Você está na página 1de 137

CNEN/SP

ipen tmOtuto d*
Enargéth— •
PnquI—m
Nuol—n»

AUTARQUIA ASSOCIADA A UNIVERSIDADE


DE SAO PAULO

ESTUDO DA BIODETERIORAÇÃO DO CONCRETO


POR Thiobacillus

MÁRCIA AIKO SHIRAKAWA

Dissertação apresentada como parte


dos requisitos para obtenção do Grau
de Mestre em Ciências na Área de
Reatores Nucleares de Potência e
Tecnologia do Combustível Nuclear.

Orientador:
Profa. Dra. Bárbara Maria Rzyskí

São Paulo
1994
ir^STITUTO DE PESQUISAS Ef^ERGÉTICAS E NUCLEARES
Autarquia associada à Universidade de São Paulo

ESTUDO DA BIODETERIORAÇÃO DO COMCRETO POR


THIOBACILLUS

MÁRCIA AIKO SHIRAKAWA

Dissertação apresentada como parte dos


requisitos para obtenção do grau de
Mestre em Ciências
na Área de R e a t o r e s Nucleares d e P o t ê n c i a
e Tecnologia do Combustível Nuclear

O r i e n t a d o r : Proff^. Dr^. B á r b a r a Maria R z y s k i

SÀO PAULO
1994
4
4
Agradecimentos

Este trabalho contou com a colaboração de várias instituições e profissionais de áreas diferentes da
ciência. A parte experimental foi realizada em três laboratórios:

• Laboraíório.de Microbiologia da Supervisão de Rejeitos e


Descontaminação do ÍPEN-CNEN/SP
9 Laboratório de Microbiologia da Divisão de Análises
Microbiológicas da C E T E S B
» Laboratório de Química dos Materiais do Agrupamento de
M a t e r i a i s d e C o n s t r u ç ã o civil, Divisão d e E n g e n h a r i a civil d o BPT

Agradeço ao CNPq pela bolsa concedida e ao IPEN pela possibilidade de realizar este trabalho.

Várias pessoas contribuiram de forma significativa para a realização deste trabalho, a todas elas o
meu sincero agradecimento;

A Dra. Bárbara Maria Rzyski (IPEN) pela orientação e oportunidade de realizar um trabalho desta
natureza.

A Dra. Maria .Alba Cincotto (PO LI/U SP) pelo apoio científico e moral nos momentos dificeis, pelo
incentivo e constante colaboração.

A Maria Inês Z.Saío (CETESB) pela disponibilidade nas discussões sobre algumas questões
microbiológicas.

A Dra. Petra Sanchez Sanchez (CETESB) por ter possibilitado a realização de boa parte do trabalho
experimental no laboratótio de microbiologia.

Ao Roberto Vicente (IPEN) pelas conversas, sempre produtivas, em momentos decisivos

Ao Eng^. Vandertey M. John (IPT) pela paciência, em diversas situações, com a qual me ensinou a
usar o programa Windows

Ao Dr. José Roberto Rogero (IPEN) pelo apoio em várias fases

Ao Dr. Osvaldo Garcia Jr. (UNESP/ARARAQUARA) pelos primeiros passos para a familiarização
I com Thiobacillus.

Ao Dr. George Lucki (IPEN) pela tradução de artigo em língua russa, sem a qual haveria uma
lacuna no levantamento bibliográfico.

CAO t:Ac;cN;i CE ENERGIA N Ü C I E ^ R / S P -


COMIS
Ao Dr. Sérgio Massaru (I.Q./USP) pelas discussões químicas dos compostos contendo enxofre.

Ao Dr. Daniel Atendo (I. G./USP) pela Difração de raios-X e primeiros passos em geologia.

Às bibliotecárias Elaine C. Pereira, Ney Marly Moura e Maria Teresa Zanútowski (JPEN) pelo apoio

bibliográfico.

A Luiziana F. Silva (Agrup.de Biotecnologia-ÍPT) por algumas observações criticas na etapa final.

Ao Eng. Luiz C. Urenha (Agrup.Biotecnologia-IPT) pelo incentivo inicial

Aos Eng^^ Vera Lúcia A. Sardinha e Estevam Morinigo Jr. (SABESP) que colaboram na viabilização

de algumas amostragens.

Aos colegas da Supennsão de Rejeitos e Desconíaminação do IPEN, especialmente à Vera Lúcia K.

Isiki.

Aos colegas do Lab. de Química dos Materiais do Agrup. de Materiais de Construção civil do IPT,
especialmente à Maria Cecília Florindo e Valdecir A. Quarcioni

Aos colegas do Laboratório de Microbiología da CETESB, especialmente ao Octavio Luiz Ferreira


pela elaboração de alguns meios de cultura.

Aos meus amigos Celina, Eni, Márcia, Irai, Neide, Marcos, Ananda, Tufik, Misefa, Gi, Eder, Bete,
Sían e Chico pelo apoio sempre que foi necessário.

A Dra Heloísa Barbosa (ICB/USP), que por sua sensibilidade e didática no curso de Microbiología
básica para a graduação, despertou-me uma verdadeira paixão pelo universo dos microrganismos
Ao Acauã por ser um grande companheiro de estrada

Ao meu Jllhão Ibyatã por me ensinar muitas coisas boas

À minha mãe por seu espírito de pesquisa nos fatos do cotidiano


ESTUDO DA BIODETERIORAÇÃO DO CONCRETO POR THIOBACILLUS

MÁRCIA AIKO SHIRAKAWA

Resumo

A construção de u m repositório final, n o plano superficial d o solo, p a r a rejeitos


radioativos de nível baixo e médio de radiação, é imia necessidade q u e se encontra e m
evolução n o Brasil. Sendo o critério de durabilidade do concreto p a r a esta finalidade, de
cerca de 500 anos, é importante avaliar t o d o s o s possíveis mecanismos de deterioração. Este
trabalho teve p o r objetivo investigar a biodeterioração do concreto p o r microrganismos.

O s estudos microbiológicos fiiram dirigidos para isolar e purificar Thiobacillus a


partir de amostras ambientais de concreto e areia. Este gênero mclui bactérias
quimiolitotróficas, reconhecidas na üteratiu-a, c o m o extremamente agressivas ao concreto,
pela produção de ácido sulfiirico resuhante de seu metaboUsmo.

A anáUse microbiológica quantitativa ío\ realizada sobre um concreto com


deterioração evidente; n o qual determinou-se o número mais provável de Thiobacillus.
Efetuaram-se também as c o n t a g e n s de bactérias heterotróficas e fimgos. A análise
qualitatKa para Thiobacillus foi realizada sobre amostras ambientais de areia para
construção civil, lodo, e eflorescencia de concreto.

A p ó s o isolamento de cinco cepas neutrofilicas e cmco cepas acidofihcas, foram


efetuados testes preliminares para a identificação de Thiobacillus. F o r a m identificadas duas
cepas de Tfiiobacillus thiooxidans, uma cepa de Thiobacillus ferrooxidans e uma cepa de
Thiobacillus íhioparus.

Desenvolveu-se u m teste qualitativo para observar a capacidade de crescimento de


algumas cepas, sobre meios sólidos elaborados com suspensões de materiais de c o n i i r u ç ã o
como nutrientes. Os resultados obtidos indicaram a necessidade de se prosseguir estudos
fiituros sobre este tema. P r o p õ e - s e um plano de trabalho que inclui o e m p r e g o de análise
microbiológica como um d o s critérios para a seleção de locais para instalação de
repositórios e para a seleção de materiais de construção.

-'l '..1. t fiR/S~ -


STUDY OF CONCRETE BIODETERIORATION BY THIOBACILLUS
I

MARCIA AIKO SHIRAKAWA

Abstract

The construction of final shallow ground repositories for l o w and intermediate level
radioactrs'e w a s t e s is an increasing need in Brazil. Ehie to the requeriment of a ser\ice life of
the concrete of about 500 years, it is important t o evaluate any possible deterioration
mechanism This w o r k intended t o mvestigate the effect of concrete biodeterioration by
microorganisms.

The microbiological research w a s directed in order to isolate and purify Thiobacillus


from enviromnent concrete and sand samples .Tliis genus comprises well k n o w n species o f
bacteria regarded as extremely deleterious to concrete, due to the production of sulfuric acid
that results from its m e t a b o h s m

T h e quantitative microbiological analysis w a s carried out for a concrete with evident


deterioration by using the most probable number test for Thiobacillus. The counting of
heterotrophic bacteria and fungi were also performed. Qualitatrs'e analysis of Thiobacillus
was carried out in e m i r o n m e n t a l s a n e i e s of sand, shme and concrete efflorescence.

After the isolation of five neutrophilic strains and five acidophilic strains, preliminar>'
identification test for Thiobacillus w a s performed. Through this w o r k it w a s identified t w o
strains of Thiobacillus thiooxidatis, one strain oi Thiobacillus ferrooxidans and one strain of
Thiobacillus thioparus.

Qualitative tests w e r e performed in order to evaluate the ability of the strains to


grow on solid media made out of suspensions of construction materials as nutrients. The
results of this w o r k point out that fiirther research works should be done. An outline of
steps of w o r k is proposed, including the use of microbiological analysis as one of the criteria
for the selection of repository sites and for the selection of the construction materials.

u
GLOSSÁRIO:

P o r se tratar de estudo multidisciplinar julgou-se necessária a apresentação inicial de


u m glossário c o n t e n d o t e r m o s técnicos de áreas pertinentes envolvidas neste trabalho.

» A c e p t e n d e e l é t r o n s : substância que age recebendo elétrons n u m a reação de oxi-


redução.

• A e r o b i o : organismo que utiliza oxigênio para se desenvolver.

• A n a e r ó b i o : organismo que se desenvolve na ausência de oxigênio.

o Á r e a p o t e n c i a l : área contida na área preliminar identificada c o m o potencialmente


satisfatória para abrigar u m repositório para rejeitos radioativos, através da apücação
de critérios técnicos restritivos e estudos técnicos específicos.

• Á r e a p r e l i m i n a r : área identificada dentro da região de interesse, a ser investigada


para identificação de áreas potenciais.

• A T P : (adenosina trifosfato) ribonucleosídeo 5'trifosfato fimcionando c o m o u m grupo


doador de fosfato n o ciclo de energia da célula.

• Bacilo : bactéria em forma de bastão

• B a c t é r i a s a u t o t r ó f i c a s : são aquelas que utilizam dióxido de c a r b o n o como única


fonte de carbono, não necessitando de compostos orgânicos pré-elaborados do meio
para o seu crescimento.

• B a c t é r i a G r a m - n e g a t i v a : bactéria que p o d e ser classificada p o r técnica de coloração


diferencial denominada Método de Gram (ver M é t o d o de Gram). A s bactérias Gram-
negativas p o s s u e m maior concentração de Upideos e menor concentração de
peptoglicano na parede celular do que as bactérias Grara-positrvas. Essas
caracteristicas são consideradas como as causas mais importantes que favorecem a
diferenciação desses tipos de bactérias.

• B a c t é r i a s h e t e r o t r ó f i c a s : são as que requerem um ou mais c o m p o s t o s orgânicos, que


não o dióxido de carbono, para a síntese de seu protoplasto.

• Bactérias quimiolitotróficas: são aquelas capazes de obter energia a partir da


oxidação de c o m p o s t o s inorgânicos.

ni
Biofilme: crescimento microbiano que forma uma película sobre materiais inorgânicos.
Este filme é formado pela excreção de produtos extracelulares como
heteropolissacarideos ou proteínas.

C a d e i a r e s p i r a t ó r i a : uma seqüência de substâncias transportadoras de elétrons que


transfere os elétrons dos substratos até o oxigênio molecular nas células aerobias. Em
anaerobiose o s íons nitrato ou sulfato p o d e m ser o s aceptores finais.

C e p a : linhagem de uma espécie de microrganismo.

Ciclo d e C a l v i n : é um processo de fixação de dióxido de carbono. A reação básica é


catahsada p o r uma enzima (carboxidismutase), na qual a ribulose difosfato atua como
aceptor de CO2 na formação de dois moles de ácido fosfoghcérico. As demais etapas
do ciclo são responsáveis pela formação da glicose e regeneração da ribulose difosfato.

C i m e n t o P o r t l a n d c o m p o s t o : aglomerante hidráulico obtido pela m o a g e m de clinquer


Portland ao qual se adiciona, durante a operação, a quantidade necessária de sulfato de
cálcio. D u r a n t e a moagem é permitido adicionar a esta mistura materiais pozolànicos,
escórias granuladas de alto-fomo e/ou materiais carbonáticos, n o s teores especificados
por norma (-6)

C i m e n t o P o r t l a n d c o m u m : aglomerante hidráulico obtido pela m o a g e m de cHnquer


Portland ao qual se adiciona, durante a operação, a quantidade necessária de uma ou
mais formas de sulfato de cálcio. Durante a m o a g e m é permitido adicionar a esta
mistura materiais pozolaiiicos, escórias granuladas de alto-fomo e/ou materiais
carbonáticos, com teores especificados por norma(^).

Cimento Portland de alto-forno: aglomerante hidráulico obtido pela mistura


homogênea de chnquer Portland e escória granulada de alto-foiTio, moídos em
conjunto ou em separado(^).

C l i n q u e r P o r t l a n d : produto constituído principalmente por silicatos de cálcio com


propriedades hidráulicas (capacidade hidratação adquirindo resistêucia mecânica).

D u r a b i l i d a d e : capacidade que um produto, componente, montagem ou construção,


possui de manter seu desempenho acima dos níveis mínimos especificados, de maneira
a atender às exigências dos usuários, em cada situação específica.

Eflorescencia: íons li.wiados, caiTeados para a superfície, que precipitam por


evaporação da água, podendo reagir com os gases da atmosfera.

IV

comt : Â 0 ^JXxíVi lí LNEPGIA NUCLEAR/SP •


Escória g r a n u l a d a d e alío-forno : subproduto do t r a t a m e n t o de minério de ferro em
alto-fomo, o b t i d o sob forma granulada por resfriamento brusco, constituído em sua
maior parte de silicatos e aluminossiücatos de cálcio(^).

M é t o d o d e G r a m : processo diferencial de coloração n o qual o esfregaço bacteriano


fixado é t r a t a d o pelas seguintes soluções, na ordem se sua apresentação : cristal violeta
(ou violeta de Genciana), solução iodo-iodetada, álcool ou álcool cetona (agente
descorante) e safranina ou outro contra-corante a d e q u a d o (fiicsina diluída). As bactéria
coradas p e l o m é t o d o de Gram pertencem a dois g r u p o s : bactérias Gram-positivas que
retêm o c o m p l e x o cristal violeta-iodo e apresentam coloração violeta escuro e as
bactérias Gram-negatrvas, que perdem o complexo cristal violeta-iodo e são coradas
pela safranina ( o u fucsina diluída), apresentando p o i s coloração vermelha.

M i c r o b i o t a : p o p u l a ç ã o de microrganismos de u m determinado nicho

Pite: c o r r o s ã o localizada em diversos pontos de u m a dada superfície.

Rejeito r a d i o a t i v o : qualquer material resultante da a t h i d a d e humana que contenha


radionuchdeos acima dos limites de isenção especificados, pela N o r m a CNEN. N E
6.02 - Licenciamento de instalações radiativas, e cuja reutilização é imprópria ou não
prexista.

Repositório final : depósito destinado a receber, em observância aos critérios


estabelecidos pela Comissão Nacional de Energia Nuclear, os rejeitos radioativos
provenientes d e armazenagens temporárias, depósitos intermediários e depó.sitos
proxásórios.

R e p r o c e s s a m e n t o : tratamento de combusiKel nuclear queimado para recuperação de


materiais físseis e separação de radionuclideos indesejáveis.
ABREVIAÇÕES

BSR bactéria sulfato-redutora

C E P E U S P = Conjunto de Práticas Esportivas da Universidade de São Paulo

C E T E S B = Companhia de Tecnologia de Saneamento Ambiental

col. = colônia

E T A = estação de tratamento de água

I.P.T. = Instituto de Pesquisas Tecnológicas do Estado de São Paulo S.A

mm. = minuto

N M P = n ú m e r o mais provável

p.a. = para anáüse

rpm. rotações por minuto

U.F.C. = unidade formadora de colônia

VI
SUMÁRIO
Pag.

