Pretratamiento Biológico de Lignocelulosas y sus aplicaciones.

Los carbohidratos lignocelulósicos, es decir, celulosa y hemicelulosa, tienen un potencial abundante como
materia prima para la producción de biocombustibles y productos químicos. Sin embargo, estos
carbohidratos generalmente están infiltrados por la lignina. La descomposición de la barrera de lignina
alterará las estructuras de las lignocelulosas y hará que los carbohidratos sean accesibles para una
bioconversión más eficiente. El pretratamiento biológico de las lignocelulosas utilizando hongos de la
pudrición blanca se ha utilizado durante décadas para la alimentación de rumiantes, hidrólisis enzimática y
biopulping. La aplicación de las capacidades de los hongos de la podredumbre blanca puede ofrecer
procesos respetuosos con el medio ambiente para utilizar lignocelulosas sobre el tratamiento previo físico
o químico.
La biomasa lignocelulósica se produce en grandes cantidades en el mundo; la mayoría de estos desechos se
dejan en el campo, causando un problema de eliminación para las agroindustrias productoras locales. Sin
embargo, la biomasa lignocelulósica tiene un gran potencial como materia prima para la producción de más
productos de valor agregado, como productos químicos de bajo precio, por ejemplo. xilitol, xilosa, glucosa,
furfural (Rahman et al. 2006; Sánchez 2009), combustibles (Kim y Dale 2004), biofibras (Reddy y Yang
2005), alimento para rumiantes (Okano et al. 2009), biopulp (Chen et al. 2002; Scott et al. 2002; Yaghoubi
et al. 2008), o incluso para la producción de enzimas (Hölker et al. 2004).
El pretratamiento de la biomasa lignocelulósica se puede realizar por métodos físicos, mecánicos, químicos
y biológicos (revisado por ejemplo, Mosier 2005; Taherzadeh y Karimi 2008; Hu et al. 2008; Hendriks and
Zeeman 2009; Alvira et al. 2010). El tratamiento previo biológico emplea microorganismos y sus
mecanismos enzimáticos para descomponer la lignina y alterar las estructuras de la lignocelulosa. Algunos
de los microorganismos más prometedores para el tratamiento biológico son los hongos de podredumbre
blanca que pueden mineralizar la lignina en CO2 y agua en cultivo puro (Lundquist et al. 1977; Hatakka
1983). Varios hongos de la podredumbre blanca como Pleurotus ostreatus son capaces de metabolizar
eficazmente la lignina en una variedad de materiales lignocelulósicos (Kirk y Chang 1981; Hatakka 1983;
Keller et al. 2003). Los hongos se han estudiado en relación con varias enzimas ligninolíticas, como las
peroxidasas de lignina (LiP), las peroxidasas de manganeso (MnP), la laca (Lac) y las peroxidasas versátiles
(VP) (Higuchi 2004; Wong 2009). Teniendo estas enzimas, estos hongos pueden tener muchas aplicaciones
en biopulping, biobleaching, alimentos para rumiantes, xilosa, etanol, biogas y producciones de enzimas
(Kirk y Chang 1981; Reid 1989).
Los pretratamientos biológicos que utilizan hongos de podredumbre blanca se han llevado a cabo
principalmente mediante fermentación en estado sólido (SSF). En SSF, se ha demostrado que la producción
de enzimas ligninolíticas es mayor que en la fermentación sumergida (SF) (Xu et al. 2001). La actividad de
la enzima y la degradación de la lignina están influenciadas por varios factores, como la cepa fúngica, la
composición de nutrientes (nitrógeno, Mn2 + y Cu2 +), el contenido de humedad, la aireación, el pH y la
temperatura (Kaal et al. 1995; Zhao et al. 1996 Fu et al. 1997; Dorado et al. 2001; Šnajdr y Baldrian 2007;
Patel et al. 2009b).
Efecto del pretratamiento biológico en las características de la biomasa.
Los hongos de la podredumbre blanca tienen una capacidad única para despolimerizar, romper los enlaces
carbono-carbono y mineralizar la lignina por enzimas ligninolíticas. Pleurotus ostreatus y B. adusta son
