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1 Titulação da norfloxacina (NFX) em SUV (tampão 10 mM) com


cobre-fenantrolina (CuPhen)

Todos os experimentos foram realizados a temperatura ambiente de 23ºC. Foi utilizado


tampão fosfato 10 mM pH 7,4. Foi preparada uma solução estoque de CuPhen 3 mM.
Para a preparação das vesículas unilamelares pequenas (SUV) foi utilizado Pc-Lα
Lecithin em clorofórmio CHCl3 10 mM. Essa solução de Pc(CHCl3) 10 mM foi secada com N2 e
colocada no vácuo por 2 horas. Depois desse tempo as películas formadas foram hidratadas
com 1,2 mL de pB 10 mM pH 7,4 e submetemos para agitação mecânica via vortex e
sonicação. Centrifugamos as amostras e recolhemos 1 mL do sobrenadante livre de impurezas.
Finalmente foi adicionado 12 µL de NFX(aq) 1,6 mM, tendo assim uma solução estoque
concentrada de SUV/NFX 10 mM/16 µM.
O comprimento de onda de excitação utilizado foi sempre de 330 nm. Aberturas das
fendas do fluorímetro foram 4 nm para a excitação e 4 nm para a emissão.

1.1 Resultados preliminares

Espectros de Fluorescência
Os espectros de fluorescência da NFX em PC titulada com o complexo CuPhen foram
obtidos e os resultados são apresentados na Fig. 1. Observa-se em ambos uma diminuição da
intensidade de fluorescência, característica de supressão de fluorescência pelo complexo
metálico, com deslocamento inicial do pico de 406 nm para 412 nm, o que poderia indicar que
algumas moléculas de NFX estariam se associando às vesículas de PC pois, quando a NFX em
solução aquosa pH 7,4 apresenta pico de fluorescência em 407 nm, enquanto que ligada a
micelas de SDS o pico deslocava-se para 432 nm. [Dissertação de Gabriel Vignoli Muniz,
2014]. Em concentrações maiores do complexo, para o caso com PC a supressão parece ser a
mesma do que sem PC.
NFX em PB NFX+PC em PB
6 6
3,0x10 3,0x10
0 M 0 M
2 2
6
2,5x10
4 6
2,5x10 4
6 6
8 8
Intensidade

Intensidade

6
2,0x10 10 6
2,0x10 10
12 12
6
14 6
14
1,5x10 16 1,5x10
16
20 20
6 6
1,0x10 1,0x10

5 5
5,0x10 5,0x10

0,0 0,0
360 380 400 420 440 460 480 500 360 380 400 420 440 460 480 500

Comprimento de onda (nm) Comprimento de onda (nm)

Figura 1. Esquerda: espectros de fluorescência da NFX 16 µM sem PC. Direita: espectros de fluorescência da NFX
16 µM com PC 10 mM subtraindo o espectro do espalhamento. Todas as medidas foram em tampão pB 10 mM
pH 7,4 titulando com CuPhen. Excitação em 330 nm.
2

Variação da fluorescência da NFX em SUV em função da titulação de CuPhen


A Fig. 2 apresenta a variação da fluorescência de NFX em SUV em 412 nm, como
função da concentração do complexo. Esses resultados serão analisados de acordo com
diferentes modelos de associação

8 Sem PC 1,0 Sem PC


Com PC
0,9 Com PC
Sem PC
0,8
6 Com PC
0,7 Equation y =0.5*A* ((1+x/CL+1/(Kb*CL
))- ((1+x/CL+1/(Kb*CL))^2 - 4
*x/CL)^0.5 )
0,6

(F0-F)/F0
0,5
F0/F-1

4
Adj. R-Sq 0,99937 0,998
0,4 Value Standard
Book4_D A 1 0
0,3 Book4_D CL 25,95 0,8012
2
Book4_D Kb 0,313 0,04225
0,2
Book4_D A 1 0
0,1 Book4_D CL 31,29 1,34073
Book4_D Kb 0,667 0,32311
0 0,0
0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 30
[CuPhen] (M)
[CuPhen] M)

Figura 2. Esquerda: Variação da fluorescência da NFX/PC, como função da concentração dos complexos de
CuPhen. Direita: Variação máxima da fluorescência da NFX/PC como função da concentração dos complexos de
CuPhen. Pico de análise em 408 nm.

Como o gráfico anterior pode não representar uma curva linear de Stern-Volmer, fez-se o
gráfico da variação máxima da fluorescência respeito à fluorescência máxima. Podemos
observar, destes gráficos das variações da intensidade de fluorescência, que as vesículas de
lecitina-NFX não apresentam uma interação com o complexo cobre fenantrolina em pH 7,4.

2 Titulação da norfloxacina (NFX) em SUV (tampão salino 10 mM


0.15 M NaCl) com cobre-fenantrolina (CuPhen)

Todos os experimentos foram realizados a temperatura ambiente de 23ºC. Foi utilizado


tampão fosfato salino pBS (10 mM, 0,15 M NaCl) pH 7,4.
Para a preparação das vesículas unilamelares pequenas (SUV) foi utilizado Pc-Lα
Lecithin em clorofórmio CHCl3 10 mM com NFX 16 µM. Uma solução de Pc(CHCl3) 10 mM foi
secada com N2 e colocada no vácuo por 2 horas. Depois desse tempo as películas formadas
foram hidratadas com 1,2 mL de pB 10 mM pH 7,4 + 10,52 mg de NaCl, e submetemos para
agitação mecânica via vortex e sonicação. Centrifugamos as amostras e recolhemos 1 mL do
sobrenadante livre de impurezas. Finalmente foi adicionado 12 µL de NFX(aq) 1,6 mM, tendo
assim uma solução estoque concentrada de SUV/NFX 10 mM/16 µM em pBS.
O comprimento de onda de excitação utilizado foi sempre de 330 nm. Aberturas das
fendas do fluorímetro foram 4 nm para a excitação e 4 nm para a emissão.
3