Resumo i
Abstrat ii
Glossário üi
Abreviações vi

l.INTRODUÇÃO 1
1.1 A questão da deposição dos rejeitos radioativos 1
1.2 Objetivos 7

2. LEVANTAMENTO BroLIOGRÁFICO 8
2.1. Biodeterioração 8
2.1.1. Uma questão semântica 8
2.1.2. A biodeterioração de minerais 9'
2.1.2.1. Biodeterioração p o r formação de biofilme e
acúmulo de água 9
2.1.2.2. Biodeterioração p o r tensão de sais 10
2.1.2.3. Biodeterioração p o r complexação 10
2.1.2.4. Biodeterioração p o r ataque ácido 10
2.1.3. O ciclo do enxofre associado ao processo de corrosão
microbiológica e biodeterioração 11
2.1.3.1. Bactérias r e d u t o r a s de sulfato 11
2.1.3.2. Bactérias sulfoxidantes 12
2.1.4. Corrosão microbiológica de metais 16
2.1.4.1. Processo aerobio de corrosão microbiológica 17
2.1.4.2. Processo anaeróbio de corrosão microbiológica 18

2.1.5. A ecologia da corrosão microbiológica 20


2.1.5.1. O papel da microbiota de superfície 20
2.1.5.2. Interação exopolímero-metal 20
2.1.5.3. O papel da associação de inicrorganismos 21

2.2. Biodeterioração do concreto 22


2.2.1. B i o d e t e r i o r a ç ã o da matriz de cimento hidratado 22
2.2.1.1. A carbonatação da matriz de cimento hidratado: 22
2.2.1.2. A ç ã o ácida na matriz de cunento hidratado 23
2.2.1.3. Histórico sobre a biodeterioração d o c o n c r e t o 23
2.2.1.4. Biodeterioração acelerada do concreto em
condições laboratoriais controladas 26
2.2.1.5. Atividade vital dos microrganismos n o interior d o
concreto 26
2.2.1.6. Biodeterioração do concreto p o r diferentes
espécies de Thiobacillus 28

2.2.1.7. M e c a n i s m o de biodeterioração do concreto p o r


microrganismos de vários gêneros e espécies 29
2.2.1.8. Presença de microrganismos em concretos
brasileiros 30
2.2.1.9. E s t u d o de biocidas no combate biodeterioração.... 31
2.2.2. C o r r o s ã o microbiológica em armaduras para concreto
armado 31
2.2.3. Biodeterioração do concreto por microrganismos em
repositórios finais para rejeitos radioativos 32

3. M A T E R I A I S E M É T O D O S 34
3.1. Materiais 34
3.1.1. Equipamentos 34
3.1.2. Materiais 34
3.1.3. Reagentes 35
3.1.4. Soluções 36
3.1.5. M e i o s de cuhura 36
3.2. Metodologia 38
3.2.1. Descrição geral dos experimentos efetuados 38
3.2.2. A m o s t r a s estudadas 38
3.2.2.1. Concreto deteriorado : estudo-de-caso 40
3.2.2.2. Amostras coletadas do ambiente construído 45
3.2.2.3. Amostras de areias para construção civil 46

3.2.3. Coleta e preservação das amostras: 47


3.2.3.1. Coleta das amostras 47
3.2.3.2. Preservação das amostras 47
3.3. Métodos 47
3.3.1. Análise microbiológica realizada em estudo-de-caso 47
3.3.1.1. Técnica d o s tubos múltiplos para determinação
do n ú m e r o mais provável (NMP) de Thiobacillus.... 48
3.3.1.2. Ensaios complementares análise microbiológica
quantitativa 54
3.3.1.3. C o n t a g e m em placas de bactérias heterotróficas 54

3.3.1.4. C o n t a g e m de fimgos 55
3.3.1.5. T e s t e quahtativos para bactérias redutoras de
sulfato 56
3.3.2. Composição química da matriz (concreto/esmdo-de-caso) 56
3.3.2.1. Reconstituição de traço 56
3.3.2.2. Difi-ação de raios X 57
3.3.3. Testes presuntivos quahtativos para Thiobacillus 57
3.3.4. Obtenção de cultura pura e identificação de Thiobacillus 57
3.3.4.1. Seleção p o r passagens sucessKas em meio m i n e r a l . . 58
3.3.4.2. Isolamento das colônias em meio sóhdo seletivo 59

3.3.4.3. Purificação das culturas a partir de colônias


isoladas 59
3.3.4.4. Testes com os isolados em meios de
cultura com variação do p H inicial 61
3.3.4.5. Curva de crescimento 61
3.3.4.6. Testes preliminares para identificação de
Thiobacillus 61
3.3.5. Teste qualitatK'o para crescimento de cepas de isoladas em
meios de cultura de suspensões de materiais de construção .... 65
3.3.5.1. Meio de cultura sóhdo contendo escória
granulada de alto-fomo (COSIPA) 65
3.3.5.2. Análise química da escória granulada de aUo-
fomo 66
3.3.5.3. M e i o de cultura sóhdo contendo matriz do
concreto (estudo-de-caso) 67

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO 69
4.1. Resuhados obtidos em estudo-de-caso 69
4.1.1. Resultados das análises microbiológicas quantitativas 69
4.1.2. Resultados da análise microbiológica em períodos de
coleta diferentes 70
4.1.3. Resultados da análise quimica da matriz do concreto 70
4.1.4. Discussão d o s r e s u l t a d o s 71
4.2. Testes presuntivos qualitativos p a r a r . / / j / c p a r u s 73

4.2.1. Resultados d o s t e s t e s presuntivos em amostras do ambiente


construído 73
4.2.2. Discussão d o s r e s u l t a d o s 74
4.3. Testes presuntivos qualitativos p a r a T.thioparus, T.thiooxidans e
T.ferrooxidam 76
4.3.1. Resultados d o s teste presuntivos em amostras de areia 76

4.3.2. Discussão dos r e s u l t a d o s 78


4.4. Isolamento e identificação preliminar para 77z/oeac///?¿s 79

4.4.1. Resultado do p r o c e s s o de isolamento de cepas puras 79


4.4.2. Resultado do e s t u d o d o comportamento de cepas puras em
meios de cultura c o m variação do p H inicial 83
4.4.2.1. Meio líquido ATCC 238 modificado para pH
inicial = 1 2 83
4.4.2.2. Meio s ó ü d o S6 e S5 84
4.4.2.3. Meio d e P o s t g a t e modificado para T.thioparus 85
4.4.2.4. Meio de P o s t g a t e modificado para T. thiooxidam.... 85
4.4.2.5. A d a p t a ç õ e s d o Meio A T C C 238 em comparação
com o s m e i o s de Postgate modificados para
T. thiooxidam e T. thioparus 86
4.4.2.6. Discussão d o s resultados 87
4.4.3. Resultados da curva de crescimento para observar a
concentração de bactérias n o inoculo para os testes de
identificação 88
4.4.3.1. Discussão d o s resultados 88
4.4.4. Resultado d o s t e s t e s preliminares para identificação de
Thiobacillus 90
4.4.4.1. Discussão d o s resultados 91
4.5. Resultados dos testes qualitatKos de crescimento de cepas isoladas
em meio de cultura e l a b o r a d o s com suspensões de materiais de
construção 96
4.5.1. Discussão d o s resultados 97
5. SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS 98

6. CONSIDERAÇÕES FINAIS 101

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 104

8. A N E X O S 113
ANEXO I (Soluções) 113
A N E X O n ( M e i o s de cultura) 115
l.INTRODUÇÃO

1.1 A questão da deposição final dos rejeitos radioativos


A utilização de radionuclideos, e m diversas áreas da d ê n c i a , biomedicina,
indústria, agriciütura e instalações nucleares, v e m delineando uma curva ascendente da
concentração de rejeitos radioativos, e m fimção d o t e n ç o , depositados e m repositórios que
passam a &zer parte da biosfera. O s benefícios provenientes da energia nuclear t r a z e m
t a m b é m alguns custos para a sociedade, entre eles o d o gerenciamento de rejeitos
radioativos gerados e m cada área de aplicação.
N o BrasiL, o s rejeitos são classificados e m categorias segundo o estado físico,
natureza da radiação, concentração e taxa de exposição, conforme critérios estabelecidos
pela N o r m a Experimental "Gerência d e rejeitos radioativos e m instalações radiativas"
( C N E N - N E 6.05)(^7) D e n t r o destes critérios o s rejeitos são s e p a r a d o s e m níveis de
radiação; desta forma, são classificados e m rejeitos de nível baixo de radiação, nível médio e
nível alto.
O gerenciamento d o s rejeitos radioativos compreende as e t a p a s de coleta,
segregação, pré-tratamento, tratamento, acondicionamento, armazenagem tenq)orária,
transporte e deposição final e m repositórios específicosC^^) O objetivo da deposição e m
repositórios finais é garantir o confinamento segiu-o destes materiais p e l o tenq)o q u e se fizer
necessário de forma que n ã o a p r e s e n t e m efeitos prejudiciais inaceitáveis ao h o m e m e a
outras espécies de seres vivos.
O s rejehos gerados n o Brasil, até o m o m e n t o , são de níveis baixo ou médio de
radiação, c o m emissores alfa abaixo d o s limites estabelecidos pela n o r m a C N E N - N E 6.05.
E m 1986 o Governo Federal decidiu adiar o reprocessamento de combustíveis nucleares.
Por essa razão, n ã o são g e r a d o s rejeitos de nível a k o associados a essa etapa d o ciclo do
combustível(29).
Durante décadas alguns países depositaram seus rejeitos colocando-os em
cavidades rochosas, minas abandonadas o u minas escavadas c o m a finahdade de deposição.
Além destas medidas, vários países a d o t a r a m a prática de deposição n o m a r para certos tipos
de rejeitos de nível babío de radiação(29).
A prática de deposição de rejeitos n o mar manteve-se sob moratória, pela
Convenção para a prevenção de poluição marinha p o r despejo de rejeitos e outras matérias
(Convention for the Prevention of Marine Pollution by Dumping of W a s t e and Other Matter),
até que se provasse que não apresentaria riscos ao h o m e m e ao meio ambiente. D e s d e 1982
os países que d e p o s h a v a m seus rejeitos n o mar suspenderam esta prática, m a n t e n d o uma
moratória volmitária, apesar de mn grupo de estudos da Agência de Energia Nuclear da
Organização para C o o p e r a ç ã o Econômica e Desenvolvimento - N E A / O E C D - (Nuclear
Energ>' Agency of the Organisation for Economic Cooperation and Development) ter
concluído, em 1988, que a deposição no mar era tecnicamente exeqüível^'^X
Atualmente, os repositórios finais de superficie são indicados para confinar
rejeitos de níveis médio e baixo de radiação c o m meia vida curta, enquanto os repositórios
de profimdidade são mais indicados para confinar rejeitos embalados, de nível alto de
radiação e meia vida longa.
N a s décadas de 1940 e 1950, a prática de deposição de rejeitos radioativos de
níveis médio e baixo de radiação, em trincheiras escavadas ao nível do solo, foi amplamente
adotada p o r vários países. Porém, algumas destas trincheiras foram desativadas no
Canadá^^') e n o s E s t a d o s Unidos<^2^), por constatar-se que em alguns destes locais, ocorreu
a hberação d o s radionuchdeos depositados, com migração n o solo e riscos de contaminação
das águas subterrâneas potencialmente utilizáveis pelo h o m e m
Atualmente, o conhecimento acumulado sobre o assunto indica a dispombihdade
de métodos seguros, para a deposição superficial no solo, de rejeitos de nível baixo e médio
de radiação. O isolamento seguro dos rejeitos radioativos depende de t o d o um sistema de
deposição, que consiste de três grandes componentes: o local, o repositório e a embalagem
do rejeito. Este conceito de sistema, imphca que algumas caracteristicas m e n o s favoráveis
de um dos componentes possam ser compensadas por um melhor desempenho de um outro
componente, desde que seja atingido um grau desejável de isolamento do sistema como um
todo(38.39V

O repositório de superfície tem duas fimções importantes:

• hmitar a dispersão de radionuclideos contidos no rejeito de tal forma que


estes não excedam os hmites estabelecidos ao ambiente h u m a n o ; e

o proteger o rejeito de processos de deterioração como a erosão, transgressão


por vegetais de raízes proflxndas, refiígio para animais e intmsão pelo
homem.

A seleção do local adequado para se implantar um repositório, é de importância


central para garantir maior segurança. Quatro fatores são considerados no processo de
seleção para a escolha do local adequado^^^*:
• hidrogeologia;
• ecologia;
• u s o da terra; e
t fatores sócio-econômicos.

P o r t a n t o , a seleção de u m local adequado para u m repositório, d e p e n d e de u m


trabalho de pesquisa a n ç l o , que envolve disciplinas variadas, incluindo as ciências da Terra,
ecologia, meteorologia/climatologia, biologia (microbiologia), geologia, engenharia crvil,
matemática, física e ciências sociais, entre outras.
U m princípio importante para deposição ao níxel do solo é que as características
hidrogeológicas naturais devem confinar os radionuchdeos, de forma que estes n ã o venham
a contaminar as águas subterrâneas potencialmente utilizáveis pelo homem^^^). O u t r o fator
importante é que o local seja estável sob o p o n t o de \ãsta geotectônico^^^l
U m local ideal é aquele cuja constituição geológica retarde a migração dos
radionuchdeos até que estes decaiam a níveis aceitáveis. N o entanto, estes locais são
limitados na Natureza. Assim sendo, toraa-se necessária a utilização de técnicas de
engenharia para aumentar a retenção de radionuchdeos dentro do repositório. O s obstáculos
construídos para esta finahdade são denommados barreiras de engenharia^^^)
A s barreiras de engenharia p o d e m ser efetuadas com opções variadas, objetKando
prevenir a iofiltração de água n o rejeito e a migração de radionuchdeos para o ambiente.
Três possibilidades são consideradas importantes^^^):

• melhorar as condições geoquímicas incluindo, nas áreas de deposição de


rejeitos, materiais com capacidade elevada de retenção de radionuclideos;
neste caso, o material mais utilizado é a argila;
• utilizar materiais estruturais, por exemplo, o concreto, m e t a l plásticos e
outros, para melhor isolamento do rejeito; e
• controle dos aquíferos, por um sistema artificial de drenagem das águas
pluviais.

A maioria dos projetos de repositórios incluem o uso do c o n c r e t o como um


material de construção, sendo recomendado como uma barreira de engenharia eficiente para
reduzir a infihração de água, a erosão e a intrusão por agentes indesejáveis^^^*.
N o Brasil, ainda não há um local definido para a construção de um repositório
para rejeitos radioativos gerados por instalações nucleares e radiativas. U m estudo inicial
envolveu anáhses de regiões de mteresse, localizadas em vários estados (Piauí, Pará, Ceará,
Rio Grande d o N o r t e , Paraíba, Pernambuco, Bahia, Minas Gerais e Rio de Janeiro), mas
após alguns fatores de restrição, estas regiões de interesse foram reduzidas a algumas áreas
candidatas. A s ü h a s oceânicas Martin V a z e Trindade foram consideradas c o m o áreas
candidatas(^29)

U m levantamento feito por S U A R E Z ^ ^ ' ) previu que até o ano 2010 o volume
total de rejeitos acondicionados no Brasil chegaria a 8.000 m^, além dos 3.500 m^
resultantes da área contaminada após a violação de uma fonte de ^^'^Cs, em setembro de
1987 na cidade de Goiânia ( G 0 ) ( ^ ' ) . O s rejeitos resultantes deste acidente deverão ser
depositados separadamente dos demais.

Ao considerar a previsão da quantidade de rejeitos gerados no Brasil, o ní\'el de


radiação, as c o n d i ç õ e s cümáticas e as ahematrvas para isolar estes rejeitos, evidenciou-se
que a prática d e deposição mais conveniente para a nossa reahdade é u m repositório de
superfície c o m sistema de barreiras múltiplas^^^)^ consistindo de :

• embalagens dos rejeitos;


• estrutura de concreto;
« c a m a d a s de argiias,
e areia; e
• sistema de drenagem

A durabilidade do concreto utilizado c o m o barreira de engenharia para um


repositório de superfície é estimada em 500 anos segundo a concepção canadense^^"^* e em
300 anos segundo a concepção francesa"^^^^ e espanliola<^^93) pg^a que o concreto mantenha a
durabilidade p o r algumas centenas de anos, a sua velocidade de deterioração deve ser muito
b a i x a . E n t r e o s mecanismos de deterioração do concreto, as causas p o d e m ser relacionadas a
fatores intrínsecos e extrínsecos ao concreto^'^). Entre os fatores intrinsecos estão;

e r e a ç õ e s álcali-agregados;
» tensões térmicas resultantes d o calor de hidratação do cimento; e
t e n s ã o interna por uma sobrecarga externa.

E n t r e os fatores extrínsecos estão:

• deterioração química por ataque de cloretos, sulfatos, ácidos orgânicos e


inorgânicos e ação do gás carbônico;
• deterioração por congelamento-descongelamento; e
• ação por microrganismos

COMISCAD UCCmi II LívrRGIA NUCLEAR/SP . ra


A durabilidade do concreto p o d e ser influenciada pelo ambiente no qual o
concreto está e x p o s t o e pela qualidade dos materiais utilizados^''*).
Alguns estudos^'^' ,50, 70) indicam a importância da contribuição dos
microrganismos n o p r o c e s s o de deterioração d o concreto e m repositorios para rejeitos de
nivel baixo de radiação e até mesmo de nivel alto de radiação(^'). S u p õ e - s e que a atividade
microbiana p o s s a atuar tanto na biotransformação do rejeito q u a n t o na deterioração do
concreto, e ÊicUitar a migração dos radionuclideos para á g u a s subterrâneas potenciabnente
utilizavies pelo h o m e m O u t r o fator de dispersão d o s r a d i o n u c h d e o s d o repositório para o
ambiente p o d e ser pelo escape de gases (por exenqjlo, H2 ou CO2 radioativos) resultantes
do metabolismo microbiano sobre rejeitos orgânicos depositados.
Várias espécies de microrganismos aeróbios e anaeróbios p o d e m estar envolvidos
n o processo d e biodeterioração do concreto. No entanto, as bactérias do género
Thiobacillus apresentam-se como as mais agressivas, p o r p r o d u z i r e m ácido sulfiirico como
produto final resultante da oxidação de m n ou mais c o m p o s t o s reduzidos de enxofre
inorgânico (^1' 59, 71, 72 )^ merecendo, p o r t a n t o , atenção especial em esmdos desta
natiueza.
C o m a p r e o c u p a ç ã o de estabelecer critérios para a construção de um repositório
de rejeitos radioativos e avahar a sua segurança, a Supervisão de Rejeitos e
Descontaminação do Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares/ Comissão Nacional de
Energia Nuclear - São Paulo (IPEN/CNEN-SP), iniciou estudos de durabihdade de barreuas
de engenharia em repositórios finais para rejeitos radioativos, onde u m d o s enfoques é a
biodeterioração do concreto, pois as condições climáticas do Brasil são favoráveis
prohferação de microrganismos raesófilos (aqueles que crescem melhor s temperaturas de
25 a 40 OC).
A interação meio ambiente e microrganismos, q u e difere para cada nicho, toma
importante conhecer a microbiota dos locais a serem escolhidos, dos materiais de constmção
e do ambiente construído. A interferência de cada um destes c o m p o n e n t e s no processo de
biodeterioração, possivelmente resulta numa durabihdade aUerada do concreto. Para se atuar
em âmbito preventivo, deve-se assbn, efetuar estudos que p o s s a m contribuir para o
conhecimento d a s formas de atenuação da atividade dos microrganismos n o concreto.
A a b o r d a g e m de um estudo preventKo, nesta área, p o d e ser efetuada em várias
direções:
• estudos acelerados em laboratório, da biodeterioração do concreto por
bactérias de mteresse, previamente isoladas;
• quantificação, isolamento e identificação de microrganismos agressivos ao
concreto, no local escolhido; e
• estudo da química d o s materiais de c o n s t m ç ã o e sua interferência no
metabolismo dos microrganismos envolvidos em processos de
biodeterioração.