degradadores de lignina altamente específicos basados en el análisis de degradación marcado con lignina
14C (Agosin, Daudin y Odier 1985). Los cambios en la relación entre las unidades de lignina p-
hidroxifenilo (H), guayacilo (G) y siringil (S) se analizaron mediante cromatografía de pirólisis de gases-
espectrometría de masas.
La hemicelulosa es más fácil de degradar que otros componentes en la biomasa lignocelulósica, Pleurotus
ostreatus (Baldrian et al. 2005) y Pleurotus dryinus ( Kachlishvili et al., 2005) mostraron producir múltiples
endoxilanasas. La degradación de la hemicelulosa combinada con la degradación de la lignina puede
disminuir la recalcitración de las lignocelulosas a la hidrólisis enzimática, pero la pérdida de xilano aumenta
el riesgo de disminuir toda la recuperación de azúcar en el proceso de bioconversión (Yu et al. 2010a).
Los hongos también producen una batería de enzimas celulasas con diferentes especificidades y
características sinérgicas. Las celulasas hidrolizan los enlaces β-1,4-glicosídicos de la celulosa. El hongo
de la podredumbre blanca no selectivo degrada todos los componentes de las lignocelulosas en cantidades
iguales, incluida la celulosa. De lo contrario, los hongos selectivos de la podredumbre blanca degradan las
celulosas en cantidades insignificantes (Blanchette 1995) y son adecuados para el tratamiento previo
biológico.
Factores que afectan el pretratamiento biológico con hongos de rotación blanca.
Las actividades de los hongos y la producción de enzimas ligninolíticas están influenciadas por varios
factores, como la cepa fúngica, la concentración y la fuente de nitrógeno, la adición de Mn2+ y Cu2+, la
aireación, el contenido de humedad, la acidez ( pH), y temperatura.. Los factores nutricionales pueden
controlar el modo de degradación de la lignina en las lignocelulosas de forma selectiva o simultánea, tanto
en estado sólido como en fermentación sumergida.
Cepa fúngica
Hay muchas especies y cepas de hongos de la podredumbre blanca, de los cuales algunos producen todas
las enzimas ligninolíticas y otros solo producen parcialmente enzimas ligninolíticas (Elisashvili et al. 2008).
El primer paso es la selección de una gran cantidad de aislamientos para elegir los aquellos con la mayor
producción y actividad de enzimas ligninolíticas y una alta degradación de la lignina en los sustratos
específicos. En dichos estudios, se analizaron 19 aislamientos de hongos de la podredumbre blanca para la
hidrólisis enzimática de la paja (Hatakka 1983). Después de 5 semanas de tratamiento previo con Pleurotus
ostreatus, el 35% de la pajilla original se convirtió en azúcares reductores, el 74% de los cuales era glucosa.
Por otro lado, solo el 12% de la pajilla de control sin tratar se convirtió en azúcares reductores, el 42% de
los cuales era glucosa. La degradación preferencial también depende del sustrato. Por ejemplo, Pleurotus
sp. preferiblemente degradan la lignina de la paja, mientras que no deslignifican el abedul de madera dura
o el pino de madera blanda (Hatakka 1983). En otro estudio (Taniguchi et al. 2005), se realizó la evaluación
de cuatro aislamientos de los hongos de podredumbre blanca Pleurotus ostreatus, P. chrysosporium, T.
versicolor y Ceriporioposis subvermispora para el tratamiento previo de la paja de arroz seguida de una
posterior hidrólisis enzimática y diferentes Se informaron resultados. P. ostreatus prefirió degradar la
lignina más que los polisacáridos en la paja de arroz, mientras que P. chrysosporium y C. subvermispora
degradaron la lignina y también los polisacáridos de la paja.
El rastreo de los hongos para la degradación de lignina preferencial se puede llevar a cabo utilizando
microscopía electrónica de barrido. En tales estudios (Blanchette 1984), se eliminaron selectivamente 29
hongos de la podredumbre blanca, incluida la lignina de varias especies de coníferas y árboles de madera