2.1 Resultados preliminares

Espectros de Fluorescência
Os espectros de fluorescência da NFX em PC titulada com o complexo CuPhen foram
obtidos e os resultados são apresentados na Fig. 3. Observa-se uma diminuição da intensidade
de fluorescência, característica de supressão de fluorescência pelo complexo metálico, com
deslocamento inicial do pico de 407 nm para 413 nm, o que também poderia indicar que mais
moléculas de NFX estariam se associando às vesículas de PC [Dissertação de Gabriel Vignoli
Muniz, 2014]. Em concentrações maiores de complexo, para o caso com PC a supressão é
também parecida do que sem PC.
NFX em PBS NFX+PC em PBS
6 6
2,5x10 2,5x10

0 M 0 M
2 2
2,0x10
6
4 2,0x10
6
4
6 6
8 8

Intensidade
10
Intensidade

1,5x10
6 10 1,5x10
6

12 12
14 14
16 16
6 6
1,0x10 20 1,0x10 20
24 24
28 28
5 5
5,0x10 5,0x10

0,0 0,0
360 380 400 420 440 460 480 500 360 380 400 420 440 460 480 500

Comprimento de onda (nm) Comprimento de onda (nm)

Figura 3. Esquerda: espectros de fluorescência da NFX 16 µM sem PC. Direita: espectros de fluorescência da NFX
16 µM com PC 10 mM subtraindo o espectro do espalhamento. Todas as medidas foram em tampão pBS 10 mM
0.15 M pH 7,4 titulando com CuPhen. Excitação em 330 nm.

Variação da fluorescência da NFX em SUV em função da titulação de CuPhen


A Fig. 4 apresenta a variação da fluorescência de NFX em SUV em 413 nm, como
função da concentração do complexo. Esses resultados serão analisados de acordo com
diferentes modelos de associação

8 1,0 Sem PC
Sem PC Com PC
Com PC 0,9 Sem PC
0,8 Com PC
6
0,7

0,6
Equation y =0.5*A* ((1+x/CL+1/(Kb*CL))- ((1+x/CL+1/(K
(F0-F)/F0

b*CL))^2 - 4*x/CL)^0.5 )
0,5
F0/F-1

0,4
Adj. R-Square 0,99955 0,99891
Value Standard Error
0,3 Book4_DC1 A 1 0
2
Book4_DC1 CL 14,15388 0,27064
0,2 Book4_DC1 Kb 0,47984 0,02155
Book4_DC2 A 1 0
0,1 Book4_DC2 CL 30,36317 0,62359
Book4_DC2 Kb 0,70554 0,11804
0 0,0
0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 30
[CuPhen] (M)
[CuPhen] M)

Figura 2. Esquerda: Variação da fluorescência da NFX sem PC e com PC, como função da concentração dos
complexos de CuPhen. Direita: Variação máxima da fluorescência da NFX sem PC e com PC como função da
concentração dos complexos de CuPhen. Pico de análise em 408 nm.
4

Aqui pode se apreciar notavelmente que o gráfico anterior não representa uma curva
linear de Stern-Volmer, então se fez o gráfico da variação máxima da fluorescência respeito à
fluorescência máxima. Podemos observar, destes gráficos das variações da intensidade de
fluorescência, que as vesículas de lecitina-NFX aparentemente apresentam uma interação com
o complexo cobre fenantrolina em pH 7,4.

3 Norfloxacina em SUV/ácido esteárico, titulando com cobre-


fenantrolina.

Todos os experimentos foram realizados a temperatura ambiente de 23ºC. A partir de


agora utilizaremos pBS 0,15M (10 mM, 0,15 M NaCl) pH 7,4 para hidratação.
Para a preparação das vesículas unilamelares pequenas (SUV)/SA foi utilizado Pc-Lα
Lecithin em clorofórmio CHCl3 10 mM. Adicionamos 240 µL de SA 25mM a 1,2 mL de
Pc(CHCl3) 10 mM para obter uma concentração final de SA = 5mM. Esta solução foi secada com
N2 e colocada no vácuo por 2 horas. Depois desse tempo as películas formadas foram
hidratadas com 1,2 mL de PB 10 mM pH 7,4 + 10,52 mg de NaCl, adicionamos logo 12 µL de
NFX(aq) 1,6 mM, e submetemos para agitação mecânica via vortex e sonicação. Centrifugamos
as amostras e recolhemos 1 mL do sobrenadante livre de impurezas.
Titulamos a solução com o complexo de CuPhen, para observarmos as mudanças nos
espectros de fluorescência estacionária. Como controle, também titulamos a solução sem PC
com cloreto de cobre (II) para comparar com as interações dos complexos.

3.1 Resultados preliminares

Espectros de Fluorescência
Os espectros de fluorescência da NFX em PC/SA titulada com o complexo CuPhen foram
obtidos e os resultados são apresentados na Fig. 5. Observa-se uma diminuição da intensidade
de fluorescência, característica de supressão de fluorescência pelo complexo metálico, com
deslocamento do pico de 407 nm (sem PC, com PC o deslocamento foi para 414 nm) para
416 nm em PC/SA, indicando que a associação de moléculas de NFX às vesículas é maior do
que os outros casos. Em concentrações maiores de complexo a supressão é menor do que nos
outros casos (em PC e sem PC)
5

NFX+PC/SA
(416, 3,27132E6)[54]

NFX 0 M
NFX+PC
6
3,0x10 0 M 3,0x10
6
3,0x10
6
2
2 4
0 M
4 6
6
2,5x10 2,5x10
6
2 2,5x10
6