O s estudos acelerados da ação microbiológica sobre o c o n c r e t o , efetuados em


laboratório, podem contribuir, através de modelos matemáticos, para a obtenção de dados
que permitam projetar c o n c r e t o s c o m a dmabilidade desejada. N o entanto, estes estudos têm
maior significado quando efetuados c o m a microbiota local, que é atuante n o processo
específico, e não com microrganismos estranhos ao ambiente em questão.
Atuabnente n ã o é possível estudar-se a microbiota ambiental de u m local
específico para repositório para rejeitos radioativos, p o r q u e arada n ã o há local definido no
Brasil.
Diante destas q u e s t õ e s apresentadas, e p o r não haver d a d o s experimentais sobre a
biodeterioração do concreto n o Brasil, com informações sobre a atividade vital dos
microrganismos nos concretos brasileiros, este trabalho foi efetuado para obter-se dados
microbiológicos ambientais em estudo-de-caso de uma estrutura de concreto apresentando
deterioração evidente; de areias para construção civil, de amostras de lodo, concreto e
eflorescencia, coletados de diferentes procedências.
1,2 Objetivos
Este trabalho teve p o r objetivo reaüzar anáüses microbiológicas que p u d e s s e m
colaborar para o estudo da biodeterioração do concreto, nas condições ambientais
brasileiras, envolvendo bactérias do género Thiobacillus. Para tanto, algumas metas
principais foram abrangidas:

• Realização de testes presuntivos para observar ocorrência de Thiobacillus


em areia para construção civil, concreto e amostras diversas coletadas do
ambiente construído;

• Isolamento e purificação de Thiobacillus com características neutrofíhcas e


acidofihcas;

• Estabelecimento de critérios para a identificação dos Thiobacillus isolados;

• Elaboração de u m teste quahtatK'o de crescimento em meio de cultura sóhdo


composto por uma suspensão de materiais de constmção.

Os dados obtidos p o d e r ã o ser utilizados como um parâmetro em pesquisas flituras,


diretamente relacionadas com a prevenção da biodeterioração do concreto de repositórios
finais para rejeitos radioativos.

COMISCfiO KÄC;CN/L II LNERGIA WUCIEÂR/SP - í «


2. LEVANTAMENTO BIBLIOGRÁFICO

Tendo em vista que a biodeterioração do concreto é tun tema multidisciplinar ainda


não estudado no Brasil, é necessário rever previamente a literatma sobre os p r o c e s s o s de
biodeterioração e corrosão microbiológica para posteriormente estudar a biodeterioração do
concreto. Para tanto, este capitulo é dividido em dois blocos:

• levantamento bibliográfico sobre o fenômeno da biodeterioração, n o qual são


enfocadas a biodeterioração de materiais de natureza mineral e a corrosão
microbiológica de metais;

• levantamento bibliográfico sobre a biodeterioração do concreto, n o qual


abordou-se a ação das bactérias d o gênero Thiobacillus, a corrosão das
armaduras metálicas no concreto armado por bactérias redutoras de sulfato e
a biodeterioração do concreto em repositórios finais para rejeitos radioativos.

2.1. Biodeterioração

2.1.1. Uma questão semântica

A transformação de vários tipos de materiais vem sendo associada ao metabolismo


de microrganismos. Esse processo p o d e ser desejável ou indesejável. Algumas questões
semânticas relacionadas à designação da participação dos microrganismos em p r o c e s s o s
biotecnológicos e ambientais foram discutidas n o 1 Simpósio Latino Americano de
Biodeterioração realizado em Campos do Jordão, S.P.- Brasil em 1992('*^\ As
biotransformações desejáveis foram definidas como biodegradação, por exemplo, a
biodegradação de plásticos e resíduos industriais, enquanto que as deletérias foram definidas
como biodeterioração, por exemplo, a biodeterioração de equipamentos metálicos e
concreto. Este mesmo critério foi adotado por A L L S O P P O .

Neste traballio adotou-se o termo biodeterioração para a deterioração do concreto


associada ao ataque microbiológico, embora muitos autores utilizem o termo corrosão
microbiológica do concreto . Esta distinção é mantida para e\itar um e q u K o c o com a
corrosão microbiológica das armaduras metálicas do concreto armado.

O termo corrosão microbiológica é aplicado a um metal quando este apresenta danos


de natureza eletroquímica correlacionados à participação de uma microbiota local
ocorrendo, portanto, na armadura de metálica do concreto. N o caso do c o n c r e t o (cimento
hidratado-agregados) o d a n o mais agressivo não envolve uma reação eletroquímica, mas,
uma dissolução d o s c o m p o n e n t e s hidráuhcos do concreto, pelos m e t a b ó h t o s ácidos dos
microrganismos. Assim o t e r m o biodeterioração parece ser mais adequado.

Este trabalho possui uma interface entre a microbiologia e a engenharia civil, por
essa razão, elaborou-se m n glossário , no qual são definidos alguns t e r m o s técnicos
utiüzados nesta dissertação (PP «

2.1.2. A biodeterioração de minerais

Geralmente os microrganismos que vivem sobre pedras p o d e m atuar n o processo da


biodeterioração. Entre eles estão as bactérias quimioütotróficas e quimiorganotróficas,
cianobactérias, fimgos e hquens. Estes grupos de microrganismos contribuem
significativamente para a deterioração de materiais de natureza mineral c o m o pedras,
concreto, cerâmica e vidro. S A N D & B O C K í^**) classificaram os mecanismos de ação da
biodeterioração segundo algumas caracteristicas principais:

• formação de biofilme e acúmulo de água;

• por tensão de sais;

• complexação; e

• ataque ácido.

2.1.2.1. Biodeterioração por formação de biofilme e acúmulo de água

Normalmente, o s microrganismos crescem podendo formar u m biofihne sobre os


materiais inorgânicos ou microcolònias nos poros dos materiais. A s células excretam
material extracelular c o m p o s t o por heteropoUssacarídeos e proteínas. N o seu metabolismo,
os microrganismos p o d e m excretar compostos como o nitrato ou ácidos orgânicos, os quais
acumulam-se na microcolônia/biofilme. Alguns destes compostos são fortemente hidrofílicos
retendo água em sua estrutura; conseqüentemente, o crescimento microbiano resuUa em
aumento do teor de água do material poroso. Os compostos dissolvidos, por serem
higroscópicos, pemiitem apenas a evaporação parcial da água, mesmo sob condições de
secura severa. O teor de água aumentado na microcolônia/biofilme é parcialmente
responsável pela deterioração dos materiais em condições de ciclagem térmica, onde
ocorrem fases de congelamento e descongelamento da água, o que resuha em aumento de
volume dos p o r o s . Este tipo de biodeterioração ocorre em regiões de climas frios e é
considerado fracamente agressivo ao material atacado.

2.1.2.2. Biodeterioração por tensão de sais

O s ácidos são convertidos a sais p o r r e a ç õ e s químicas c o m a matriz mineral


susceptível. Sob condições de secura, a água se evapora, resultando e m aumento da
concentração de sais. Estes sais acumulam-se sob a superfície d o s materiais, causando lun
estado de tensão q u e resulta em esfi)liação da camada superficial. Este tipo de ataque é
fracamente agressivo ao mineral.

2.1.2.3. Biodeterioração por complexação

O ferro, potássio, manganês, magnésio, cálcio e outros metais são frequentemente


fatores limitantes do crescimento microbiano, pois apresentam-se geralmente na forma
insolúvel em materiais de natureza mineral. O s microrganismos p o d e m superar esta limitação
p o r excreção de ácidos orgânicos, que se complexam com os metais, e permitem que estes
estejam biologicamente disponíveis através da conseqüente solubilização. E s t e tipo de
ataque é fracamente agressivo aos minerais.

2.1.2.4. Biodeterioração por ataque ácido

A p r o d u ç ã o biológica de ácidos minerais e orgânicos causa o ataque mais fortemente


agressivo aos materiais de natureza mineral. Entre as bactérias quimiolitotróficas, que
excretam ácidos inorgânicos, estão os Thiobacillus p r o d u t o r e s de ácido sulfúrico, e as
bactérias nitrificantes, que produzem ácido mtrico; e quase t o d o s os microrganismos
secretam ácidos orgânicos. A biodeterioração consiste na dissolução d o s materiais pelos
ácidos produzidos durante o metabolismo da microbiota local.

A p r o d u ç ã o de ácido sulfúrico, por bactérias do gênero Thiobacillus, é considerada


a causa mais agressKa para biodeterioração d o concreto^^'- ^8,59) pg^a melhor
compreender este fenômeno é unportante conhecer o ciclo do enxofre e os microrganismos
envoKidos neste processo .

10
2.1.3. O ciclo do enxofre associado ao processo de corrosão
microbiológica e biodeterioração

E m b o r a saiba-se que uma variedade grande de microrganismos, de gêneros e


espécies diferentes, é encontrada nos processos de biodeterioração de materiais, os
microrganismos que fazem parte do ciclo do enxofre t ê m u m papel muito importante neste
contexto. O ciclo em questão encontra-se esquematizado, simplificadamente, na Figura 1.

Bactérias Bactérias
ondantes oxidantes

Degradação por , Síntese .


por vegetais
animais e bacterias

Composto
orgânico de enxofre

Figura. 1 : O ciclo do enxofre envolvendo as bactérias oxidantes aeróbias e bactérias


redatoras anaeróbias.(VIDELA(^^))

2.1.3.1. Bactérias redutoras de sulfato

A s bactérias redutoras de sulfato (BRS), estritamente anaeróbias, compreendem os


gêneros Dessulfovíbrio (não esporuladas) e Dessiilfomaculum (esporuladas). A temperatura
ótima de crescimento está entre 25 e 4 4 ^ 0 . Podem crescer em p H entre 5,5 e 9,0, sendo o
p H ótimo de 7,2. São bactérias Gram negativas, curvas, sigmoides ou eventuabnente
espiraladas, com dimensões próximas a 0,5-1,0 um p o r 3,0-5,0 |.im, e movimentam-se por
flagelo polar. N o processo de respiração destas bactérias anaeróbias, o íon sulfato atua
como aceptor final de elétrons em lugar do oxigênio (^'l A Figura 2 mostra o esquema do
mecanismo de redução do sulfato por estas bactérias.

11
Carbono organico^gj„^,¿o
Oxidado fr^^,^ > ^ 2-

Carregadores \f
do transporte •
I «( eletrônico /V

Reduzido soj
Carbono '''9^^*'^°^^^^^^^
* CO,

Figura 2 : P r o c e s s o de respiração anaeróbia das bactérias r e d u t o r a s de sulfeto, o n d e o íon


sulfato é o a c e p t o r final de elétrons ( G R A G N O L I N O & T U O V I N E N C ^ I ) )

2.1.3.2. Bactérias sulfoxidantes

Entre as bactérias aeróbias sulfoxidantes, envoKidas em processos de


biodeterioração, encontram-se aquelas pertencentes ao gênero Thiobacillus, que
compreendem bacilos gram-negativos, medindo aproximadamente 0,5 p o r 1,0 a 4,0 | i m A
energia para o seu metabolismo é obtida a partir da oxidação de u m o u mais compostos
reduzidos de enxofre, incluindo sulfetos, enxofre elementar, tiossulfato, politionatos e
tiocianato. O s elétrons derivados do processo de oxidação entram na cadeia respiratória
para formação de ATPÍ'*^) q sulfato gerahnente é o p r o d u t o final m a s p o d e m formar-se
transitoriamente enxofre, sulfitos e pohtionatos^^^' T. ferrooxidans é a única espécie do
gênero capaz de o b t e r energia por oxidação da pirita e do íon ferroso (^''

Todas as espécies p o d e m fixar o dióxido de carbono através do ciclo de CaKin e


são, portanto, capazes de reahzar o crescimento autotrófico; algumas espécies são
quimiolitotróficas obrigatórias, enquanto outras são capazes de crescer também
quimiorganotroficamente. A maioria das espécies movimentam-se mediante flagelo polar. A
temperatura ótima de crescimento varia entre 20 e 430C. O gênero mclui espécies aeróbias
obrigatórias e anaeróbias facultativas denitrificantes, O p H ótimo de crescimento varia de 2
a 8 . Em c o n d i ç õ e s ótimas de laboratório a espécie T thiooxidans cresce c o m enxofre
elementar p r o d u z i n d o p H < 2 í'*^- E m contraste, algumas espécies de T.thioparus foram
isoladas na índia a partir de solos c o m p H = 10(^9) \ Figura 3 mostra esquematicamente a
oxidação de ura c o m p o s t o de enxofre reduzido por bactérias do g ê n e r o Thiobacillus era
condições de aerobiose e anaerobiose.

12
'reduzido
Oxidado

Carregador
2e- de
Elétrons

Reduzido AEROBIOSE
^oxidado

'reduzido
Oxidado •>N02 (NO+N2O+N2)
Carregador
2e- de
Elétrons

Reduzido ANAEROBIOSE
^oxjdado

Figura 3 : Oxidação de compostos de enxofre p o r bactérias do gênero Thiobacilbts em


condições de aerobiose e a n a e r o b i o s e ( G R A G N O L I N O & T U O V I N E N Í ^ l ) )

A s reações apresentadas na Tabela 1 mostram que muitos c o m p o s t o s inorgânicos de


enxofre são suceptrveis oxidação microbiológica. N a s vias m e t a b ó b c a s da oxidação
biológica, o c o r r e m várias etapas mediadas por enzimas específicas, acopladas a u m sistema
transportador de elétrons, onde o oxigênio é reduzido a água c o m o mostra a reação
terminal:

1/2 O2 + 2H+ + 2e- ^ H2O

Tabela 1 :Reações de oxidação por Thiobacillus (GRAGNOLINO & rUQVINEN(3l))

S2032- + 2O2 + H2O 2SO42- + 2H+


28° + 3O2 + 2H2O ^ 2SO42-- + 4H+
4S2O32- + O2 + 2H2O 2S4O62- + 4 0 H -
2S4O62- + 7O2 + 6H2O 8SO42- + 12H+
2SCN- + 4O2 + 4H2O ^ 2SO42- + 2CO2 + 2NH4+
H2S + 2O2 ^ SO42- + 2H+
2H2S + O2 -> 28° + 2H2O
2S3O62- + 4O2 + 4H2O 6SO42- + 8H+
5H2S + 8NO3- ^ 5SO42- + 4N2 + 4H2O
+ 6NO3- +2H2O -> 5SO42- + 3N2 + 4H+
5S20^2- + 8NO3- +H2O ^ IOSO42- + 4N2 + 2H+

13

COWISCÂO aCiCiv-L L l uviCFGf Nü CL EA «5/SP - ÍPES


A Figura 4 mostra as etapas e n v o M d a s na oxidação do sulfeto. enxofre elementar e
sulfoânions.

APS= A d e n o s i n a 5 f o s f o s s u l f a t o

Figura 4 : F o r m a s metaestáveis de enxofre decorrentes da oxidação de compostos


inorgânicos de enxofre por bactérias do gênero Thiobaciüus (GRAGNOLINO &
TU0VENEN(31))

O gênero Thiobacillus reúne microrganismos considerados os principais agentes


etiológicos envolvidos n o s processos de biodeterioração de concreto em esgotos (^''
58. 59, 71, 72) Segundo M I L D E (^'), a identificação de Thiobacillus, n o s produtos de
deterioração do concreto, é um fator importante para o estudo da biodeterioração do
concreto influenciada pelo ambiente. N o entanto, a identificação das espécies, para o gênero
Thiobacillus, é, em alguns casos, relativamente complexa; por este motivo, algumas
linhagens são classificadas em g m p o s (^^l Desta forma, cada grupo reúne linhagens com o
maior número de caracteristicas similares entre si. A caracteristica mais importante é o p H
final que a linhagem a ser identificada consegue atingir em meio de cultura hquido. A Tabela
2, elaborada a partir dos dados da hteratura apresenta o grupo, a espécie

representante e algvunas de suas características.

14
Tabela 2 . Características dos membros de cada g r u p o de Thiobacillus

Grupo Espécie p H final F o n t e de C a r b o n o Característica


particular

0 *'T.trautweinii" >6,6 autotrófico facultativo flagelos peritriqueos

la ** não há \ima 6,6-5,0 autotrófico facultativo -


espécie definida
1 T novellus 6,6 - 5,0 autotrófico facultativo imóvel

2 T.denitrificam 6,6 - 5,0 autotrófico estrito anaeróbia


denitrificante

3 T. íhioparus 5,0-3,5 autotrófico estrito -


4 T.neapolitanus 5,0-2,8 autotrófico estrito -
5 T. thiooxidans <2,0 autotrófico estrito resiste a p H < l , 0

6 T.ferrooxidam <2,0 autotrófico estrito oxida Fe2+

7 T.intermedins 2,8-2,0 autotrófico facultativo -

* segundo a classificação de KELLY^'^^) as bactérias deste grupo encontram-se excluídas d o


género Thiobacillus
** segunde KELLYÍ'*^) as bactérias do grupo Ia são provaveknente hnhagens de
T. versutus

A Figura 5 , elaborada por HUTCHINSON*^^^), apresenta um diagrama onde os


grupos do gênero Thiobaciüus são separados em planos distintos. Os grupos são
subdivididos, a princípio, em duas categorias q u a n t o sua fonte de carbono, os autotróficos
obrigatórios e os heterotróficos (autotróficos facultativos). A partir deste critério inicial, o
p H fina! do meio de culmra passa a ser o divisor de grupos. Desta forma, tem-se
autotróficas e heterotróficas cujo p H final do meio apresenta valor >5,0 e uma outra
subdivisão cujo pH é <5,0. Entre os grupos q u e apresentam pH final do meio <5,0, tem-se
os que apresentam pH final >2,8 e os que apresentam pH final <2,8. O centro da
circunferência simbohza a linhagem que melhor representa cada grupo. O s fatores que
definem a localização de uma detenninada linhagem com relação espécie representante do
grupo foram definidos detalhadamente em trabalho pubhcado por esse autor^^^).

15
o Grupo l a
HETEROTRÓFICOS

pH>5,0
|pH<S,0

Grupo?

AUTOTRÓFICOS
pH>2,8 ', pH<2,8

Figura 5 : Diagrama das relações entre os g m p o s de Thiobacillus, mostrando planos que


separam os g r a p o s conforme a fonte de carbono e o p H final n o meio de cultura
(HUTCHINSON(35))

N o Brasil, a indicação da ocorrência de bactérias sulfoxidantes, em amostras de solo


do Estado de São Paulo, foi observada pela primeira v e z em 1975, p o r LOPES^^^) onde
todos os solos analisados apresentaram atividade oxidante do enxofre. E m 1983,
PARON^^^^observou que o número de Thiobacillus em sedimentos aquáticos da represa do
L o b o , Brotas, Itirapira (S.P.), exercia influência na acidez da amostra analisada. E m 1991
S H I R A K A W A e colaboradores^''^) isolaram T.thioxidans e T.ferrooxidam do porto de areia
de Itaquaquecetuba (S.P.). G A R C I A Jr.^^^) isolou T.ferrooxidam e T. thiooxidam a partir
de amostras de efluentes de mina e minérios uraníferos contendo pirita procedentes de
P o ç o s de Caldas ( M G ) , Figueira (PR), Siderópolis ( S . C ) e L a g o a Real (BA).

