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Microbiologia Práticas By:Salsicha

1.Cuidados de Assepsia
 Desinfetar as mãos e a bancada com álcool
 Flambagem
 Esterilização
 Autoclave  Esteriliza artigos através do calor húmido sob pressão; Todas as partículas têm de estar à
mesma temperatura (evitar bolhas de ar porque à sua volta as partículas ficam a temperaturas diferentes)
 Câmaras de fluxo de ar laminar  + eficiente; não filtra gases; Filtro HEPA

 Classificação de agentes biológicos por classes de risco  4 Grupos consoante o risco de doença humana

2.Ubiquidade Microbiana

 É o facto de os micróbios estarem em todo o lado


 Para provar isto, temos de criar condições favoráveis ao crescimento da colónia que será visível a
olho nu:
o Condições ambientais (temperatura, pH, etc)
o Condições nutritivas (composição química do meio)
o Isto depende do micróbio que pretendemos
 Inocular = Inserir = Contaminar  Inocular/ contaminar um meio estéril
 Meios:
o Agar Nutritivo:
 Carne + Peptona (proteína) + Água + Ágar
 pH =7
 Aminoácidos + Sais + Água
o Agar Mosto:
 Mosto de uva + Ágar
 pH=5,5 (+ácido)
 Açúcares (sacarose, frutose e glicose)
3.Diversidade Microbiana

 Microorganismos:
o Não são vistos a olho nu
o Podem ser procariotas ou eucariotas,
unicelulares ou pluricelulares
o Eucariotas:
 Fungos (leveduras, bolores)
 Protistas (protozoários, algas)
 Leveduras: unicelulares
 Bolores: pluricelulares; organizam-
se em hifas  micélio
4.Isolamento de Cultura Pura. Postulados de Koch. Cuidados de Assepsia II
 Cultura pura:
o Constituída por um único tipo de microrganismos e com homogeneidade genética
o Permite estabelecer uma relação causa-efeito
 Postulados de Koch:
o Individuos doentes possuem o
micoorganismo e indivíduos saudáveis não
o Microorganismo tem de ser isolado e
cultivado em cultura pura
o Individuos saudáveis inoculados com o
microorganismo ficam com a doença
o O microorganismo pode ser isolado outra
vez a partir do hospedeiro experimental
o Limitações: não aplicável a todas as
bactérias, nem a agentes não cultiváveis in
vitro
 Riscado:
o Estelizar a ansa na chama e deixar arrefecer numa parte do agar sem material vivo  Tomar um
bocado da cultura com as bactérias a isolar  Espalhar o conteúdo no agar (flambear a ansa entre
cada riscado)
o Trabalhar perto da chama e desinfetar as mãos e bancada
o Não exige trabalho preparatório
 Inclusão e Espalhamento: Tem de se fazer diluições para haver menos células, para depois conseguirmos ver
as colónias

5. Morfologia Colonial. Morfologia Celular. Técnicas de Coloração de Bactérias


 Esfregaço:
o Mata as células, mas mantém as estruturas celulares  Fixação
 Quimica  ex álcool
 Física  ex: calor
o Gotas em ambas as extremidades  Espalha-se com a ansa esterilizada  Limpar excessos com o
papel molhado com álcool  Passa na lamparina 3x
 Processo de coloração
o Simples, diferencial ou estrutural
 Coloração Simples: Azul de Metileno
o Meio neutro  Estruturas celulares  Cargas negativas
 Reagem com o catião azul de metileno  Coloração
 Coloração Diferencial
o Microorganismos diferentes reagem de maneira diferente
à mesma técnica de coloração
o Coloração de Ziehl-Nielsen
o Coloração de Gram:
 Corante primário  Cristal de violeta (corante
básico)
 Mordente  Solução de Lugol + Corante =
Formação de complexos  + coloração
 Descorante  Álcool iodado  Retira a coloração
violeta às Gram negativas
 Corante de contraste  Safranina  Cora as células Gram negativas, ficando cor de
rosa/vermelhas

*Nota: Gram positivas têm uma camada de peptidoglucano mais espessa  Corante violeta não
é retirado

