Centro de Formación Técnica Santo Tomás

Técnico en Análisis Químico 2016

Laboratorio de Bioquímica

Determinación Espectrofotométrica de las Proteínas

Método Biuret
Marcia Cerda Iribarren

Cerdamarcia.x3@gmail.com
Resumen
En este laboratorio trabajamos con el reactivo de Biuret para cuantificar la concentración de la proteína
BSA utilizando un espectrofotómetro.
Palabras claves: Espectrofotómetro, Absorbancia, sensibilidad.

Introducción Procedimiento

Determinar la concentración de 1.Preparar una gradilla con los tubos

proteínas en una muestra biológica es de ensayo.
una técnica de rutina básica cuando se 2.Agregarel volumen indicado de la
aborda un esquema de purificación de solución de BSA 4.8 % o la muestra
una proteína concreta, cuando se problema con una pipeta graduada.
quiere conocer la actividad específica 3.Agregar el volumen indicado de
de una preparación enzimática, para agua con una pipeta graduada.
el diagnóstico de enfermedades, así 4.Agregar 4.0 ml de reactivo de Biuret
como para otros muchos propósitos. con una pipeta graduada de 5 ml
Existen diferentes métodos para la 5.Agitar y esperar 20 minutos a
cuantificación de proteínas. Muchos temperatura ambiente para la
de estos métodos se basan en: a) la formación del complejo coloreado.
propiedad intrínseca de las proteínas 6. Mida la absorbancia de los tuvos en
para absorber luz en el UV, b) para la un espectrofotómetro a 540 mm,
formación de derivados químicos, o c) previa calibración del equipo blanco.
la capacidad que tienen las proteínas
de unir ciertos colorantes.
Resultados y Observaciones
Materiales y Reactivos
Primera tabla
-Espectrofotometro (visible)
-Celdas para espectrofotómetro Tubo BSA H2O R. Absorb. Conc Absorb.
-1 Piseta 4.8 Biuret % real
-Agua destilada %
-Tubos de ensayos 1B 0.0 1.0 4.0 0.012 0 -
2S 1.0 0.0 4.0 0.063 0.96 0.051
-Gradilla
3S 0.8 0.2 4.0 0.054 0.768 0.042
-Pipeta graduada de 5 ml 4S 0.6 0.4 4.0 0.038 0.576 0.026
-Pipeta graduada de 1 ml 5S 0.4 0.6 4.0 0.038 0.384 0.026
-Vasos precipitados 6S 0.2 0.8 4.0 0.027 0.192 0.015
-Reactivo de Biuret
-Solución de BSA 4.8 %
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Segunda Tabla

Tubo BSA H2O R. Absorb. Conc Absorb. Concentración v/s Absorbancia

muestra Biuret % real 0.06
0.05
7 Mp 1.0 0.0 4.0 0.038 0.458 0.026
0.04
8Mp 1.0 0.0 4.0 0.036 0.4148 0.024
0.03
0.02
Para calcular la concentración 0.01
utilizamos la ecuación: 0
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2
C1 x V1 = C2 x V2

C2= C1 x V1 Conclusión
V2
Y para la obtención de la ecuación de En este laboratorio trabajamos con el
la recta y el coeficiente de regresión reactivo de Biuret que gracias a este
utilizamos nuestra calculadora reactivo que da a color purpura
directamente, utilizando los datos de podemos con espectroscopia.
la primera tabla. Dando como Trabajamos con una proteína que fue
resultados: BSA 4.8% la cual fuimos adicionando
diferentes concentraciones a los tubos
r= 0.9706 de ensayo con la misma cantidad del
m=0.0458 reactivo Biuret en donde se pudo
b=5x10-3 apreciar en las tablas que a mayor
concentración de proteína mayor
Con esos datos podemos calcular la absorbancia.
concentración de las muestras Antes de comenzar a trabajar con el
problema. Despejando la ecuación espectrofotómetro hay que colocar un
blanco el cual nos ayudara a que el
y= mx+b equipo se pueda calibrar, ya que si
llegamos y utilizamos , nuestra
x= y - b absorbancia puede dar otro valor la
m cual nos perjudicara en el momento de
Donde y es la absorbancia real realizar nuestra curva.
Absorbancia
Concentración real Anexo
0 0
1.Mencione las causas del deterioro
0,192 0,015
de las cubetas
0,384 0,026
0,4148 0,024 Las causas del deterioro de las
0,4585 0,026 cubetas se deben al mal uso de las
0,576 0,026 personas que las emplean. Ya que las
0,768 0,042 personas al utilizarlas las dejan al aire
0,96 0,051
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4.¿Cuáles son las partes de un

libre, no las lavan correctamente ni las espectrofotómetro?
secan, y todos esto pueden producir

manchas en las cubetas dejándolas

defectuosas a su uso.

2.¿Cómo se deben Limpiar las

cubetas?

Si se conoce la naturaleza del

contaminante, se debe utilizar un
disolvente que haya utilizado.

Lavar con agua destilada. Colocarlas

en un baño termostático. Luego secar
Referencias
con mucho cuidado y no dejarlas al
aire.
-Material celdas. Extraído de :
https://www.google.cl/url?sa=t&rct=j&
3.Mencione el material de Fabricación
q=&esrc=s&source=web&cd=2&cad=r
de las celdas de Espectroscopia UV-
ja&uact=8&ved=0ahUKEwie67qFi5z
VIS
MAhVIf5AKHR-
aDZUQFgghMAE&url=http%3A%2F%
-plástico o vidrio (para la región
2Fwww.uclm.es%2Fprofesorado%2F
Visible)
pablofernandez%2FFAI%2FT03.pptx
-sílice fundido (cuarzo) (para la región
&usg=AFQjCNFwjOw6HrVnPcGLOfO
Visible y UV por debajo de 350 nm
Syb2il1t8-
eIR hasta 3000 nm )
w&sig2=LZ_tSI3WC15OK9Qn54sOIA
-vidrio de silicato para medidas
entre375 y 2000 nm (V e IR)
-Cubetas de espectrofotómetro.
-NaCl para la región del IR
Extraído de :
http://labotienda.com/documentos/info
/ingles/33xxxxx.pdf

-Métodos para la cuantificación de

proteínas. Extraído de :
http://www.uco.es/dptos/bioquimica-
biol-
mol/pdfs/27%20M%C3%89TODOS%
20PARA%20LA%20CUANTIFICACI
%C3%93N%20DE%20PROTE%C3%
8DNAS.pdf