Tesis de Licenciatura-VALERIA SANDER-“Aspectos endócrinos e inmunes de la acción de la N, N dimetilbiguanida: metformina en el tratamiento de la poliquistosis ovárica inducida en ratones BALB/c mediante androgenización con dehidroepiandrosterona”

Indice
Resumen……………………………………………...2
Introducción ....................................................4
Hipótesis de trabajo….....................................21
Objetivo de la tesis.........................................22
Materiales y Métodos ...................................23
Resultados ....................................................35
Discusión ......................................................50
Conclusión.....................................................62
Referencias ..................................................63
Agradecimientos …………………………………77
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Aspectos endócrinos e inmunes de la acción de la metformina en el tratamiento del PCOS
inducido por hiperandrogenización
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“Aspectos endócrinos e inmunes de la acción de la N, N

dimetilbiguanida: metformina en el tratamiento de la poliquistosis ovárica
inducida en ratones BALB/c mediante androgenización con
dehidroepiandrosterona”
Resumen
El síndrome del ovario poliquístico (PCOS) es un desorden endócrino complejo de origen

y sintomatología heterogéneos. Las mujeres con PCOS suelen presentar elevados niveles de
andrógenos e insulina y frecuentemente disfunción reproductiva (subfertilidad, anovulación ó
pérdida de la preñez temprana). A pesar de su prevalencia, se sabe muy poco acerca de su
etiología.
Durante los últimos años comenzaron a emplearse distintas terapias en esta patología.
La metformina (N,N dimetil-biguanida), droga sensibilizante a la insulina, resultó capaz de
resolver varias de las anormalidades metabólicas y permitió la concepción espontánea. Sin
embargo, la mayor parte de los estudios relacionados con la utilización de esta biguanida en
humanos ha sido observacional y se ha basado en el patrón menstrual y el perfil hormonal de
las mujeres afectadas.
Por ende, es útil analizar el rol de la metformina en la modulación de la
esteroidogénesis, la respuesta inmune y el estrés oxidativo, puesto que los hallazgos que se
realicen resultan de particular interés cuando se trata de ajustar tratamientos clínicos
utilizando combinaciones de drogas.
En el presente trabajo se estudió mediante la androgenización con
dehidroepiandrosterona (DHEA) de ratones prepúberes de la cepa BALB/c el rol de la
metformina en el tratamiento de la cistogénesis. En principio se examinó la morfología ovárica,
teniendo en cuenta el desarrollo folicular en ese órgano. Asimismo se abarcaron aspectos de
su funcionalidad como la secreción de progesterona (P 4) y estradiol (E2), dos de los principales
productos de la esteroidogénesis del ovario, asi como los niveles de PGE, prostanoide
involucrado en el proceso de ovulación.
En el tratamiento con DHEA disminuyó el número de folículos en desarrollo de
estadios tempranos y se observó un incremento en la atresia folicular. Cuando se administró
metformina en forma conjunta con DHEA, estos efectos fueron atenuados. Además, sólo los
individuos que recibieron el tratamiento DHEA desarrollaron quistes ováricos.
Luego de la androgenización los niveles de E2 y P4 aumentaron respecto del control,
mientras que los de PGE disminuyeron. La metformina fue capaz de revertir este efecto
respecto de la secreción de las tres hormonas.
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Por otra parte, existe una estrecha relación entre la insulina y la síntesis de
andrógenos: la hiperinsulinemia sería la principal causa del hiperandrogenismo en mujeres
con PCOS. Si bien en este trabajo no se ha evaluado directamente la sensibilidad a insulina,
se han medido algunos de sus marcadores como la concentración de insulina en suero, los
niveles de glucosa en sangre y el índice de homeostasis (HOMA), el cual refleja la relación
glucosa:insulina.
Los niveles de glucosa no se vieron modificados por la androgenización, a diferencia
de los de insulina y HOMA que se encontraron aumentados. La metformina logró restaurar la
concentración de insulina a niveles control así como los de HOMA, mas no modificó los de
glucosa, evidenciando un rol diferente al de antihiperglucemiante clásico.
Otro aspecto focalizado en este estudio fue el que se desprende de la consideración del
daño causado durante el desarrollo de PCOS al ovario por el exceso de especies reactivas del
oxígeno (ROS), referido generalmente como “estrés oxidativo”
.Con el fin de evaluar el balance oxidante/antioxidante del ovario se midió la
concentración de la enzima antioxidante catalasa (CAT), la concentración del metabolito
antioxidante glutation (GSH) y se estimó la peroxidación lipídica mediante la cuantificación del
producto malondialdehído (MDA).
Al inyectar durante 20 días consecutivos DHEA, se evidenció la presencia de estrés
oxidativo y daño al tejido ovárico. Se obtuvieron concentraciones de GSH y CAT menores al
control, mientras que el daño tisular ovárico fue evidenciado por altos valores en la
concentración de MDA. Estos efectos no pudieron ser revertidos por la aplicación conjunta de
metformina y DHEA, salvo en el caso de GSH, donde los valores fueron restaurados a los
control.
Por último y considerando el importante rol del sistema inmune en los procesos
ováricos y la patología quística se estudió por citometría de flujo, la expresión linfocitaria T en
ovarios, ganglios axilares y retroperitoneales y los niveles séricos del factor de necrosis
tumoral alfa (TNF-).
Por medio de citometría de flujo encontramos que la androgenización disminuyó el
porcentaje de T CD4+ y aumentó el de T CD8+ tanto del tejido ovárico como de los ganglios
retroperitoneales, mientras que no modificó el porcentaje en ganglios axilares.Por su parte, la
aplicación de metformina conjuntamente con DHEA fue capaz de restablecer la expresión de
las subpoblaciones linfocitarias a los valores control. Finalmente, el tratamiento con DHEA
incrementó los niveles de TNF-, los cuales llegaron a valores control cuando se administró
conjuntamente con metformina.
En conclusión, estos resultados indican que la metformina, directa e indirectamente es capaz
de participar en algunos aspectos de las respuestas endocrina e inmune.
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INTRODUCCIÓN
Síndrome de Ovario Poliquístico
Definición
El Síndrome de Ovario Poliquístico (PCOS) es una endocrinopatía común

entre las mujeres en edad reproductiva. Se caracteriza por disfunción reproductiva
asociada con desórdenes metabólicos. En estudios epidemiológicos se ha
encontrado que aproximadamente entre el 3,5 y el 10 % de las mujeres presentan
PCOS, dependiendo del criterio diagnóstico. Si se analiza la población subfértil, se
estima que el PCOS es diagnosticado en aproximadamente el 75 % de los pacientes
con infertilidad anovulatoria y en el 82 % de mujeres con abortos recurrentes.
Es una patología heterogénea que puede presentar hipersecreción de
hormona luteinizante (LH), niveles de hormona folículo estimulante (FSH) bajos o
normales, incremento en la atresia folicular, resistencia a insulina, diabetes
mellitus tipo 2 e infertilidad (Abbott, 2002) (Tabla 1). Los síntomas más comunes
son hiperandrogenismo -que puede generar hirsutismo y/ó acné-, irregularidad
menstrual e infertilidad (Abbott, 2002; Azziz, 2004; Franks, 1995).
Sin embargo, las consecuencias de este síndrome se extienden más allá del
eje reproductivo, puesto que este desorden aumenta sustancialmente el riesgo de
desarrollar anormalidades metabólicas y cardiovasculares (Tabla 1).
A pesar de su prevalencia, existen numerosos interrogantes respecto de su
etiología y patofisiología. Recientemente, en la reunión sobre PCOS desarrollada en
Rótterdam en el año 2003 fue recomendado definir este síndrome luego de la
exclusión de otras condiciones médicas que causen ciclos menstruales irregulares y
exceso de andrógenos como: (hiperprolactinemia, síndrome de Cushing,
acromegalia, neoplastia secretora de andrógenos, o hiperplasia adrenal congénita).
Acordándose el diagnóstico de PCOS cuando y la determinación de que al menos
dos de las siguientes condiciones estenán presentes: i) oligo o anovulación, ii)
hiperandrogenismo clínico o bioquímico o iii) ovarios poliquísticos (Azziz, 2004).
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 Ovarios Poliquísticos
 Hiperandrogenismo (hirsutismo,
acné)
 Anovulación (amenorrea,
Desórdenes reproductivos oligomenorrea)
 Hipersecreción de LH
 Riesgo de pérdida de la preñez
temprana incrementado.
 Hiperinsulinemia y síndrome de
resistencia a insulina
 Secreción disminuida de insulina
por células pancreáticas β y
diabetes mellitus tipo 2
Desórdenes metabólicos
 Obesidad (particularmente
adiposidad abdominal)
 Hiperlipidemia
Desórdenes de la salud en  Riesgo cardiovascular aumentado

 Cáncer de endometrio
general
Tabla 1. Importantes desórdenes reproductivos, metabólicos y de salud en general que

pueden manifestarse en mujeres con PCOS. Es importante destacar que sus combinaciones y
grado de expresión son muy variables entre los individuos.
Origen de la enfermedad quística
Existen evidencias que señalan que el PCOS podría tener la siguiente

secuencia de origen: Durante la gestación, la gonadotrofina coriónica (hCG)
placental, la LH de la pituitaria fetal y los genes que regulan la foliculogénesis y la
esteroidogénesis, individualmente o en conjunto, provocarían hiperandrogenismo,
conduciendo así a una exposición a andrógenos en exceso durante la etapa prenatal
y potencialmente prepuberal de la hembra en desarrollo. Luego, en la etapa

postpuberal, la exposición temprana a un exceso de andrógenos produce: (i)
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inhibición de la retroalimentación negativa para LH provocando su anormal
acumulación, (ii) aumento de la adiposidad abdominal (central) que genera
resistencia a insulina (incrementada por genes que regulan la diferenciación de
adipocitos, secreción y acción de insulina). La hiperinsulinemia resultante actúa de
forma sinérgica con la hipersecreción de LH, aumentando la esteroidogénesis, e
induciendo el arresto prematuro de folículos en desarrollo y la anovulación (Abbott,
2002).
Exposición prenatal/prepuberal
a andrógenos
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Adiposidad central
Secreción anormal de LH Resistencia a insulina
1
Hiperandrogenismo Anovulación
Ovario
1 genes que regulan

 Foliculogénesis
 Esteroidogénesis
HCG/LH
2 genes que regulan
 Secreción de insulina
 Acción de insulina
 Diferenciación de adipocitos
Figura 1. Diagrama representando la hipótesis del origen del desarrollo del

Síndrome del Ovario Poliquístico.
Desarrollo Folicular Normal y Patológico
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La formación de gametas femeninas (ovogénesis) es un proceso que ocurre en
el ovario. En la mayoría de las hembras de mamíferos comienza en la vida
intrauterina, quedando determinado en esta etapa el número definitivo de células
germinales. Luego del nacimiento, los ovocitos experimentan una división meiótica,
que queda arrestada en profase I, y son rodeados por una única capa de células
planas, llamada de la granulosa, que a su vez está rodeada por una lámina basal.
Una vez en la pubertad, el ovario adquiere sensibilidad a las gonadotrofinas
hipofisarias y se establece un ciclo ovárico productor de gametas.
Durante el desarrollo, los folículos van atravesando distintos estadios de
maduración. Los dos primeros, folículos primarios y secundarios, son de
crecimiento autónomo, es decir, poco influenciados por las hormonas plasmáticas.
Esto sucede en primer término porque se encuentran en una zona poco
vascularizada y en segundo término por la baja expresión de receptores para dichas
hormonas. La continuidad de este desarrollo está relacionada con la migración del
folículo a una zona vascularizada, la formación de una capa celular por fuera de la
lámina basal -la teca interna-, y la aparición de receptores para la FSH, el estradiol
(E2) y la testosterona en las células de la granulosa. Así, estas últimas expresan
receptores para FSH y las células exteriores, o de la teca, receptores para LH.
El folículo terciario contiene varias capas de células de la granulosa, debido a
la acción proliferativa de FSH, y dos capas de células de la teca -llamadas teca
interna y teca externa-. Finalmente se forma el antro con líquido folicular rodeando
al ovocito. Como resultado del efecto estimulatorio de las gonadotrofinas que llegan
por los capilares al folículo en desarrollo, el folículo terciario aumenta enormemente
de tamaño y se transforma en folículo preovulatorio o de Graff.
La duración total del proceso de foliculogénesis desde un folículo primordial
hasta uno preovulatorio es variada y depende de la especie. Se ha estimado en 85
días para la especie humana.
Durante la etapa de maduración folicular y bajo la influencia de LH y FSH,
los folículos producen y liberan estrógenos, predominantemente estradiol. Esta
síntesis ocurre gracias a la acción coordinada de las células de la teca y de la
granulosa tal como se esquematiza en la figura 2. En este proceso coordinado, los

andrógenos sintetizados por las células tecales, son aromatizados a estrógenos en
las células de la granulosa. Mientras que la LH estimula a las células tecales para
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producir andrógenos, la FSH aumenta los niveles de aromatasa promoviendo su
conversión a estradiol (Niswender, 2000).
Los niveles circulantes de estradiol aumentan progresivamente,
acompañando el crecimiento de los folículos, llegando hasta un nivel crítico que
activa el centro cíclico hipotalámico. Esto resulta en la liberación de un pulso de
GnRH, seguido de uno de LH, el cual desencadena la ovulación y la posterior
formación del cuerpo lúteo.
Sin embargo, no todos los folículos son ovulados. Un determinado número de
folículos preantrales durante la fase lútea tardía es reclutado y comienza su
crecimiento. El reclutamiento es el ingreso de folículos de un determinado tamaño a
la etapa dependiente de gonadotrofinas. Después de la etapa de reclutamiento,
durante la selección, emerge el folículo ovulatorio de la cohorte de folículos
reclutados. Aquellos que no son seleccionados, degeneran y mueren en un proceso
denominado atresia.
El desarrollo folicular temprano es normal en PCOS, sin embargo, la
maduración de los folículos antrales se encuentra alterada. Esta anomalía podría
estar dada por el estímulo de LH que sinergiza con el estímulo de la insulina, para
dar una respuesta prematura de las células de la granulosa. Esta respuesta
esteroidogénica actuaría suprimiendo la actividad de la aromatasa y el crecimiento
de las células de la granulosa, lo cual generaría un arresto de la foliculogénesis. De
esta manera los folículos continúan creciendo por el estímulo trófico hormonal y la
falta de una señal de “corte y ovulación”, por lo cual se convierten en quistes.
Pese a estos desarreglos hormonales, algunas mujeres con PCOS pueden
ovular con normalidad, mientras que otras presentan oligomenorrea o amenorrea.
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Figura 2. Modelo: “Dos células, dos gonadotrofinas”. La LH al unirse a su receptor en las