(407, 2,25329E6)[48] 6 (414, 2,29562E6)[52] 8


4
8 10

Intensidade
6
Intensidade

10

Intensidade
6
2,0x10 2,0x10
6
8 2,0x10
6
12
12 14
10
14 16
6
1,5x10 1,5x10
6 12 1,5x10
6
16 20
14
20 24
16
6 24 6 6 28
1,0x10 1,0x10 20 1,0x10
28
24
5 5 28 5
5,0x10 5,0x10 5,0x10

0,0 0,0 0,0


360 380 400 420 440 460 480 500 360 380 400 420 440 460 480 500 360 380 400 420 440 460 480 500

Comprimento de onda (nm) Comprimento de onda (nm) Comprimento de onda (nm)

Figura 5. Direita: espectros de fluorescência da NFX 16 µM com PC/SA 10 mM/5 mM subtraindo o espectro do
espalhamento. Esquerda: espectros anteriores de fluorescência da NFX 16 µM em pBS 0,15 M pH 7.4, para
comparação. Todas as medidas foram em tampão pBS titulando com CuPhen. Excitação em 330 nm.

Variação da fluorescência da NFX em SUV/SA em função da titulação de CuPhen


A Fig. 6 apresenta a variação da fluorescência de NFX em SUV em 416 nm, como
função da concentração do complexo.

8 NFX 1,0 NFX


NFX/PC 0,9 NFX/PC Equation y =0.5*A* ((1+x/CL+1/(Kb*
CL))- ((1+x/CL+1/(Kb*CL))^
7 2 - 4*x/CL)^0.5 )
NFX/PC/SA NFX/PC/SA
0,8
6 NFX Adj. R-Sq 0,99835 0,999 0,99876

0,7 NFX/PC Book3_D A


Value Standard
1 0
5
0,6
NFX/PC/SA FMAXC
Book3_D CL 14,15 0,28397
FMAXC 775
(F0-F)/F0
F0/F-1

Book3_D Kb 0,480 0,0227


4 0,5 FMAXC 95
Book3_D A 1 0
FMAX1
0,4
3 Book3_D CL 30,63 0,66466
FMAX1 386
0,3 Book3_D Kb 0,731 0,13486
FMAX1 26
2 Book3_D A 1 0
0,2 FMAX2
Book3_D CL 21,38 1,84453
1 FMAX2 913
0,1 Book3_D Kb 0,084 0,00761
FMAX2 07
0 0,0
0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 30

[CuPhen] M) [CuPhen] M)

Figura 6. Esquerda: Variações da fluorescência da NFX sem PC, em PC, e em PC/SA, como função da
concentração dos complexos de CuPhen. Direita: Variação máxima da fluorescência da NFX sem PC, em PC, e
em PC/SA como função da concentração dos complexos de CuPhen. Pico de análise em 416 nm.

Podemos observar, destas variações da intensidade de fluorescência, que as vesículas de


lecitina com SA apresentam uma supressão mais lenta da NFX do que nos outros casos. Isto
poderia indicar que a interação do complexo metálico com a NFX é menor quando agregamos
o ácido esteárico às moléculas de PC.

4 Norfloxacina em SUV/ácido esteárico 0%,20%,40% e 60%,


titulando com cobre-fenantrolina

Todos os experimentos foram realizados a temperatura ambiente de 23ºC. Foi utilizado


pBS 0,15 M (10 mM, 0,15 M NaCl) pH 7,4 para hidratação.
Para a preparação das vesículas unilamelares pequenas (SUV)/SA foi utilizado Pc-Lα
Lecithin em clorofórmio CHCl3 10 mM. Distribui-se 1,2 mL desse estoque em 4 frascos
rotulados para identificação das diferentes concentrações de SA. Adicionamos aos 1,2 mL de
Pc(CHCl3) 10 mM alíquotas de SA o suficiente para obter em cada frasco 0, 2, 4 e 6 mM. Estas
soluções foram secadas com N2 e colocadas no vácuo por 2 horas, guardando-se na geladeira
6

para trabalhar no dia seguinte. No dia seguinte as películas formadas foram hidratadas com
1,2 mL de pBS 0,15 M pH 7,4, adicionamos 12 µL de NFX(aq) 1,6 mM, submetemos para
agitação mecânica via vortex e sonicação. Centrifugamos as amostras e recolhemos 1 mL do
sobrenadante livre de impurezas.
Titulamos a solução com o complexo de CuPhen, para observarmos as mudanças nos
espectros de fluorescência estacionária. Como controle, também titulamos a solução sem PC
com cloreto de cobre (II) para comparar com as interações dos complexos.

4.1 Resultados preliminares

Espectros de Fluorescência
Os espectros de fluorescência da NFX em PC/%SA titulada com o complexo CuPhen
foram obtidos e os resultados são apresentados na Fig. 7a. Observa-se uma diminuição da
intensidade de fluorescência pelo complexo metálico, característica de supressão de
fluorescência, com pouco deslocamento do pico entre 414 nm para 417 nm a medida que a
concentração do SA é maior, indicando que a associação de moléculas de NFX às vesículas de
PC é quase a mesma. Nas titulações com o complexo a supressão é menor a medida que
aumentamos a concentração do SA.
6
0% acido stearico 6
20% acido stearico
2,5x10 2,5x10
(414, 2,29562E6)[52]
(415, 2,21173E6)[53]
[CuPhen] [CuPhen]
6 6
2,0x10 2,0x10 0 uM
0 uM
2
2
4
4
6
6 6 6
intensidade

1,5x10 1,5x10 8
8
intensidade

intensidade

10
10
12
12
14
6
1,0x10
14 6
1,0x10 16
16
20
20
24
24
28
5
5,0x10
28 5
5,0x10

0,0 0,0
360 380 400 420 440 460 480 500 360 380 400 420 440 460 480 500

comprimento de onda(nm) comprimento de onda(nm)

2,5x10
6
40% acido stearico 6
2,5x10
60%acido stearico

[CuPhen]
6
[CuPhen] 6
2,0x10 (415, 1,92478E6)[53] 2,0x10 (416, 1,88561E6)[54] 0 uM
0 uM 2
2 4
4 6
6 6
6
intensidade

1,5x10 1,5x10 8
intensidade

8 10
10 12
12 14
6 6
1,0x10 14 1,0x10 16
16 20
20 24
24 28
5 5
5,0x10 28 5,0x10

0,0 0,0
360 380 400 420 440 460 480 500 360 380 400 420 440 460 480 500

comprimento de onda(nm) comprimento de onda(nm)

Figura 7a. Espectros de fluorescência da NFX 16 µM com PC:SA 10 mM: 0, 2, 4 e 6 mM subtraindo o espectro do
espalhamento. Todas as medidas foram em tampão pBS titulando com CuPhen. Excitação em 330 nm.