dura. En otro estudio, se evaluaron 32 aislamientos de hongos de pudrición blanca para la paja de trigo para
mejorar la producción de biogás (Muller y Trosch 1986). Se encontró que el pretratamiento de la paja con
Pleurotus ostreatus tiene la tasa más alta en la degradación de la lignina. La producción de biogás a partir
de la paja pretratada con hongos fue doble en comparación con la paja no tratada.
Fuente de nitrógeno y concentración
La concentración de nitrógeno en el medio de cultivo, tanto en estado sólido como en la fermentación
sumergida, desempeña un papel importante en la producción y actividad de las enzimas ligninolíticas. Sin
embargo, los efectos del nitrógeno varían entre especies y cepas de hongo. Las actividades de la enzima
ligninolítica (Lac, MnP y peroxidasa) de Pleurotus ostreatus disminuyen cuando el medio se complementa
con una fuente de nitrógeno inorgánico. Por otro lado, la suplementación de nitrógeno orgánico (peptona y
caseína) en concentraciones bajas mostró efectos positivos en las actividades de Lac, MnP y LiP utilizando
P. ostreatus (Mikiashivili et al. 2006). Diferentes respuestas de Pleurotus sp. causada por la suplementación
de diferentes tipos de fuentes de nitrógeno también se informó (Stajic et al. 2006a). P. eryngii y P. ostreatus
produjeron Lac con la mayor actividad cuando se usa (NH4) 2SO4 como fuente de nitrógeno. La producción
de peroxidasas utilizando P. ostreatus se logró cuando la fuente de nitrógeno en el medio era la peptona.
Adición de Mn2+ y Cu2+
La expresión y producción de MnP están reguladas por la presencia de Mn2+ en el medio. Mn2+ controla la
transcripción del gen mnp que depende tanto del crecimiento como de la concentración (Brown et al. 1991;
Gettemy et al. 1998); y afecta la producción de enzimas LiP y MnP (Bonnarme y Jeffries 1990). En ausencia
de Mn2+, predominaron las isoenzimas LiP extracelulares, mientras que en su presencia, las isoenzimas
MnP fueron dominantes. Otros resultados sugieren (Kerem y Hadar 1995) que la mineralización de la
lignina sintética se ve incrementada por la adición de Mn2+ por Pleurotus ostreatus.
Se informó que la adición de Cu2+ mejora la producción de enzimas ligninolíticas y fue el inductor más
eficiente para Lac (Palmieri et al. 2000). La adición de 1 mM de Cu2+ incrementó la producción de Lac en
ocho veces utilizando P. ostreatus cultivado en medio líquido limitado en nitrógeno (Baldrian y Gabriel
2002). La adición de Cu2+ más de 0,3 mM inhibió el crecimiento de hongos y disminuyó la actividad de
Lac con P. ostreatus (Patel et al. 2009b), la adición simultánea de Cu2+ y lignina podría aumentar
significativamente la actividad de Lac de 8 U/mL (solo Cu2+ agregado) a 12 U/mL (Cu2+ y lignina agregada)
Aireación
La aireación es uno de los parámetros más importantes que afectan la producción y la actividad de las
enzimas ligninolíticas. Las funciones de la aireación son por ejemplo, oxigenación, eliminación de CO2,
disipación de calor, distribución de vapor de agua para regular la humedad y distribución de compuestos
volátiles producidos durante el metabolismo. La porosidad del medio afecta la tasa de aireación y, por lo
tanto, la pO2 y la pCO2 deben optimizarse para cada tipo de medio, microorganismo y proceso (Graminha
et al. 2008). La degradación de la lignina es un proceso oxidativo, y reemplazar el aire con una atmósfera
de O2 estimula la degradación de la lignina por parte de muchos hongos de pudrición blanca que crecen en
la paja y la madera (Zadražil et al. 1991). El enriquecimiento de oxígeno de la atmósfera también estimula
la degradación del componente no lignina, así como la degradación de la lignina (Reid 1989).
Contenido de humedad
El contenido de humedad de la fermentación en estado sólido es un factor crítico para el crecimiento y las