células de la teca estimula la síntesis de andrógenos, los cuales difunden a través de la
lámina basal y llegan a las células de la granulosa. La FSH estimula la actividad aromatasa,
que convierte los andrógenos en estrógenos.
Alteraciones hormonales en el PCOS
Niveles de LH y FSH
En el ciclo reproductivo normal, la secreción de LH hipotalámica es regulada

por la retroalimentación negativa que realizan cíclicamente los esteroides gonadales
estradiol y progesterona.
En esta patología parecería que esta retroalimentación está impedida por la
secreción tónica de estas hormonas. El resultado es una elevada secreción de LH,
por el aumento en la frecuencia y amplitud de los pulsos de secreción. Por otro
lado, la secreción de FSH puede o no hallarse inhibida. En este último caso ya no
por los esteroides, sino por la retroalimentación negativa realizada por las inhibinas
ováricas sobre la hipófisis. Cabe aquí aclarar que durante el desarrollo de PCOS, los
niveles de inhibina (hormona que inhibe la secreción de FSH), se encuentran
aumentados y se han correlacionado con los niveles de androstenediona
independientemente de la LH (Pigny 1997, 2000). Vale decir que una o más formas
de inhibinas podrían promover la producción de andrógenos ováricos por las
células de la teca en una regulación autócrina/parácrina.
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Además, la insulina incrementada podría actuar sobre las células
gonadotróficas aumentando la secreción de LH.
Secreción de hormonas esteroideas
El hiperandrogenismo, resultado de una esteroidogénesis alterada, es el

síntoma más frecuente en pacientes con PCOS, ya tengan ciclos sexuales normales
o anovulatorios. Sin embargo, la secreción de andrógenos se halla mucho más
incrementada en mujeres poliquísticas con anovulación que en aquellas con ciclos
regulares.
Este exceso de andrógenos circulantes proviene principalmente del ovario
(ver figura 3), aunque la glándula adrenal también puede contribuir a la secreción
de dichas hormonas. Los andrógenos aumentados son principalmente
dehidroepiandrosterona (DHEA) y DHEA sulfato, esta última de origen
exclusivamente adrenal. También aumenta la fracción libre de testosterona, debido
en primer término a la disminución de la proteína transportadora de hormonas
sexuales (SHBG) y en segundo término, a un leve aumento de la testosterona total
(Gori, 2001).
Los andrógenos son sintetizados en las células de la teca, las cuales poseen
la enzima P450c17. La actividad de esta enzima puede ser estimulada por la
activación de los receptores de insulina, los factores de crecimiento insulínicos
(IGFs) y LH. Por diversas causas, aún no totalmente esclarecidas, estos factores
suelen hallarse incrementados en PCOS y en consecuencia se produce un aumento
en la secreción de andrógenos. La insulina y los IGFs poseen un efecto proliferativo
sobre las células de la teca, lo cual contribuye a su hiperplasia, que conlleva una
mayor liberación de andrógenos.
Estudios realizados in vivo e in vitro, muestran que las células de la teca,
además de un sobrestímulo a la esteroidogénesis, presentan una alteración
intrínseca de su actividad. Cultivos primarios de células de la teca de mujeres
poliquísticas mostraron una secreción de androstenediona aumentada 20 veces con
respecto a las células provenientes de ovarios normales. Esto tiene su correlato en
la cantidad y actividad de enzimas esteroidogénicas, que también se hallaron
incrementadas (Gilling-Smith, 1994).
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P 450
P450 c17
scc 17 OH Pregnenolona
Colesterol Pregnenolona
3  HSD P 450 c17
PROGESTERONA Dehidroepiandrosterona (DHEA)
P 450 c17
17 OH Progesterona
3  HSD
P 450 c17
ANDROSTENEDIONA
17  HSD
Testosterona
P 450 AROM
ESTRADIOL
Figura 3. Diagrama de la esteroidogénesis y las enzimas involucradas en dicho

proceso.
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Prostaglandinas
Han sido denominadas “eicosanoides” las familias de prostaglandinas (PGs),

leucotrienos y compuestos similares que derivan de ácidos grasos esenciales de
veinte carbonos. Las prostaglandinas F2  y E2 son prostanoides producidos por
las células de la granulosa y de la teca del ovario durante la fase estrogénica del
ciclo sexual. Sin embargo, sólo la síntesis de PGs por las células de la granulosa se
encuentra influenciada por la acción de las gonadotrofinas, mientras que su
síntesis por parte de las células de la teca sería estimulada por otros factores. La
producción de PGs en el ovario podría estar influenciada por distintas citoquinas
proinflamatorias, entre ellas, interleukina 1 (IL-1) y factor de necrosis tumoral alfa
(TNF) (Navarra, 1996).
Las prostaglandinas (PGs) están involucradas en la regulación parácrina de
varias funciones ováricas, como es el caso de la ruptura folicular asociada a la
ovulación (Husein, 2003; Medan, 2003) y la luteólisis (Motta, 1999, 2001 (a)). Por
otro lado, niveles incrementados de PGE son responsables de la regulación de
linfocitos T durante el ejercicio físico excesivo (Lakier, 2003), presentan una acción
supresora de linfocitos T en ratones BALB/c (Kuroda, 2003) y suprimen la
diferenciación de células dendríticas asociadas a tumores (Yang, 2003).
Particularmente, la PGE es una molécula inmunosupresora (Wojtowicz-Praga, 1997)
que se ha encuentrado aumentada en pacientes con PCOS (Navarra, 1996).
Resistencia a la insulina
Entre las alteraciones más comunes en mujeres poliquísticas, se encuentra

el aumento de los niveles circulantes de insulina. Este aumento es el resultado de
la resistencia periférica a insulina, que puede verse acompañada por intolerancia a
la glucosa (Bergh, 1993), la cual resulta afectar aproximadamente al 40% de las
mujeres que padecen este síndrome.
Dunaif (1995) describe a la resistencia a insulina en PCOS como un defecto
en la transducción de las señales de insulina (autofosforilación en serina más que
en tirosina del componente intracelular del receptor para insulina) presente tanto
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en adipocitos como en músculos esqueléticos, los cuales son los principales blancos
de acción de esta hormona.
Se ha observado que existe una correlación entre el grado de
hiperinsulinemia y el grado de hiperandrogenismo, y los estudios realizados hasta
el momento parecerían indicar que lo segundo es consecuencia de lo primero
(Bergh, 1993). Esta relación está dada por la regulación negativa de la insulina
sobre la expresión de la proteina transportadora de andrógenos, SHBG, y el
estímulo a la esteroidogénesis ovárica.
Si bien en PCOS los niveles de insulina están relacionados con diversos
factores, tales como la grasa abdominal, el ejercicio físico, etc. se ha propuesto la
influencia de polimorfismos en genes relacionados con la secreción de insulina y
con la vía de señalización de la misma como su causa (Abbott, 2002) (Figura 1).
Asimismo, se ha observado que el Factor de Crecimiento Insulínico 1 (IGF-1)
se encuentra implicado en esta patología, dado que, junto con la insulina, cumple
un importante papel en la estereidogénesis y folículogenesis (Amato, 2003). El IGF-
1 se ha encontrado aumentado en PCOS. Más aún, se ha demostrado que las
proteínas transportadoras de IGF-1, principalmente la IGFBP-3, se encuentran
alteradas en la fase folicular de mujeres con PCOS regulando así la disponibilidad
de IGF-1 durante la patología (Amato, 1999).
Las especies reactivas del óxigeno (ROS) y el estrés oxidativo
Los radicales libres pueden ser definidos como moléculas o fragmentos de

moléculas con un electrón desapareado, el cual le confiere sus propiedades
características, entre ellas, alta reactividad química y por ello corta vida media. Las
especies reactivas del oxígeno (ROS) y derivados tóxicos del oxígeno, son los
radicales libres de mayor relevancia en las células de metabolismo aeróbico y entre
ellos podemos mencionar al radical superóxido (O2-.), al peróxido de hidrógeno (H2O2)
y al radical hidroxilo (OH-.).
Estas moléculas pueden ser originadas por procesos de ruptura homolítica
o por reacciones de transferencia electrónica. En muchos procesos metabólicos se
forman intermediarios radicales. En condiciones normales, estos son intermediarios
transitorios de reacciones reguladas enzimáticamente que pasan a producto bajo
condiciones controladas, sin llegar a acumularse.
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condiciones normales, estos son intermediarios transitorios de reacciones reguladas

enzimáticamente que pasan a producto bajo condiciones controladas, sin llegar a
acumularse.
Los radicales libres reaccionan con ácidos nucleicos y nucleótidos, con tioles,
constituyentes o no de proteínas, y con dobles enlaces de proteínas y de ácidos
grasos y nucleicos. Al reaccionar producen modificaciones químicas que se
acumulan con el tiempo y que producen deterioro del metabolismo celular
(Halliwell, 1984).
El estrés oxidativo se define como un desbalance entre la producción de ROS
y su “neutralización o inactivación” mediante sistemas protectores (Sabuncu, 2001).
Se encuentra implicado en la causa y progresión de diversas enfermedades y
desórdenes metabólicos, entre los cuales se pueden nombrar: involución temprana
del cuerpo lúteo, riesgos cardiovasculares, enfermedades del sistema circulatorio,
diabetes mellitus, enfermedades infecciosas, enfermedades cerebrales, etc. (Niwa,
1993; Erel, 1997; Finotti, 2000; Sabuncu, 2001; Vural, 2001). Más aún, en trabajos
recientes se demostró una relación directa entre el estado oxidante y antioxidante y
PCOS en mujeres registrandose un aumento en el estado oxidante y una
insuficiencia en el antioxidante. Es importante destacar que Además, se observó
que ambos estados se correlacionanban con los niveles de insulina circulantes y la
resistencia a la insulina, que son dos importantes factores alterados durante el
desarrollo de la enfermedad quística (Maser, 2002).
El daño oxidativo en las membranas lipídicas
El daño en las células se puede producir por una vía que depende
esencialmente del deterioro de las membranas biológicas. Las membranas
biológicas son siempre ricas en ácidos grasos poliinsaturados y se encuentran
bañadas por fluido con alto contenido de oxígeno y metales, por lo cual están muy
expuestas al ataque oxidativo. El mismo se puede producir por distintos
mecanismos. Entre ellos se destacan: la unión covalente de los radicales libres a
enzimas o receptores de membrana, a ácidos grasos poliinsaturados y la
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peroxidación lipídica de ácidos grasos poliinsaturados. Los efectos de estos cambios
son la modificación de la reactividad, excitabilidad, estructura, funcionamiento,
carácter antigénico y perjuicio de los mecanismos de transporte (Halliwell, 1984).
La peroxidación lipídica
La peroxidación lipídica transcurre en tres pasos. El primero (iniciación)

consiste en la abstracción de un átomo hidrógeno de un grupo metileno. Esto se
facilita si además existe otra doble ligadura en el carbono adyacente, como ocurre
en los ácidos grasos poliinsaturados de membrana. El radical hidroxilo es un típico
iniciador. Ni el radical superóxido, ni el peróxido de hidrogeno poseen la suficiente
energía para actuar directamente como iniciadores, aunque en presencia de iones
hierro su conversión a radical hidroxilo puede iniciar la peroxidación lipídica. En el
segundo paso (propagación), los radicales reaccionan nuevamente formando hidro-
peróxidos lipídicos, que en una tercera etapa de terminación se escinden en
pequeños derivados aldehídos (como el MDA) (Buege y Aust, 1979).
Los productos de la peroxidación lipídica son dañinos particularmente para
las proteínas asociadas a membrana con grupos tioles. Los grupos sulfhidrilos
reaccionan con los aldehídos derivados o con MDA, causando conversación cruzada
intra e intermolecular. Esto afecta, por ejemplo, a los receptores de gonadotrofinas,
y por ende influye sobre la capacidad esteroidogénica del cuerpo lúteo (Motta, 1999,
2001 (b)).
Mecanismos antioxidantes del tejido
Para evitar los daños producidos por la acumulación de ROS, en la célula

existen numerosos mecanismos protectores, que actúan como antioxidantes
endógenos.
Estos pueden ser los ejercidos por: i) enzimas como la superóxido dismutasa
(SOD), glutation peroxidasa (GSH-Px) y catalasa (CAT), ii) moléculas como el
glutation (GSH) o iii) vitaminas como la vitamina C, que capturan e inactivan los
radicales libres (Aten, 1992).
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Metabolito antioxidante: el Glutation (g-glutamilcisteinil glicina)
El glutation, tiol tripeptídico, es la molécula pequeña de mayor abundancia

en células animales. Tiene numerosas y variadas funciones: está implicado en la
síntesis de DNA y proteínas, regula la actividad enzimática y el transporte intra e

intercelular, y es el principal antioxidante en la célula. Esta última capacidad se
basa en que mediante la oxidación de sus grupos sulfhidrilos puede reducir
disulfidos y otras moléculas, pasando de glutation reducido (GSH) a glutation
oxidado (GSSG). Por lo tanto, modula el estado redox de la célula directamente,
neutralizando radicales libres, e indirectamente, manteniendo los grupos tioles de
otros antioxidantes y actuando como cofactor de enzimas detoxificantes. El GSSG
es reciclado a GSH por acción de la enzima glutation reductasa, y cuando
disminuye la concentración de GSH, como sucede en condiciones de estrés
oxidativo, se desinhibe su síntesis de novo (Luperchio, 1996).
Enzima antioxidante: la Catalasa (CAT)
La catalasa es una enzima antioxidante que “neutraliza” al peróxido de

hidrógeno originado en los tejidos:
CATALASA
2 H2O2 2 H 20 + O2
El peróxido de hidrógeno interviene en la funcionalidad del aparato

