UNIVERSISDAD DEL ATLANTICO

PROGRAMA DE FARMACIA

ELECTROFORESIS

BIOLOGIA MOLECULAR

ANA MARIA ROJAS MARTINEZ

NATALIA SEVERICHE
MARIA CAMILA VEGA LLERENA
JOSE DAVID TORRES

BARRANQUILLA – COLOMBIA
2018
CONTENIDO

INTRODUCCIÓN .................................................................................................... 3
LA ELECTROFORESIS. ......................................................................................... 4
TIPOS DE ELECTROFORESIS .............................................................................. 7
INTRODUCCIÓN

En biología molecular, una gran cantidad de técnicas que se realizan comúnmente

requieren el uso de la electroforesis, por lo que supone una parte importante del
procedimiento sistemático del análisis (separación, purificación, preparación) de
los ácidos nucleicos y las proteínas. La mayoría de las biomoléculas poseen una
carga eléctrica cuya magnitud depende del pH del medio en el que se encuentran;
como consecuencia, pueden desplazarse cuando se ven sometidas a un campo
eléctrico hacia el polo de carga opuesta al de la molécula. A diferencia de las
proteínas, que pueden tener una carga positiva o negativa, los ácidos nucleicos
sólo poseen carga negativa, debido a su esqueleto de fosfatos. Por lo tanto, en
una electroforesis, los ácidos nucleicos migrarán hacia el polo positivo; es decir, el
ánodo. En el caso de las proteínas se realiza pre-tratamiento con detergentes,
como el dodecilsulfato de sodio (SDS), que les con- fi ere carga negativa; con ello
se homogenizan las proteínas de la muestra y todas migrarán hacia el polo
positivo, y sólo se separarán por tamaño. El principio de la electroforesis consiste
en la migración proporcional de las moléculas a través de un gel u otro tipo de
matriz porosa, según su peso molecular o tamaño; movimiento generado por el
campo eléctrico.
LA ELECTROFORESIS.

Es un método de separación y purificación de moléculas, que depende del

movimiento de las partículas cargadas en un campo eléctrico, a través de una
matriz porosa la cual la separa por tamaños moleculares y carga eléctrica
dependiendo de la técnica que se use, las mayoría de las partículas están
cargadas eléctricamente y al igual que los electrolitos se pueden clasificar en
fuertes y débiles dependiendo de la ionización de los grupos ácidos y básicos.

La mayoría de las biomoléculas poseen una carga eléctrica cuya magnitud

depende del pH del medio en el que se encuentran; como consecuencia, pueden
desplazarse cuando se someten a un campo eléctrico hacia el polo de carga
opuesta al de la molécula. A diferencia de las proteínas, que pueden tener una
carga positiva o negativa, los ácidos nucleicos sólo poseen carga negativa, debido
a su esqueleto de fosfatos. Por lo tanto, en una electroforesis, los ácidos nucleicos
migrarán hacia el polo positivo, es decir, el ánodo. En el caso de las proteínas, que
suelen ser de carga neutra, se realiza pre tratamiento con detergentes, como el
dodecilsulfato de sodio (SDS), que les confiere carga negativa; con ello se
homogeneizan las proteínas de la muestra y todas migrarán hacia el polo positivo;
sólo se separarán por tamaño.

El principio de la electroforesis consiste en la migración proporcional de las

moléculas a través de un gel u otro tipo de matriz porosa, según su peso
molecular o tamaño; movimiento generado por el campo eléctrico.

Usos

Usado principalmente para analizar mezclas de péptidos y proteínas, más que

aminoácidos individuales pero se aplican en los mismos principios. Como los
péptidos y las proteínas contienen distintas cantidades de aminoácidos, y como
sus cadenas laterales son distintas, dos péptidos tendrán propiedades acido base
ligeramente distintas, y cargas neta ligeramente distintas al determinado pH, así
sus movilidades en un campo eléctrico serán diferentes y se podrá usar la
electroforesis para separarlo.
Un segundo factor que gobierna la rapidez de migración durante la electroforesis
es el tamaño (longitud y forma) de los péptidos o de las proteínas, teniendo en
cuenta que las moléculas grandes son más lentas que las pequeñas.

En análisis se usa para estimar el peso molecular de una proteína, comparando su

movilidad electroforética con la de proteínas de peso molecular conocido.

Elementos necesarios para una electroforesis

Para realizar una electroforesis se requiere de una serie de elementos:

Cámara de electroforesis

La cámara de electroforesis es un dispositivo que permite la generación de un

campo eléctrico alrededor de un gel donde se depositan las muestras. Este campo
se genera dentro de una solución amortiguadora en la que se encuentra
sumergido el gel que contiene las muestras; el alto contenido de electrolitos
permite la transmisión de la corriente eléctrica, manteniendo el pH estable al paso
de la corriente. La cámara cuenta con dos polos que se conectan a una fuente de
energía

Gel

La muestra debe colocarse sobre un medio de soporte, con la finalidad de evitar

perturbaciones mecánicas durante la separación.