actividades de los hongos, y afecta significativamente la degradación de la lignina (Shi et al. 2008). El
contenido de humedad se define durante la preparación inicial del sustrato antes de la inoculación. El rango
de contenido de humedad del sustrato para la SSF suele estar entre el 60 y el 80% (Karunanandaa y Varga
1996). Diferentes informes (Xu et al. 2001) enfatizan que una relación sólida/líquido más baja es más
beneficiosa para la producción de MnP y LiP. La SSF de paja es óptima en un medio con un contenido de
agua de 75 ml/25 g de sustrato (Zadražil y Brunnert 1981). Sin embargo, la mayoría de los hongos
analizados podrían digerir la paja en un amplio rango de contenido de agua. A mayores contenidos de agua
(125-150 ml / 25 g de sustrato), se observó un aumento de la producción de micelio aéreo.
Acidez (pH)
El pH es uno de los parámetros importantes en el cultivo de hongos que es difícil de controlar en la
fermentación en estado sólido (Hölker et al. 2004). La mayoría de los hongos de la podredumbre blanca
crecen bien con pH de sustrato ligeramente ácidos entre 4 y 5 (Reid 1989). Muchos hongos reducen la
acidez del sustrato durante su crecimiento (Zadražil y Brunnert 1981; Agosin et al. 1985). La actividad y la
producción de enzimas ligninolíticas se ven afectadas por el pH inicial de la SSF. El pH óptimo para la
producción máxima de Lac utilizando P. ostreatus se observó a pH 5.0. Sin embargo, la producción de Lac
disminuyó cuando el pH inicial aumentó a más de 5.0. Un cambio en el pH alterará la estructura
tridimensional del árbol y puede reducir su actividad (Patel et al. 2009b).
Temperatura
El efecto de la temperatura en la velocidad y la selectividad de la deslignificación varía de un género a otro.
La mayoría de los hongos de la pudrición blanca son mesófilos, con una temperatura óptima entre 15 ° y
35 ° C (Reid 1989). Se han reportado varias temperaturas óptimas para la SSF en la producción de enzimas
ligninolíticas usando hongos de podredumbre blanca. La degradación de lignina de G. applanatum,
Pleurotus ostreatus y Pleurotus serotinus, incluso en una escala absoluta, fue menor a 30 oC que a 22 oC
(Zadražil y Brunnert 1981). La diferente temperatura óptima en SSF para el tratamiento biológico de
biomasa lignocelulósica está relacionada con la fisiología fúngica, la cepa fúngica y el tipo de sustrato. La
temperatura óptima para la actividad de Lac utilizando P. ostreatus fue de 28 oC (Patel et al. 2009b). El
metabolismo de los hongos de la podredumbre blanca durante la deslignificación genera calor y puede
elevar el material de fermentación a temperaturas que inhiben el crecimiento de los hongos.
Aplicación de pretratamiento biológico que utiliza hongos de rango blanco en fermentación en estado
sólido.
La combinación de la tecnología de fermentación en estado sólido (SSF) con la capacidad de los hongos
para degradar selectivamente la lignina ha hecho posible la aplicación a escala industrial de biotecnologías
basadas en lignocelulosa. Uno de los aspectos más importantes de los hongos de la podredumbre blanca
está relacionado con el uso de su sistema ligninolítico para una variedad de aplicaciones. Una revisión, que
cubre las ventajas y los inconvenientes de SSF (Hölker et al. 2004), muestra a SSF como una tecnología
robusta que supera a las tecnologías de fermentación convencionales con respecto a la simplicidad, la
rentabilidad y los requisitos de mantenimiento. Estas ventajas hacen que SSF sea una tecnología atractiva
para los problemas ambientales, donde el dinero y las personas altamente educadas son limitadas
(Bhatnagar et al. 2008; Rivela et al. 2000).
 Tabla 1. Aplicación del tratamiento previo biológico de biomasa lignocelulósica con Pleurotus ostreatus
en la fermentación en estado sólido.
Propósito Sutrato Referencia