2.1.4. Corrosão microbiológica de metais

A corrosão microbiógica de encanamentos subterrâneos, ocorrida n o s Estados


Unidos, em 1954, causou perdas estimadas entre 500 milhões e 2 bilhões de dólares anuais.
N o mesmo periodo, as perdas p o r este tipo de c o r r o s ã o alcançaram no Japão 0,2 milhões d e
dólares^^^).

16
A denominação corrosão microbiológica, empregada para expressar a participação
dos microrganismos nos fenômenos de corrosão, p o d e induzir a pensar-se na existência de
um processo químico diferente, o q u e é u m equívoco, pois a natureza eletroquímica da
corrosão permanece válida nos casos de corrosão por microrganismos. Segundo
VIDELA^^^) os microrganismos participam do processo de corrosão da seguinte maneira:

• produzindo substâncias corrosivas , originadas n o metabolismo, as quais


p o d e m ser de natureza química diversa, c o m o álcalis, ácidos, sulfetos, etc,
que transformam u m meio originalmente inerte em agressivo;

• originando pilhas de aeração diferencial p o r efeito de u m c o n s u m o desigual


de oxigênio, como é o caso dos tubérculos encontrados na corrosão de canos
de ferro ou em tanques de alumínio ou de suas ügas.

As reações de corrosão p o d e m ser induzidas ou aumentadas p o r atividade


microbiana, conforme as reações eletroquímicas clássicas de corrosão, r e s u h a n d o na
dissolução do metal dos sítios anódicos e captação subsequente de elétrons n o s sítios
catódicos. O consumo de elétrons varia dependendo do potencial de oxi-redução da
superfície. E m ambientes aeróbios o oxigênio é o aceptor de elétrons, formando óxidos e
hidróxidos do metal. Quando o ambiente apresenta potencial de oxi-redução baixo, os
prótons t o m a m - s e aceptores de elétrons, produzindo gases e outros p r o d u t o s altamente
reduzidos*^^). Segundo FORD^^^), os microrganismos envoKidos n o processo de corrosão
estão classifícados em quatro grupos distintos:

• bactérias redutoras de sulfato;

• bactérias "formadoras de limo";

• bactérias oxidadoras de ferro; e

• grupo variado, contendo bactérias sulfoxidantes, fimgos e algas.

2.1.4.1. Processo aerobio de corrosão microbiológica

As informações a respeito da influência dos microrganismos sobre o mecanismo de


corrosão aerobia são hmitadas p o r q u e o processo oxidativo abiótico é muito mais rápido. A
maior influência aparente de uma comunidade aerobia sobre a superfície do metal é a criação

17
de uma célula de aeração diferencial. A formação de luna comunidade heterogênea de
microrganismos p r o d u z u m filme microbiano sobre a superficie do metal, q u e resuha na
depleção de oxigênio sob o filme. N e s t a s condições, uma área de d e p l e ç ã o de oxigênio
t o m a - s e anódica em relação a outra área mais oxigenada. N o ânodo o metal susceptível
sofre oxidação e vai para a solução, enquanto o s elétrons hberados combinam-se c o m a água
e o oxigênio n o cátodo^^^- A Figura 6 apresenta este processo de forma esquemática .

Area ^^^SlXÍ"
catódica e Area g
anódica i

Metal M

Figura 6 : Célula de aeração diferencial composta por uma comunidade microbiana aerobia
sobre a superficie de um metal (ATLAS^^

2.1.4.2. Processo anaerobio de corrosão microbiológica

A corrosão de . letais em ambientes anaeróbios tem sido amplamente estudada, os


microrganismos de maior importância neste processo são as bactérias r e d u t o r a s de sulfato
í^'*). O s produtos de c o r r o s ã o na presença destas bactérias são o sulfeto de ferro e o
hidróxido de ferro II.

A s bactérias redutoras de sulfato são identificadas como os microrganismos mais


comumente responsáveis pelo processo de corrosão sob condições anaeróbias. Acredita-se
que elas podem mfluenciar o processo diretamente, pelo consumo de hidrogênio catódico
(despolarização catódica), ou indiretamente p o r produção de sulfeto c o m o p r o d u t o final de
seu metabolismo. Um d o s mecanismos de corrosão anaeróbia na presença das B R S .
apresentado por PANKHANlA^^^^é ilustrado na Figura 7 .

18
3Fe(OH)2

Fes

2-
SO^ * Z lactato
2 acetato + 2 CO2+ 2 H¿0

H* OH H*

OH" H* SO4"

H* OH"

Figura 7 : M e c a n i s m o de corrosão anaeróbia p o r bactérias r e d u t o r a s de sullfato


(PANKHANIA(54))

A s r e a ç õ e s descritas a seguir sumarizam o mecanismo que descreve a corrosão


anaeróbia do ferro:

4FeO -> 4Fe2+ + Se" Reação anódica

8H2O 8H+ + 80H- Dissociação da água

8H+ + 8e- ^ 4H2 Reação catódica

4H2 + SO42- S2- + 4H2O Despolarização catódica por microrganismos

Fe2+ + S2- FeS Produto de corrosão

3Fe2+ + 60H- 3Fe(OH)2 Produto de corrosão

4FeO + SO42- + 6 0 H - + 4H2O - > 3Fe(OH)2 + FeS + OH"

19
2.1.5. A ecologia da corrosão microbiológica

O estudo da interação microbiana no processo de corrosão microbiológica é tema


central de uma revisão publicada por F O R D & MITCHELL(28)^ do Laboratório de Ecologia
de Microrganismos da Universidade de Harward, onde o s autores discutem alguns conceitos
ecológicos ligados corrosão microbiana, d o s quais destacam-se:

• O papel da microbiota de superficie;

• A interação exopolimero-metal; e

• O papel da associação de microrganismos.

Nesta revisão, os autores separaram os processos envolvidos na corrosão


microbiológica em seções sub-itemizadas a seguir para facilitar a discussão. N o entanto, é
i n ç o r t a n t e lembrar q u e t o d o s os processos p o d e m estar o c o r r e n d o simultaneamente na
superficie de uma mesma comunidade.

2.1.5.1. O papel da microbiota de superfície

Para compreender a fimção dos microrganismos n o processo de corrosão, é


essencial obter-se informações sobre a complexidade da ecologia das comunidades
microbianas, capazes de crescer e aderir superficie de sólidos.

Nenhum substrato metáhco parece ser totahnente únune colonização por


microrganismos, embora a velocidade de colonização possa ser fortemente afetada por íons
tóxicos (cobre e níquel) ou inclusões de biocidas. A natureza do biofilme é tal que o
ghcocalix, material extracelular que os microrganismos secretam, geralmente formado por
pohssacarideos, p o d e m ter ação quelante hgando-se a íons tóxicos e biocidas, tornando-os
meficazes.

2.1.5.2. Interação exopolímero-metal

O s polímeros extracelulares, produzidos por bactérias, são comumente ácidos e


contêm g r u p o s fimcionais que reagem prontamente com íons metáhcos. Alguns estudos
estabeleceram que existem diferenças consideráveis entre a capacidade ligante de um íon
metálico particular e um exopohmero específico. A extensão da ligação depende de fatores

20
ambientais, tais c o m o p H , potencial de oxi-redução, e competição de íons. A ligação do
metal c o m o exopolímero microbiano depende da estrutura química do exopolímero.

2.1.5.3. O papel da associação de microrganismos

A conty>lexidade da interação microbiana n o ambiente não p o d e ser realísticamente


modelada e m laboratorio; p o r esta razão, a velocidade de corrosão medida em laboratorio é
invariavelmente b e m menor do que aquela encontrada n o meio ambiente. U m a das razões
primárias é a associação de microrganismos presentes na superficie d o biofilme. O estudo da
associação é dificultado e m virtude da inabilidade de isolar-se p o p u l a ç õ e s específicas de
comunidades sinérgicas

As bactérias redutoras de sulfeto associam-se freqüentemente a outros


microganismos anaerobios, sendo os seus produtos metabólicos utilizados c o m o substrato
p o r o u t r o s m e m b r o s da associação. A associação de microrganismos p a r e c e ter u m papel
importante n o processo de corrosão anaeróbia. Formam-se nichos n o s quais ocorre a
transferencia mterespecífica de hidrogênio e utilização de ácidos g r a x o s p o r bactérias
redutoras de sulfato DesenvoK'em-se mterações complexas similares entre populações de
microrganismos aeróbios na superficie do metal. Recentemente, P A N K H A N I A í^**) sugeriu
que as bactérias sulfoxidantes estão presentes dentro de comimidades microbianas
anaeróbias. A aeração p o d e t o m a r estas bactérias atK'as, produzindo m e t a b ó h t o s ácidos e
aumentando as reações de corrosão.

21

COMISCAC f . 4 : , ( X L U LKERGIA NUCLEAR/SP • IPEl


2.2. Biodeterioração do concreto

O levantamento bibliográfico, sobre o fenômeno d e biodeterioração d o concreto, por


questões didáticas foi dividida em três sub-ítens:

• a biodeterioração da matriz do cimento hidratado;


• a corrosão das armaduras para concreto a r m a d o ; e
• a b i o d e t e n o r a ç ã o d o concreto em repositórios finais para rejeitos radioativos.

Entende-se por concreto a mismra íntuna resultante da homogeneização


proporcionada de u m cunento Portland e suas adições, a g r e g a d o s m i ú d o s e agregados
graúdos com a água. A matriz inclui sempre o cimento hidratado e o a g r e g a d o miúdo. O
termo biodeterioração do concreto é xuna forma genérica de mencionar a biodeterioração da
matriz. Entende-se p o r concreto armado aquele onde são c o l o c a d a s armaduras (barras e fios
de aço) para absorver os esforços de tração e compressão.

2.2.1. Biodeterioração da matriz de cimento hidratado

2.2.1.1. A carbonatação da matriz de cimento hidratado:

O concreto é uma mistura de cimento, agregado miúdo (geralmente areia quartzosa),


agregado graúdo (geralmente granito) e água. Os constituintes quimicamente a t h o s são o
cunento e a água. Q u a n d o estes compostos reagem, formam-se os c o m p o s t o s hidratados do
cimento, responsáveis pelas propriedades mecânicas do concreto. O s agregados p o d e m ser
considerados como materiais inertes. Durante a hidratação ocorre a liberação de hidróxido
de cálcio, o que t o m a a solução n o p o r o do concreto a k a m a n t e alcalina ( p H 11-12,5). Neste
estágio acreditava-se que o concreto deveria estar hvre do ataque p o r microrganismos. Com
a exposição da superficie d o concreto ao gás carbônico atmosférico ocorre a carbonatação
da superfície exposta até que t o d o o hidróxido de cálcio superficial seja convertido em
carbonato de cálcio (uma solução saturada de carbonato de cálcio t e m um p H de 10,2). Na
presença de umidade, parte do carbonato de cálcio é dissoKido c o m o bicarbonato que, em
contato com o CO2 atmosférico e água (formando por sua v e z o ácido carbônico) atinge ura
estado de equilíbrio. Uma solução de bicarbonato nestas condições tem um p H 8,4. O
concreto exposto a esta atmosfera toma-se quimicamente estável nesta condição

22
2.2.1.2. Ação ácida na matriz de cimento hidratado

A s soluções ácidas causam a dissolução progressiva da portlandita [ C a ( 0 H ) 2 ] e de


silicatos e aluminatos hidratados da matriz. Quando os ácidos formam sais solúveis em água,
com o hidróxido de cálcio d o concreto, estes sais são arrastados pela água

Entre os ácidos p r o d u z i d o s biologicamente encontram-se ácidos fracos, como os


ácidos orgânicos de m o d o geral, e o s ácidos fortes c o m o os ácidos mtrico e sulfiirico. O
ácido sulfúrico é mais agressivo ao concreto porque além do fenômeno de dissolução da
matriz, seu sal correspondente, o sulfato, pode reagir c o m os c o m p o s t o s hidratados do
cimento formando c o m p o s t o s expansivos como a etringita ( 3 C a O . A l 2 0 3 . 3 C a S 0 4 . 3 1 H 2 0 ) ,
taumasita ( C a S i 0 3 . C a C 0 3 . C a S 0 4 . 1 5 H 2 0 ) e a gipsha.(CaSO4.2H20).Vale ressaltar que o
fenômeno de dissolução é rápida e a reação com o sulfato é lenta^^^)

2.2.1.3. Histórico sobre a biodeterioração do concreto

O primeiro caso de biodeterioração do concreto foi observado na cidade de


Melboume, AustráUa, e m 1945, por P A R K E R (^6) A superfície interna d o concreto da rede
de esgoto desta cidade apresentava-se deteriorado apenas achna do nível das águas servidas;
na atmosfera deste e s g o t o detectou-se uma quantidade apreciável de g á s sulfídrico. Nas
regiões deterioradas foi obser\'ada a presença de sulfato de cálcio , ácido sulfúrico hvre e
enxofre elementar. P o r n ã o ser exphcada a produção de ácido sulfúrico hvre a partir de gás
sulfídrico, sem a contribuição biológica, este autor mvestigou a presença de Thiobacillus
nos produtos de deterioração deste concreto. Foram isoladas cinco hnhagens de bactérias
produtoras de ácido sulfúrico. Por suas características morfológicas de cultura em meio de
cultura sóhdo e propriedades bioquímicas das hnhagens, PARKER^^^^ identificou-as como
pertencentes a uma nova espécie denommando-as de Thiobacillus concretivorus.AxvLd\mQXAQ
estas linhagens estão recatalogadas como Thiobacillus thiooxidans^'^^\

N o mesmo ano, PARKER^^^^ pubhcou um trabalho evidenciando a deterioração do


concreto por essas m e s m a s linhagens isoladas, expondo amostras de argamassa em
atmosfera contendo gás sulfídrico, em condições laboratoriais controladas. A argamassa foi
acidificada até atingir p H = 5,0 para posterior inoculação. A deterioração ácida típica
ocorreu apenas nas amostras inoculadas com os Thiobacillus isolados.

O processo de deterioração do concreto do esgoto de M e l b o u m e foi anahsado por


RIGDON^^^) c o m o uma sequência de etapas :

23
P r o d u ç ã o de g á s sulfídrico n o e s g o t o p o r bactérias redutoras d e sulfato e
d e c o m p o s i ç ã o de proteínas;

E s c a p e d o g á s sulfídrico do e s g o t o p a r a a atmosfera;

O x i d a ç ã o d o g á s sulfídrico p e l o s Thiobacillus c o m formação de ácido


sulfiirico ( e m laboratório o g á s sulfídrico n ã o é consumido diretamente,
parte d o g á s sulfídrico é transformado abioticamente para enxofre elementar
e este é oxidado pelos Thiobacillus);

Decoirç)osição da pasta de cimento endurecida, p o r ação d o ácido sulfiirico.

Para facilitar a visualização deste p r o c e s s o elaborou-se a Figma 8 q u e ilustra


esquematicamente a s etapas citadas n o processo d e biodeterioração d o concreto de esgoto
de M e l b o u m e .

CONCRETO

MASSA ACINZENTADA MOLE

• REGIÃO ANAERÓBIA
DO ESGOTO

Figura 8: Seção transversal da tubulação de concreto apresentando biodeterioração

Este tipo d e deterioração foi observado predominantemente em climas quentes,


porém, em 1977, t o m o u - s e u m problema sério n o concreto da rede de esgoto de Hamburgo,
Alemanha. Nesta cidade, a s canalizações de c o n c r e t o recém-construídas foram deterioradas
até uma profimdidade d e 4 cm, p o r ataque de ácido sulfiirico. N o prazo de d e z anos, vários
quilômetros destes c o n c r e t o s necessitaram de restauração (^^'^ Este problema parece ter
sido causado pelo t e o r elevado de compostos de enxofre d o s detergentes e u m aumento no
conteúdo de proteínas n a s águas servidas d o e s g o t o , o s quais conduziram a u m a maior
produção d e c o m p o s t o s voláteis de enxofre, resuUantes da degradação d o s aminoácidos. Em

24
p o u c o s anos, concretos novos, do esgoto, deterioraram-se apesar de serem cobertos por
tuna camada protetora de epoxi.

M I L D E e colaboradores (^') efetuaram um estudo para identificar quais as espécies


de Thiobacillus que poderiam estar presentes neste concreto, e qual o envolvimento destas
bactérias na biodeterioração do concreto. O s resultados do estudo ecológico realizado por
estes autores evidenciaram u m desenvoKdmento sucessivo de espécies diferentes de
Thiobacillus durante o processo de biodeterioração do concreto.

O s resultados encontrados por M I L D E Í ^ ' ) são parciahnente coincidentes c o m os


encontrados p o r P A R K E R & PRIST(58) e PARKER(59)), obtidos do c o n c r e t o do esgoto de
Melboume; onde foram isolados T.thiooxidans , T.neapolitanus e organismos que
convertem tiossulfato em tetrationato, resultando num a u m e n t o do p H do meio de cultura
("linhagem M " , "T.trauweinii"). N o esgoto de H a m b m g o n ã o foram encontradas as espécies
T. denitrificans, T. thioparus e "hnhagem M", as quais foram e n c o n t r a d o s em número
r e l a t h a m e n t e elevado no esgoto de Melboume. A s diferenças na distribuição das espécies
dos Thiobacillus encontrados parecem ser dependentes do meio ambiente.

T A Y L O R & H U T C H I N S O N ( 8 3 ) registraram um problema sério de deterioração do


concreto, e m torres de refiigeração, associado à atividade de bactérias sulfoxidantes
presentes em n ú m e r o elevado na água de circulação e n o s p r o d u t o s ú m i d o s deteriorados.
Outro caso de deterioração do concreto, não relacionado ao e s g o t o , foi relatado por
THORNTON^^^) em túneis de concreto dos lagos artificiais de Piedmont e Clendening
também envolvendo a ocorrência de Thiobacillus.