Uma segunda medida foi repetida para 20%, 40% e 60% SA (Fig. 7b) com a mesma
forma de preparação das amostras anteriores, adicionando a NFX (etOH) junto com o SA antes
7

de serem secadas com N2. Pode-se apreciar que elas seguem a mesma tendência das medidas
anteriores mostradas em Fig. 7a.
20% acido stearico
6
primeiro 0% acido stearico
2,5x10
(414, 2,29562E6)[52] 1,2x10
6

[CuPhen]
6
2,0x10 6
0 uM 1,0x10
2 0 M
4 2
5
6 6 8,0x10
4
intensidade

1,5x10
8
intensidade

10
6
12 6,0x10
5 8
1,0x10
6 14 10
16 12
20 4,0x10
5
14
24
16
5,0x10
5 28
5 20
2,0x10
24
28
0,0 0,0
360 380 400 420 440 460 480 500 360 380 400 420 440 460 480 500

comprimento de onda(nm) Comprimento de onda (nm)

60% acido stearico


40% acido stearico
(415, 1,2602E6)[53]
(415, 1,23598E6)[53]
6 6
1,2x10 1,2x10

6 6
1,0x10 1,0x10
0 M
0 M
Intensidade
Intensidade

2
8,0x10
5
2 8,0x10
5
4
4
6
6
6,0x10
5
6,0x10
5 8
8
10
10
12
5 12 5
4,0x10 4,0x10 14
14
16
16
20
2,0x10
5
20 2,0x10
5

24
24
28
28
0,0 0,0
360 380 400 420 440 460 480 500 360 380 400 420 440 460 480 500

Comprimento de onda (nm) Comprimento de onda (nm)

Figura 7b. Espectros de fluorescência da NFX 16 µM com PC:SA 10 mM:0, 2, 4 e 6 mM subtraindo o espectro do
espalhamento, repetição das medidas anteriores, exceto a primeira figura, a qual corresponde ao gráfico anterior
para comparação. Todas as medidas foram em tampão pBS titulando com CuPhen. Excitação em 330 nm.

Variação da fluorescência da NFX em SUV/%SA em função da titulação de CuPhen


A Fig. 8a apresenta a variação da fluorescência de NFX em SUV/SA em 416 nm, como
função da concentração do complexo.
Equation y =0.5*A* ((1+x/CL+1/(Kb*CL))- ((1+x/CL+1/(Kb*CL))^2 - 4*x/CL)^0.5 )
NFX sem PC
PC 0% SA
8 NFX sem PC 1,0 PC 20% SA Adj. R-Square 0,9995 0,99876 0,99637 0,99591
PC 0% SA PC 40% SA Value Standard Error

PC 20% SA 0,9 PC 60% SA


Book5_DFMAXC A 1 0
7
PC 40% SA NFX sem PC Book5_DFMAXC CL 14,15775 0,28397

PC 60% SA 0,8 PC 0% SA Book5_DFMAXC Kb 0,48095 0,0227

6 PC 20% SA Book5_DFmaxFm A 1 0
0,7 PC 40% SA
1
Book5_DFmaxFm CL 30,63386 0,66466
1
5 PC 60% SA
0,6
Book5_DFmaxFm Kb 0,73126 0,13486
1
Book5_DFmaxFm A 1 0
(F0-F)/F0

2
F0/F-1

4 0,5 Book5_DFmaxFm
2
CL 30,55172 1,33198

Book5_DFmaxFm Kb 0,49627 0,13663


2
0,4
3 Book5_DFmaxFm
3
A 1 0

Book5_DFmaxFm CL 8,0011 3,20569


0,3 3
Book5_DFmaxFm Kb 0,05237 0,00537
2 3

0,2 Book5_DFmaxFm
5
A 1 0

Book5_DFmaxFm CL 50,56786 2,68924


1 5
0,1 Book5_DFmaxFm Kb -1,52211E15 --
5

0 0,0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45

[CuPhen] M) [CuPhen] M)

Figura 8a. Esquerda: Variações da fluorescência da NFX sem PC e em PC/%SA, como função da concentração
dos complexos de CuPhen. Direita: Variação máxima da fluorescência da NFX sem PC e em PC/%SA como
função da concentração dos complexos de CuPhen. Pico de análise em 416 nm.
8

Apresentamos também a variação da fluorescência de NFX em SUV/SA em 416nm,


como função da concentração do complexo para a segunda medida repetitiva para 20%, 40% e
60% de SA (Fig. 8b).
NFX sem PC Equation y =0.5*A* ((1+x/CL+1/(Kb*CL))- ((1+x/C
L+1/(Kb*CL))^2 - 4*x/CL)^0.5 )
PC 20% SA
8 NFX sem PC 1,0 PC 40% SA
PC 20% SA PC 60% SA Adj. R-Squ 0,9972 0,9905 0,9836
0,9
7 PC 40% SA NFX sem PC Value Standard E
Book9_DF A 1 0
PC 60% SA PC 20% SA
0,8 PC 40% SA
MaxC
Book9_DF CL 14,157 0,28397
6 PC 60% SA MaxC 75
0,7 Book9_DF Kb 0,4809 0,0227
MaxC 5
5 Book9_DF A 1 0
0,6 maxFm2
Book9_DF CL 19,104 1,07252