reproductor masculino y femenino. Cumple un rol fundamental durante la
capacitación del espermatozoide, además de intervenir en la unión del mismo a la
zona pelúcida (Aitken, 1989; Bize, 1991). Durante la regresión del cuerpo lúteo o
luteólisis se produce peróxido de hidrógeno (Riley, 1991) cumpliendo una función
antiesteroidogénica (Endo, 1991).
Sistema inmune y reproducción
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Existe numerosa evidencia avalando la hipótesis que en distintas especies,
las células del sistema inmune juegan un papel fundamental en la actividad cíclica
del ovario (Brannstrom, 1993). Su similitud con los procesos inflamatorios queda
evidenciada durante la ovulación y luteólisis, donde los cambios vasculares y el
influjo de leucocitos, incluídos los macrófagos, fueron las primeras evidencias que
llevaron a los investigadores a estudiar la posibilidad del control ovárico por el
sistema inmune (Bukovsky, 1979). La expresión linfocitaria T que infiltra al ovario
varía con el estadio del ciclo sexual, incrementandose el subtipo CD8+ durante la
luteólisis. Más aún, los linfocitos activados son una fuente importante de citoquinas
(Interferón , interleuquinas, factor de necrosis tumoral ) que a su vez son capaces
de modular la esteroidogénesis (Lawler, 1999).
En trabajos previos de nuestro laboratorio (Luchetti, 2004) se observó que la
inducción de quistes en ovarios de ratones de la cepa BALB/c prepúberes estaba
acompañada de un aumento en la infiltración linfocitaria T del subtipo CD8+ y una
disminución en la del subtipo CD4+. Estos resultados coinciden con aquellos
encontrados por Lu (2002) donde, posteriormente a la estimulación con estrógenos,
se evidenció un incremento en la población T CD8+ y en una población B
productora de citoquinas. Por otro lado, cambios selectivos en la población T se han
demostrado en la falla ovárica prematura (Chernyshov, 2001). Estas evidencias
junto con el hecho de que mecanismos inmunes regulan la foliculogénesis
(Brannstrom, 2002) podrían sugerir que la infiltración linfocitaria alterada en PCOS
podría estar relacionada con la atresia folicular descrita. Más aún, la población
enriquecida de CD8+ T se halla involucrada con un incremento en la producción de
citoquinas (Araya, 2002; Korhonen, 2002; Peral, 2002; Sayin, 2003; Deshpande,
2000).
Factor de Necrosis Tumoral alfa (TNF- )
El Factor de Necrosis Tumoral alfa (TNF-) es una citoquina que se ha visto

incrementada en el suero de mujeres con PCOS (Amato, 2003). En el ovario puede
ser sintetizada por una variedad de tipos celulares, entre ellos células luteales
grandes, macrófagos y linfocitos.
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Esta citoquina tiene dos vías de acción antagónicas mediadas por sus
receptores de tipo I y II. El primero se hallaría implicado en señales apoptóticas,
mientras que el segundo mediaría una respuesta proliferativa.
En el ovario, el efecto de esta citoquina dependerá del tipo celular y del
estadio de desarrollo folicular, así como también se han observado diferencias entre
especies.
Spaczynski (1999) demostró que tiene un efecto proliferativo sobre cultivos
primarios de células de la teca intersticiales de rata, aumentando en particular, el
número de aquellas células con actividad esteroidogénica. A pesar de que esta
citoquina es conocida por inhibir la síntesis de andrógenos y progesterona, el
balance de la secreción de andrógenos en el tejido sería positivo, dado que prevalece
el aumento de las células esteroidogénicas sobre su menor actividad. Este estímulo
sobre la proliferación celular que resulta en una esteroidogénesis incrementada es
consistente con la hipertecosis y con el aumento de la secreción de andrógenos por
parte de las mismas, observados en PCOS. Estos autores (Spaczynski, 1999)
observaron que el efecto proliferativo de TNF- resulta aditivo con el de insulina e
IGF-I, indicando que no comparten la misma vía de transducción de la señal.
Cabe destacar que el TNF- es una citoquina de “tipo Th1”, esto es, del tipo
de citoquina que promueve la reabsorción embrionaria desatando los mecanismos
correspondientes (Romagnani, 1997).
La Metformina: (N,N dimetil biguanida) como tratamiento de PCOS
Las terapias farmacológicas tradicionales utilizadas en el tratamiento de

PCOS, generalmente están dirigidas a controlar los síntomas a corto plazo, mas no
corrigen los riesgos metabólicos asociados, a largo plazo. Recientemente, ha surgido
numerosa evidencia indicando que la insulino resistencia posee importantes
implicancias en la patogénesis de PCOS, y más aún, que las drogas sensibilizantes
a insulina como la metformina, la roziglitazona, la troglitazona o el d-quiro-inositol,
podrían resultar una aproximación terapeútica muy útil (Hasan, 2005).
Entre ellas, la N,N´dimetil biguanida: metformina comenzó a emplearse como

un agente hipoglucémico oral a finales de la década del ’50 en Europa, y fue
introducida en los Estados Unidos en 1994, momento a partir del cual comenzó a
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utilizarse ampliamente en el tratamiento de la diabetes tipo II. Aunque su
mecanismo molecular aún no se conoce, i) promueve la captación de glucosa en los
músculos por estimulación insulínica, ii) disminuye la producción de glucosa y
aumenta la oxidación de ácidos grasos en el hígado (Hawley, 2002), mientras que
no acarrea riesgos significativos de producir acidosis láctica (Sáenz Calvo, 2005).
Como se mencionó anteriormente aún se desconoce el alcance del
mecanismo de acción de la droga. Por ejemplo, se ha encontrado que la droga
revierte el síndrome de insulino resistencia que se encuentra generalmente
asociado a PCOS (Harbone, 2003) y regula la actividad esteroidogénica (La Marca,
2002). Sin embargo resultan controvertidos los resultados correspondientes a la

acción de la metformina sobre el sistema inmune. Así, se ha demostrado que esta
biguanida regula la actividad quinasa del receptor de insulina mediante la
regulación del antígeno de diferenciación de células plasmáticas (PC-1) (Stefanovic,
1999), pero no pudo demostrarse su efecto sobre la proliferación de linfocitos T en
ganglios linfáticos (Ruat, 2003).
HN NH
(CH3)2 N C NH C NH2
Figura 4: Fórmula molecular de la N, N dimetilbiguanida: metformina
¿ Por qué este modelo de estudio ?
En 1962, Mahesh y Greenblatt, lograron aislar dehidroepiandrosterona

(DHEA) del tejido ovárico de mujeres con poliquistosis ovárica. Más tarde se observó
que este andrógeno es el que presenta mayor aumento en dicha patología (Coney,
1984).
19
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Desde entonces, se han utilizado diversos modelos experimentales para el
estudio de PCOS, que se han enfocado sobre distintos aspectos del síndrome. Un
modelo murino creado por Roy (1962) reproduce el PCOS mediante la inyección
diaria de DHEA, obteniéndose la mayoría de los aspectos salientes de la patología
humana.
Subsecuentes estudios avalaron este modelo (Lee, 1991; Anderson, 1992;
Lee, 1998; Henmi, 2001) y lo confirmaron como óptimo para el estudio de la
patología quística.
Mediante este modelo, se observó la formación de quistes, la elevación de los
niveles de los andrógenos DHEA y testosterona, y de los niveles de LH, no así de los
de FSH (Lee, 1991). En estudios previos realizados en nuestro laboratorio (Luchetti,
2004) se encontró que la inducción de PCOS en ratones prepúberes hembras de la
cepa BALB/c inducía la formación de quistes de ovario y aumentaba la producción
de estradiol. Coincidiendo con los hallazgos en mujeres con PCOS, se observó que
modificaba el balance oxidante-antioxidante, ya que aumentaba la peroxidación
lipídica (como índice de estrés oxidativo y oxidación) y disminuía la de glutation
(metabolito antioxidante).
Asimismo, se encontraron variaciones en la expresión fenotípica de linfocitos
T que infiltran al ovario quístico y ganglios linfáticos retroperitoneales. En controles
de ambos tejidos, la proporción de T CD4+ y CD8+ era equivalente, mientras que
luego de la inducción de quistes ováricos con DHEA, disminuía la expresión de T
CD4+ y aumentaba la de T CD8+. Estos resultados coinciden con lo publicado por
Lu (2002), quién encontró que luego de la administración de E en ratas se producía
un aumento de la población T CD8+ que se correlacionaba con un aumento de la
población de células B productoras de citoquinas.
En el presente trabajo de investigación utilizamos el modelo de
androgenización con DHEA a fin de estudiar los efectos del tratamiento con
metformina.
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Hipótesis de trabajo
El tratamiento con metformina sería capaz de restaurar la funcionalidad ovárica no
solo modulando el sistema insulina/glucosa, sino también a través de una acción
novedosa restableciendo parámetros hormonales y del sistema inmune.
Ovario Poliquistico
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Objetivo de la Tesis
El objetivo del presente trabajo es el estudio de la acción de la metformina sobre los
sistemas endócrino e inmune en el tratamiento de PCOS inducido en ratones de la
cepa BALB/c mediante androgenización con dehidroepiandrosterona.
De acuerdo al objetivo general, se proponen los siguientes objetivos parciales:
 Cuantificación del desarrollo folicular en el modelo de PCOS inducido por

dehidroepiandrosterona en ratones prepúberes BALB/c. Efecto de la metformina.
 Determinación de la funcionalidad ovárica durante la inducción de poliquistosis

ovárica mediante la androgenización de ratones BALB/c con
dehidroepiandrosterona. Acción de la metformina.
 Establecimiento del síndrome de insulino resistencia.
 Evaluación del balance oxidante-antioxidante en el ovario. Relación con el PCOS.

Efectos del tratamiento con metformina.
 Estudio de la relación de las subpoblaciones linfocitarias T CD4+/CD8+ en

ovarios y ganglios retroperitoneales (drenantes de ovario), comparación con
ganglios axilares. Acción del tratamiento con metformina en la expresión del
subtipo linfocitario.
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 Producción de TNF  sérico y rol de metformina.
MATERIALES Y MÉTODOS
1. Modelo Experimental
1.1 Animales
Se utilizaron ratones hembras prepúberes (25 díasde edad) de la cepa BALB/c,

mantenidos en condiciones controladas de temperatura (23ºC) e iluminación (14
horas luz, 10 horas oscuridad) con agua y alimento ad libitum.
1.2 Modelo de disfunción ovárica por poliquistosis:
Como modelo de poliquistosis ovárica se usó el propuesto por Lee en 1998, que
consiste en la androgenización con dehidroepiandrosterona (DHEA), levemente
modificado por Luchetti (2004) con el fin de ser aplicado en ratones.
Los grupos experimentales fueron:
Grupo DHEA: los animales fueron inyectados subcutáneamente con DHEA (dosis:
60 mg /kg peso corporal, disuelto en 0,1 ml de aceite vegetal), diariamente durante
un lapso de 20 días.
Grupo DHEA + Met : los animales fueron inyectados subcutáneamente con DHEA
(dosis: 60 mg/kg peso corporal, disuelto en 0,1 ml de aceite vegetal) y les fue
administrada metformina oralmente por medio de una cánula (dosis: 50 mg/kg de
23
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peso corporal disuelto en 0,05 ml de agua). Ambos tratamientos fueron aplicados
conjuntamente durante 20 días.
Grupo control: los animales de este grupo fueron inyectados con aceite vegetal (0,1
ml) y se les suministró agua (0,05 ml) oralmente por medio de una cánula. Ambos
tratamientos fueron aplicados diariamente durante 20 días. (Ver figura 5).
Durante los 20 días de tratamiento se tomaron extendidos vaginales de cada

individuo con el fin de determinar el estadio del ciclo sexual en el que se
encontraban. Tal como fue hallado en trabajos previos (Luchetti, 2004), sólo los
animales pertenecientes al grupo DHEA exhibieron estro constante. Los individuos a
los cuales se suministró cualquiera de los otros tratamientos (grupo DHEA + Met,
grupo control) mostraron distintos estadios del ciclo. Sin embargo, ninguno de ellos
presentó un ciclo sexual completo hasta el día del sacrificio. Debido a este hecho se
decidió tomar muestras sólo de animales que en el momento del sacrificio
exhibieran estadio de estro (en todos los grupos).
Luego de 20 días de tratamiento, 20 ratones por grupo fueron anestesiados en
una cámara saturada con éter, y posteriormente fueron sacrificados por
desmedulación.
Grupo Control
1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 1 2 1 3 1 4 1 5 1 6 1 7 1 8 1 9 2 0
Inyección durante 20 días consecutivos de

vehículo (0.1 ml aceite).
Administración oral de vehículo (agua 0.05 ml) Sacrificio
durante 20 días
Grupo DHEA
1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 1 2 1 3 1 4 1 5 1 6 1 7 1 8 1 9 2 0
Inyección durante 20 días consecutivos de DHEA

(60mg/kg de peso en 0.1 ml vehículo).
Sacrificio
Grupo DHEA +Met
1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 1 2 1 3 1 4 1 5 1 6 1 7 1 8 1 9 2 0
Inyección durante 20 días consecutivos de DHEA

(60mg/kg de peso en 0.1 ml vehículo).
Administración oral de Metformina(50 mg/kg de
peso en 0.05 ml de vehículo) durante 20 días
Sacrificio
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_______________________
Figura 5: Esquema del modelo experimental, especificando los 3 grupos de animales con los
cuales se trabajó.
1.3 Muestreos
Previo al sacrificio, se tomaron muestras de sangre y se determinaron los

niveles de glucosa de todos los animales sacrificados (N=20 por grupo). Luego, por
centrifugación (15 minutos, 900 g, 4ºC) se aisló el suero. Este fue conservado a
-70ºC hasta la realización de los ensayos para estradiol (E 2), progesterona (P4),
insulina y TNF-.
Se extrajeron ovarios. De cada grupo, 10 ovarios fueron incluidos en
formaldehído 4% (fijación) para la posterior realización de estudios morfológicos,
otros 10 fueron inmediatamente procesados para estimar la proporción de
subpoblaciones de linfocitos T, 10 fueron incubados durante 1h a 37ºC con CO 2 en
Krebs con el fin de medir PGE liberada en el medio de cultivo y los restantes
guardados a –70ºC para luego procesarlos y evaluar el balance oxidante/
antioxidante del tejido.
También fueron obtenidos los ganglios axilares y retroperitoneales de los 20
animales de cada grupo, los cuales fueron procesados inmediatamente a fin de
evaluar la proporción de las subpoblaciones de linfocitos T.
Todos los ensayos fueron repetidos tres veces.
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OVARIO
Morfología SANGRE
Peroxidación lipídica Hormonas P4 y E
Glutation TNF alfa
Catalasa Glucosa
PGE Insulina
Cuantificación linfocitos T
CD4+/CD8+
Proteínas
NÓDULOS LINFÁTICOS AXILARES Y