O problema da biodeterioração do concreto no e s g o t o de H a m b u r g o despertou o


interesse de pesquisadores que modenizaram as técnicas para detectar a presença de
Thiobacillus p r o d u t o r e s de ácido, em amostras ambientais, através da investigação de ixm
ácido graxo específico empregado c o m o um biomarcador^^"*-

2.2.1.4. Biodeterioração acelerada do concreto e m condições laboratoriais


controladas

E m experimentos laboratoriais com condições extremamente controladas, S A N D e


colaboradores^^i^ reproduziram a biodeterioração do concreto em câmaras contendo gás
sulfídrico e amostras de concreto inoculadas com diversas espécies d o s Thiobacillus
isolados de Hamburgo. Neste experimento as amostras c o m p o s t a s p o r cimento Portland de
aho fonio apresentaram alteração do pH da superfície do concreto de 9 para 2, em um

25
período de 50 dias, enquanto as amostras c o m p o s t a s p o r cimento Portland c o m u m levaram
120 dias para apresentar essa mesma alteração no pH. Em trabalho pubhcado
posteríormente. S A N D & BOCK^^^) constataram, depois de 270 dias d e incubação das
amostras de c o n c r e t o em câmara controlada de H2S, q u e os corpos de prova de concreto
confeccionados com cimento Portland de alta resistência a sulfatos apresentaram
deterioração neghgenciável; os corpos confeccionados c o m cimento Portland comum
apresentaram g r a u médio de deterioração, enquanto que os corpos confeccionados com
cimento Portland de alto-fomo exibham forte grau de deterioração.

2.2.1.5. Atividade vital dos microrganismos no interior do concreto

A alcahnidade elevada do concreto e os efeitos inibidores do íon hidroxila sobre a


atividade vital das células, t o m a m duvidoso o desenvolvimento dos microrgamsmos no
interior do concreto. N o entanto, esta hipótese apresenta-se questionada p o r DROZD(26)
que c o m p r o v o u o desenvoKimento de microrgamsmos n o s p o r o s do concreto, cuja água
apresentava p H na faixa de 11,5 a 12,5. N o s p o r o s artificialmente criados foram encontradas
bactérias amonificantes aeróbias e anaeróbias, bactérias denitrificantes, bactérias do sihcato,
leveduras e fimgos.

Esta questão, referente à atividade vital de microrganismos nesta faixa de p H , no


interior do concreto, é motivo de polêmica e desperta o interesse para várias situações na
engenharia civil; p o r esta razão, o experimento efetuado p o r DROZD^^^^ é descrito, neste
item, de forma mais detalhada.

A Figura 9 ilustra o modelo experimental elaborado pelo autor para a detecção da


a t m d a d e vital dos microrganismos nos poros artificialmente constmídos. O s t u b o s capilares
de vidro representam uma célula juntamente c o m três fihnes de teflon, onde se efetuou o
estudo microbiológico. A cavidade de vidro contmha ar, e a água não penetrou dentro desta
cavidade, m a s saturou os poros da base do corpo de prova de concreto e manteve-se
acumulada p o r forças de capilaridade.

26
1) Tanque de aeração
2) Soluf áo com lodo
3) Corpo de prova de concreto
4) Cavidade de vidro setn &mdo
5) Tampa de borracha
tf) Zona de capilares de wdro incorporados
ao concreto para obsenrajáo da atividade
vital ios microrganismos

Figura. 9 : Corpo-de-prova de concreto c o m cavidade artificial e zona de capilares de vidro


incorporados para observação da atividade vital de microrganismos(DROZD(26))

A p o p u l a ç ã o de microrganismos da água n o tanque de aeração foi representada p o r


comimidades de várias bacterias, incluindo o gênero Alcaligenes, Achromobacter,
Pseudomonas, Corynebacterium, e também fimgos, algas e protozoários. Depois de 1, 3, 6
e 12 meses o autor investigou a presença de microrganismos n o s corpos-de-prova de
concreto, t a n t o n a s células de tubos capilares q u a n t o na massa do concreto. Os resultados
deste trabalho indicaram que o número de microrganismos aumentou com o tempo. A
pesquisa abrangeu corpos-de-prova confeccionados c o m vários tipos de cimento, sendo que,
de t o d o s eles foram isolados microrganismos. O acúmulo de metano, na atmosfera do vidro,
determinado p o r cromatrografia. confirmou a atividade vital d o s microrgamsmos n o s p o r o s
do concreto.

A Figura 10 ilustra a mudança na composição de gases na cavidade artificial


encontrada pelo autor.

1 2 3 4 5

Terrpo (semanas)

Figur. 10 . Mudança da composição de gases na atmosfera dentro da cavidade de


vidro do corpo-de-prova de concretoíDROZD^-'^^)

27
A detecção de espécies aeróbias e anaeróbias, e a sua proliferação, n o s p o r o s do
concreto, indicaram u m estado ativo da microbiota nas c o n d i ç õ e s e x t r e m a s de p H n o
interior do poro. O autor supõe que, as células microbianas, a o e n t r a r e m n o s p o r o s do
concreto, durante a infiltração e difiisào da água, do tanque para a b a s e d o corpo-de-prova,
adaptam-se às condições de p H do poro (igual a 12). Neste caso, o c o r r e a interação de dois
principios: a alcalinidade d o concreto age sobre os microrganismos, e, p o r outro lado, o s
microrganismos mudam o valor do p H do meio para as suas p r ó p r i a s condições ótimas
através da produção de ácido durante o seu metabolismo.

A adaptação das células microbianas para as condições existentes n o s p o r o s é


acompanhada pela seleção de microrganismos, e conduz à f o r m a ç ã o de uma biocenose
estável em condições extremas. Neste caso, a interrelação na comunidade de
microrganismos é metabiótica. A falta de oxigênio n o s p o r o s d o c o n c r e t o favorece o
crescunento de espécies anaeróbias. A nutrição é provida pela massa trocada entre o
ambiente externo e a água d o poro. A massa de troca ocorre em virtude de dois contra-
fluxos de difijsão: as substâncias oxidadas dif\mdem-se de fora para dentro e, as reduzidas,
de dentro para fora.. Dessa forma, os microrganismos m a n t ê m sua atividade vital nos
espaços porosos. A sobrevivência dos mesmos para estas condições de alcalinidade elevada
parece ser dependente de vários fatores:

• a habihdade de criar condições favoráveis em z o n a s l o c a h z a d a s ;

• formação de comunidades com mterrelaçòes metabióticas;

• o consumo de compostos orgânicos que se difundem c o m o nutriente; e

• a propriedade do concreto de reagir com o dióxido de c a r b o n o , em evolução,


hberado c o m o produto final do metabohsmo, c a r b o n a t a n d o a parede do
p o r o , com conseqüente diminuição do p H na água do p o r o .

2.2.1.6. Biodeterioração do concreto por diferentes espécies de


Thiobaci/lus

Os resultados da anáhse microbiológica, encontrados n o c o n c r e t o do esgoto de


H a m b u r g o ( ^ ' \ permitem concluir que no inicio do processo de biodeterioração predominam
as bactérias quimiolitotróficas facultativas, neste caso, p r e d o m i n a n d o T. intermedius e
T. novellus, que são capazes de crescer em ambientes neutros ou hgeiramente alcahnos. A
medida que a deterioração prossegue e o valor do p H na superfície d o concreto cai para
menos de 6,0 o n ú m e r o de T. neapolitanus aumenta. Se o p H dn superfície cai para abaixo

28
de 5,0, os T. thiooxidans iniciam o seu crescimento causando acidificação intensa, abaixando
para p H 2 a superfície d o concreto . A Figura 11 esquematiza o processo em questão. Esta
figura foi elaborada a apartir dos resultados apresentados p o r MILDE^^')

SUPERFÍCIE DO CONCRETO
pH<7
TTiiotacilhíS novetliís

Thiobacillus nmpvZitanttr

rhiobacillus thiooxidans «

(concreto do esgoto de Hamburgo)

" Espécies predominantes em pH especírico

Figura 11 : Biodeterioração d o concreto apresentando sequência d o desenvolvimento


sucessivo de espécies neutrofilicas e acidofilicas de Thiobc Ulus.

2.2.1.7. Mecanismo de biodeterioração do concreto por microrganismos de


vários gêneros e espécies

Em trabalho pubhcado p o r KARAVAIKO^^^^ foram encontradas bactérias


heterotróficas n o concreto integro e em amostras c o m diferentes graus de deterioração.
Evidenciou-se que estas bactérias utilizavam os Ugnosulfonatos, e m p r e g a d o s como aditKos
do concreto.

Este autor p r o p õ e u m mecanismo de ação da biodeterioração do concreto, onde as


bactérias heterotróficas estariam iniciando o p r o c e s s o ; medida que se formam susbtâncias
orgânicas simples, com diminuição do p H , e, c o m c o n s u m o de oxigênio em micro-regiões.
inicia-se o desenvoKimento de bactérias redutoras de sulfato, que p r o d u z e m g á s sulfidrico.
o qual é oxidado em condições aeróbias pelo T. thioparus até sulfato. O autor acredita que
este processo esteja relacionado com o aumento do t e o r de sulfato encontrado no extrato
aquoso do concreto anahsado. N a s zonas parciaknente deterioradas aparecem as bactérias
nitrificantes, a sua quantidade aumenta significativamente no concreto deteriorado. Neste
caso não ocorreu o desenvoKimento dos microrganismos acidofíhcos.

Entre as bactérias quimiolitotróficas encontradas estão as bactérias tiônicas e a s


bactérias nitrificantes; entre os microrganismos heterototróficos, encontraram-se as bactérias
amónicas, bactérias denitrificantes e fimgos filamentosos. A s bactérias fotossmtéticas são

29
representadas p o r Symtococcus sp. N e s t e processo t o m a m parte bactérias aeróbias e
anaeróbias, e algmnas destas encontram-se em associações tróficas.

Para ilustrar melhor o mecanismo de biodeterioração d o concreto p r o p o s t o por este


autor elaborou-se a Figura 12 q u e ilustra o processo de biodeterioração d o concreto por
desenvolvimento sucessivo de bactérias de gêneros e espécies diferentes.

-Bactérias heterotróficas

Thiobaafíus

Bactérias
Redutoras de
Sulfato

Microrregiões anaeróbias
com substôncías orgânicas
mm
5)
Concreto deteriorado
por dissolução ácida dos
compostos hidratados do
cimento

Fig. 12 : M e c a n i s m o de biodeterioração do concreto envolvendo u m p r o c e s s o sequencial de


colonização p o r bactérias de gêneros e espécies diferentes.

2.2.1.8. Presença de microrganismos e m concretos brasileiros.

O p r i m e u o mdício da presença de microrganismos em concretos brasileiros foi


observado p o r R I B A S SILVA (^5) q^e encontrou vários tipos de microrganismos ao
anahsar a microestmtura de concretos coletados em Brasiha. N o entanto, n e s t e s casos, não
foram efetuadas anáhses microbiológicas nestes concretos, portanto não é possível saber se
os microrganismos estavam vivos, participando do processo de deterioração,ou se estes
eram contaminações provenientes dos agregados, e embora presentes, estavam mviáveis no
interior do concreto.

E m 1992, S H I R A K A W A e colaboradores^^^^ encontraram bactérias heterotróficas,


fungos e indicação para Thiobacillus e bactérias redutoras de sulfato em concreto
deteriorado na cidade de São Paulo.

30
2.2.1.9. Estudo de biocidas no combate à biodeterioração
P o r r a z õ e s econômicas, o interesse na prevenção d o processo de biodeterioração
t e m aumentado n o s últimos anos. Uma possibilidade para reduzir a extensão da deterioração
p o d e ser a inibição d o crescimento dos Thiobacillus pela aplicação de biocidas. E M M E L e
colaboradores(2^) testaram 16 biocidas quanto capacidade de inibição d o crescimento de
Thiobacillus e obtiveram resultados satisfatórios em dois tipos de biocidas, o que pernoite
sugerir-se q u e estes p o d e m ser utilizados com sucesso para prevenir ou reduzir a
biodeterioração d o concreto por produção biológica d e ácido sulfúrico. Este trabalho não
revela a composição quimica destes biocidas.

Algumas substâncias químicas são mencionadas p o r BORZANl(^3)conio mibidoras


de bactérias de m o d o geral, entre elas estão os c o m p o s t o s quaternários de amónio,
pohclorofenóis, pohaminas, diclorodi-hidroxifenilmetano, b r o m e t o de dimetilcetilamônio,
tri-w-butüborato e etihdenodiacetato.

2.2.2. Corrosão microbiológica em armaduras para concreto armado

Os trabalhos pubücados sobre a corrosão microbiológica em a r m a d m a s .são raros.


Neste item é discutido um trabalho pubhcado p o r M O O S A W ^ ^ ) Q^^Q Q autor evidencia a
ação das bactérias redutoras de sulfato na corrosão em armaduras para concreto armado.

A corrosão de metais, em particular de materiais ferrosos, p o r bactérias redutoras de


sulfato é um fenômeno b e m documentado^^"*' N o entanto, a corrosão de armaduras de
aço em concreto armado, como resultado direto da atividade das bactérias redutoras de
sulfato é p o u c o estudado. A corrosão do aço das armaduras p o d e resultar em expansão e
deterioração da estrutura do concreto.

A água presente no poro do concreto, em t o r a o da armadura, t e m u m p H de


aproximadamente 12,5. e é mantido neste valor pela camada rica em hidróxido de cálcio em
contato íntimo c o m a superfície da armadura. Enquanto este p H é mantido, esta região está
passiva, e a annadura deve peraianecer hvTe de corrosão. O ingresso de íons agressKos
como o cloreto, próximo á armadura, p o d e aUerar uma região da armadura do estado
passivo para um estado ativo.

Segundo MOOSAVl^^^^, dois tipos de bactérias podem estar imphcadas na corrosão


da armadura n o concreto: as bactérias aeróbias sulfoxidantes e as bactérias anaeróbias
redutoras de sulfato. O papel das bactérias sulfoxidantes não está restrito somente a sistemas
de esgoto, pois algumas pubhcações mdicaram a sua presença em tanques de estocagem de

31
Óleo, construídos em concreto e abastecidos de a e r a ç ã o suficiente. A ação das B R S na
corrosão da armadura do concreto não está bem definida. Supõe-se que o gás sulfídrico
produzido pelas B R S p o d e ser utilizado como substrato pelas bactérias sutfoxidantes no
processo de oxidação. Outra possibilidade é o sulfeto, produzido biologicamante, reagir com
I a superfície do aço da armadura causando a corrosão. E m tanques de estocagem de óleo,
onde coexistem condições aeróbias e anaeróbias, tanto as B R S , quanto as bactérias
sulfoxidantes p o d e m estar ativas cotr^letando o ciclo d o enxofre.

O s residtados publicados por MOOSAVK^^) p r o p õ e m u m mecanismo de corrosão


da armadiu-a de aço do concreto por bactérias r e d u t o r a s de sulfato: o sulfeto biologicamente
produzido pela atividade destas bactérias, pode p e r m e a r através do concreto, formando uma
camada de sulfeto de ferro sobre a armadura; sob tensão, esta camada se rompe, dando
continuidade ao processo de corrosão; na sequência, espera-se tuna corrosão p o r pite. O
sulfeto de ferro, formado sobre a armadura, p o r ser volumoso, p o d e causar expansão e
físsuramento do concreto que cobre a armadura.

Quanto metodologia utilizada, MOOSAVI^^^) conclui que as técnicas de


impedância de corrente alternada e mído eletroquímico. mostraram-se valiosas na
monitoração da corrosão microbiológica de armaduras do concreto.

2.2.3. Biodeterioração do concreto por microrganismos em repositórios


finais para rejeitos radioativos

A deposição de rejeitos radioativos em repositórios finais de superfície ao nível do


solo é uma prática bem aceita, adotada pela Agência Internacional de Energia Atômica
(International Atomic Energy Agency). Somente rejeitos com nivel médio ou babeo de
radiação, contendo radionuclideos com meia vida curta p o d e m ser depositados neste tipo de
repositório^^^- O s concretos utilizados como barreiras de engenharia em repositórios de
superficie ao nível do solo, devem manter a durabilidade p o r 300^^^' a 500 anos^'*^

Q u a n d o a escala de tempo envolve algumas centenas de anos, alguns fatores pouco


relevantes para a contnição civil passam a ser considerados. Visando esta questão, algumas
instituições de pesquisa ligadas energia nuclear, em vários países que adotaram a
deposição ao nível do solo, estão preocupadas com o processo de biodeterioração do
concreto em repositórios finais para rejeitos radioatKos e a interrelação cora a
biotransformação dos rejeitos nele depositados* •^^^ .

32
A N I R E X (Nuclear Industry Radioactive W a s t e Executive), uma empresa prestadora
de serviços de gerenciamento de rejeitos radioativos na Inglaterra, desenvolveu um
programa amplo de pesquisa para determinar a influência d o s microrganismos n o s locais de
deposição de rejeitos radioativos. O estudo observou como populações mistas de
microrganismos p o d e m sobreviver e crescer em m n repositório de concreto para rejeitos
radioativos d e nível babeo de radiação. Esta pesquisa confirmou que existem microrganismos
capazes de crescer sobre os componentes orgânicos d o s rejeitos, e m p H elevado, próximo
ao concreto do repositório. O p H de 12,25 parece ser o limite superior tolerável para o
crescimento microbiano. Embora os rejeitos não se apresentem c o m o substratos ótimos para
a atividade vital microbiana, as condições ambientais são suficientes para permitir o
crescimento d o s microrganismos^^^X

Esse estudo feito pela N I R E X indicou t a m b é m que tanto o dióxido de carbono


quanto o metano p o d e m ser formados, por ação microbiana, dentro d o repositório. O
dióxido de carbono p o d e ter sua concentração limitada p o r reagir c o m o concreto. A fração
celulósica é a principal determinante d o crescimento celular e do aparecimento de
compostos orgânicos solúveis.

Acredita-se que c o n g o s t o s intermediários sejam produzidos n o rejeito até que


ocorra o crescimento do próximo microrganismo, necessário para a continuidade da
biotransformação sequencial. Os compostos solúveis n o s p o r o s do concreto e a população
de microrganismos presentes no rejeito irão variar com o tempo e sustentar a atividade
biológica p o r um período prolongado. A s estimativas do modelo matemático adotado por
HODGKINSON & COOPER^^l) sugeriram que a maior ação microbiana dentro do
repositório será atingida depois de 400 anos.