(F0-F)/F0
maxFm2 59
F0/F-1

4 0,5 Book9_DF Kb 0,1972 0,01746


maxFm2 9
Book9_DF A 1 0
0,4
3 maxFm3
Book9_DF CL 11,729 3,61897
maxFm3 71
0,3 Book9_DF Kb 0,0662 0,00859
2 maxFm3 5

0,2 Book9_DF
maxFm4
A 1 0

1 Book9_DF CL 20,824 4,73728


0,1 maxFm4 4
Book9_DF Kb 0,0885 0,01905
maxFm4 2
0 0,0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45

[CuPhen] M) [CuPhen] M)

Figura 8b. Esquerda: Variações da fluorescência da NFX sem PC e em PC/%SA, como função da concentração
dos complexos de CuPhen. Direita: Variação máxima da fluorescência da NFX sem PC e em PC/%SA como
função da concentração dos complexos de CuPhen. Pico de análise em 416 nm.

Podemos observar, destas variações da intensidade de fluorescência, que a medida que a


concentração de SA é maior a supressão da NFX é mais lenta cada vez do que nos outros casos.
Isto poderia indicar que a interação do complexo metálico com a NFX é diminuía quando
aumentamos a quantidade de ácido esteárico às moléculas de PC (blindagem eletrostática?).

5 Norfloxacina em SUV/SDS 0%,20%,40% e 60%, titulando com


cobre-fenantrolina

Experiência 1
Todos os experimentos foram realizados a temperatura ambiente de 23ºC. Foi utilizado
pBS 0,15M (10 mM, 0,15 M NaCl) pH 7,4 para hidratação.
Foi preparado uma solução estoque de SDS(etOH) 30 mM. Para a preparação das vesículas
unilamelares pequenas (SUV)/SDS foi utilizado Pc-Lα Lecithin em clorofórmio CHCl3 10 mM.
Distribui-se 1,2 mL desse estoque em 4 frascos rotulados para identificação das diferentes
concentrações de SDS. Adicionamos aos 1,2 mL de Pc(CHCl3) 10 mM alíquotas de SDS o
suficiente para obter em cada frasco 0, 2, 4 e 6 mM de SDS, guardando-se na geladeira para
trabalhar no dia seguinte. Depois de uma semana estas soluções foram secadas com N2 e
colocadas no vácuo por 2 horas, as películas formadas foram hidratadas com 1,2 mL de pBS
0,15 M pH 7,4, e submetemos para agitação mecânica via vortex e sonicamos 5 vezes.
Centrifugamos as amostras e recolhemos 1 mL do sobrenadante livre de impurezas. Agora
adicionamos 12 µL de NFX(aq) 1,6 mM e voltou-se sonicar. Fez-se uma nova amostra para
2 mM pois houve uma perda desta.
9

Experiência 2
Para a preparação das vesículas unilamelares pequenas (SUV)/SDS foi utilizado Pc-Lα
Lecithin em clorofórmio CHCl3 20 mM. Distribui-se 0,6 mL desse estoque em 4 frascos
rotulados para identificação das diferentes concentrações de SDS. Adicionamos aos 1,2 mL de
Pc(CHCl3) 10 mM alíquotas de SDS o suficiente para obter em cada frasco 0, 2, 4 e 6 mM de
SDS, estas soluções foram secadas com N2 e colocadas no vácuo por 2 horas, as películas
formadas foram hidratadas com 1,2 mL de pBS 0,15 M pH 7,4, adicionamos 12 µL de NFX(aq)
1,6 mM e submetemos para agitação mecânica via vortex e sonicamos 5 vezes. Centrifugamos
as amostras e recolhemos 1 mL do sobrenadante livre de impurezas.

Experiência 3
Para a preparação das vesículas unilamelares pequenas (SUV)/SDS foi utilizado Pc-Lα
Lecithin em clorofórmio CHCl3 20 mM. Distribui-se 0,6 mL desse estoque em 4 frascos
rotulados para identificação das diferentes concentrações de SDS. Adicionamos aos 1,2 mL de
Pc(CHCl3) 10 mM alíquotas de SDS o suficiente para obter em cada frasco 0, 2, 4 e 6 mM de
SDS, estas soluções foram secadas com N2 e colocadas no vácuo por 2 horas, as películas
formadas foram hidratadas com 1,2 mL de pBS 0,15 M pH 7,4, adicionamos 12 µL de NFX(aq)
1,6 mM e submetemos para agitação mecânica via vortex e sonicamos 5 vezes. Centrifugamos
as amostras e recolhemos 1 mL do sobrenadante livre de impurezas. Fez-se novas amostras
para 0 e 2 mM, pois houveram uma perda destas.

5.1 Resultados preliminares

Espectros de Fluorescência

Experiência 1
Os espectros de fluorescência da NFX em PC/%SDS titulada com o complexo CuPhen
foram obtidos em 3 experiências distintas e os resultados são apresentados como segue. Na Fig.
9 observa-se uma diminuição da intensidade de fluorescência pelo complexo metálico,
característica de supressão de fluorescência, com deslocamento do pico de 414 nm para 417,
421 e 423 nm a medida que a concentração do SDS é maior.
10

0% SDS
20% SDS
6 6
3,0x10 3,0x10
0 M
0 M
2
2
2,5x10
6 6
2,5x10 (417, 2,39565E6)[55] 4
4
6
6
8
8
(414, 1,98744E6)[52] 10
2,0x10
6 10 6
2,0x10 12
12
Intensidade