6.Preparação e Esterilização de Meios de Cultura


 Meio de Cultura
o Preparado sólido ou um líquido utilizado para crescer, transportar ou armazenar microorganismos.
o Necessidades nutricionais dos diferentes microorganismos
 Meio sólido  Com agentes gelificantes  Agar-agar
 Meio definido/sintético:
o Sabe-se quais os constituintes químicos e as suas quantidades
o Para um grupo específico de microorganismos
 Meio complexo:
o Não se sabe a composição química com exatidão  sabe-se mais ou menos os ingredientes, mas
não as quantidades
o Ex: Agar nutrititvo e de mosto
o Permite o crescimento duma larga gama de microorganismos
 Meio de suporte:
o Meios que permitem o crescimento duma larga gama de microorganismos
o Ex: meios complexos
 Meio indicador:
o Contém um composto cuja cor muda, quando um fator em estudo se altera devido ao crescimento
microbiano (crescimento microbiano  Alteração de pH, por exemplo  Cor altera)
o Utilizado na contagem de bactérias (ex: um meio perder a cor à medida que há redução devido ao
crescimento microbiano)
 Meio seletivo:
o Apenas permitem o crescimento de certos microorganismos
o Meio McConkey  Sais biliares  Crescimento de bactérias entéricas (do trato digestivo)
o Meio com antibiótico  só crescem os resistentes
 Meio Diferencial:
o Favorece o crescimento de determinados microorganismos numa cultura mista
o Distingue microorganismos vindos de colónias semelhantes
 Meio de McConkey  crescimento de colónias de coliformes (coloração vermelha)
 Meio de BEM  colónias de coliformes (coloração verde e metalizada)
 Agar com sangue  distingue bactérias hemolíticas
 Meio enriquecido:
o Permitem melhorar o crescimento de microorganismos com exigências nutricionais específicas

7. Condições Ambientais de Crescimento Microbiano: Temperatura, pH e O2 Cultura de Anaeróbios

 Fatores ambientais  oxigénio, temperatura, pH,


salinidade, pressão, radiação…
 Crescimento de anaeróbios  Jarra de anaerobiose +
Câmara de anaerobiose
 Efeito do pH:
o Acidófilos  0<pH<5
o Neutrófilos  5,5<pH<8  carne, saliva, sangue
o Basófilos  8<pH<11,5  água do mar, sabão
8. Contagem de Populações Microbianas

 A sua contagem tem de ser feita por diluições e amostragem  Erros


o Amostragem  Pressupõe que as populações de micróbios estão distribuídas uniforme e
aleatoriamente  Mas nem sempre é verdade devido a problemas de agregação e dispersão das
células  Erros do microorganismo em estudo, das condições ambientais ou do operador
 Contagem de colónias:
o Placas entre 30 e 300 colónias
o Média do nº de colónias (Cm  1,96√Cm para saber os erros, em que Cm é a média do nºde colónias
nas placas)
o Volume em mL e Diluição com o expoente positivo
o Contagem feita em ufc/mL  (nºmédio de colónas x Diluição) / Volume
 Contagem de células viáveis (com capacidade se reproduzirem/formar colónias):
o Inclusão
o Espalhamento
o Bioluminescência
o Técnica das membranas (amostra é filtrada pela membrana e depois a membrana é colocada no
meio apropriado)
o …
 Contagem de células totais (incluindo mortas):
o Câmaras de contagem
o Turbidimetria
o …
9. Antibióticos e Antibiogramas
 Composto produzido por um microorganismo, que mata ou inibe o crescimento de outros microorganismos
susceptíveis
 Deve inibir o crescimento ou matar o micróbio patogénico, danificando o menos possível o hospedeiro
 Mecanismo  inibição da síntese da parede celular, da síntese proteica ou da de ácidos nucleicos
 MIC  concentração mínima para inibir o crescimento do micróbio
 MIT  concentração mínima para matar o micróbio
 Antibiograma
o Mede o grau de sensibilidade do micróbio a uma gama de antibióticos
o Mais utilizado  Kirby-Bauer
o + Sensibildade ao antibiótico = - MIC = + Auréola à volta do disco (é preciso menos antibiótico para
haver inibição do crescimento)
10. A Eficiênca do papel higiénico e a Dispersão Microbiana
 Cadeia de transmissão microbiana:
o Para impedir a transmissão microbiana podemos:
 Eliminar as fontes do patogene  mas nem sempre é possivel
 Impedir a transmissão para o hospedeiro  Cuidados de higiene
 Diminuir a suscetibilidade do hospedeiro  Vacinação
 Impedir a transmissão do patogene a partir do hospedeiro  ex: hospedeiro não sair de
casa
 Coliformes  Grupos de bactérias indicadoras de contaminação  Podem ser detetados pelo meio de
MacConkey  Meio seletivo (apenas crescem Gram negativas) e diferencial para a E.Coli
 Procedimento:
o Placa de Petri com meio de MacKonkey
o Passar com os dedos envolvidos em papel higiénico numa cultura de E.Coli
o Papel  Recipiente com lixivia
o Inocular o dedo na metade “antes” do meio de MacKonkey
o Lavar as mãos + Toalha
o Inocular o dedo na metade “depois” do meio de MacKonkey
o Observar o crescimento depois duma semana
*Nota: Trabalhar sempre ao pé da lamparina
 Contaminações: Toalha, manípulo da torneira, sabonete (mas supostamente, depois de lavar as mãos haverá
menos crescimento microbiano)