33
3. MÂTERÎAIS E MÉTODOS

3.1. Materiais
3 . 1 . 1 . Equipamentos
• Autoclave, marca Lutz Ferrando, m o d e l o Esteril-matic vapor Luferco, São
P a u l o , Brasil;
Autoclave, marca Phoenix, m o d e l o A V - 1 8 , Araraquara, São Paido;
Balança anaUtica com precisão de 0,001 mg, marca Mettler, Zurique, Smça;
Balança semi-anahtica com precisão de 0,1 g, marca Mettler, modelo Pn
1210, Zurique, Suiça;
Banho-maria, marca Quimis , Diadema, Brasil;
Contador de colônia, marca Gallenkamp, catálogo N o CX 300, Inglaterra;
Destilador de água, marca Corning, m o d e l o A G I 1, São Paulo, BrasU;
Estufa para esterilização e secagem, marca L u t z Ferrando, São Paulo, Brasil;
Fluxo laminar, marca Veco, modelo V L F S 18, Campinas, Brasil;
Incubadora bacteriológica, marca Precision PS Scientific, modelo 805,
E s t a d o s Unidos da América;
Incubadora bacteriológica construida n o I P E N ;
Potenciómetro marca Digimep, m o d e l o D M p H 2 , São Paulo, Brasil;
Refrigerador marca Brastemp, 320 ütros, Brasil;
Shaker, (agitador de erlenmeyers). marca N e w Brunswick Scientific, modelo
Incubator Shaker- serie 25, New Jersey, USA..

3.1.2. Materiais
• Balões volumétricos: de borossihcato (Pyrex ou vidro neutro) com
capacidade de 100 mL , 1 L e 2 L;
• Bico de Bunsen,
• Estantes de arame galvanizado, perfiiradas, para t u b o s de ensaio com 18 mm
de diâmetro X 180mm comprimento e para tubos com 16mm de diâmetro X
150mm de comprimento;
• Frascos para água de diluição, de borossihcato (Pyrex ou vidro neutro), com
t a m p a s de rosca que permitam boa vedação e sejam liwes de substâncias
tóxicas solúveis. Este frasco deve ter capacidade para volumes maiores do
q u e 100 m L para permitir boa h o m o g e n e i z a ç ã o ;

34
F r a s c o s de Erlenmeyer,de borossilicato com capacidade de 2 5 0 TDL, 500 mL,
1000 m L e 2 0 0 0 m L ;
Jarras de anaerobiose;
M e m b r a n a filtrante, marca MiUipore de p o r o s i d a d e 0,22 m i c r ô m e t r o ;
Pipetas,tipo M o h r de 5 e 10 mL com graduação de 1/10 e erro de cahbração
inferior a 2 , 5 % e com bocal para t a m p ã o de a l g o d ã o ;
Placas de Petri, de vidro pyrex ou plástico atóxico transparente;
P o r t a filtro para membrana filtrante;
Sistema g e r a d o r de dióxido de carbono e hidrogênio;
Tela d e amianto;
Tripé;
T u b o s de ensaio: de borossilicato (pyrex) ou vidro n e u t r o , de 18mm x
1 8 0 m m e 16mm x 150mm;

3.1.3. Reagentes
Acetato de c h u m b o p.a., Merck;
Ácido bórico p . a . , C A A L ;
Ácido sulfiirico p.a., Q.M.;
Agar; M e r c k
Agarose , Sigma:Type II Medium EEO/A-6877
Bicarbonato de sódio p.a., C A A L ;
Cloreto de amonio p.a., Merck;
Cloreto de cálcio p.a., C A A L ;
Cloreto d e c o b a h o hexahidratado p.a.,Merck;
Cloreto de magnesio hexahidratado p.a.; C A A L ;
Cloreto d e m a n g a n ê s tetrahidratado p.a.. Cario Erba;
Cloreto de potássio p.a.; C A A L ;
Cristal violeta p.a.. Nuclear;
Dextrose p . a . , M e r c k ;
Enxofre elementar p.a., Ecibra;
Extrato d e levedura; Difco;
Fosfato de potássio dibásico p.a.; Nuclear;
Fosfato d e potássio monobásico p.a.. Nuclear;
Hidróxido d e sódio p.a., Merck;
l o d e t o de p o t á s s i o p.a., Merck;

35
Iodo p.a., Reagen;
L a c t a t o de sódio p.a., Merck;
Molibidato de amonio p.a., Cario Erba;
Nitrato de cálcio P.A, C A A L ;
N e o p e p t o n a ; Difco
Nitrato de potássio p.a.. Nuclear ;
Oxalato d e amonio p.a.,Merck;
Safranina p.a., Fluka;
Sulfato d e amonio p.a., Ecibra;
Sulfato de cobre heptahidratado p.a.,Merck;
Sulfato ferroso amoniacal hexahidratado p.a., Merck;
Sulfato ferroso heptahidratado p.a., Nuclear;
Sulfato de magnesio heptahidratado p.a.; Nuclear;
Sulfato de zinco heptahidratado p.a.; Q.M.;
Tiocianato de amonio p.a., Merck;
Tiossulfato de sódio pentahidratado p.a., Merck;
Triptona, Difco;
V e r d e de bromocresol p.a., Merck;
Vermelho de fenol p.a.,.Merck.

3.1.4. Soluções

As soluções utilizadas e o modo de preparo estão Hstadas no Anexo I

3.1.5. Meios de cultura


A Tabela 3 apresenta os meios de cuhura utihzados e sua aplicação neste trabalho. A
fórmula e m o d o de preparo destes meios p o d e m ser encontrados no A n e x o 11.

36
Tabela 3 : M e i o s de cultura e sua utilização
Meio de cultura titüização
Postgate liquido modificado para T.thioparus T e s t e presuntKo para T.thioparus
Postgate sólido modificado para T.thioparus Isolamento de T. thioparus
A T C C 238 líquido adaptado para T.thioparus Crescimento de T.thioparus
( 0 , 5 % de tiossulfato de sódio)
Postgate líquido modificado para T.thiooxidans T e s t e presuntivo para T. thiooxidans
Postgate sólido modificado para T.thiooxidans Isolamento de T. thiooxidam
9 K - SO Uquido Enriquecimento de T. thiooxidam
9K-Fe2+b'quido T e s t e presuntrvo para T.ferrooxidam
"TK" sóUdo Isolamento de T.ferrooxidam
A T C C 238 c o m 1% de S^ ( p H = 4,2) Crescimento de T. thiooxidam
A T C C 238 c o m 1% de SO ( p H = 12) Sobrevivência de T. thiooxidam
A T C C 238 - tiossulfato agar Isolamento de T. thiooxidam
Meio de cultura para indicação de espécie Teste presuntrvo para T.denitrificam
anaeróbia ( T.denitrificans)
Agar triptona extrato de levedura C o n t a g e m de bacterias heterotróficas
Agar Sabourand dextrose C o n t a g e m de fimgos
Meio de Starkey Teste presuntKo para
Bactéria redutoras de sulfato
Meio S6 Teste de identificação (cepa neutrofílica)
Meio S 5 Teste de identificação (cepas acidofihcas)
SO + 6% de riossulfato T e s t e de identificação (cepa neutrofilica)
S6 + 4 % de fosfato Teste de identificação (cepa neutrofilica)
5 5 + 4 % de fosfato Teste de identificação (cepas acidofilicas)
56 + 1% de S0(sem riossulfato) Teste de identificação (cepa neutrofilica)
5 5 + 1% de S0( sem riossulfato) Teste de identificação (cepas acidofilicas)
56 + 5% de NaCl Teste de identificação (cepa neutrofíhca)
S5 + 5 % de NaCl Teste de identificação (cepas acidofilicas)
S8 Teste de identificação para observar
denitrificação em anaerobiose
S7 Teste de identificação para observar
crescimento em tiocianato
Agar nutriente Teste de identificação para obser\'ar
crescimento heterotrófico
Agar citrato de Simon's Teste de identificação para observar utihzação
de citrato

37
3.2. Metodologia

3.2.1. Descrição geral dos experimentos efetuados


Neste trabalho foram reahzadas anáhses microbiológicas quantitativas envolvendo
testes presuntivos para obtenção do número mais provável de Thiobacillus, contagem de
bactérias heterotróficas e fiingos em estudo-de-caso. Também foram efetuados testes
presuntivos quahtativos para bactérias redutoras de sulfato. A s determmações da massa seca
das amostras anahsadas, o p H e umidade foram realizados como ensaios complementares
anáhse microbiológica. A composição qiumica e reconstitxiição de traço caracterizaram o
concreto analisado em esmdo-de-caso.

Amostras de areia e do ambiente construído foram anahsadas c o m testes presuntivos


quahtitativo s para Thiobacillus .

A partir dos testes presuntivos positivos para Thiobacillus efetuaram-se o


isolamento e purificação de cepas com caracteristicas neutrofíhcas e acidofihcas.

As culturas puras isoladas foram submetidas a u m conjimto de testes preliminares


para identificação de Thiobacillus.

Posteriormente, foram reahzados testes quahtativos de crescunento d e cepas puras


11 em meios de cuhura elaborados com suspensões de materiais de construção.

A Figura 13 apresenta um esquema geral dos experimentos efetuados.

3.2.2. Amostras estudadas

A anáhse microbiológica quantitativa foi efetuada em estudo-de-caso de um


reservatório de água, apresentando deterioração evidente em várias regiões da estmtura de
concreto.

Para a anáhse quahtativa. foram estudadas amostras do ambiente c o n s t m í d o , de


diferentes naturezas, coletadas em locahdades distmtas. Estudaram-se t a m b é m amostras de
areias destmadas constmção civil.

38
CONTAGEM DE
CONCRETO
BACTtRUS
SOLO ANALISE
MICROBIOLÓGICA HETEROTRÓFICAS
í EFLORESCÊJCIA
QUANTITATIVA
(IhBT^BÜTANTAN) EBsak»
eoia.pkAeBtki«i ;
pH, UMIDADE,
MASSA SECA

TESTE QUALITATIVO PARA


AMOSTRAS
BACTÉRLftó REDUTORAS DE SULFATO
AMBIENTAIS
RECONSTITUIÇÃO
COMPOSIÇÃO ^ DE TRAÇOS
QUÍMICA
DIFRAÇÃO
DE RAIOS X

LODO
^ (ETA.RIACHO GRANDE)

C01«nŒT0 »•
(GUARAPIRANGA)
ANAUSE TESTE
QUALITATIVA PRESUNTIVO
EFLORESCENOA
PARA POSITIVO
(PISCINA-CEPEUSP)
THtOBACãJ.US
AREIAS!
ITAQUAQUECETUBA - S.P.
ISOLAMENTO
BIRITIBA MIRIM-S.P.
JACAREÍ-SJ».
PURinCAÇAO

IDENTinCAÇAO

TESTE PRELIMINAR DE CRESCIMENTO EM MEIO DE CULTURA DE


SUSPENSÃO DE MATERIAIS DE CONSTRUÇÃO

* Ensaios efetuados com suspensão aquosa da amostra(1:10)


** Ensaios efetuados com inoculação direta da amostra

Figura 13 : Esquema geral apresemando a procedência das amostras analisadas e as etapas


dos experimentos efetuados

39
3.2.2.1. Concreto do reservatório de água do Instituto Butantan
O estudo-de-caso, n o qual se realizou o teste d o s t u b o s múltiplos para obtenção do
número mais provável de Thiobacillus, contagem de bactérias heterotróficas e fimgos, foi
efemado sobre o concreto de u m reservatório de água construído na década de 1970. Este
reservatório está situado próximo à Cidade Universitária A r m a n d o de Salles Olheira, e
pertence ao Instituto Butantan - São Paulo. O aspecto geral da estrutura de concreto pode
ser observado na Figiu-a 14 .

Figura 14; Estrutura geral d o reservatório de água do Instituto Butantan, São Paulo

Várias regiões d o concreto deste reservatório de água apresentavam danos


agrupados conforme caracteristicas distintas:
• Fissuras na junta de concretagein, c o m vazamento de água e acúmulo de
eflorescencia constituída de carbonatos.
• Expansão do concreto na região da armadura corroída.
• C o r r o s ã o da annadura em região c o m vazamento e lixiviação de produto
ferruginoso.

40
F o r a m coletadas amostras de eflorescencia, abaixo da junta de concretagem, amostra
do concreto c o m corrosão da annadura e amostra de solo em c o n t a t o com a base da
estmtura do concreto. A s características das amostras coletadas estão apresentadas na
Tabela 4 .

Tabela 4 : Características das amostras coletadas, para análise microbiológica, da estrutura


de concreto d o reservatório de água d o Instituto Butantan

Amostra Código Característica da Aspecto macroscópico


amostra

Eflorescencia Cl Região apresentando Úmida, p o r o s a ,


(calcita) eflorescencia por c o m colonização aparente por
vazamento de água microrgamsmos,
coloração amarelada e esverdeada

Concreto C.2 Concreto deteriorado Concreto expandido, seco,


com corrosão com corrosão da quebradiço,
da armadura armadura exposta colonização aparente p o r fimgos,
coloração verde-escuro

Solo em C.3 Solo em contato Solo aparentemente seco


contato com a base da estrutura com acúmulo de eflorescencia
com o concreto de concreto deteriorado proveniente da lixiviação da
bases da estrutura de concreto

Uma das regiões com fissura na junta de concretagem é apresentada na Figura 15


Abaixo da fissura ocorre a ft)rmação de uma camada de eflorescência,onde ocorre
vazamento de água. A Figura 16 mostra um detalhe da região apresentando eflorescéncia.

41

COf/iILCÄC í.::.a.,-. l . .F^CRGIA NüCLEAn./SF ^ 1F£S


Figura 15 . Fissura na junta de concretagem, abaixo da qual ocorre vazamento de água com
formação de eflorescencia por evaporação da água de Ibdviação- reserv atório de água do
Instimto Butantan, São Paulo.

Figura. 16 : Detalhe da região do concreto apresentando eflorescencia - reservatório de água


do Insthuto Butantan, São Paulo

42
A Figura 17 evidencia, em detalhe, u m a região onde o c o r r e fissura. A fiiixa
esbranquiçada, acima da fissura, mostra acúmulo de eflorescencia sem lunidade aparente. A
faixa esverdeada, abaixo da fissura, apresenta-se c o m vazamento de água, onde a
eflorescencia possui uma consistência gelatinosa e aspecto arenoso; causando a inq)ressão
da ocorrência de colonização por microrganismos

Figura. 17 : Detalhe de uma região da fissura na junta de concretagem -

reservatório de água do Instituto Butantan, São Paulo

As Figuras 18 e 19 mostram, respectivamente, uma região do concreto com corrosão da


armadura e a base do concreto em contato com o solo

43
Figura 18 : Detalhe da região apresentando concreto com corrosão da armadura exposta-
reservatório de água do Intituto Butantan, São Paulo

Figura 19 : Base do r e s e n a t ó r i o assentado diretamente sobre o solo- reservatório de água


do Intituto Butantan, São Paulo

44
3.2.2.2. Amostras coletadas do ambiente construido

Para a realização de testes qualitativos p r e s u n t i v o s , q u e indiquem presença de

Thiobacillus n o ambiente construido, coletou-se a m o s t r a s relacionadas com o concreto, de

natxueza diversa, e m localidades distintas. F o r a m c o l e t a d a s a m o s t r a s de lodo em c o n t a t o

c o m o c o n c r e t o , eflorescencia, concreto e cano d e ferro a p r e s e n t a n d o corrosão evidente. A s

amostras coletadas, c o m sua procedência e características m a c r o s c ó p i c a s são apresentadas

na Tabela 5 .

Tabela 5 : Características das amostras c o l e t a d a s d o a m b i e n t e construído de localidades

distintas
Amostra Código Características Procedência

Lodo em contato com viga C.4 Coloração ocre-alaranjado, ETA


de ferro com corrosão do Riacho Grande
consistência gelatinosa
evidente (São Bernardo do Campo- S-P)

Lodo em contato com o C.5 Semelhante à amostra anterior ETA


concreto em deterioração do Riacho Grande
(Sào Bernardo do Campo- S-P)

Lodo de fundo C.6 Semelhante à amostra anterior, ETA


do decantador coletada do fundo do decantador do Riacho Grande
(São Bernardo do Campo- S-P)

Brita graúda com C.7 Amostra parcialmente recoberta Captador de água bmta
concreto por limbo escuro da represa de Guarapi ranga
(São Paulo - S P )

Concreto C.8 Semellhante à anterior Captador de água bruta


da represa de Guarapi ranga
(São Paulo - S P . )

Raspado do concreto C.9 Semellhante à anterior Captador de água bruta


da represa de Guarapi ranga
(São Paulo - S P )

Estalactite por CIO Incrustração calcárea Piscina do CEPEUSP


eflorescencia no concreto na forma de estalactites
Cidade Universitária
da parede de concreto de uma
(São Paulo - S P . )
piscma olímpica

Cano de ferro Cll Amostra com corrosão severa Piscina do CEPEUSP


recoberta por eflorescencia da
Cidade Universitária
lixiviação do concreto
(São Paulo - S P )

E T A = Estação d e t r a t a m e n t o de água

C E P E U S P = Conjunto de práticas esportivas da Universidade de São Paulo.

45
3.2.2.3. Amostras de areias para construção civil

Areias de diferentes p r o c e d e n c i a s foram coletadas para o teste presmitivo qualitativo


para Thiobacillus. A p r o c e d ê n c i a e as características das amostras estão descritas na Tabela
6.

Tabela 6 : Características d a s a m o s t r a s de areias procedentes de Biritiba Mirim, Jacareí e

Itaquaquecemba

Amostra Código Característica Procedência

Areia bruta A.l Areia antes da lavagem, Biritiba Mirim - S P .


coletada de uma região interna do monte
(no Setor de areias do IPT)
Areia bruta A.2 Areia antes da lavagem, Biritiba Mirim - S P .
coletada de uma região externa do monte
(Setor de areias do IPT)

Areia lavada A.3 Areia lavada, ainda molhada, Biritiba Mirim - S P .


coletada em contato com o chão de concreto
(Setor de areias do IPT)
Areia lavada A.4 -Areia lavada, ainda molhada, Biritiba Mirim - S P .
coletada de uma região superior do monte
(Setor de Areias do IPT)
Areia lavada A.5 Areia lavada, seca, coletada após secagem Biritiba Mirim - S P .
de uma região superior do monte,
(Setor de areias do IPT)
Areia úmida A.6 Areia com umidade de chuva Jacareí - S P ,
coletada na região superior do monte
(depósito a céu aberto no IPEN)
Areia A.7 Areia com umidade de chuva, Jacarei - S P .
molhada coletada do interior do monte
(de depósito a céu aberto no IPEN)
Areia A.8 Areia encharcada com água de chuva, Jacareí - S P .
Molhada em contato com o solo,
(depósito a céu aberto no IPEN)
Areia do Porto A.9 Areia final do porto, Itaquaquecetuba - S P .
coletada de um monte pronto para distribuição
do porto de areia de Itaquaquecetuba
Arenito A.IO Arenito cimentado por sulfetos, Itaquaquecetuba - S P .
coletado de uma região rica em pirita
do porto de areia de Itaquaquecetuba

O objetivo de investigar a presença de Thiobacillus nas areias é obserxar se estas,


enquanto materiais de c o n s t r u ç ã o , permitem a proliferação destas bactérias. E importante
considerar que as amostras p r o c e d e n t e s de Biritiba Mirim foram coletadas no Setor de areias

46

COMISCAD I - A l . C K / . . N E R 6 I A N U C L E A R / S P • IPE®
do IPT e as amostras de Jacareí foram coletadas em depósito no IPEN, enquanto as
amostras de Itaquaquecetuba foram coletadas diretamente do porto.