Intensidade
14
14
16
16
1,5x10
6 6
1,5x10 20
20
24
24
28
28
6 6
1,0x10 1,0x10

5 5
5,0x10 5,0x10

(420, 460581,28375)[58]
0,0 0,0
360 380 400 420 440 460 480 500 360 380 400 420 440 460 480 500

Comprimento de onda (nm) Comprimento de onda (nm)

60% SDS
40% SDS
3,0x10
6 (423, 3,0174E6)[61]
(421, 2,82266E6)[59] 3,0x10
6

0 M 0 M
2 2
6 4 4
2,5x10
6 2,5x10
6
6
8 8
10 10
6
2,0x10 12 6 12
2,0x10
Intensidade

Intensidade
14 14
16 16
6 20 20
1,5x10 1,5x10
6
24
24
28 28

6
1,0x10 1,0x10
6

5 5
5,0x10 5,0x10

(426, 171973,22594)[64] (423, 207084,47629)[61]


0,0 0,0
360 380 400 420 440 460 480 500 360 380 400 420 440 460 480 500

Comprimento de onda (nm) Comprimento de onda (nm)

Figura 9. Espectros de fluorescência da NFX 16 µM com PC:SDS 10 mM:0, 2, 4 e 6 mM subtraindo o espectro do


espalhamento. Todas as medidas foram em tampão pBS titulando com CuPhen. Excitação em 330 nm.

Experiência 2
Observa-se (Fig. 10) uma diminuição da intensidade de fluorescência pelo complexo
metálico, característica de supressão de fluorescência, com deslocamento do pico de 412 nm
para 420, 427 e 429 nm a medida que a concentração do SDS é maior.
11

6 6
3,0x10 3,0x10
0%SDS 20%SDS

(412, 2,40586E6)[50]
6 6
2,5x10 2,5x10 (420, 2,24118E6)[58]

0 M 0 M
6
2 6
2
2,0x10 4 2,0x10 4
Intensidade

Intensidade
6 6
8 8
6
1,5x10 10 6
1,5x10 10
12 12
14 14
6
16 6
16
1,0x10 20 1,0x10 20
24 24
28 28
5 5
5,0x10 5,0x10

(412, 621414,61343)[50] (419, 365035,23513)[57]


0,0 0,0
360 380 400 420 440 460 480 500 360 380 400 420 440 460 480 500

Comprimento de onda (nm) Comprimento de onda (nm)

40%SDS 6
6 (427, 3,09775E6)[65] 3,0x10 60%SDS
3,0x10

0 M 6
2,5x10 (429, 2,34511E6)[67]
6
2,5x10 2 0 M
4 2
6 4
6
6 8 2,0x10 6
2,0x10
Intensidade

Intensidade
10 8
12 10
14 6 12
6
1,5x10 1,5x10
16 14
20 16
24 20
6
6
1,0x10 28 1,0x10 24
28

5 5
5,0x10 5,0x10

(427, 367667,94893)[65] (428, 422174,7569)[66]


0,0 0,0
360 380 400 420 440 460 480 500 360 380 400 420 440 460 480 500

Comprimento de onda (nm) Comprimento de onda (nm)

Figura 10. Espectros de fluorescência da NFX 16 µM com PC:SDS 10 mM:0, 2, 4 e 6 mM subtraindo o espectro do
espalhamento. Todas as medidas foram em tampão pBS titulando com CuPhen. Excitação em 330 nm.

Experiência 3
Observa-se (Fig. 11) uma diminuição da intensidade de fluorescência pelo complexo
metálico, característica de supressão de fluorescência, com deslocamento do pico de 409 nm
para 414, 424 e 427 nm a medida que a concentração do SDS é maior.
12

6
3,0x10 0% SDS 6
3,0x10 20% SDS

(414, 2,39699E6)[52]
6 6
2,5x10 2,5x10
(409, 2,10574E6)[47]
0 M
0 M 2
6 2 6 4
2,0x10 2,0x10
4 6
Intensidade

Intensidade
6 8
8 10
6 6
1,5x10 10 1,5x10 12
12 14
14 16
6 16 6 20
1,0x10 1,0x10 24
20
24 28
28
5 5
5,0x10 5,0x10

(410, 290006,35769)[48] (415, 234158,01045)[53]


0,0 0,0
360 380 400 420 440 460 480 500 360 380 400 420 440 460 480 500

Comprimento de onda (nm) Comprimento de onda (nm)

6
3,0x10 40% SDS 6
3,0x10 60% SDS

6 6
2,5x10 (424, 2,42643E6)[62] 2,5x10
0 uM
2 0 M
6 4 6 2
2,0x10 2,0x10 (427, 1,84127E6)[65]
6 4
Intensidade

Intensidade
8 6
10 8
6 6
1,5x10 12 1,5x10 10
14 12
16 14
6 20 6 16
1,0x10 1,0x10
24 20
28 24
28
5 5
5,0x10 5,0x10

0,0 (427, 155913,70545)[65] 0,0 (429, 130019,47685)[67]

360 380 400 420 440 460 480 500 360 380 400 420 440 460 480 500

Comprimento de onda (nm) Comprimento de onda (nm)

Figura 11. Espectros de fluorescência da NFX 16 µM com PC:SDS 10 mM:0, 2, 4 e 6 mM subtraindo o espectro do
espalhamento. Todas as medidas foram em tampão pBS titulando com CuPhen. Excitação em 330 nm.

Nestes três casos estes deslocamentos dos picos estariam indicando que a associação de
moléculas de NFX às vesículas de PC é cada vez maior quando concentração do SDS aumenta.
Titulando com o complexo também podemos observar que a supressão tem quase a mesma
forma a medida que aumentamos a concentração do SDS (No caso do ácido esteárico a
supressão era muito menor).