11. Análise Microbiológica da Água + Detecção de Indicadores Microbianos


 Organismos indicadores:
o Utilizável para todos os tipos de água
o A bactéria indicadora deve estar sempre presente quando existem patogénos entéricos na água
o Ela deve sobreviver mais tempo do que o patógeno entérico mais resistente
o Não se reproduz na água contaminada
o É específica para os patógenos
o Grande sensibilidade
o Deve ser inofensiva para os seres humanos
o O teor de bactéria indicadora é proporcional ao grau de contaminação da água
o Ex: Bactérias coliformes
 Bactérias coliformes:
o Anaeróbias facultativas
o Gram negativas
o Forma de bastonetes
o Fermentam a lactose com produção de gás  cria bolha
 Teste Presuntivo:
o Teste com tubos de diferentes concentrações
o Negativo: não há bolha de ar  não há bac.coliformes
o Positivo: há bolha de ar  há coliformes
o Com os tubos positivos  Riscado em meio ENDO ou BEM  Observar se as bactérias obtidas têm
as características das coliformes
o Cálculo de MPN através da contagem de tubos positivos, usando uma tabela
 Técnica de Filtração por membrana:
o Usada em águas com poucas partículas em suspensão
o A água passa por uma membrana Filtração  O filtro é transferido para um meio sólido seletivo
 Análise das colónias que se formam
 Agar EMB
o Eosina e azul de metileno  Inibem o crescimento de Gram positivas
o Gram negativas que produzem produtos acídicos apresentam um brilho metalizado (ex:E.Coli)
 Agar ENDO
o Inibe o crescimento de Gram positivas
o Produção de aldeídos e ácidos
o Fucsina  Coloração vermelha nas colónias
o Ex: E.Coli  brilho verde metálico

12. Análise Microbiológica do Leite

 Devido à sua natureza o leite é um veículo para disseminação de agentes patogénicos


 Determinação da carga microbiana do leite:
o Teste da Redução do Azul de Metileno (TRAM)
 Mede-se o tempo que o leite demora a descorar
 - tempo para descorar = leite com - qualidade = + ufc/mL
o Método da inclusão, com posterior contagem de colónias

13. Simbioses com Plantas Rhizobium e Micorrizas


 Rhizobum:
o Bactérias Gram negativas
o Colonizam-se dentro dos nódulos radiculares das raízes da
planta (SIMBIOSE) + Convertem o azoto em amoníaco 
BACTERÓIDES
o Organismos que absorvem substâncias orgânicas
provenientes de matéria orgânica em decomposição (são
bactérias saprófitas)
 Micorrizas  Simbiose entre fungos e raízes de plantas  + Zona de
absorção radicular
 Globina (planta) + Grupo heme (microorganismo) =
LEGHEMOGLOBINA  Permite a fixação do azoto + Transporta O2 (Respiração dos bacteróides) + Dá uma
cor rosada aos nódulos
 Micorriza arbuscular:
o Micorriza em que o fungo penetra as
células corticais das raízes de uma
planta vascular
o Absorção de nutrientes como o fósforo
e micronutrientes do solo  +
Afinidade das hifas para os iões fosfato
 Meio de Manitol Levedura
 Vermelho de Congo (coloração)

 Estirpes de crescimento rápido  Acidificação
do meio de cultura
 Estirpes de crescimento lento  Alcalinização
do meio de cultura
Fig.1 - Bacteróides de Rhizobium Fig.2 -Micorrizas