3.2.3. Coleta e preservação das amostras:

3.2.3.1. Coleta das amostras

As amostras foram coletadas cuidadosamente com espátulas e recipientes,


previamente esterilizados em autoclave a vapor, á t e n ^ e t a r u r a de l l l ^ C ' durante 15
minutos, tendo-se o cuidado de utilizar u m a espátula para cada amostra diferente.

3.2.3.2. Preservação das amostras

As amostras foram inoculadas, n o s respectivos meios de cultura, n o m e s m o dia da


coleta. A única amostra de areia não processada no mesmo dia, foi mantida e m geladeira p o r
u m período de cinco dias; neste caso, efetuou-se teste qualitativo para Thiobacillus.

3.3. Métodos

3.3.1. Análise microbiológica realizada em estudo-de-caso

A análise microbiológica foi realizada em estudo-de-caso. na qual quantificou-se,


por teste presuntrvo, alguns tipos de microganismos. Este estudo foi efetuado n o concreto
aparente do reservatório de água do Instituto Butantan, S.P. Foram coletadas amostras de
concreto com corrosão da armadura, eflorescencia e solo em contato com a base da
estrutura de concreto, conforme descrito na Tabela 4. Para obter-se informações sobre a
microbiota deste concreto, detenninou-se o n ú m e r o mais provável ( N M P ) de Thiobacillus,
a contagem de bactérias heterotróficas e fimgos. Realizou-se também um teste quahtativo
para bactérias redutoras de sulfato.

47
3.3.1.1. Técnica dos tubos múltiplos para determinação do número mais
provável (NMP) de Thiobacillus

O número mais provável ( N M P ) de Thiobacillus foi determinado pela técnica d o s


tubos múltiplos. Esta técnica foi aplicada conforme a Norma Técnica CETESB
L5.217/1991(21).

Para a determinação do N M P de T.thioparus utilizou-se o meio de Postgate


modificado para T.thioparus; para d e t e m ú n a ç ã o d o N M P de T.thiooxidans, o meio de
Postgate modificado para T. thiooxidans e para a determinação do N M P de T.ferrooxidam,
o meio 9K modificado para T.ferroxidam.

Na tentativa de investigar a presença de cepas anaerobias de Thiobacillus utilizou-se


o meio de Postgate modificado para T.thioparus, adicionando-se a este 2 g /L de nitrato de
potássio, 1 g/L de bicarbonato de sódio e uma gota de ácido sulfiirico 0,5 molar para cada
10 mL de meio de cultura. Esta adaptação foi efetuada com base no meio utilizado p o r
T A Y L O R e colaboradores

Somente as amostras inoculadas para investigação de Thiobacillus anaeróbios foram


incubadas em anaerobiose, as demais foram incubadas e m aerobiose.

A Tabela 7 ilustra a reação principal que ocorre em cada meio de cultura, c o m o


conseqüência do metabolismo da bactéria a ser selecionada neste meio seletivo, q u e resulta
em uma mudança visual observável, através da qual constata-se a indicação do crescimento
de uma determinada espécie de Thiobacillus. A s reações completas, c o m o balanço
estequiométrico, encontram-se na Tabela 1 .

48
Meio de cultura Espécie de Reação Indicação de
Thiobacillus crescimentol

Postgate modificado T. thioparus S2O3 2- -> H2SO42- Viragem do indicador


com vermelho de fenol vermelho -> amarelo

Postgate modificado T.thioxidans S2O32- -> H2SO42- Viragem do indicador


com verde de verde -> amarelo
bromocresol

Meio 9 K T.ferrooxidans Fe2+ -> Fe3+ Oxidação do Fe2"'"


com FeS04 Verde -> laranja

Meio de Postgate T.denitrißcans S2O3 2- -> H2SO42- viragem do indicador


modificado com KNO3 vermelho -> amarelo
e NaHCCp-

F u n d a m e n t o da técnica:

Esta técnica baseia-se n o principio de que as bactérias presentes em uma amostra


p o d e m ser separadas umas das outras p o r agitação, resultando em uma suspensão d e células
bacterianas indKdduais. A dUuição sucessKa da amostra leva ao ponto de extinção, ou seja,
atinge-se uma determinada diluição a partir da qual não há mais bactérias. O N M P obtido
pela técnica dos tubos míihiplos é resultante de uma anáhse estatística baseada na
distribuição de Poisson ( " ^

Neste caso, utUizaram-se cinco t u b o s para cada diluição, sendo q u e cada tubo é
marcado simplesmente como positKo ou negativo, não sendo necessário pesquisar o n ú m e r o
de microrganismos em cada tubo positivo. A combmação de resuhados positivos e negativos
da etapa de diluição, antes da extmção, é utilizada em conexão com tabelas estatísticas
apropriadas (como por exemplo a Tabela 8 ) para obter a contagem de bactérias viáveis.

A Tabela 8 apresenta os índices de N M P para várias combinações de r e s u h a d o s


positivos e negativos quando são utihzados inóculos de 10 mL, ImL e 0,1 m L em séries de
cinco tubos.

49
Procedimento da técnica

P o r tratar-se de amostras sólidas e semi-sólidas, efetuou-se inicialmente uma


suspensão de cada amostra em água destilada estéril em uma p r o p o r ç ã o 1:10 (massa de
amostra : v o l u m e de água).

A suspensão foi homogeneizada e submetida a uma agitação de 200 r p m durante 30


min. U m milihtro desta suspensão corresponde a 0,1 g da amostra.

Para a inoculação n o s meios de concentração dupla, foram utilizados 10 m L desta


suspensão, enquanto que para os meios de concentração simples utilizaram-se I m L e
submúltiplos de I m L . (moculando-se 1 m L das diluições sucessivas efetuadas a partir desta
suspensão, utilizando-se o fator 10 de diluição)

A Figura 20 apresenta um esquema geral de procedimento para a execução da


técnica d o s t u b o s múUiplos. Os detalhes operacionais para o p r o c e d i m e n t o desta técnica
p o d e m ser encontrados na referência 2 1 .

50
l O m L e m cada t u b o * *

TTTTl
M 10
1)

T
Apót a inoculação
_ K incubar à temperatura
de 2 8 t 2 « C
durante 21 dias

10 mL i
1 mL em cada t u b o *
Após o período de
«#* íncubaçãD. verificar
o número de tubos
positivos e negativos
10-2 e aplicar a Tabela 8

10mL|,

n-ésjma diluição
1 mL em cada tubo*

10

1] Amostra
2) Água destilada estéril
3) Suspensão 1:10 da amostra em égua destilada estéril
após agitação de 200 rpm por 30 min.

» Tubo contendo 10 mL (concentração simples)


de meio líquido de cultura seletivo para cada espécie

Tubo contendo 10 mL (concentração dupla]


de meio líquido de cultura seletivo para cada espécie

« * • Frasco contendo 90 mL de égua de diluição

Figura 20 : Esquema geral para o procediiuento da técnica d o s tubos múltiplos.

51
Tabela 8 : índice de N M P e limites de confiança de 9 5 % , quando são utilizados inóculos de
10 mL, I m L e 0,1 m L em séries de cinco tubos^^l)
Índice de Liniilrs de conflança de
Número de tubos com reação positiva quando sao inoculados , em NMP/lOOniL 95%
séries de cincotubos, i n t u i o s de
10 mL ImL 0.1 mL Inferior Superior
0 0 0 <2 -
0 0 1 2 <1 10
0 1 0 2 <1 10
0 2 0 4 <1 13
a 0 2 <1 11
a I 4 1 15
j( 4 0 4 1 15
f 1 1 6 2 18
l 2 0 6 2 18
0 0 4 1 17
j 0 1 7 2 20
j 1 0 7 2 21
I 1 9 3 24
2 2 ü 9 3 25
2 J u 12 5 29
3 0 0 8 3 24
3 0 1 11 4 29
3 1 0 11 4 25
1 1 14 6 35
3 2 0 14 6 35
3 2 1 17 7 40
4 0 13 5 38
4 »0 1 17 7 45
4 1 0 17 7 46
4 1 1 21 9 55
4 1 2 26 12 63
4 2 a 22 9 56
4 2 1 • 26 12 65
4 3 0 27 12 67
4 3 1 33 15 77
4 4 0 34 16 80
ü 0 23 9 86
5 0 1 30 10 110
0 2 40 20 140
1 0 30 10 120
5 1 1 50 20 150
5 1 2 6(1 30 180
5 5(1 20 170
2
2 I
0 7Ü 3(1 210
2 2 90 40 25(1
3 0 8(1 3(1 250
5 3 1 IlU 4U 300
5 3 2 140 60 360
s 3 3 170 80 410
4 0 130 50 390
5 4 1 170 70 480
5 4 2 220 10(1 580
5 4 3 28U 120 690
5 4 4' 350 160 820
S 5 0 240 100 940
5 5 I 300 100 1300
5 5 2 500 200 2000
5 5 .3 900 30(1 2900
5 5 4 1600 60U 5300
5 5 5 >U)00 - -

52

Le LívthGIÀ fâ'CLEÂR/SF - IPÊS


Interpretação dos resultados:

O N M P foi obtido através de tabelas, em que são d a d o s os limites de confiança de


95 % para cada valor determinado. O N M P de Thiobacillus foi expresso p o r 100 g d e
amostra seca.

A Tabela 8 apresenta o N M P para várias combinações de resultados positivos e


negativos, q u a n d o são inoculadas cinco porções de 10 m L , cinco p o r ç õ e s de 1 m L e cinco
p o r ç õ e s de 0,1 m L da amostra.

Q u a n d o são inoculados mais de três volumes decimais ( c o m o n e s t e caso, onde


inoculou-se volumes de 1 0 ° a 10"^ m L da suspensão da amostra em água destilada estéril),
utiliza-se para a composição do código, apenas os resultados positivos c o r r e s p o n d e n t e s a
três séries consecutivas inoculadas.

O primeiro algarismo escolhido para c o r t ç o r o código é o c o r r e s p o n d e n t e à série de


menor volume da amostra (maior diluição) em que t o d o s os t u b o s apresentaram r e s u h a d o s
poshivos, desde que t e n h a m sido inoculadas diluições subsequentes para totalizar os três
algarismos para c o m p o r o código. Encontrando-se o código na Tabela 8 e o N M P a ele
correspondente, o valor final do N M P é obtido através da fórmula:

Onde:

índice de N M P = valor do indice de N M P encontrado na Tabela 8 , correspondente


ao código

M V l = maior volume inoculado selecionado para c o m p o r o código

Cada amostra p o d e apresentar u m teor de umidade diferente; p o r essa razão,


expressou-se o resultado d o N M P por 100 gramas de massa seca.

53
3.3.1.2. Ensaios complementares à análise microbiológica quantitativa

Para auxiliar a interpretação d o s resultados da análise microbiológica quantitativa,


nas amostras de c o n c r e t o , solo e eflorescencia do concreto d o reservatório de água do
Instituto Butantan, f o r a m realizados dois ensaios c o n ç l e m e n t a r e s :

• D e t e r m i n a ç ã o do p H na suspensão da amostra. A medida foi efetuada


diretamente da suspensão, após agitação de 2 0 0 rpm, p o r 30 min. Esta
medida é imqjortante para observar se o p H da amostra p o d e influenciar a
espécie d e Thiobacillus encontrada;

• D e t e r m i n a ç ã o da massa seca da amostra. Esta determinação é importante


para se expressar o N M P de Thiobacillus p o r lOOg de amostra seca. Para
que o s d a d o s p o s s a m ser comparados, contagem de bactérias heterotróficas e
fimgos t a m b é m foi expressa por 100 g de amostra seca.

Para a determinação da massa seca de amostra , p e s o u - s e u m a p o r ç ã o h o m o g ê n e a da


amostra, em uma cápsula d e porcelana, previamente seca. E m seguida, colocou-se a cápsula
com a amostra em estxxfa a 105 ± 2^C p o r 15 horas, para ehminação da umidade. A o final
do tratamento térmico o conjxmto foi esfiiado, em dessecador, até atingir massa constante
anotando-se a massa encontrada. O valor porcentual do resíduo é obtido através da
expressão:

M2XIOO

ML

P = p o r c e n t a g e m da amostra seca em relação à amostra úmida


M ] = massa inicial da amostra úmida (g)
M 2 = massa final da amostra seca(g)

A umidade da amostra, em porcentagem, foi obtida através da diferença entre a


massa micial e a massa final da amostra.

3.3.1.3. C o n t a g e m e m placas de bactérias heterotróficas

A detenninação da concentração de bactérias heterotróficas, em uma amostra,


baseia-se no princípio de que, definindo-se condições de nutrição, temperatura e tempo de
incubação, as bactérias Naáveis p o d e m se desenvolver nas condições estabelecidas, formando

54
colonias, observáveis a p ó s d e t e r m i n a d o período de incubação. V o l u m e s decimais adequados
da amostra são inocxilados e m p l a c a s de Petri, adicionando-se a seguir o meio sólido Agar
Triptona Extrato de Levedura. A p ó s o período estabelecido para a incubação, é feita a
contagem das imidades f o r m a d o r a s d e colônias (UFC)/ mL c o m o auxílio de m n contador
tipo Quebec ou similar. E s t e m é t o d o foi efetuado conforme critéríos estabelecidos pela
N o r m a Técnica C E T E S B L5.201(22).

A concentração das bactérias é obtida multiplicando-se a média d a s contagens das


colônias por placa, pela diluição utilizada, e o resultado é expresso c o m o número de
unidades formadoras de colônia de bactérías por mL. Como neste caso 1 m L da suspensão
corresponde a 0 , l g da amostra, é necessário corrigir esta diferença e d e p o i s descontar a
umidade da amostra. E m b o r a a contagem de bactérias heterotróficas, a partir de amostras
sóhdas e semi-sóhdas, n o r m a l m e n t e seja expressa em UFC/g de amostra seca, neste caso, foi
adotado como U F C / 1 0 0 g de amostra seca, para que os r e s u h a d o s p u d e s s e m ser
comparados c o m a expressão mais comum para o N M P de Thiobacillus que, e m amostras
ambientais é dado p o r 100 g de amostra seca.

3.3.1.4. Contagem de fungos


A contagem d o s fimgos e m irnia amostra baseia-se no princípio de que, em
condições adequadas de nutrição, temperatura e tempo de mcubação, o s fungos viáveis
presentes, com capacidade de se desenvoKerem nas condições estabelecidas, formam
colônias observáveis após determinado periodo de incubação. Para isto, são inoculados em
placa de Petri, v o l u m e s decimais adequados da amostra , adicionando-se a seguir o meio de
cultura "Agar Sabouraud D e x t r o s e " . Após o periodo de incubação estabelecido, é feita a
contagem das colônias c o m o auxílio de um contador tipo Quebec ou similar. Para a
execução desta técnica utihzou-se o s critérios estabelecidos pela norma Técnica C E T E S B
L5.204 (23).

O resuhado foi expresso c o m o número de colônias de fungos p o r grama de amostra


obtido pela contagem de U F C nas placas em duplicata, calculando-se a média entre as
contagens, e, multiphcando-se o valor encontrado pela diluição utilizada, corrigindo-se o
valor obtido por grama de amostra seca. O resuhado final, neste caso, da mesma forma que
para a contagem de bactérias heterotróficas, foi ex-presso em UFC/lOOg de amostra seca.

55

coMicLAc t.;...;. . u L M h e i A N U C L E A R / S P - IPÊ!


3.3.1.5. Teste qualitativos para bactérias redutoras de sulfato

E s t e teste foi realizado com o objetivo de investigar se a fonte de enxofre reduzido,


para o s Thiobacillus, poderia estar sendo produzida p o r bactérias redutoras de sulfato.

Utilizou-se o meio de Starkey como estabelecido na Norma Técnica CETESB^^O)^


porém n ã o se aplicou a técnica dos tubos múltiplos. Realizou-se u m ensaio qualitativo,
inoculando-se a amostra diretamente n o meio de Starkey em condições de anaerobiose, por
u m p e r í o d o de 21 dias, à t e n ç e r a t u r a de 20OC,

A s bactérias redutoras de sulfato reduzem, e m anaerobiose, o sulfato contido n o


meio de cultura a sulfeto de hidrogênio que, reagindo c o m os ions ferro, formam o sulfeto
férrico, o qual confere coloração negra ao meio. Esta mudança \isual indica a presença de
BRS na amostra.

3.3.2. Composição química da matriz do concreto (estudo-de-caso)

3.3.2.1. Reconstituição de traço

A anáhse química da matriz foi efetuada em duas regiões : uma região seca, sem
vazamento de água, e uma região com vazamento de água. Estas anáhses foram reahzadas
com o objetivo de conseguir-se a reconstituição de t r a ç o destas duas regiões, e tambéin com
o objetKo de observar se este concreto teria, na sua composição, um sulfeto potenciabnente
oxidável pelos Thiobacillus.

E s t a s anáhses químicas foram efemadas pelo Laboratório de Química dos Materiais,


no A g r u p a m e n t o de Materiais de C o n t m ç ã o civü, Di\ásão de Engenharia civil do EPT ,
conforme critérios estabelecidos no Boletim IPT N ^ 25^36)

3.3.2.2. Difração de raios X :

A análise de difração de raios X foi efetuada e interpretada pelo Laboratório de


Difração de raios X do departamento de Mineralogia do Instituto de Geociências da U S P :
com u m difratômetro de raios X URD-6, radiação C u K a , 40kV e 20 mA. As amostras
foram trituradas em granulometria de argila. O objetivo desta anáhse foi observar a
caracteristica da região apresentando eflorescencia.

56
3 . 3 . 3 . Testes presuntivos qualitativos para Thiobacillus

O teste presuntivo qualitativo foi efetuado em amostras de areias destinadas à


construção civil, coletadas de localidades distintas, amostras de lodo em contato com o
concreto de u m a estação de tratamento de água, material superficial raspado do concreto de
u m captador d e água bruta, e em amostra de eflorescencia do concreto de uma piscina
olímpica.