Deslocamentos dos picos

Experiência 1
Para apreciar melhor possíveis deslocamentos dos picos se fez uma normalização das
curvas espectrais para 0, 12 e 24 µM de CuPhen, obtendo os seguintes resultados (Fig. 12).
13

0 M CuPhen 0mM_SDS 12 M CuPhen 0mM_SDS 24 M CuPhen 0mM_SDS


(414, 1)[52] 2mM_SDS (412, 1)[50] 2mM_SDS (412, 1)[50] 2mM_SDS
1,0 1,0 1,0
4mM_SDS 4mM_SDS 4mM_SDS
(419, 1)[57] (423, 1)[61] 6mM_SDS (426, 1)[64] 6mM_SDS (418, 1)[56] (425, 1)[63] 6mM_SDS
(421, 1)[59] (419, 1)[57] (425, 1)[63]
(426, 1)[64]
0,8 0,8 0,8
intensidade(u.a.)

intensidade(u.a.)
intensidade(u.a.)
0,6 0,6 0,6

0,4 0,4 0,4

0,2 0,2 0,2

0,0 0,0 0,0


360 380 400 420 440 460 480 500 360 380 400 420 440 460 480 500 360 380 400 420 440 460 480 500

comprimento de onda(nm) comprimento de onda(nm) comprimento de onda(nm)

Figura 12. Espectros normalizados de fluorescência da NFX 16 µM com PC/SDS para as concentrações fixas de 0,
12 e 24 µM. Todas as medidas foram em tampão pBS titulando com CuPhen. Excitação em 330 nm.

Experiência 2
Para apreciar melhor possíveis deslocamentos dos picos se fez uma normalização das
curvas espectrais para 0, 12 e 24 µM de CuPhen, obtendo os seguintes resultados (Fig. 13).

0 M CuPhen 12 M cuphen 24M CuPhen


(411, 1)[49]
0mM_SDS (412, 1)[50] 0mM_SDS 0mM_SDS
(411, 1)[49]
2mM_SDS 2mM_SDS 2mM_SDS
1,0 1,0 1,0
4mM_SDS 4mM_SDS 4mM_SDS
6mM_SDS 6mM_SDS 6mM_SDS
(419, 1)[57] (426, 1)[64]
0,8 (420, 1)[58] 0,8 (428, 1)[66] 0,8
intensidade(u.a.)

intensidade(u.a.)
(427, 1)[65] (429, 1)[67]
intensidade(u.a.)

(418, 1)[56] (425, 1)[63] (430, 1)[68]

0,6 0,6 0,6

0,4 0,4 0,4

0,2 0,2 0,2

0,0 0,0 0,0


360 380 400 420 440 460 480 500 360 380 400 420 440 460 480 500 360 380 400 420 440 460 480 500

comprimento de onda(nm) comprimento de onda(nm) comprimento de onda(nm)

Figura 13. Espectros normalizados de fluorescência da NFX 16 µM com PC/SDS para as concentrações fixas de 0,
12 e 24 µM. Todas as medidas foram em tampão pBS titulando com CuPhen. Excitação em 330 nm.

Experiência 3
Para apreciar melhor possíveis deslocamentos dos picos se fez uma normalização das
curvas espectrais para 0, 12 e 24 µM de CuPhen, obtendo os seguintes resultados (Fig. 14).

0 M CuPhen 0mM_SDS 12M CuPhen 0mM_SDS 24 M CuPhen 0mM_SDS


(410, 1)[48]
2mM_SDS (410, 1)[48]
2mM_SDS (409, 1)[47] 2mM_SDS
1,0 1,0 1,0
4mM_SDS 4mM_SDS 4mM_SDS
(427, 1)[65] (414, 1)[52]
(414, 1)[52] 6mM_SDS (427, 1)[65] 6mM_SDS (413, 1)[51] (428, 1)[66] 6mM_SDS
(424, 1)[62] (423, 1)[61]
0,8 0,8 0,8 (423, 1)[61]
intensidade(u.a.)

intensidade(u.a.)
intensidade(u.a.)

0,6 0,6 0,6

0,4 0,4 0,4

0,2 0,2 0,2

0,0 0,0 0,0


360 380 400 420 440 460 480 500 360 380 400 420 440 460 480 500 360 380 400 420 440 460 480 500

comprimento de onda(nm) comprimento de onda(nm) comprimento de onda(nm)

Figura 14. Espectros normalizados de fluorescência da NFX 16 µM com PC/SDS para as concentrações fixas de 0,
12 e 24 µM. Todas as medidas foram em tampão pBS titulando com CuPhen. Excitação em 330 nm.

Vemos em todos os casos que a medida que incrementamos a quantidade de SDS numa
concentração fixa de CuPhen, o pico de fluorescência máxima desde 409 nm desloca-se até
428 nm aproximadamente.
14

Variação da fluorescência da NFX em SUV/%SA em função da titulação de CuPhen

Experiência 1
A Fig. 15 apresenta a variação da fluorescência de NFX em SUV/SDS em 423 nm, como
função da concentração do complexo.
Equation y =0.5*A* ((1+x/CL+1/(Kb*CL))- ((1+x/CL+1/(K
NFX sem PC b*CL))^2 - 4*x/CL)^0.5 )

PC 0mM SDS
16 NFX sem PC 1,0 PC 20mM SDS Adj. R-Squ 0,99964 0,9989 0,99821
PC 40mM SDS Value Standard E
PC 0mM SDS 0,9 PC 60mM SDS
Book5_DF A 1 0

14 maxFm5

PC 20mM SDS NFX sem PC Book5_DF CL


maxFm5
13,932
84
0,23923

0,8 PC 0mM SDS Book5_DF Kb 0,4748 0,01867

12 PC 40mM SDS PC 20mM SDS


maxFm5 3
Book5_DF A 1 0
PC 60mM SDS 0,7 PC 40mM SDS maxFm1
Book5_DF CL 20,950 0,51528
PC 60mM SDS maxFm1 03
10
0,6 Book5_DF Kb
maxFm1
0,6024
7
0,06124