Los geles pueden ser de agarosa o poliacrilamida. Para la separación de ácidos

nucleicos se usan geles de agarosa o acrilamida y para proteínas, sólo de
acrilamida.
Buffer de corrimiento

El buffer de corrimiento es de la misma composición y pH que el buffer con el que

se prepara el gel de resolución, ya sea de agarosa o de acrilamida. Éste
proporciona el medio para la transmisión de la corriente eléctrica y mantiene el pH
sin variaciones mientras se realiza el corrimiento.

Marcador de peso molecular

Son moléculas de ADN o de proteínas que permiten determinar por comparación

el tamaño de los fragmentos de ácidos nucleicos o proteínas contenidos en las
muestras sometidas a electroforesis. Los marcadores de peso molecular están
disponibles comercialmente en amplia variedad. En el caso de marcadores de
peso molecular de ácidos nucleicos, éstos pueden ser fagos o plásmidos
sometidos a corte con enzimas de restricción que generan fragmentos de tamaño;
también puede tratarse de moléculas de ADN sintéticas denominadas escaleras,
porque contienen fragmentos con incrementos de tamaño gradual.

Buffer de carga

Este amortiguador tiene como fi n brindar peso, densidad y color a la muestra, lo

que facilita su depósito en el pocillo y evita su salida del gel; permite, además,
monitorear el corrimiento de la muestra en el gel. Se emplea en relación 1:3 para
ácidos nucleicos o 1:6 para proteínas, respecto a la cantidad de muestra.

Transiluminador ultravioleta

El transiluminador transmite luz del espectro ultravioleta a través de la muestra,

excitando la molécula cromogénica que emite energía fluorescente que permite
visualizarla. El transiluminador es el sistema empleado con más frecuencia por ser
simple y efectivo.
TIPOS DE ELECTROFORESIS

HORIZONTAL

Se lleva a cabo con el gel de agarosa para ácidos nucleicos .para el corrimiento el
buffer debe cubrir el gel, con la finalidad de evitar que se seque por el
calentamiento inducido por el paso de la corriente eléctrica. al momento de cargar
las muestra en los pocillos , se puede optar por hacerlo en seco, esto es llenar
parcialmente la cámara con liquido de corrimiento de tal manera que la parte
superior de gel no se cubra de buffer para que los pocillos puedan llenarse sin la
interferencia del liquido . Una vez cargada la muestra, se corre por unos minutos a
bajo voltaje hasta que la muestra entre en el gel y entonces se cubra todo con el
buffer de corrimiento. También existe la técnica de electroforesis submarina en la
que la totalidad del gel se cubre con el buffer de corrimiento desde el momento de
cargar las muestras en los pocillos, para tener en cuenta en esta técnica el buffer
debe cubrir el gel y es submarina por que el la muestra se coloca con el gel
sumergida en el buffer.
VERTICAL

Es empleada de forma exclusiva con gel de poliacrilamida, se utiliza para las

proteínas o ácidos nucleicos de pequeños tamaños el gel debe estar contenido
entre dos placas rectangulares de vidrio donde la corriente eléctrica se genera
gracias al buffer en el que se encuentra embebido el gel y llena las cubetas o
compartimientos del ánodo y el cátodo.

ELECTROFORESIS DE FRENTE MOVIL

La electrpforesis de frente movil es aquella en que las particulas se mueven de

forma libre en el medio que se encuentran dispersas

Las sustancias a separar se introducen en un tubo en forma de u , disueltas en un

tapon de pH y fuerza ionica decuados , se colocan los electrodos en sendos
brazos del dispositivo , entre los que se crea un campo electrico, provocando que
las moleculas de la muestra cargadas emigren haciaia los electrodos de polaridad
opuesta por ejemplo las proteinas.

PROCEDIMIENTO GENERAL DE UNA ELECTROFORESIS

A continuación, se exponen los pasos de los que consta una electroforesis típica.

1. Preparar un gel de agarosa o acrilamida a la concentración requerida.

2. Mezclar las muestras a analizar con un buffer de carga adecuado.

3. Cargar las muestras en el gel.

4. Realizar la corrida electroforética al voltaje pertinente.

5. Visualizar los ácidos nucleicos

FACTORES QUE AFECTAN A LA ELECTROFORESIS

1 CAMPO ELÉCTRICO

 diferencia de potencial :voltajes (v voltios )

 Intensidad (A – amperios): flujo de carga eléctrica, depende del V y del R
(Ley de Ohm V =RxI).
 Resistencia (R-Ohmios) :determinada por el soporte y tampón electroforesis
 temperatura: efecto Joule (refrigerantes).

2. MUETSRA

 Carga o densidad de carga : carga eléctrica /masa de molécula

 tamaño
 forma: formas globulares avanzan mas

3. TAMPON DE ELECTROFORESIS

 pH determina la carga de las moléculas , que generalmente es ligeramente

básica moléculas (-)
 fuerza iónica: moderada a (0,05 o 0,1 M) para que no interfiera.
BIBLIOGRAFIA

- Guo Y., Li X., Fang Y. T e eff ects of electroendosmosis in agarose

electrophoresis. Electrophoresis, 1998;19:1311-1213.

- Sambrook J., Russell D.W. Gel electrophoresis of DNA and pulsed- fi eld
agarose gel electrophoresis. En: Molecular cloning a laboratory manual, 3ª
ed. Nueva York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001.