RETROPERITONEALES
Cuantificación linfocitos T CD4+/CD8+
Figura 6: Muestreo y estudios realizados

2. Ensayos
2.1. Evaluación de la morfología del ovario:
Con el fin de evaluar el efecto de la metformina sobre el desarrollo folicular, el

número de folículos en los distintintos grupos fue cuantificado. En 10 ovarios de
cada grupo (previamente fijados e incluidos en parafina) se realizaron cortes
histológicos seriados (6 m/sección cada 50 m). Estos fueron montados en
portaobjetos cubiertos de gelatina (Biobond, British Biocell Internacional, Cardiff).
Posteriormente fueron desparafinados y teñidos con hematoxilina-eosina para
observar su morfología bajo un microscopio de luz y la proporción de cada tipo de
folículo fue expresada por ovario. El área del ovario fue medida con Easy Image
Mating (version 1.66; Bergstr m Instrument AB, Solna, Suecia). Los tipos foliculares
fueron definidos de acuerdo al criterio propuesto por Cheng (2002) y Hu (2004).
Según estos autores los folículos primarios son aquellos que poseen un oocito
rodeado de una única capa de células cúbicas (granulosa). Los folículos preantrales
son los que poseen un oocito rodeado por 2 o más capas de células de la granulosa,
26
__________________________________________________________________________________________
_______________________
pero carecen de antro. Los antrales se distinguen por poseer un antro entre las
distintas capas de células de la granulosa que rodean al oocito. Los folículos se
clasificaron como atrésicos si cumplían 2 o más de los siguientes criterios: más de
dos núcleos picnóticos, células de la granulosa adentro de la cavidad antral, células
de la granulosa desprendiéndose de la membrana basal, o número impar de capas
de células de la granulosa (Cheng, 2002; Hu, 2004).
2.2 Actividad secretora del ovario:
Obtención de las muestras para la evalución de la producción de

Progesterona y Estradiol.
Previo al sacrificio, se extrajo sangre de los animales anestesiados con éter.

De la misma se separó el suero, por centrifugación (15 minutos, 900 g, a 4°C).
El suero obtenido de cada individuo para la determinación de P 4 y E2 fue
extraído 3 veces con volumen de 1 ml de eter dietílico. Luego fue secado en una
atmósfera de N2 y conservado a –20°C hasta el momento de realizar el
radioinmunoensayo de P4 o E2.
2.2.1 Producción de Progesterona
Se evaluó por radioinmunoensayo (RIA) con anticuerpo específico (provisto por

el Dr. GD Niswender, Colorado State University, Ford Collind, CO) la concentración
de P4 en suero (Motta, 2001 (b)). Los reactivos y las muestras fueron reconstituídos
en el Buffer de RIA Progesterona (Na 2HPO4*2H2O 40mM, NaH2PO4 34 mM, NaCl 154
Mm, Gelatina 0,1 %, Azida Sódica 0,002%, pH= 7). Tanto las muestras patrones
como las muestras a ensayar (100 l) se incubaron a 4 ºC toda la noche con 200 l
del anticuerpo anti-P4 y 100 l del metabolito marcado con tritio (17a-Hidroxi-
[1,2,6,7-3H] Progesterona, 60 Ci/mmol, 1 mCi/ml, Amersham Corporation,
Arlington Heights USA). Las uniones inespecíficas se separaron mediante el
agregado de 200 l de una suspensión de carbón activado-dextrán (Carbón 1%,
Dextrán 0,1 % en Buffer RIA) y centrifugación a 2000 g por 15 minutos a 4ºC en
centrífuga refrigerada (Sorvall RC-5B).
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_______________________
El sobrenadante de centrifugación se recogió en viales conteniendo líquido de
centelleo, y se cuantificó la radioactividad en un contador de centelleo líquido beta.
Los resultados se calcularon a partir de una curva patrón de progesterona y se
expresaron en ng P4/mg proteína.
2.2.2 Producción de Estradiol
Se evaluó por radioinmunoensayo (RIA) con anticuerpo específico (provisto por

el Dr. GD Niswender, Colorado State University, Ford Collind, CO) la concentración
de estradiol en suero. Los reactivos y las muestras se reconstituyeron en el Buffer
de RIA Estradiol (Tris HCl 0,05 M, NaCl 0,1 M, Gelatina 0,1 %, Azida Sódica 0,1%,
pH 8). Tanto las muestras patrones como las muestras a ensayar (100 l) se
incubaron a 4 ºC toda la noche con 200 l del anticuerpo anti-E y 100 l del
metabolito marcado con tritio-[2,4,6,7,16,17- 3H] Estradiol, 250µCi, Amersham
Corporation, Arlington Heights USA). Se utilizó para separar las uniones específicas
una suspensión de carbón activado-dextrán (Carbón 1%, Dextrán 0,1 % en Buffer
RIA) y centrifugación a 2000g por 15 minutos a 4ºC en centrífuga refrigerada
(Sorvall RC-5B).
El sobrenadante de centrifugación se recogió en viales conteniendo líquido de
centelleo, y se cuantificó la radioactividad en un contador de centelleo líquido beta.
Los resultados se calcularon a partir de una curva patrón de estradiol y se
expresaron en ng E2/mg proteína.
2.2.3 Niveles de PGE producida y liberada al medio.
La medición de PGE fue llevada a cabo en el medio de incubación, dado que

previamente hemos corroborado que tanto los homogenatos como el tejido incubado
reflejaban los niveles de este prostanoide.
Brevemente, el tejido (de cada ovario) fue pesado e incubado en Krebs- Ringer-
Bicarbonato (KRB) con glucosa (11 mmol/l) como sustrato externo (pH =7.0) por 1
hora en un agitador Dubnoff, bajo una atmósfera húmeda de 5% de CO 2 en 95% de
O2 a 37ºC. Al finalizar el período de incubación el tejido fue retirado y la solución
acidificada a pH 3 con HCl y extraído para la determinación de las prostaglandinas
28
__________________________________________________________________________________________
_______________________
3 veces con volumen de 1 ml de acetato de etilo. Luego fueron secados en una
atmosfera de N2 y guardados a –20°C hasta el momento de realizar el
radioinmunoensayo de PGE.
Se evaluó por radioinmunoensayo (RIA) con anticuerpo específico (Sigma
Chemical Co, USA) la concentración de PGE en el sobrenadante de cultivo, previa
extracción. La técnica se basa en aquella descripta por Campbell (1987) y posee
una sensibilidad de 5 pg/tubo, con reactividad cruzada menor al 0,1%.
Brevemente, los reactivos y las muestras son reconstituidos en el buffer de RIA
Prostaglandinas (K2HPO4*3H2O 7,30 mM; K2HPO4 2,70 mM; NaCl 154 mM;
Albúmina Bovina 7,14 mM; Azida sódica 15,38 mM; PH 7,4). Tanto las muestras
patrones como las muestras a ensayar (100 l) se incuban por 30 minutos con 500
l del anticuerpo anti- PGE a 4ºC. Luego se agregan 100 l del metabolito PGE
marcado con tritio ([ 5,6,8,9,11,12,14,15 (n)-3H ]- PGE; 160Ci/ml (Sigma Chemical
Co, St. Louis, MO, USA) y se incuban por 1 hora a 4ºC. Una vez transcurrida la
hora, se agregan 200 l de una suspensión de carbón activado-dextrán (Carbón
1% / Dextrán 0,1% en buffer RIA Prostaglandinas), se deja reposar por 10 minutos
a 0ºC y finalmente se realiza una centrifugación a 2000g por 15 minutos a 4ºC en
centrífuga refrigerada (Sorvall RC-5B).
El sobrenadante de centrifugación se colecta en viales conteniendo líquido de
centelleo y se procede a cuantificar la radioactividad en un contador de centelleo.
Los resultados (pg PGE por tubo) se calculan a partir de una curva patrón de
Prostaglandina (15-4000pg), y los resultados finales se expresan en ng PGE/mg
proteína.
2.3 Establecimiento del Síndrome de insulino resistencia
Aunque la sensibilidad a insulina no fue determinada en forma directa, se

estableció en forma indirecta mediante la evaluación de marcadores que la
involucran, como son los niveles de glucosa en sangre y los de insulina en suero.
29
__________________________________________________________________________________________
_______________________
2.3.1 .Determinación de glucosa en sangre
Se emplearon tiras reactivas HAEMO- GLUKOTEST (Roche) que utilizan la

reacción glucosa oxidasa / peroxidasa. Las tiras actúan en el rango 20-800 mg/100
ml (1-44 mmol/l). Los resultados se expresaron en mmol glucosa/l suero.
2.3.2. Cuantificación de insulina en suero
Se utilizó el método de Coat-A-Count (Diagnostic Products Corporation, USA),

el cual inmoviliza el anticuerpo contra insulina de ratón en tubos de polipropileno.
Luego de la incubación con I125 insulina, se centrifugó y se descartó el
sobrenadante (uniones inespecíficas). En los tubos se cuantificó mediante contador
de centelleo gamma la radioactividad. Se realizó una curva patrón, y se
extrapolaron en la misma los valores de las muestras, obteniendo así la
concentración de insulina en suero, expresada en pg de insulina/ ml suero. La
sensibilidad analítica fue de 1.2 mUI insulina/ml de suero.
2.4 Evaluación del balance oxidante/antioxidante del tejido ovárico
2.4.1 Obtención de las muestras
Como se explicó previamente, los ovarios fueron extraídos y conservados a –

70ºC. Posteriormente se homogeneizaron manualmente a 0ºC en buffer de
homogeneización para estrés oxidativo (EDTA 1Mm, KCl 150Mm, b Mercaptoetanol
1mM, Tris Base 20 mM, Sacarosa 500 mM.). El homogenato fue centrifugado a
10000 g, 4ºC por 10 minutos. Se separó el sobrenadante y fue fraccionado para los
ensayos de peroxidación lipídica, glutation, catalasa y determinación de proteínas.
2.4.2 Análisis de peroxidación lipídica del tejido ovárico
El fundamento de esta técnica radica en que al existir un desbalance

oxidante/antioxidante en las células, los radicales libres producidos actúan sobre
los ácidos grasos de las membranas provocando reacciones que tienen, entre sus
30
__________________________________________________________________________________________
_______________________
subproductos al malondialdehído (MDA). El mismo es capaz de combinarse con el
ácido tiobarbitúrico (TBA) formando un reactivo de color que puede cuantificarse a
535 nm en espectrofotómetro (Buege y Aust, 1978).
Brevemente: se incubaron 350 l de sobrenadante con 650 l TBA 0,67 % (TCA
15% p/v, TBA 0,375 % p/v, HCl 0,25 N) por 20 minutos a 100ºC. La reacción se
detuvo por inmersión en hielo, leyéndose la absorbancia a 535 nm dentro de los
siguientes 5 minutos. Se realizó una curva patrón de MDA, y los resultados se
expresaron como moles MDA/ g tejido.
2.4.3. Medición del contenido de glutation total
El método (Tietze, 1969) se basa en la reacción de reducción del ácido 5,5,-

ditiobis-2 nitro benzoico (DTNB), llevada a cabo por el glutation reducido (GSH), en
medio reductor. Al reducirse, el DTNB forma compuestos coloreados, que es posible
cuantificar a 412 nm. Para medir el glutation total, se agrega glutation reductasa al
medio, enzima que cataliza el pasaje de glutation oxidado (GGSG) a su forma
reducida.
La determinación se realizó en el homogenato de ovario. Se colocaron 900 l de
buffer, 100 l de muestra, 50 l de NADPH, 20 l del reactivo de Ellman (DTNB) y,
en último lugar, 20 l de GR. Considerando la linealidad de la reacción, se registró
la absorbancia a cada minuto, durante los primeros 6 minutos a fin de determinar
la pendiente de la reacción. Con el objeto de cuantificar el contenido de glutation, se
comparó con la pendiente de una reacción que se incubó con una concentración de
GSH conocida. Los resultados se expresaron como moles de GSH/gr tejido.
2.4.4. Medición de la actividad enzimática de catalasa (CAT)
El fundamento de esta técnica es que la catalasa cataliza la descomposición

de peróxido de hidrogeno en agua y oxígeno, por medio de la siguiente reacción:
catalasa
2 H2O2  2 H2O + O2
El agua oxigenada absorbe luz a 240 nm, por lo cual su desaparición se

puede determinar por espectrofotometría, a esa longitud de onda.
31
__________________________________________________________________________________________
_______________________
Se colocaron 100 l de muestra en 3 ml de Buffer Fosfato 50 mM pH = 7,2,

luego se agregaron 100 l de peróxido de hidrogeno 3M y se midió la DO a 240 nm
durante 1 minuto, cada 10 segundos.
Para obtener la cantidad de catalasa en la muestra, se realizaron una serie

de cálculos descriptos y fundamentados por Chance (1954). Brevemente, se graficó
el log [H2O2] en función del tiempo, y se calculó la pendiente del gráfico. Esta es la k
´. Finalmente,
k´x dilución / k x mg de proteína = [ catalasa ] = nmoles / mg de proteína.