Hidrólisis enzimática Paja de arroz (Taniguchi et al. 2005)

Biofuel (Bioetanol, Biogás and

Rastrojo de maíz (Yang et al. 2010)
Pirolisis)

Casco de semilla de algodón (Li et al. 2001)

(Ortega Cerrilla et al.

Paja de cebada
Alimento para rumiantes 1986)

Cáscara de arroz (Beg et al. 1986)

Paja de trigo (Agosin and Odier 1985)

Juncao (Liu et al. 2009)

Producción de enzimas
Paja de trigo (Bhattacharya et al.)

Hidrólisis enzimática de lignocelulosa

Los polisacáridos en la biomasa lignocelulósica, incluidas las de celulosa y hemicelulas, se pueden
hidrolizar a azúcares monoméricos como la glucosa y la xilosa, que también pueden usarse para la
producción de etanol, xilitol, ácido orgánico y otros productos químicos. Los polímeros de celulosa en la
pared celular están directamente asociados con los restos de lignina y hemicelulosa, dando como resultado
estructuras físicas y morfológicas aún más complejas, de modo que se obstruye la hidrólisis enzimática.
Los factores limitantes que afectan la hidrólisis enzimática de la biomasa se han dividido tradicionalmente
en dos grupos: (a) características estructurales de la biomasa y (b) mecanismos enzimáticos.
Convencionalmente, las características estructurales se han dividido en dos grupos y se han clasificado
como físicas o químicas. Las características químicas estructurales son las composiciones de los grupos
celulosa, hemicelulosa, lignina y acetilo unidos a la hemicelulosa. Las características estructurales físicas
consisten en un área de superficie accesible, cristalinidad, la distribución física de la lignina en la matriz de
la biomasa, el grado de polimerización, el volumen de poros y el tamaño de las partículas de la biomasa.
Con el fin de mejorar la velocidad de hidrólisis enzimática y aumentar el rendimiento de azúcar fermentable,
el proceso de tratamiento previo es absolutamente esencial. Se requiere un tratamiento previo para alterar
la composición química y estructural de la biomasa lignocelulósica para facilitar la hidrólisis rápida y
eficiente de los carbohidratos en azúcares fermentables (Chang y Holtzapple 2000). El enfoque principal
de la mayoría de los estudios que tratan la conversión de biomasa lignocelulósica ha sido maximizar la
disponibilidad de celulosa a celulasa. El tratamiento previo de la lignocelulosa con hongos de la pudrición
blanca para la hidrólisis enzimática se ha estudiado durante mucho tiempo (Hatakka 1983). Se han utilizado
diferentes especies de hongos de la podredumbre blanca con varias biomasas lignocelulósicas para la
hidrólisis enzimática. El pretratamiento biológico de las lignocelulosas podría aumentar la accesibilidad de
la enzima a la biomasa y aumentar el rendimiento de azúcar.
El el pretratamiento biológico de paja de arroz con P. ostreatus mejoró la hidrólisis enzimática de tres a
cinco veces en comparación con la paja de arroz no tratada y redujo el requerimiento de energía para su
molienda (Taniguchi et al. 2005). Se notificaron mejoras similares con el tratamiento previo biológico en
la paja de arroz usando cuatro hongos de pudrición blanca P. chrysosporium, T. versicolor, y C.
subvermispora.
Biocombustible: Bioetanol, Biogás y Pirolisis
El bioetanol se puede producir a partir de biomasa lignocelulósica después del hidrólisis de los componentes
polisacáridos (hemicelulosas y celulosa) en monosacáridos. El aumento del rendimiento de azúcar por
hidrólisis enzimática después del tratamiento biológico indica un alto rendimiento de bioetanol. Lo mismo
ocurre para la producción de biogás. La producción de biogás a partir de paja de trigo pretratada
biológicamente aumentó de 0.293 L/g (sin tratar) a 0.343 L/g (pretratada) usando Pleurotus ostreatus
(Muller y Trosch 1986). Sin embargo, el pretratamiento biológico de la paja de maíz con El tratamiento
biológico previo puede disminuir la energía de activación y la temperatura de reacción de la pirólisis de
hemicelulosa y celulosa (hasta 36 oC), acortar el rango de temperatura de la pirólisis activa (hasta 14 oC) y
aumentar la velocidad de descomposición térmica.
Alimentación de rumiantes
El uso directo de residuos lignocelulósicos como alimento para rumiantes, o como un componente de
dichos alimentos, representa una de las aplicaciones más antiguas y más extendidas de la biomasa. La idea
de utilizar hongos de la pudrición blanca para mejorar la digestibilidad de los desechos lignocelulósicos
para rumiantes fue desarrollada por primera vez en 1902 por Falck (Cohen 2002), quien sugirió el uso de
hongos para el mejoramiento de los desechos lignocelulósicos. Desde entonces, se ha realizado una cantidad
considerable de trabajo en la mejora de la materia lignocelulósica para alimentar utilizando hongos de la
podredumbre blanca. El concepto de deslignificación preferencial de residuos de lignocelulosa con hongos
de pudrición blanca se ha aplicado para aumentar el valor nutricional de los forrajes (Agosin y Odier 1985;
Zadražil y Puniya 1995; Okano et al. 2009). El tratamiento con microorganismos de la lignocelulosa podría
mejorar el valor nutricional (Okano et al. 2009) y la digestibilidad in vitro (Zadražil y Puniya 1995),
aumentar la biodisponibilidad de los nutrientes y disminuir los factores antinutricionales (Mandebvu et al.
1999).
Producción de enzimas
La capacidad de las enzimas ligninolíticas para oxidar tanto los compuestos relacionados con lignina
fenólicos como los no fenólicos, así como los contaminantes ambientales altamente recalcitrantes, hace que
estas enzimas sean muy útiles para su aplicación a varios procesos biotecnológicos (Mayer y Staples 2002;
Minussi et al. 2002; Regalado et al. 2004; Couto y Herrera 2006). La producción y aplicación de Lac se ha
investigado más intensamente que otras enzimas ligninolíticas durante las últimas décadas, y dicha
literatura se ha revisado (Call y Mücke 1997; Leonowicz et al. 2001). Lac se puede implementar en la
industria alimentaria, la industria de la pulpa y el papel y la industria textil (Couto y Herrera 2006; Call y
Mücke 1997; Riva 2006; Cañas y Camarero 2010). La SSF para la producción de enzimas tiene más
ventajas que la SF, ya que varios estudios han demostrado un alto rendimiento del producto y un
procesamiento posterior simplificado en comparación con la SF (Hölker y Lenz 2005; Couto y Sanroman
2006). Los desechos lignocelulósicos se usan generalmente como sustrato para la producción de enzimas.
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