(F0-F)/F0
Book5_DF A 1 0
F0/F-1

maxFm2
8 0,5 Book5_DF CL 27,666 0,66705
maxFm2 63
Book5_DF Kb 0,8362 0,159
0,4 maxFm2 3
6 Book5_DF A 1 0
maxFm3

0,3 Book5_DF CL
maxFm3
15,504
6
0,31839

4 Book5_DF Kb
maxFm3
0,8882 0,0726

0,2 Book5_DF A 1 0
maxFm4
2 Book5_DF CL 17,510 0,25542
0,1 maxFm4 64
Book5_DF Kb 1,0605 0,08209
maxFm4 1
0 0,0
0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 30

[CuPhen] M) [CuPhen] M)

Figura 15. Esquerda: Variações da fluorescência da NFX sem PC e em PC/%SDS, como função da concentração
dos complexos de CuPhen. Direita: Variação máxima da fluorescência da NFX sem PC e em PC/%SDS como
função da concentração dos complexos de CuPhen. Pico de análise em 423 nm.

Experiência 2
A Fig. 16 apresenta a variação da fluorescência de NFX em SUV/SDS em 423 nm, como
função da concentração do complexo.
Equation y =0.5*A* ((1+x/CL+1/(Kb*CL))- ((1+x/CL+1/(Kb*CL
))^2 - 4*x/CL)^0.5 )

NFX sem PC
16 1,0
NFX sem PC PC 0mM SDS Adj. R-Squa 0,99964 0,9989 0,99812

PC 20mM SDS Value Standard Er

14 PC 0mM SDS 0,9 PC 40mM SDS


Book9_DF
maxFm5
A 1 0

PC 20mM SDS 0,8


PC 60mM SDS
Book9_DF
maxFm5
CL 13,932
84
0,23923

NFX sem PC Book9_DF Kb 0,4748 0,01867


12 PC 40mM SDS PC 0mM SDS
maxFm5
Book9_DF A
3
1 0

PC 60mM SDS 0,7 PC 20mM SDS


maxFm1
Book9_DF CL 29,113 0,69215

10 PC 40mM SDS
maxFm1 17

0,6 PC 60mM SDS


Book9_DF
maxFm1
Kb 0,4639
9
0,0614
(F0-F)/F0

Book9_DF A 1 0
F0/F-1

maxFm2
8 0,5 Book9_DF CL 24,103 0,62521
maxFm2 43
Book9_DF Kb 0,7264 0,11028
0,4 maxFm2 3
6 Book9_DF A 1 0
maxFm3

0,3 Book9_DF
maxFm3
CL 23,331
98
0,7882

4 Book9_DF
maxFm3
Kb 0,8730
8
0,18835

0,2 Book9_DF A 1 0
maxFm4

2 Book9_DF CL 24,098 0,21484


0,1 maxFm4 09
Book9_DF Kb 0,5443 0,02317
maxFm4 4

0 0,0
0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 30

[CuPhen] M) [CuPhen] M)

Figura 16. Esquerda: Variações da fluorescência da NFX sem PC e em PC/%SDS, como função da concentração
dos complexos de CuPhen. Direita: Variação máxima da fluorescência da NFX sem PC e em PC/%SDS como
função da concentração dos complexos de CuPhen. Pico de análise em 423 nm.

Experiência 3
A Fig. 17 apresenta a variação da fluorescência de NFX em SUV/SDS em 423 nm, como
função da concentração do complexo.
15

NFX sem PC Equation y =0.5*A* ((1+x/CL+1/(Kb*CL))- ((1+x/CL+1/(


Kb*CL))^2 - 4*x/CL)^0.5 )
PC 0mM SDS
16 1,0 PC 20mM SDS
NFX sem PC PC 40mM SDS Adj. R-Squar 0,99841 0,99903 0,99903

PC 0mM SDS 0,9 PC 60mM SDS


Value Standard Err

14 Book7_DFm A
axFm5
1 0

PC 20mM SDS NFX sem PC Book7_DFm CL 13,9328 0,23923


0,8 PC 0mM SDS
axFm5 4

PC 40mM SDS
Book7_DFm Kb 0,47483 0,01867
12 PC 20mM SDS axFm5

0,7 Book7_DFm A 1 0

PC 60mM SDS PC 40mM SDS axFm1


Book7_DFm CL 20,1294 0,53058
10 PC 60mM SDS axFm1 3

0,6 Book7_DFm Kb
axFm1
0,64449 0,07341

(F0-F)/F0
Book7_DFm A 1 0
F0/F-1

0,5
axFm2
8 Book7_DFm CL 20,5034 0,35752
axFm2 6
Book7_DFm Kb 0,97683 0,10125
0,4 axFm2

6 Book7_DFm A
axFm3
1 0

0,3 Book7_DFm CL
axFm3
20,7462
7
0,3011

4 Book7_DFm Kb
axFm3
1,71621 0,22469

0,2 Book7_DFm A
axFm4
1 0

Book7_DFm CL 20,5355 0,23798


2 0,1
axFm4 5
Book7_DFm Kb 1,62744 0,16207
axFm4

0 0,0
0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 30

[CuPhen] M) [CuPhen] M)

Figura 17. Esquerda: Variações da fluorescência da NFX sem PC e em PC/%SDS, como função da concentração
dos complexos de CuPhen. Direita: Variação máxima da fluorescência da NFX sem PC e em PC/%SDS como
função da concentração dos complexos de CuPhen. Pico de análise em 423 nm.

Podemos observar, destas variações da intensidade de fluorescência, que a medida que a


concentração de SDS é maior a supressão da NFX é mais rápida cada vez do que nos outros
casos. Isto poderia indicar que a interação do complexo metálico com a NFX aumenta quando
aumentamos a quantidade de SDS às moléculas de PC.