Donde k es una constante, que en nuestro modelo vale 4.6 x 10 -7 M-1 s-1.
2.5 Actividad del sistema inmune
2.5.1. Expresión linfocitaria en ovarios, ganglios axilares y retroperitoneales.
Teniendo en cuenta la activa interrelación entre el sistema inmune y el

endócrino en los procesos fisio-patológicos del ovario, fue de nuestro interés
establecer si la patología ovárica era capaz de alterar la expresión de las
subpoblaciones de linfocitos T y por lo tanto la producción de citoquinas. Asimismo
se determinó si la metformina era capaz de modular estas anomalías. Con este fin,
se estudió la expresión de linfocitos T CD8+ y CD4+ en ovarios (10 por grupo),
ganglios axilares (40 por grupo) y retroperitoneales (40 por grupo) (drenantes de
ovario).
Obtención de las muestras
Para llevar a cabo la técnica de citometría de flujo, el tejido ovárico y los

ganglios linfáticos debieron dispersarse (Luchetti, 2004). Brevemente, los ovarios y
ganglios fueron disgregados enzimáticamente en medio de cultivo (M199 /Hepes
25mM/NaHCO3 26 mM y penicilina 50UI/ml) con colagenasa libre de tripsina
(740UI/100mg tejido). Luego de 90 minutos, las células fueron lavadas 2 veces con
medio de cultivo, dos veces con Buffer Salino Dulbeco-Fosfato libre de Ca ++ y Mg ++
32
__________________________________________________________________________________________
_______________________
(PBS) y dos veces con medio de cultivo conteniendo EDTA (1 mM). Para eliminar los
glóbulos rojos, las suspensiones fueron aplicadas a Ficoll- hystopaque gradiente
1.077 (Sigma, Saint Louis, USA), centrifugadas a 400g por 45 minutos y lavadas
con PBS 0,1% BSA. Los linfocitos T obtenidos se contaron en cámara de Newbauer
y resultaron presentar una viabilidad del 80 % según el método de tinción con
tripan blue.
Citometría de flujo T CD4+/CD8+:
Las células se resuspendieron hasta una concentración de 1 x 10 6 células por

ml y se sometieron a inmunofluorescencia directa con marcación de dos
fluorocromos. Brevemente, 100 l de la suspensión celular fueron incubados con
2.5 µl de anticuerpos anti CD8 (conjugado con FITC; eBioscience, USA) y 2.5 l de
anticuerpos anti CD4 (conjugado con PE: ficoeritrina; eBioscience, USA) por 30
minutos a 4ºC y luego lavados con BSA 1% en PBS. El control de isotipo lo
representó la incubación con PE IgG2a de rata, isotipo k y FITC IgG2a de rata
isotipo k. Los anticuerpos fueron utilizados a saturación tal como lo indica la
titulación previa. Luego las muestras fueron lavadas con PBS y PBS-EDTA, fijados
en paraformaldehído 4 % y conservadas a 4ºC, en la oscuridad hasta la medición de
CD4+ y CD8+ por citometría de flujo llevada a cabo dentro de los 6 días posteriores
a este tratamiento.
Las mediciones se realizaron con el equipo de citometría del Instituto LANAIS,
División Inmunogenética del Hospital de Clínicas “Gral José de San Martín” (UBA).
El análisis fluorométrico fue evaluado con FACScan ® y se utilizó el programa
Winmdi 2.8. Las suspensiones celulares se analizaron utilizando diferentes
características de las células T como la granulosidad y tamaño. Luego, se
adecuaron los parámetros del análisis al de esas características en los linfocitos T
de ratón. Tanto el cuadrante como la ventana de análisis se conservaron a lo largo
de toda la cuantificación. La determinación de citometría de flujo fue realizada
utilizando fluorescencia Standard 1 (FL1: FITC- anti linfocito CD8+ de ratón)
fluorescencia standard 2 (FL2: PE- anti linfocito CD4+ de ratón). Se analizaron en
cada muestra de tejido ovárico 50.000 células totales y en ganglios linfáticos un
total de 10.000 linfocitos.
33
__________________________________________________________________________________________
_______________________
2.5.2. Cuantificación de TNF alfa:
A partir del suero de los animales (obtenido como se especificó con

anterioridad) de los distintos grupos, se cuantificó la producción de TNF- mediante
la utilización de un kit de ensayo inmunométrico enzimático (EIA) para esta
citoquina (Assay Design´s Mouse, MI, USA).
Brevemente, este kit consiste en una placa de 96 wells, que trae unido un
anticuerpo monoclonal contra TNF- de ratón. Se incubaron 200 l de suero,
agregando luego un anticuerpo policlonal contra TNF- de ratón, que se une al
TNF- capturado en la placa. Luego de una corta incubación se volcó el contenido y
lavó el exceso de anticuerpo. Se agregó anticuerpo de burro contra IgG de conejo
conjugado a peroxidasa de caballo, que se une al anticuerpo policlonal contra TNF-
 Se cortó la reacción y midió la absorvancia a 450 nm. La DO es directamente
proporcional a la concentración de TNF-.
Se realizó una curva patrón, donde se extrapolaron los valores de DO
muestrales, obteniendo así la concentración de TNF- en pg/ml suero.
3. Medición de la Concentración de proteínas
La cuantificación de proteínas en los homogenatos de ovario se realizó por el

Método de Bradford.
4. Análisis Estadístico
El análisis estadístico se realizó mediante análisis de varianza (ANOVA) no

paramétrico. Se realizaron comparaciones con el test de Tukey, que realiza
comparaciones entre pares de grupos. Se probó el supuesto de homocedácea del
ANOVA con la prueba de Bartlet.
34
__________________________________________________________________________________________
_______________________
RESULTADOS
1. Funcionalidad ovárica
1.1. Morfología Ovárica
El exámen de los cortes histológicos de ovarios del tratamiento control, los

grupos DHEA y DHEA+ Met mostró importantes diferencias. Los ovarios
pertenecientes a ratones androgenizados (grupo DHEA) revelaron una disminución
significativa de folículos primarios (P) y preantrales (PF) en relación con los de los
animales del grupo control (Figura 7). En cambio, el número de folículos antrales
(A) y atrésicos (At) por ovario se incrementó significativamente en el grupo DHEA
comparado con los controles. La androgenización con DHEA también permitió la
formación de quistes (2,0 + 0,4 por ovario). No se observaron quistes en ningún otro
grupo. (Figura 7 A-D). Cuando se administró metformina en forma conjunta con
DHEA la inhibición inducida por DHEA de los folículos primarios y preantrales se
vio parcialmente revertida, mientras que el incremento de los folículos antrales y
atrésicos inducidos por DHEA fue completamente eliminado (Figura 7D). No se
observó la formación de cuerpos lúteos en ninguno de los ovarios correspondientes
a individuos de cualquiera de los tratamientos. Como se mencionó previamente,
ninguno de ellos pudo completar un ciclo sexual regular, ni siquiera los individuos
control, posiblemente por su carácter de prepúberes.
35
__________________________________________________________________________________________
_______________________
300 a
Control
No. Folículos por ovario
c
200 DHEA
b DHEA+Met
100
d
100
f j
h
e g i i
g
0
A B
P PF A At F C
C D
Figura 7: Comparación morfológica de ovarios de los tratamientos Control, DHEA y DHEA+

Met. A) Análisis estadístico del número de folículos por ovario en grupos control, DHEA y
DHEA+ metformina (N = 10 por grupo). Los valores representan la media + error estándar
(SEM). Las diferencias fueron consideradas significativas para p < 0,05. Se muestran cortes
respresentativos. B: Corte de ovario perteneciente al grupo control. (Tinción Hematoxilina-
Eosina, A= 100X). C: Corte de ovario perteneciente al grupo DHEA. (Tinción Hematoxilina-
Eosina, A= 40X). D: Corte de ovario perteneciente al grupo DHEA+ metformina. (Tinción
Hematoxilina-Eosina, A= 100X). P: folículos primarios; PF: folículos preantrales; A: folículos
antrales; At F: folículos atrésicos; C: quistes.
36
__________________________________________________________________________________________
_______________________
1.2. Actividad secretora del ovario
Con el fin de evaluar como la funcionalidad del ovario se ve afectada por la

androgenización y la administración conjunta de DHEA y metformina, se
estudiaron los niveles de algunos de los productos más importantes de secreción
del ovario: progesterona (P4), estradiol (E2) y los del prostanoide prostaglandina E
(PGE). Es importante recordar aquí que las prostaglandinas actuarían como
moduladoras de importantes funciones ováricas como la ovulación. (Husein, 2003)
y la luteólisis (Motta, 1999, 2001(a y b)).
1.2.1. Niveles de progesterona (P4)
La P4, uno de los principales productos de la esteroidogénesis ovárica, se

encontró significativamente incrementada en animales androgenizados (2,61 ± 0,07
ng/ml) con respecto al grupo de animales control (1,51 ± 0,05 ng/ml) (p<0,001). En
el grupo DHEA+Met, la concentración de esta hormona (1,7 ± 0,2 ng/ml) presentó
diferencias significativas con el grupo DHEA (p<0,001), no observandose en sus
valores diferencias significativas con el grupo control (p > 0,05) (Figura 8).
3
***
Concentración de Progesterona
(ng/ml suero)
0
Control DHEA DHEA + Met
Figura 8: Niveles séricos de P4 para los tratamientos, Control, DHEA y DHEA + Met. Los
valores representan la media ± error estandard (SEM). Las diferencias fueron consideradas
significativas para p<0,05. N= 10 animales/grupo (Nota : ***: p < 0,001 respecto de los otros
2 tratamientos)
37
__________________________________________________________________________________________
_______________________
1.2.2. Niveles de estradiol (E2)
La inyección diaria de DHEA durante 20 días consecutivos incrementó

significativamente (p< 0,05) los niveles séricos de estradiol respecto del grupo
control (29 + 2 vs. 7+ 2 ng/ml de suero respectivamente). Sin embargo, cuando los
ratones fueron tratados con DHEA y metformina conjuntamente, los niveles séricos
de esta hormona se reestablecieron. (10,3 + 3 ng/ml de suero, p > 0,05) (Figura 9).
30 ***
(ng/ml suero)
20
Estradiol
10
0
Figura 9: Niveles séricos de E2 para los tratamientos control, DHEA y DHEA+ Met. Los
significativas para p < 0,05 . N= 10 animales/grupo. Nota: ***p< 0,05.
1.2.3. Prostaglandina E producida y liberada al medio
La liberación de PGE producida en ovarios fue significativamente menor (p<

0.05) en el grupo al que se le administró DHEA durante 20 días en relación con los
niveles de esta hormona liberada por los tejidos correspondientes al grupo control
(270 + 29 vs. 443 + 53 pg/mg tejido respectivamente). Sin embargo, cuando los
ratones fueron tratados con DHEA y metformina conjuntamente, los niveles séricos
de esta hormona fueron reestablecidos (451 + 25 pg/mg tejido) (Figura 10).
38
__________________________________________________________________________________________
_______________________
500
400
PGE (pg/mg tej)

***
300
200
100
0
Control DHEA DHEA+Met
Figura 10: Niveles de PGE liberados al medio por tejidos ováricos correspondientes a los
tratamientos control, DHEA y DHEA + metformina. Los valores representan la media ± error
estandard (SEM). Las diferencias fueron consideradas significativas para p < 0,05. N= 10
animales/grupo. Nota: *** = p< 0,05.
2 Establecimiento del Síndrome de insulino resistencia
Dada la frecuente presencia del síndrome de insulino-resistencia en mujeres

con poliquistosis, y su estrecha vinculación con los desbalances endócrinos de esta
patología, se evaluó indirectamente la presencia del mismo en el modelo de
poliquistosis ovárica provocada por androgenizacón con DHEA y su reversión con
metformina.
2.1 Cuantificación de glucosa en sangre
La concentración de glucosa fue evaluada en sangre de individuos de los

distintos tratamientos. No se observaron diferencias significativas (p > 0,05) entre
ellos (Control: 5,7 ± 0,9 mmol/l de sangre, DHEA: 6,1 + 0,5 mmol/l de sangre y
DHEA+ metformina: 5,8 + 0,7 mmol/l de sangre) (Figura 11).
39
__________________________________________________________________________________________
_______________________
7.5
Niveles de glucosa
en sangre (mmol/l)
5.0
2.5
0.0
Figura 11: Concentración de glucosa en sangre en grupos control, DHEA, DHEA+

metformina. La concentración de glucosa no varió entre los distintos tratamientos (p > 0,05).
Los valores representan la media ± error standard (SEM). Las diferencias fueron
consideradas significativas para p<0,05. N= 10 animales/grupo.
2.2 Cuantificación de insulina en suero
A diferencia de lo observado con los niveles de glucosa, al cuantificar los niveles

de insulina se verificó un incremento significativo de la concentración sérica de esta
hormona en el grupo DHEA al compararlo con el grupo Control (159 ± 19 y 37 ± 8
UI/ml suero respectivamente, p < 0,001). Al suministrar metformina
conjuntamente con DHEA los valores de insulina no lograron volver a los del grupo
control (84 + 15 UI/ml suero, p < 0,05), sin embargo fueron significativamente
menores a los del grupo DHEA (p < 0,05) (Figura 12).
40
__________________________________________________________________________________________
_______________________
200
Niveles de insulina en suero

150
(uIU/ml suero)
100 c
50 a
0
Figura 12: Concentración sérica de insulina en grupos control, DHEA, DHEA+metformina.

