en en los
objetivos. En los modernos microscopios hay dos oculares (microscopios binoculares) que
están unidos mediante un mecanismo que permite ajustar la distancia interpupilar. En
general los mas utilizados son los de 10X ( producen un aumento de 10 veces ).

MICROSCOPIO MICROSCOPIO
MONOCULAR BINOCULAR

* OBJETIVOS: Están colocados en la parte inferior del tubo insertados en una pieza
metálica, denominada revolver, que permite cambiarlos fácilmente. Generan una imagen
real, invertida y aumentada. Los mas frecuentes son los de 4, 10,
40, y 100 aumentos. Este último se llama de inmersión ya que para
su utilización se necesita utilizar aceite de cedro sobre la
preparación. En la superficie de cada objetivo se indican sus
características principales, aumento, apertura numérica, y llevan
dibujado un anillo coloreado que indica el número de aumentos
(rojo 4X, amarillo 10X, azul 40X y blanco 100X).

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MANEJO Y USO DEL MICROSCOPIO ÓPTICO

1. Colocar el objetivo de menor aumento en posición de empleo y bajar la platina

completamente. Si el microscopio se recogió correctamente en el uso anterior, ya
debería estar en esas condiciones.
2. Colocar la preparación sobre la platina sujetándola con las pinzas metálicas.
3. Comenzar la observación con el objetivo de 4x (ya está en posición) o colocar el
de 10 aumentos (10x) si la preparación es de bacterias.
4. Para realizar el enfoque:
a. Acercar al máximo la lente del objetivo a la preparación, empleando el
tornillo macrométrico. Esto debe hacerse mirando directamente y no a
través del ocular, ya que se corre el riesgo de incrustar el objetivo en la
preparación pudiéndose dañar alguno de ellos o ambos.
b. Mirando, ahora sí, a través de los oculares, ir separando lentamente el
objetivo de la preparación con el macrométrico y, cuando se observe algo
nítida la muestra, girar el micrométrico hasta obtener un enfoque fino.
5. Pasar al siguiente objetivo. La imagen debería estar ya casi enfocada y suele ser
suficiente con mover un poco el micrométrico para lograr el enfoque fino. Si al
cambiar de objetivo se perdió por completo la imagen, es preferible volver a
enfocar con el objetivo anterior y repetir la operación desde el paso 3. El
objetivo de 40x enfoca a muy poca distancia de la preparación y por ello es fácil
que ocurran dos tipos de percances: incrustarlo en la preparación si se descuidan
las precauciones anteriores y mancharlo con aceite de inmersión si se observa una
preparación que ya se enfocó con el objetivo de inmersión.
6. Empleo del objetivo de inmersión:
. Bajar totalmente la platina.
a. Subir totalmente el condensador para ver claramente el círculo de luz que
nos indica la zona que se va a visualizar y donde habrá que echar el aceite.
b. Girar el revólver hacia el objetivo de inmersión dejándolo a medio camino
entre éste y el de x40.
c. Colocar una gota mínima de aceite de inmersión sobre el círculo de luz.
d. Terminar de girar suavemente el revólver hasta la posición del objetivo de
inmersión.
e. Mirando directamente al objetivo, subir la platina lentamente hasta que la
lente toca la gota de aceite. En ese momento se nota como si la gota
ascendiera y se adosara a la lente.
f. Enfocar cuidadosamente con el micrométrico. La distancia de trabajo
entre el objetivo de inmersión y la preparación es mínima, aun menor que
con el de 40x por lo que el riesgo de accidente es muy grande.
g. Una vez se haya puesto aceite de inmersión sobre la preparación, ya no se
puede volver a usar el objetivo 40x sobre esa zona, pues se mancharía de
aceite. Por tanto, si desea enfocar otro campo, hay que bajar la platina y
repetir la operación desde el paso 3.
h. Una vez finalizada la observación de la preparación se baja la platina y se
coloca el objetivo de menor aumento girando el revólver. En este momento

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 ya se puede retirar la preparación de la platina. Nunca se debe retirar con
el objetivo de inmersión en posición de observación.
i. Limpiar el objetivo de inmersión con cuidado empleando un papel especial
para óptica. Comprobar también que el objetivo 40x está perfectamente
limpio.

MANTENIMIENTO Y PRECAUCIONES

1. Al finalizar el trabajo, hay que dejar puesto el objetivo de menor aumento en

posición de observación, asegurarse de que la parte mecánica de la platina no
sobresale del borde de la misma y dejarlo cubierto con su funda.
2. Cuando no se está utilizando el microscopio, hay que mantenerlo cubierto con su
funda para evitar que se ensucien y dañen las lentes. Si no se va a usar de forma
prolongada, se debe guardar en su caja dentro de un armario para protegerlo del
polvo.
3. Nunca hay que tocar las lentes con las manos. Si se ensucian, limpiarlas muy
suavemente con un papel de filtro o, mejor, con un papel de óptica.
4. No dejar el portaobjetos puesto sobre la platina si no se está utilizando el
microscopio.
5. Después de utilizar el objetivo de inmersión, hay que limpiar el aceite que queda
en el objetivo con pañuelos especiales para óptica o con papel de filtro (menos
recomendable). En cualquier caso se pasará el papel por la lente en un solo sentido
y con suavidad. Si el aceite ha llegado a secarse y pegarse en el objetivo, hay que
limpiarlo con una mezcla de alcohol-acetona (7:3) o xilol. No hay que abusar de
este tipo de limpieza, porque si se aplican estos disolventes en exceso se pueden
dañar las lentes y su sujeción.
6. No forzar nunca los tornillos giratorios del microscopio (macrométrico,
micrométrico, platina, revólver y condensador).
7. El cambio de objetivo se hace girando el revólver y dirigiendo siempre la mirada a
la preparación para prevenir el roce de la lente con la muestra. No cambiar nunca
de objetivo agarrándolo por el tubo del mismo ni hacerlo mientras se está
observando a través del ocular.
8. Mantener seca y limpia la platina del microscopio. Si se derrama sobre ella algún
líquido, secarlo con un paño. Si se mancha de aceite, limpiarla con un paño
humedecido en xilol.
9. Es conveniente limpiar y revisar siempre los microscopios al finalizar la sesión
práctica y, al acabar el curso, encargar a un técnico un ajuste y revisión general
de los mismos.

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HUEVO DE ASCARIS EN HECES TRICHOMONAS VAGINALIS

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PRÁCTICAS:
1. Introducción al manejo del microscopio (pag 16 libro hema).
2. estudio microscópico de la cristalización de la saliva (pag. 19 libro hema).

PREGUNTAS:

1. ¿Qué parámetro óptico indica la capacidad del microscopio para revelar detalles
adyacentes de un objeto?
a) Aumento
b) Poder de resolución
c) Profundidad de campo
d) Contraste

2. ¿Cuál de los siguientes elementos no es un componente de la parte mecánica de un

microscopio óptico?
a) Platina
b) Tornillo macrométrico
c) Tubo
d) Diafragma

3. ¿Qué microscopio es especialmente adecuado para el estudio de sedimentos de orina?

a) M. Simple
b) M. Compuesto
c) M. de Contraste de Fases
d) M. de Fluorescencia

4. ¿Qué microscopio proporciona unas imágenes que producen una mayor sensación de
tridimensionalidad?
a) M. de campo oscuro
b) M. de fluorescencia
c) M. electrónico de transmisión
d) M. electrónico de barrido

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