Los valores representan la media ± error estandard (SEM). Las diferencias fueron
consideradas significativas para p<0,05. N= 10 animales/grupo. Nota: a vs b p < 0,001; a vs
c p < 0,05; b vs c p < 0,05.
2.3. Efecto de la metformina sobre el índice de masa corporal y el modelo de

determinación de homeostasia
El peso de los animales no fue modificado con ninguno de los tratamientos

2
(Tabla 2) y el índice de masa corporal (BMI) definido como peso (kg)/ altura (m2)
fue similar en todos los grupos analizados (Tabla 2).
El modelo de determinación de homeostasia (HOMA), el cual es un indicador de
la resistencia a la insulina dado que tiene en cuenta la relación glucosa: insulina,
se define como (HOMA= insulina (UI/mlx glucosa (mmol/l):BMI(kg/m2)). Este
parámetro se incrementó luego del tratamiento con DHEA comparado con los
controles. Cuando la metformina fue administrada junto con DHEA, los efectos de
la androgenización en el HOMA fueron parcialmente revertidos (Tabla 2).
41
__________________________________________________________________________________________
_______________________
Grupo Control DHEA DHEA+ Met
Edad (días) 45 45 45
Peso (g) 14+2,5 14,8+1,8 15,2+2,4
Indice de masa corporal 5,7+0,4 5,4+ 0,6 5,3+ 0,8

(Kg/m2)
HOMA 2,3+ 0,6 a 10,6+ 1,2 b 5,5+ 0,8 c
Tabla-2 Comparación de peso, BMI y HOMA para los grupos Control, DHEA y DHEA + Met
Datos representados como media + desviación Standard (SEM). Nota: b vs a,c p < 0,001 y c
vs a p < 0,05. N= 10 animales/grupo. Las diferencias fueron consideradas significativas
para p < 0,05.
3. Balance oxidante/antioxidante en el tejido ovárico: stress oxidativo
3.1. Medición del MDA formado como producto de la peroxidación lipídica
Dada la importancia de la integridad de las membranas para mantener los

receptores que permiten la unión de distintos factores que estimulan la
funcionalidad del ovario, se estimó la peroxidación lipídica en homogenatos de este
tejido. En los animales tratados con DHEA, la producción del metabolito
proveniente de la degradación de lípidos MDA, fue significativamente mayor al
grupo control (1922 ± 157 y 909 ± 132 mol MDA/gr. de tejido respectivamete; p <
0,001). La administración de metformina en forma conjunta con DHEA no fue capaz
de revertir los efectos de ésta última sobre la peroxidación lipídica (DHEA+ met
1890 ± 132 vs. 1922 + 157 mol MDA/g de tejido respectivamente, p>0,05) (Figura
13).
42
__________________________________________________________________________________________
_______________________
2000 b c
Concentración de MDA
(mol MDA/ gr tejido)
a
1000
0
Control DHEA DHEA+Met
Figura 13: Concentración de MDA en ovarios de grupos control, DHEA y DHEA+ Met. Los
significativas para p<0,05. N= 10 animales/grupo. Nota: a vs. b,c p<0,001 ; b vs. c p>0,05
3.2. Medición del contenido de glutation total ovárico
Para establecer la capacidad antioxidante del tejido ovárico durante los

distintos tratamientos, se determinó el contenido de glutation (GSH) total en los
mismos. El glutation se encontró fuertemente disminuído en los animales tratados
con DHEA respecto de los controles (0,48 ± 0,08 vs 0,66 ± 0,01 pmol/mg proteína
respectivamente, p < 0,001). Esta disminución fue revertida en los animales
tratados con DHEA+Met (0,66 ± 0,09 pmol/mg proteína y en el control 0,66 + 0,01
pmol/mg proteína, p > 0,05) (Figura 14).
43
__________________________________________________________________________________________
_______________________
0.75
(UM GSH/Ug proteínas)

Concentración de GSH
***
0.50
0.25
0.00
Control DHEA DHEA+ Met
Figura 14: Contenido de Glutation en homogenato de ovarios en grupos control, DHEA y

DHEA + Met. Los valores representan la media ± error estandard (SEM). Las diferencias
fueron consideradas significativas para p<0,05. N= 10 animales/grupo. Nota: *** p< 0,001
respecto del resto de los tratamientos.
3.3. Medición de catalasa en los tejidos ováricos
Uno de los mecanismos antioxidantes enzimáticos mejor descriptos es el

llevado a cabo por la catalasa, puesto que esta enzima es la encargada de
neutralizar el peróxido de hidrógeno producido durante los procesos fisio-
patológicos. Es por ello que se midió su concentración en los tres grupos de estudio.
Se encontró que la misma se hallaba significativamente disminuída (p < 0,05) en los
tejidos de animales del grupo DHEA (0,113 ± 0,009 pmoles/mg proteína) con
respecto a tejidos del grupo control (0,18 ± 0,06 pmoles/mg proteína). En el grupo
DHEA+metformina el contenido de catalasa (0,10 ± 0,02 pmoles/mg proteína) fue
semejante al del grupo DHEA (p > 0,05) y, al igual que este, presentó diferencias
significativas con respecto al grupo control (p < 0,05) (Figura 15).
44
__________________________________________________________________________________________
_______________________
0.3
Concentración de Catalasa
a
(pmol/mg de proteína)
0.2
b c
0.1
0.0
Control DHEA DHEA+ Met
Figura 15: Concentración de catalasa en homogenato de ovario de los grupos control, DHEA
y DHEA + Met. Los valores representan la media ± error estandard (SEM). Las diferencias
fueron consideradas significativas para p < 0,05. N= 10 animales/grupo. Nota: a vs. b,c: p<
0,05; b vs.c p > 0,05
4.Participación del sistema inmune
4.1. Expresión linfocitaria T en ovarios, ganglios linfáticos axilares y

retroperitoneales- Citometría de flujo T CD4+/CD8+:
Con el objeto de determinar la posible variación en las subpoblaciones de

linfocitos T CD4+/CD8+ luego de la administración de DHEA, se determinó la
expresión de linfocitos T en tejido ovárico y nódulos retroperitoneales (drenantes de
este órgano). Asimismo, se cuantificaron en nódulos axilares, para conocer el
balance linfocitario sistémico.
En todos los casos las nubes de los distintos isotipos quedaron marcadamente
diferenciadas, y se observó un porcentaje de dobles positivos menor al 2 %.
45
__________________________________________________________________________________________
_______________________
4.1.1 Expresión de las subpoblaciones de linfocitos T en tejido ovárico
Con el objeto de determinar la posible variación en el balance de linfocitos T

CD4+/CD8+ en el ovario, se determinó la proporción de las subpoblaciones de
linfocitos T mediante citometría de flujo.
A partir del análisis fluorométrico y el posterior procesamiento de los datos se
pudo observar que en los individuos tratados con DHEA la subpoblación de
linfocitos T CD8+ se vió incrementada significativamente (p < 0,001) respecto de la
población T CD4+ (83+4 vs.17+5 % respectivamente), mientras que en los ovarios
de los animales del grupo control no se observaron diferencias significativas en la
proporción de dichas subpoblaciones (CD4+: 48+ 4% vs. CD8+: 51+ 3 %). La
administración de metformina en forma conjunta con DHEA fue capaz de devolver
las proporciones de las distintas subpoblaciones a los valores control (49+5 y 46+6
% CD4+ y CD8+ respectivamente)(Figura 16).
100
*** CD4+
Porcentaje de subpoblaciones
de linfocitos T en ovarios
CD8+
75
50
25
0
Figura 16: Porcentaje de linfocitos CD4+ y CD8+ extraídos de ovarios para los tratamientos
control, DHEA y DHEA+ Met. Los valores representan la media ± error estandard (SEM). Las
diferencias fueron consideradas significativas para p < 0,05. N= 10 animales/grupo.
Nota: ***:p <0,001.
46
4.1.2 Expresión de las subpoblaciones de linfocitos T en ganglios linfáticos
axilares y retroperitoneales
Con el objeto de determinar si la posible variación en el balance de linfocitos T

CD4+/CD8+ en el ovario luego de la administración de DHEA se veía reflejada en
un cambio de las subpoblaciones linfocitarias en nódulos linfáticos drenantes de
este tejido, se determinó la expresión de linfocitos T en ganglios linfáticos
retroperitoneales. Asimismo, se cuantificó en nódulos axilares, para conocer el
balance linfocitario sistémico.
Como se puede observar en la figura 17, para el caso de los ganglios axilares en
los individuos pertenecientes al grupo control, no se observaron diferencias
significativas entre las proporciones de las subpoblaciones de linfocitos T CD4+ y
CD8+ (49 ± 4 % y 49 ± 2 %, respectivamente; p > 0,05). Esta relación se repitió
tanto en el grupo DHEA (CD4+: 46 ± 5 % y CD8+: 44 ± 7 %; p > 0,05) como en el
grupo DHEA+Met (CD4+: 49 ± 7 % y CD8+: 46 ± 9 %; p > 0,05). Por lo cual, entre
los grupos no se observaron diferencias entre los porcentajes de la subpoblación
CD8+ respecto de los porcentajes de la población CD4+ (p > 0,05) (Figura 17).
60 CD4+
CD8+
de linfocitos T en ganglios
45
axilares
30
15
0
Figura 17: Porcentaje de linfocitos CD4+ y CD8+ extraídos de nódulos linfáticos axilares,
para los distintos tratamientos. Los valores representan la media ± error estandard (SEM).
N= 10 animales/grupo. Las diferencias fueron consideradas significativas para p < 0,05.
47
__________________________________________________________________________________________
_______________________
En cambio, al estudiar las subpoblaciones de linfocitos T en nódulos linfáticos
retroperitoneales, se observó que coincidieron con las halladas en ovarios (Figura
18). En particular, en el grupo DHEA la expresión de linfocitos CD4+ fue
significativamente menor a la de CD8+ (24 ± 6 % y 64 ± 4 %, respectivamente; p <
0,001), mientras que en el grupo control no se observaron diferencias significativas
entre las proporciones de las subpoblaciones T estudiadas (CD4+: 45 ± 4 % y CD8+:
48 ± 2 %). Cuando metformina y DHEA fueron administradas conjuntamente, se
observaron proporciones equivalentes (p > 0,05) de CD4+ y CD8+ (44± 7 % y 48 ± 8
%, respectivamente)(Figura 18).
75
*** CD4+
CD8+
de linfocitos T en ganglios
retroperitoneales
50
25
0
Figura 18: Porcentaje de linfocitos CD4+ y CD8+ extraídos de nódulos linfáticos

retroperitoneales para los distintos tratamientos. Los valores representan la media ± error
estandard (SEM). N= 10 animales/grupo. Las diferencias fueron consideradas significativas
para p < 0,05. (Nota:*** :p < 0,001.)
48
__________________________________________________________________________________________
_______________________
4.2. Cuantificacion de TNF  :
La citoquina denominada TNF  es una potente moduladora de la función

ovárica, afectando la esteroidogénesis de las células de la teca y de la granulosa.
Este factor fue cuantificado en el suero de los animales pertenecientes a los 3
grupos de estudio. En el grupo DHEA se evidenciaron niveles significativamente
superiores de TNF  con respecto al control (29 ± 3 y 13 ± 1 pg/ml,
respectivamente, p < 0,05) mientras que en el grupo DHEA+Met sus niveles (13 ± 1
pg/ml suero) no presentaron diferencias significativas con el control, pero sí con el
grupo DHEA (p < 0,05 )(Figura 19).
30 ***
(pg/ml suero)
20
TNF 
10
0
Figura 19: Concentración de TNF- en suero de los tratamientos control, DHEA y

DHEA+Met. Los valores representan la media ± error estandard (SEM). Las
diferencias fueron consideradas significativas para p < 0,05. N= 10 animales/grupo.
(Nota*** p < 0,05 entre ese tratamiento y cualquiera de los otros).
49
__________________________________________________________________________________________
_______________________
DISCUSIÓN
El síndrome de ovario poliquístico (PCOS) es un desorden endócrino cuyos

origen y etiología aún no han sido completamente dilucidados. Se postula que
podría ser desencadenado por distintos factores, entre ellos, una exposición a altos
niveles de andrógenos en la etapa prenatal, prepuberal o post-puberal (Abbott,
2002). La misma tendría por efecto una programación errónea de las células
esteroidogénicas ováricas, que llevaría a una síntesis aumentada de andrógenos.
además se ha visto que estarían involucrados genes que regulan el metabolismo de
la insulina y la fisiología ovárica pudiendo contribuir a su desarrollo; así como
también otros factores, como por ejemplo la distribución corporal de la adiposidad.
La sintomatología de esta patología es muy heterogénea, por lo cual, se
acordó diagnosticarla frente a la presencia de al menos dos de las siguientes
condiciones (Azziz, 2004): i) oligo o anovulación; ii) hiperandrogenismo, o iii)
presencia de quistes en los ovarios (determinado en la última reunión internacional
de PCOS realizada en Rótterdam en el 2003).
Se han observado numerosas complicaciones asociadas a este síndrome
(Abbot, 2002), entre las cuales cabe destacar:
Foliculogénesis irregular, disfunción sexual causada por anovulación, subfertilidad
o pérdida de la preñez temprana, hiperinsulinemia, síndrome de isulino resistencia
y aumento del riesgo cardiovascular.
Estas anomalías estarían relacionadas con los desordenes endócrinos
observados en esta patología. Entre ellos, los más relevantes y frecuentes son:
Elevada síntesis de andrógenos, principalmente DHEA, por parte de las células de
la teca ovárica (Coney, 1984), elevada relación LH/FSH, originada en una
retroalimentación anómala sobre el eje hipotálamo-hipofisario, y, secreción
aumentada de insulina.
Aunque durante la última década se han presentado numerosos estudios
tanto en mujeres como en modelos animales, la heterogeneidad de la patología y la
falta de un consenso en la etiología de la enfermedad hacen que existan aún
muchos interrogantes.
Con el fin de avanzar en el estudio de PCOS se han desarrollado numerosos
modelos animales (Abbot, 2002; Szkiewickz, 1998; West, 2001). En ese contexto
50
__________________________________________________________________________________________
_______________________
Mahesh y Greenblatt (1962) fueron los primeros en aislar dehidroepiandrosterona
(DHEA) en el tejido ovárico de mujeres con PCOS. Posteriormente, Roy y col (1962)
desarrollaron un modelo murino de PCOS inducida por androgenización con DHEA.
Estudios subsecuentes confirmaron que el modelo de DHEA-PCOS murino
presentaba los aspectos salientes de la patología humana que son
hiperandrogenismo, maduración anormal de los folículos ováricos y anovulación
(Lee, 1991; Anderson, 1992; Henmi, 2001).
Estos hallazgos, como las funciones inmunomoduladoras descritas para
DHEA (Araghi Nikanam, 1997; Du, 2001) nos llevaron a proponer el modelo de
DHEA-PCOS en ratones para el estudio de aspectos relacionados con el sistema
endócrino e inmune durante la patología ovárica quística.
La metformina es una droga antidiabética que incrementa la utilización de
glucosa en los tejidos que son sensibles a la insulina. Dado que el PCOS y la
diabetes comparten algunas alteraciones en sus parámetros- como una relación
alterada glucosa: insulina, metabolismo lipídico irregular y síndrome de insulino
resistencia-el uso de la metformina comenzó a ser ampliamente aceptado en el
tratamiento del PCOS. Sin embargo, la mayor parte de los estudios relacionados
con la utilización de la metformina en humanos ha sido observacional y estos se
han basado en el patrón menstrual y el perfil hormonal de las mujeres afectadas.
Por ende, resulta útil evaluar el rol de esta biguanida en la modulación de la
esteroidogénesis, la respuesta inmune y el estrés oxidativo, puesto que los hallazgos
que se realicen resultan particularmente importantes cuando se trata de ajustar
tratamientos clínicos utilizando la combinación de drogas
En este contexto resultó de nuestro interés evaluar distintos parámetros

endócrinos e inmunes luego de la administración de DHEA a ratones prepúberes de
la cepa Balb/c durante 20 días consecutivos (modelo murino DHEA-PCOS), y el
posible rol de la metformina en la reversión de sus efectos.
En primer término decidimos estudiar la funcionalidad ovárica luego de la

androgenización y el rol de la metformina como tratamiento. Para ello se analizó la
morfología del ovario realizando una estimación del número de folículos ováricos en
cada estadio de desarrollo, el número de folículos atrésicos y la presencia de quistes
en este órgano.
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Al inducir cistogénesis en los ratones prepúberes mediante la aplicación de
DHEA, la cuantificación estadística del desarrollo folicular mostró una disminución
significativa de los folículos de estadios primario y preantrales. Estos resultados
sugerirían que la alteración de la foliculogénesis durante el proceso del síndrome
del ovario poliquístico se registraría en estadios tempranos del desarrollo folicular.
Estos resultados concuerdan con las observaciones realizadas por Webber y
colaboradores (2003). Más aún, hemos encontrado una alta proporción de folículos
preovulatorios antrales en el grupo tratado con DHEA, en comparación con los
controles. Este último efecto podría ser explicado por el hecho de que a pesar de la
heterogeneidad en la etiología de PCOS, una característica común entre los
individuos afectados por esta patología es la falta de folículos preovulatorios
dominantes, los cuales serían reemplazados por numerosos folículos antrales de
tamaño medio, que contienen incrementada la capa de la teca. Dado que las células
tecales son las principales productoras de andrógenos ováricos, esta sería la causa
del hiperandrogenismo observado en PCOS (Erickson, 1991).
Por otro lado, tal como fue descrito en mujeres con PCOS (Webber, 2003), en
el presente trabajo hemos observado un incremento con respecto al grupo control
del número de folículos atrésicos por ovario. Cabe destacar que otros autores han
demostrado un incremento en la atresia folicular a causa del hiperandrogenismo
(Tsafiri, 1984) que además es responsable de una apoptosis incrementada en las
células de la granulosa (Billing, 1993).
La presencia de quistes en los ovarios de animales pertenecientes al grupo
DHEA coincide con la observación de Lee (1991), quien en un modelo de
androgenización con DHEA durante 20 días en ratas, observó la aparición de éstos
en el 88% de los individuos tratados.
Cuando se administró metformina conjuntamente con DHEA, el número de
folículos en crecimiento mostró un patrón semejante al de los controles, el número
de folículos atrésicos decayó y no se observaron quistes. Como fue demostrado
previamente en otros estudios (Berker, 2004; Mc Carty, 2004; Pawellzyc, 2004)
creemos que esto podría deberse a un efecto indirecto de la metformina sobre la
regulación del Factor de Crecimiento Insulínico (IGF-1) y los niveles de insulina,
ambos caminos cruciales en la esteroidogénesis.
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Asimismo, se cuantificó la secreción de dos de los productos principales de la
esteroidogénesis ovárica: la progesterona y el estradiol, así como también la de
prostaglandina E.
Cabe aquí destacar, que las prostaglandinas (PGs) son moduladores
fundamentales de la función ovárica como en el caso de la ruptura folicular
asociada a la ovulación (Husein, 2003; Medan, 2003) y la luteólisis (Motta, 1999,
2001(b)). Más aún, niveles incrementados de PGE son responsables de la regulación
de linfocitos T durante el ejercicio físico excesivo (Lakier, 2003), presentan una
acción supresora de linfocitos T en ratones BALB/c (Kuroda, 2003) y suprimen la
diferenciación de células dendríticas asociadas a tumores (Yang, 2003).
En el presente estudio, se observó que la androgenización con DHEA
incrementó significativamente tanto los niveles de progesterona como los de
estradiol respecto de los del grupo control, resultado que concuerda con lo hallado
por Lee (1991), además los animales pertenecientes al grupo DHEA exhibieron un
estadio de estro constante.
El incremento en los niveles de progesterona podría ser una función de las
células quísticas, que actuarían de manera similar a las células lúteas, o bien de
células foliculares alteradas por el tratamiento con DHEA (Lee, 1991). Más aún, en
estudios realizados por Anderson (1987, 1989) se observó in vitro, que células de la
granulosa incubadas en medio conteniendo altos niveles de DHEA eran capaces de
secretar más progesterona al compararlas con los controles.
El aumento en la secreción de estradiol observado en nuestro modelo
concuerda con las observaciones de numerosos investigadores (Franks, 2000;
Mendonca, 2004) en las que los folículos anovulatorios de mujeres con PCOS
hipersecretan estradiol cuando se los compara con folículos de igual tamaño de
ovarios normales o bien de ovarios poliquísticos de mujeres con ciclos ovulatorios
normales.
Colectivamente, estos resultados sugieren que la elevada presencia de ambas
hormonas en el suero de estos animales es el efecto de una esteroidogénesis ovárica
incrementada en ratones tratados con DHEA.
En un interesante trabajo de Gougeon (1996), se demostró que para que un
folículo pueda ser seleccionable para la ovulación, los niveles de estrógenos deben
ser bajos y los de andrógenos altos, dado que la relación Andrógenos/Estrógenos
necesaria sería alta respecto de los niveles observados en folículos ya seleccionados
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para la ovulación. En nuestro modelo, si bien los niveles de andrógenos son altos
dado que se induce PCOS con DHEA durante 20 días, los niveles de estradiol
resultaron también ser altos en el grupo DHEA respecto de los controles. Esto
implicaría una relación A/E más baja que la esperada, hecho que impediría la
aparición de folículos seleccionables para ser ovulados.
En el presente trabajo se demostró que la administración de metformina
junto con DHEA previene la hiperandrogenización, permitiendo que la secreción de
E2 y P4 retorne a niveles control, posibilitando así la aparición de folículos
seleccionables para la ovulación. La metformina regularía indirectamente la
esteroidogenesis en las células de la teca y de la granulosa (La Marca, 2002).
Al analizar los datos correspondientes a la liberación de PGE, por parte de los
ovarios de animales del grupo DHEA, observamos que los niveles de este
prostanoide se encuentran disminuidos significativamente en relación con los de los
controles. Esta observación disiente con lo expuesto por Navarra (1996), quien
encontró que la cantidad de PGE producida por las células de la granulosa de
pacientes con ovarios poliquísticos era mucho mayor que la liberada por células de
mujeres con ciclos ovulatorios normales. Cabe destacar aquí que las
prostaglandinas están involucradas en la ruptura del folículo ovárico asociada con
la ovulación, la cual de hecho, puede ser suprimida por inhibición de las PGs
(Priddy, 1993). Es de esperar entonces, que en el desorden quístico, donde la
anovulación es uno de los principales síntomas que pueden aparecer, los niveles de
PGE sean menores a los encontrados en controles.
Por otra parte, hemos encontrado que los animales pertenecientes al grupo
DHEA+Met presentaron un patrón de síntesis de PGE similar a aquel hallado en los
animales del grupo control. Aunque la acción de esta biguanida sobre el
mejoramiento del metabolismo lipídico ha sido demostrada (Caballero, 2004;
Domínguez, 2005; Rautio, 2005) nuestros datos representan la primera evidencia
de que la metformina modula la producción de prostaglandinas.
De esta manera, la anovulación en nuestro modelo de androgenización estaría

justificada por la ausencia de folículos seleccionables para la ovulación debido a la
alta secreción de estrógenos, así como también por la imposibilidad del folículo
maduro de "romper" la pared del tejido ovárico por la disminución en los niveles de
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PGE. El tratamiento con metformina crearía un ambiente endócrino favorable,
permitiendo solucionar ambas causas.
Como ya hemos mencionado, la relación clásica postulada entre la insulina y

la síntesis de andrógenos es que la hiperinsulinemia incrementaría la producción
de andrógenos ovárica (Bergh, 1993). Más aún, la hiperinsulinemia sería la
principal causa del hiperandrogenismo en mujeres con PCOS (Shoupe, 1983;
Dunaif, 1989). Los mecanismos ováricos involucrados en dicha relación patológica
incluyen un incremento en la actividad de la enzima P450c17, resultando en un
incremento de la actividad de la 17-hidroxilasa (Bergh, 1993). El tratamiento con
metformina en mujeres poliquísticas se administra en caso de que la patología sea
acompañada o no de insulino resistencia (Glueck, 2000). Usualmente, provoca una
mejoría generalizada tanto de parámetros metabólicos como endócrinos. La misma,
suele ser atribuida a la normalización de insulina plasmática, de los IGFs, y de la
proteína transportadora de ambos.
Si bien en este trabajo no se ha evaluado directamente la sensibilidad a
insulina, se han medido algunos de sus marcadores como la concentración de
insulina en suero, los niveles de glucosa en sangre y el índice HOMA, el cual refleja
la relación glucosa:insulina.
Nuestros resultados mostraron que el ambiente hiperandrogénico generado
por la aplicación de DHEA no modificó el peso de los animales y subsecuentemente
el BMI. Podríamos inferir por ello que en nuestro modelo no fueron inducidas
hiperlipidemia ni obesidad, ambas asociadas en muchos casos al PCOS.
No se observaron diferencias significativas en los niveles de glucosa entre los
distintos tratamientos. En cambio, los niveles de insulina y el HOMA se
incrementaron en el grupo DHEA respecto de los controles. Estos incrementos
fueron revertidos cuando se administró metformina conjuntamente con DHEA,
concordando con reportes previos (Shoupe, 1983; Dunaif, 1989, De Leo, 1999;
Glueck, 1999; Vandermolen, 2001). Aunque esta droga es utilizada para el
tratamiento de individuos con obesidad crónica, diabéticos que padecen insulino
resistencia tipo II y pacientes con PCOS (Harbone, 2003; Lord, 2003; Fedorcsak,
2003), su rol en condiciones normales de glucosa aún se desconocen.
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Nuestros resultados concuerdan con estudios previos que demostraron que
la metformina incrementa la sensibilidad periférica a la insulina en mujeres no
diabéticas con PCOS (Vandermolen, 2001).
Dado que la metformina modula la concentración de insulina, puede decirse

que actúa indirectamente sobre la actividad esteroidogénica de las células de la teca
y de la granulosa, y como se ha visto en este trabajo, lo haría en forma independiente
de los niveles de glucosa.
Otro aspecto focalizado en este estudio fue el que se desprende de la

consideración del daño causado durante el desarrollo de PCOS al ovario por el
exceso de especies reactivas del oxígeno (ROS) referido generalmente como “estrés
oxidativo”. Estas especies son generadas en todas las células aeróbicas e incluyen
la producción del radical superóxido (O2.), el peróxido de hidrógeno (H2O2) y el
radical hidroxilo (OH-.) (Halliwell, 1984). La protección contra el estrés oxidativo en
las células es llevada a cabo por enzimas (catalasa, superóxido dismutasa, glutation
peroxidasa), metabolitos como el glutation o vitaminas antioxidantes (Aten, 1992).
En este punto tenemos que destacar que la asociación de los aspectos oxidantes-
antioxidantes ha sido estudiada en otros trastornos como ser la patología quística
del hígado (Maser, 2002) y diabetes mellitus (Vural, 2001). También se ha postulado
como marcador del riesgo cardiovascular (Sabuncu, 2001). Más aún, recientemente
se ha demostrado que el balance oxidante-antioxidante estaría regulado
endocrinamente (Sugino, 1999; Motta, 2001 (a)). En función de lo expuesto
anteriormente se cuantificaron: el metabolito proveniente de la degradación lipídica
malondialdehído (MDA), la enzima antioxidante catalasa (CAT) y el metabolito
antioxidante glutation (GSH).
Los presentes estudios muestran que la cistogénesis produjo un importante
daño en el ovario que se vio evidenciado por el incremento de la concentración de
MDA en el grupo DHEA (aumento en el índice de peroxidación lipídica) acompañado
de una disminución significativa tanto de la concentración de GSH como de la
concentración de la enzima catalasa. La disminución de los niveles de GSH, así
como el incremento en la concentración de MDA, en mujeres poliquísticas en
relación con mujeres que no padecen esta patología ha sido previamente
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mencionada por Sabuncu (2001). La respuesta del glutation al aumento de las ROS
parece ser específico de tejido y dependiente de la magnitud del aumento. Así, se ha
descrito que frente a una misma inducción de estrés oxidativo, cultivos de distintos
tipos celulares responden de formas diferentes: algunos aumentan la síntesis de
GSH, dado que la misma parecería estar regulada por la disminución del GSH
reducido, mientras que otros disminuyen este metabolito seguramente por el daño
oxidativo en el mismo (Luperchio, 1996). En el caso del tejido ovárico, parecería
disminuir la producción de GSH en respuesta al aumento de la producción de ROS.
La metformina es una biguanida de estructura similar a las
aminoguanidinas, moléculas que se ha visto poseen un rol activo en la
detoxificación de ROS (Youssef, 1999). Sin embargo, respecto de la función de esta
droga en el mantenimiento del balance oxidante-antioxidante del tejido, los
resultados hallados son muy controvertidos. Esta biguanida resultó efectiva en
mejorar la captura del radical hidroxilo (Bonnefont-Rousselot, 2003) y disminuir la
actividad de la xantina oxidasa en pacientes diabéticos tipo II (Pavlovic, 2000). Sin
embargo, no fue capaz disminuir el índice sérico de peroxidación lipídica de
pacientes con PCOS (Yilmaz, 2005) ni de capturar las ROS O2. ni H2O2 generadas
por leucocitos humanos estimulados (Bonnefont-Rousselot, 2003).
Respecto de este efecto diferencial de la metformina sobre el índice de
peroxidación, se ha demostrado que la eficacia de la metformina como capturadora
de ROS depende del generador de ROS, concluyendo que si O2. y H2O2 son las
especies oxidantes más abundantes producidas durante el estrés oxidativo, la
metformina no será capaz de capturar ROS.
Estos hallazgos sumados al hecho de que nuestros resultados muestran que
la metformina no fue capaz de modular la actividad de CAT (enzima que neutraliza
el H2O2 formado por las células) ni de regular las cantidades de MDA (metabolito
que indica el índice de peroxidación lipídica) nos permiten suponer que O2. y H2O2,
serían las dos especies de ROS más abundantes generadas por ovarios
hiperandrogenizados.
A diferencia de lo que pasaba con ROS, existe acuerdo sobre el efecto de la
metformina en la modulación del GSH. Se ha visto que la metformina modula los
niveles de GSH en cultivos in vitro de oocitos (Lee, 2005), en el hígado de ratas
diabéticas (Yanardag, 2005) y en islotes pancreáticos de pacientes con diabetes tipo
II (Pavlovic, 2000). En este trabajo los niveles de GSH aumentaban, alcanzando
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valores semejantes a los de los animales del grupo control al administrarse
metformina. Esta constituye la primera evidencia de que la metformina regula los
niveles de GSH ovárica.
Se ha demostrado por primera vez, que la metformina es capaz de regular los

niveles de GSH ováricos, mas no es efectiva para modular la peroxidación lipídica ni
la actividad de la CAT en ovarios de individuos hiperandrogenizados.
Por otra parte nos interesó presentar en este trabajo un enfoque nuevo en lo
referente al estudio de PCOS y es la regulación del sistema inmune y el efecto de la
metformina en este modelo.
La ovulación ha sido comparada con una "inflamación" dado que numerosos
mediadores clásicos de la misma parecen actuar en este proceso. Uno de los
componentes de la reacción inflamatoria es la migración y activación de leucocitos
al sitio de injuria. Ha sido reportado que la perfusión de leucocitos en el ovario de
rata in vitro, aumenta el número de ovulaciones inducidas por LH. Por otro lado, el
reclutamiento de leucocitos a distintos sitios dentro del ovario ha sido descrito en
conexión con la ruptura del tejido ocurrida en la atresia y la luteólisis (Brannstrom,
1993). Más aún, Lu (2002) demostró que la estimulación con estrógenos estaba
directamente relacionada con una subpoblación de linfocitos T enriquecida en
CD8+, que a su vez permitía el aumento de los niveles de citoquinas.
Ante las evidencias de interacción entre los sistemas inmune y endócrino
postulamos que la inducción de PCOS en animales prepúberes afectaría también la
expresión de las subpoblaciones de linfocitos T. Para comprobar dicha hipótesis,
realizamos determinaciones en tejido ovárico y en ganglios retroperitoneales
(drenantes de ovario). A fin de evaluar si existía un efecto local o sistémico, los
resultados obtenidos fueron comparados con aquellos obtenidos en ganglios
axilares.
Los datos que se presentan en este trabajo demuestran que la inducción de
PCOS con DHEA incrementó significativamente los niveles de expresión de T CD8+
ovárica y disminuyó los de T CD4+ en relación a los valores obtenidos en animales
del grupo control. Aunque los receptores de DHEA/DHEAS aún no han sido
identificados, la actividad del DHEA como ligando ha sido detectada en células T
humanas y murinas (Meikle, 1992; Okabe, 1995), sugiriendo así la presencia de
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receptores para DHEA en linfocitos T. Es por esta razón que suponemos que los
disturbios endócrinos pueden estar directamente relacionados con la diferenciación
de linfocitos T. Estas observaciones se correlacionan con descubrimientos previos
que mencionan que la expresión de timocitos estaría regulada por los niveles de
estradiol (Leposavic, 2001; Obradovic, 2001). Por otro lado, Safadi (2000) encontró
que una deficiencia de estradiol en forma posterior a una ovariectomía o
menopausia, es capaz de regular el estado linfocitario. Más aún, se ha demostrado
que la producción de citoquinas por parte de las células B está controlada por una
población de linfocitos CD8+ enriquecida (Lu, 2002)
La administración de metformina conjuntamente con DHEA fue capaz de
restaurar la expresión de las subpoblaciones de linfocitos T ováricas a valores
control. Cabe destacar aquí que la relación CD4+/CD8+ (1:1) encontrada en los
ovarios del grupo control coincide con un reporte previo (Best, 1996). La citometría
de flujo correspondiente a ganglios retroperitoneales mostró valores de expresión de
las subpoblaciones de linfocitos T similares a los encontrados en ovarios. No
sucedió lo mismo con las subpoblaciones de linfocitos T pertenecientes a ganglios
axilares, donde no se hallaron diferencias entre ninguno de los grupos.
Este hecho sugiere una respuesta inmune selectiva activada en nódulos
linfáticos. Como en el caso de infiltración ovárica, la metformina administrada junto
con DHEA restauró el perfil de las subpoblaciones linfocitarias a los valores
observados en el grupo control, representando así la primera evidencia de la acción
de la metformina en los nódulos linfáticos. Dado que esta biguanida modula los
niveles de progesterona y estradiol, y a la vez estos regulan la expresión linfocitaria,
se puede sugerir que la metformina actuaría modulando indirectamente los
porcentajes de linfocitos T CD4+ y CD8+ en el ovario.
Dado que el desarrollo de marcadores de superficie de células inmunes esta
comenzando a ser utilizado para realizar diagnosis previas al desarrollo de la falla
ovárica completa, creemos que la comprensión del rol de los procesos inmunes
involucrados en PCOS podría ser importante en la manipulación de esta patología.
La administración de metformina en animales androgenizados fue capaz de

restaurar los porcentajes de las subpoblaciones linfocitarias a valores control tanto
en el tejido ovárico, como en ganglios linfáticos retroperitoneales. Sin embargo ni la
aplicación de DHEA ni la administración conjunta de metformina modificó estos
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porcentajes en ganglios linfáticos axilares. Así, podemos sugerir que esta biguanida
modula de manera indirecta los porcentajes de subpoblaciones linfocitarias, siendo
este efecto local.
En el contexto del estudio de la interacción de los sistemas endócrino e

inmune en el desarrollo de PCOS, resulta importante destacar que el TNF es un
potente modulador de la función ovárica, afectando la esteroidogénesis de células
de la granulosa y de la teca interna. Esta citoquina se ha visto incrementada en
mujeres con poliquistosis (Sayin, 2003) y se encontró que existe una mutación en el
receptor de TNF, la cual fue asociada con hiperandrogenismo. Estudios in vitro
muestran que el TNF, a nivel ovárico, tiene efecto proliferativo sobre las células de
la teca. Esto se relacionaría con la hipertecosis observada en los quistes ováricos en
humanos (Spaczynski, 1999).
En base a estos antecedentes decidimos evaluar los niveles de TNF séricos y
el posible efecto de la metformina. Al medir la concentración de TNF sérico,
encontramos que el mismo se hallaba incrementado en animales androgenizados.
Dado que el TNF modula la esteroidogenesis tanto de las células de la teca como
las de la granulosa por un mecanismo diferente de aquel inducido por insulina e
IGF-1 (Spaczynski, 1999), esta sería otra vía de control de la producción de
esteroides por un camino alternativo al de la insulina.
Los datos aquí expuestos demuestran que la metformina fue capaz de

reestablecer tanto los valores de TNF  como el de insulina a valores normales al ser
aplicada conjuntamente con DHEA, mejorando de esta forma el desorden endócrino.
En conclusión, en el presente trabajo de tesis hemos demostrado el papel

regulador de la metformina sobre la funcionalidad ovárica y parámetros del sistema
inmune. Aquí se presentan aspectos noveles de esta biguanida en lo referente a la
regulación del metabolito antioxidante ovárico GSH, a la modulación de la
expresión linfocitaria T tanto en tejido ovárico como en nódulos linfáticos drenantes
del mismo y en una acción reguladora de la insulino-resistencia por una vía
independiente de glucosa.
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La importancia del conocimiento de los mecanismos involucrados en el
accionar de la metformina radica en el hecho de que, como en otras patologías, los
tratamientos combinados con otras drogas capaces de suplir las falencias de esta
biguanida o tal vez de sinergizarla, es una metodología muy común, más en PCOS,
donde la alta heterogenicidad entre los individuos complica el hallazgo de una
medicación única y adecuada.
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CONCLUSIONES
Revierte el
aumento de
insulina
Ovario Poliquistico
Normaliza desarrollo folicular
Restablece niveles de E y de P4
Restaura Niveles de PGE
Revierte la alteración fenotípica
Restablece GSH pero no
local de Linfocitos T y el TNF
MDA ni catalasa
sérico
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AGRADECIMIENTOS
Les quiero agradecer inmensamente a todos aquellos que me apoyaron en estos

años que duró mi paso por la Facultad. Muchas gracias Ali por tu apoyo
incondicional y paciencia, por la formación científica y tu calidez humana. Muchas
gracias Caro, Emi y Eve porque encontré en Uds. amigas además de compañeras de
trabajo, y porque sin su solidaridad nunca habría llegado hasta esta instancia.
Gracias Pato, Juan Pablo, Lu, Vicky, Martín, Patorres y todos mis compañeros y
amigos de mosquitos, con quienes compartí varios años de mi vida además de
interminables reuniones en bares y algun congreso.
Gracias Mari y Vero, Lili y Vane, Clara y Naty por haberme dado la oportunidad de
conocerlas ya que son personas excelentes!
Gracias a todos mis amigos del Oeste: Dani, Mel, Juan, Wal, Leo, Clau, Romi, Rodo,
Emma, George, Pingui, Pame, Nancy por alegrarme cada vez que los veo.
Muchísimas gracias por la paciencia, por el aguante y por la compresión a mis
amigas del alma Agata, Carla, Vero y Sil.
Muchas gracias Martín por bancarme todos estos años e intentar hacerme feliz.
76
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_______________________
Y muchísimas gracias a toda mi familia, Ma, Pa, Pelón, Andre, Bobe, tía Negra y
aunque ya no estes a vos también Manolo porque nadie mejor que ustedes saben el
esfuerzo que hicimos todos para que hoy pueda estar escribiendo esto.
GRACIAS TOTALES!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
77

Tesis de Licenciatura-VALERIA SANDER-“Aspectos endócrinos e inmunes de la acción de la N, N dimetilbiguanida: metformina en el tratamiento de la poliquistosis ovárica inducida en ratones BALB/c mediante androgenización con dehidroepiandrosterona”

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Tesis de Licenciatura-VALERIA SANDER-“Aspectos endócrinos e inmunes de la acción de la N, N dimetilbiguanida: metformina en el tratamiento de la poliquistosis ovárica inducida en ratones BALB/c mediante androgenización con dehidroepiandrosterona”

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Indice

Materiales y Métodos ...................................23

“Aspectos endócrinos e inmunes de la acción de la N, N

El síndrome del ovario poliquístico (PCOS) es un desorden endócrino complejo de origen

Síndrome de Ovario Poliquístico

El Síndrome de Ovario Poliquístico (PCOS) es una endocrinopatía común

Desórdenes de la salud en  Riesgo cardiovascular aumentado

Tabla 1. Importantes desórdenes reproductivos, metabólicos y de salud en general que

Origen de la enfermedad quística

Existen evidencias que señalan que el PCOS podría tener la siguiente

y potencialmente prepuberal de la hembra en desarrollo. Luego, en la etapa

1 genes que regulan

Figura 1. Diagrama representando la hipótesis del origen del desarrollo del

Desarrollo Folicular Normal y Patológico

granulosa tal como se esquematiza en la figura 2. En este proceso coordinado, los

Figura 2. Modelo: “Dos células, dos gonadotrofinas”. La LH al unirse a su receptor en las

Alteraciones hormonales en el PCOS

En el ciclo reproductivo normal, la secreción de LH hipotalámica es regulada

Secreción de hormonas esteroideas

El hiperandrogenismo, resultado de una esteroidogénesis alterada, es el

3  HSD P 450 c17

PROGESTERONA Dehidroepiandrosterona (DHEA)

Figura 3. Diagrama de la esteroidogénesis y las enzimas involucradas en dicho

Han sido denominadas “eicosanoides” las familias de prostaglandinas (PGs),

Entre las alteraciones más comunes en mujeres poliquísticas, se encuentra

Las especies reactivas del óxigeno (ROS) y el estrés oxidativo

Los radicales libres pueden ser definidos como moléculas o fragmentos de

condiciones normales, estos son intermediarios transitorios de reacciones reguladas

El daño oxidativo en las membranas lipídicas

La peroxidación lipídica transcurre en tres pasos. El primero (iniciación)

Mecanismos antioxidantes del tejido

Para evitar los daños producidos por la acumulación de ROS, en la célula

Metabolito antioxidante: el Glutation (g-glutamilcisteinil glicina)

El glutation, tiol tripeptídico, es la molécula pequeña de mayor abundancia

síntesis de DNA y proteínas, regula la actividad enzimática y el transporte intra e

Enzima antioxidante: la Catalasa (CAT)

La catalasa es una enzima antioxidante que “neutraliza” al peróxido de

El peróxido de hidrógeno interviene en la funcionalidad del aparato

Sistema inmune y reproducción

Factor de Necrosis Tumoral alfa (TNF- )

El Factor de Necrosis Tumoral alfa (TNF-) es una citoquina que se ha visto

La Metformina: (N,N dimetil biguanida) como tratamiento de PCOS

Las terapias farmacológicas tradicionales utilizadas en el tratamiento de

Entre ellas, la N,N´dimetil biguanida: metformina comenzó a emplearse como

2002). Sin embargo resultan controvertidos los resultados correspondientes a la

Figura 4: Fórmula molecular de la N, N dimetilbiguanida: metformina

¿ Por qué este modelo de estudio ?

En 1962, Mahesh y Greenblatt, lograron aislar dehidroepiandrosterona

El tratamiento con metformina sería capaz de restaurar la funcionalidad ovárica no

solo modulando el sistema insulina/glucosa, sino también a través de una acción

novedosa restableciendo parámetros hormonales y del sistema inmune.

El objetivo del presente trabajo es el estudio de la acción de la metformina sobre los

sistemas endócrino e inmune en el tratamiento de PCOS inducido en ratones de la

cepa BALB/c mediante androgenización con dehidroepiandrosterona.

De acuerdo al objetivo general, se proponen los siguientes objetivos parciales:

 Cuantificación del desarrollo folicular en el modelo de PCOS inducido por

 Determinación de la funcionalidad ovárica durante la inducción de poliquistosis

 Establecimiento del síndrome de insulino resistencia.

 Evaluación del balance oxidante-antioxidante en el ovario. Relación con el PCOS.

 Estudio de la relación de las subpoblaciones linfocitarias T CD4+/CD8+ en

Se utilizaron ratones hembras prepúberes (25 díasde edad) de la cepa BALB/c,

1.2 Modelo de disfunción ovárica por poliquistosis:

Los grupos experimentales fueron:

Durante los 20 días de tratamiento se tomaron extendidos vaginales de cada