O objetivo da realização deste teste em amostras de natxuezas diferentes e


localidades distintas, foi obter informações a respeito da presença deste gênero de bactérias
no meio ambiente. As.características das amostras coletadas d o ambiente construído estão
descritas na Tabela 5 e as características das amostras de areia estão descrítas na Tabela 6 .

F o r a m utilizados os mesmos meios de cultura aplicados na técnica dos tubos


múltiplos para a determinação do N M P de Thiobacillus. N o teste qualitativo, cada amostra
foi inoculada em duplicata.

3.3.4. Obtenção de cultura pura e identificação de Thiobacillus

Os testes prestmtK'os quantitativos e qualitativos, p o r serem efetuados com meios de


cultura pc-letivos, indicam a presença de uma determinda espécie de Thiobacillus na amostra
analisada. N o entanto, para se identificar a espécie em questão, é necessário direcionar o
isolamento e purificação de uma cepa. Somente com a cepa pura é possível realizar os testes
preliminares para identificação.

Os critérios para a identificação preliminar dos Thiobacillus incluem várias etapas:


• Seleção por passagens sucessivas em meio mineral;
• Isolamento em meio sólido;
• Purificação das cepas isoladas, baseando-se nas caracteristicas morfológicas
d a s bactérias;
• Testes fisiológicos com a cepa pura, incluindo testes de crescimento em meio
de cultura com variação do pH inicial e teste de crescimento em fimção do
tempo; e
• T e s t e s preliminares para a identificação da espécie.

57

'•íllkriJZir • TO
3.3.4.1. Seleção por passagens sucessivas em meio mineral

Partindo-se dos meios inoculados com resultado positivo para os t e s t e s presuntivos,


efetuaram-se 5 repiques sucessKos em meio de líquido de cultiua seletivo para cada espécie.
T o d o s o s ensaios foram realizados temperatura de 2 8 2^C, em aerobiose. UtiUzou-se 5 %
de inoculo e m relação ao volume total de meio de cultma.

Para a seleção de T.thiooxidans da amostra de Itaquaquecetuba utilizou-se o meio


líquido 9 K - S ° , sob agitação de 300 rpm, durante lun período de 15 dias p a r a cada repique.
A indicação d o crescimento foi observada pela diminuição do p H n o meio líquido ( p H inicial
= 2,8 e p H final < 1,0). Para a amostra de Biritiba Mirim foi utilizado o meio líquido de
Postgate modificado para T.thiooxidans em condições estáticas.

Para a seleção de T.ferrooxidans, utilizou se o meio líquido 9K-Fe2+sob agitação de


300 r p m p o r u m periodo de 5 dias para cada repique. Q u a n d o o meio de cultura apresentou
radicação de Fe^^, por mudança de coloração com o aparecimento de precipitado
alaranjado, em menor t e n ç o , o periodo de incubação, para cada repique, foi diminuído para
3 e 2 dias.

Para a seleção de T.thioparus utilizou-se o meio líquido de P o s t g a t e modificado para


T.thioparus sob condições estáticas, p o r um periodo de incubação de 15 dias para cada
repique.

Este procedimento em meio seletivo por diluição do inoculo inicial, foi uma etapa
efetuada antes do isolamento em meio sólido. Esta técnica permitiu selecionar p o r pressão
seletiva, as bactérias que foram capazes de crescer n o s meios líquidos de cultura adequados
para cada espécie de Thiobacillus

A diluição sucessiva do inoculo inicial possibilitou a diminuição da concentração de


c o m p o s t o s químicos trazidos pela amostra. Portanto, este procedimento inibiu a proliferação
de o u t r o s microrganismos que pudessem estar nutrindo-se destes c o m p o s t o s .

3.3.4.2. Isolamento das colônias em meio sólido seletivo

O isolamento em meio sólido de cultura foi efetuado após o 5 ° repique da etapa de


enriquecimento por diluição. Foram utilizados os seguintes meios sólidos;

• Meio sólido ATCC 238 Tiossulfato-agar (7". thiooxidans);

• Meio sólido de Postgate modificado para T. thiooxidans (T thiooxidans);

58
• M e i o sólido de Postgate modificado para T.thioparus {T.thioparus); e

• M e i o 9K- Fe 2+ com agarose c o m o agente solidificante {T.ferrooxidam).

A agarose ío\ usada c o m o agente solidificante n o meio de 9K- Fe 2+ p o r q u e segxmdo


G A R C I A JR(3^) a espécie T.ferrooxidam sofre inibição p o r c o m p o s t o s orgânicos d o agar.

O s ÍDÓculos líquidos fiaram plaqueados, na fi)rma d e estria, sobre os meios sólidos


respectivos p a r a cada espécie. A p ó s a obtenção d e colônias isoladas iniciou-se a etapa de
purificação d a s culturas.

3.3.4.3. Purificação das culturas a partir de colônias isoladas

A purificação das culturas foi feita n o s m e s m o s m e i o s sólidos utilizados para a


obtenção das colônias isoladas.

As colônias isoladas foram replaqueadas n o s m e i o s sólidos seletivos para cada


espécie. A partir desta cultura observaram-se duas condições:

• A s caracteristicas macromorfológicas das colônias; e

• A s caracteristicas micromorfológicas das culturas.

S o m e n t e as culturas constimídas de colônias de bacilos Gram-negativos foram


mantidos para prosseguir na obtenção de cepa pura. Para garantir a pureza da cepa, uma
colónia da primeira placa foi semeada em uma segunda placa, do mesmo meio. Uma destas
colônias isoladas foi inoculada em meios líquidos seletKos, para realização de testes
fisiológicos e m diferentes valores de pH, testes de crescimento em fimção do t e m p o e os
testes preliminares de identificação. A Figura 21 mostra u m esquema do procedimento para
obtenção de colônias isoladas e cultura pura de Thiobacillus.

59
AMOSTRA
i
T E S T E S P R E S U N T I V O S POSITIVOS

TÉCNICA DE E N R I Q U E C I M E N T O P O R D I L U I Ç Ã O
[ 5 repiques s u c e s s i v o s e m m e i o líquido s e l e t i v o )

4.
r.tfiiooxidans r.tMoparus
- 9K-S°
r.ferrooxfdans P o s t g a t e modificado
— Postgate modificado 9 K Fe 2 * r.tMoparus
p/ T.thiooxidans
4.
ISOLAMENTO E M MEIO SÓLIDO SELETIVO

4.
T.thíoax/dans
^^^^ „ . T.ferroaxf'ífans r.tñ/oparus
• ATCC 2 3 8 T i o s s u l f a t o -Agar j ^ , ^ P o s t g a t e modificado
• P o s t g a t e s o l i d o p / r . ittiooxidans ^ir.thioparus

COLÔNIAS ISOLADAS

COLORAÇÃO D E G R A M
EXAME MICROSCÕPICO

BACILOS G R A M - N E G A T I V O S

S E M E A R E M M E I O S S Ó L I D O S SELETIVOS PARA O B T E N Ç Ã O
DE C U L T U R A P U R A

4^
CULTURA PURA

TESTES PRELIMINARES DE IDENTIFICAÇÃO

Figura 21 : Esquema do procedimento para isolamento e purificação d o s testes presuntivos


positivos para Thiobacillus

60
3.3.4.4. Testes com os isolados em meios de cultura com variação do pH
inicial.

Para confirmar o c o m p o r t a m e n t o acidofílico o u neutrofílico de algumas cepas


isoladas, efetuou-se o crescimento d a s m e s m a s , e m condições de temperatura e oxigenação
adequadas, p o r é m alterando-se o p H d o meio d e cultura. Utilizou-se o s meios de P o s t g a t e
modificado para T.thioparaus, meio de P o s t g a t e modificado para T.thiooxidans, meio
A T C C 2 3 8 contendo 1% de enxofre elementar ( e m p H = 4 , 5 ) , uma adaptação d o meio A T C C
238 c o m p H inicial = 12, meio A T C C c o n t e n d o 0 , 5 % d e tiossulfato de sódio (em p H = 7 , 5 ) e
meios sólidos S 6 e S5.

3.3.4.5. Cun/a de crescimento

A s cepas neutrofilicas isoladas apresentaram indicação do crescimento, c o m viragem


do indicador ácido-base, após d u a s semanas d e incubação. U m conjunto de testes
preliminares(35) para identificação de Thiobacillus sugerem algumas condições padronizadas
para o ensaio.

U m a destas condições é d e q u e a cepa purificada, a ser identificada, deve ser


incubada e m meio liquido S 6 (neutrofilicas) ou S5(acidofilicas), durante três dias, para s e m r
c o m o inoculo n o s vários testes para identificação. Para observar se este inoculo estaria c o m
uma concentração significativa de Thiobacillus, efetuou-se u m estudo do crescimento, de
cinco cepas neutrofilicas e uma cepa acidofilica, e m fimção do tempo de incubação (dias). O
crescimento foi acompanhado pela c o n t a g e m de U F C n o s respectivos meios sóhdos. O s
testes foram efetuados em duphcata e observados p o r u m periodo de 7 dias de iacubação.

3.3.4.6. Testes preliminares para identificação de Thiobacillus

Nos testes preluninares para identificação d e Thiobacillus selecionados p o r


H U T C H I N S O N e colaboradores^^^)^ foram utilizados dois tipos de meios como base para as
variações d e outros meios ( 8 7 , S 8 , SO + 6 % d e t i o s s u l f a t o , S6/S5 + 4 % d e fosfato, S 6 / S 5
+ 5 % d e c l o r e t o d o sódio S 6 / S 5 + 1 % d e enxofre) necessários para a identificação:

• Meio S6 ( p H micial 6,6) para as cepas neutrofíhcas; e

• Meio S5(pH inicial = 5,0) para as cepas acidofihcas.

O Anexo II descreve o procedimento e a fórmula para a elaboração de t o d o s o s


meios d e cultura necessários para o s testes de identificação.

61

C:CI^!::£C i.¿v.,LU'. U LNCF-GiA NUCLEAR/SP - !PE&


Inoculo: Utilizou-se 0,02 m L de cada cultura pura a p ó s três dias de incubação em
meio b'quido S6(neutrofílicas) ou S5(acidofilicas) em condições padronizadas. A s condições
foram padronizadas para 10 mL de meio de ctiltura liquido, em frasco de vidro Pyrex com
capacidade para 100 m L e diâmetro de 5cm, o que permite maior uniformidade na
oxigenação do meio do que em t u b o de ensaio. O s testes foram realizados à temperatura de
2 8 +2^C e em condições estáticas de aerobiose.

O s testes para Thiobacillus denitrificans foram efetuados em tubo de ensaio com 10


m L de meio de cultina líqtiido S8 e com o tubo de Diu"ham n o seu interior. Manteve-se o
mesmo período de incubação, p o r é m em condições anaeróbias.

Os testes para observar inibição do crescimento em meios líquidos com fosfato e


com cloreto de sódio, foram analisados p o r microscopia direta, examinando-se a motilidade
em gota pendente, pois todas as cepas apresentaram-se móveis em meio líquido.
Paralelamente, efetuou-se o plaqueamento em meio sólido S6 ou S5 para confirmação do
teste.

N ã o foi observada a oxidação do tiocianato n o meio S 7 , mas apenas a presença ou


ausência de crescimento das bactérias neste meio sólido.

O teste n o meio de cultura contendo ditionato não foi efetuado. T o d o s os testes


foram realizados em dupUcata c o m controle sem inoculo para t o d o s os meios testados.

A porcentagem de oxidação de tiossulfato foi analisada por iodometria,


quantificando-se o iodo consumido pelo tiossulfato remanescente no meio de cultura após o
periodo de incubação estabelecido(^^).

A Figura 22 esquematiza o preparo do inoculo e os testes necessários para a


identificação dos isolados em estudo.

A Tabela 9 apresenta os testes p r o p o s t o s p o r HUTCHINSON(35).^ onde o autor


descreve os meios utilizados, os critérios para avaliação, os g r u p o s e a espécie que melhor
representa cada g m p o .

62
CEPA PURA

INCUÇAÇAO
EU MEIO LIQUIDO
(2Í°C-3DIAS)

MEI0S6 MEIO S5
(NEUTROííUCAS) (AcmoniiCAS)

INOCUIO
1
estria com alça 0,02 mL
de platina

MEIOS SOLIDOS MEIQS LÍQUIDOS


• S6/S5
• S8 SÕUDO .SO + 6%Na2S2P3
(ANAEROBIOSE)
• S6«5 + 4 % p q 3 -
• S7 SÓUDO
.S6/55 + 5%Naa
• AGAR NUTRIENTE
. S6/S5 + S«
• AGAR CITRATO
• » LIQUIDO
.AGAR TIOSSULFATO (ANAEROBIOSE)
• 9 K - F e 2+

I^«:UBAÇÃO À TEMPERATURA DE 2 ^
DURANTE 28 DIAS

AVALIAR OS RESULTADOS E COMPARAR


COM A TABELA 9

Figura 2 2 : Esquematização do procedimento para o p r e p a r o do inoculo e d o s t e s t e s para a

identificação d o s Thiobacillus.

63
¡i.

Tabela 9 : Testes preliminares para identificação de Thiobacillus ( H U T C H I N S O N e colaboradores^^^) )


Espécie A B C D E F G H I
Grupo 0 la 1 2 3 4 5 6 7
Meio de cultura Critério de avaliação
86 /86 p H final >6,6 6,5-5,0 6,6-5,0 6,6-5,0 6,6-3,5 3,5-2,8 <2,0 <2,0 >2,0-<2,8
86/85 Oxidação do <90% <50% <30% <90% >90% >90% >90% >90 >90%
tiossulfato %
SO + 6 % Oxidação do <10% <10% <10% <10% <10% >10% >10% <10 <10%
tiossulfato tiossulfato %
86 / 85 + 4 % Inibição +/- + + + + -f- +
- -
fosfato
86/ 85 Inibição + + + + + - + +
+ 5 % NaCl
Enxofre p H fínal s/c 6,1-6,25 s/c 5,15- 4,6-4,1 3,2-2,8 <2,0 <2,0 >2,0-<2,8
88 Crescimento + + - + +/- - - - -
Anaerobiose F o r m a ç ã o d e gás - - - + - - - - -
S7 Oxidação do - - - + + - - - -
tiocianato
_ _ +
M e i o comFe^"*" O x i d a ç ã o d e Fe^"*"
Agar nutriente Crescimento + + + - - - - +
Citrato Crescimento + - - - - - - - -1-
A g a r tiossulfato D e p o s i ç ã o d e 8** - - + + + + -1-
Onde: A= tipo "trautweinii"; B= g m p o la; C = T.tiovellus; D= T.denitrifwans; E= T.thiopants; F= T.neapolitanus; G T.thiooxidans;
\\=T.fenooxidatis; \= T.intermedius.
Símbolos :s/c= sem crescimento
+ = > 90 % das linagens são positivas
- = >90 % das linhagens são negativas
3.3.5. Teste qualitativo para crescimento de cepas de isoladas em meios de
cultura de suspensões de materiais de construção

Este teste foi desenvolvido para se obter informações preliminares sobre a


capacidade das cepas isoladas conseguirem utilizar, para o seu crescimento, n u t n e n t e s d o s
próprios materiais de c o n s t m ç ã o . N e s t e caso, especificamente, aqueles contendo escória
granulada de alto-fomo ( c o m sulfeto d e cálcio e m sua composição).

Foram elaborados dois tipos de meios de culttira sólidos, imi contendo


exclusivamente escória granulada de alto-fomo c o m o nutriente e o outro c o m a matriz d e
concreto analisado em estudo-de-caso.

O meio sólido c o m a matriz d o cimento hidratado foi desenvolvido c o m mtuito


especulativo de observar se uma cepa isolada de sua superficie, exposta ao ambiente, é
capaz de crescer em u m meio contendo luna suspensão desta matriz como nutriente. N e s t e
caso, a amostra utilizada como substrato, foi coletada d o concreto d o reservatório d e água
do Instituto Butantan.

3.3.5.1. Meio de cultura sólido contendo escória granulada de alto-


-forno(COSIPA)
Para observar se os Thiobacillus isolados poderiam crescer utüizando somente o s
nutrientes contidos na escória granulada de alto-forao, idealizou-se u m meio de cultura
sólido com a seguinte formulação:

Escória granulada de aho-forao 200g

Agarose (grau eletroforese) 5g

Agua destilada - lOOOmL

Para o preparo deste meio foram esterilizados em frascos separados : 1) a escória na


forma de p ó , 2) 800 m L de água destilada, 3) a agarose dissolvida em 200 m L de água
destilada. Autoclavou-se durante 30 minutos, á teu^jeratura de 121±2.0C Após a
esterilização, adicionou-se o s 800 m L de água na escória e a g h o u - s e Nigorosamente.
Posteriormente, acrescentou-se a agarose dissolvida (este procedimento deve ser efetuado
antes que a agarose atinja seu p o n t o de solidificação). A mistura final foi distribuida em
frações de cerca de 20 m L em placas de Petri, previamente esterilizadas. A preparação d o

65
meio e a distribuição em placas foram efetuadas em fluxo laminar, p a r a evitar a
' contaminação p o r microrganismos indesejáveis.

3.3.5.2. Análise química da escória granulada de alto-forno utilizada como


! substrato em meio sólido de cultura.
*

Esta escória foi gentilmente d o a d a pelo Laboratório de Química d o s Materiais de


Construção d o A g r u p a m e n t o d e Materiais de Construção Civil do I P T . A s análises
químicas foram efetuadas conforme o s m é d o t o s descritos a seguir:

• Determinação d o resíduo insolúvel (escória) : método desacrito na N B R


5744/89C4);
• Anidrido silícico ( e s c ó r i a ) : m é t o d o descrito na N B R 5742/77(3);
• Oxido férrico ( e s c ó r i a ) : m é t o d o descrito na N B R 5742/77(3);
• Óxido de cálcio ( e s c ó r i a ) : m é t o d o descrito na N B R 8347/91(^);
• Nitrogênio total : m é t o d o semi-automático para determinação de Nitrogênio
total pelo m é t o d o Kjeldahl(24);
• Fósforo total : m é t o d o semi-automático para determinação de fósforo
tOtal(25);

• Anidrido sulfúrico : m é t o d o descrito na N B R 5745/89(^);


• Sulfeto : m é t o d o descrito p o r Voinovitch^^^^;
• Óxido de titânio : m é t o d o descrito por VogueK^^);

A Tabela 10 apresenta a c o m p o s i ç ã o química da escória granulada de alto-fomo


utilizada c o m o substrato do meio sóbdo de cultura.

66
Tabela 10 : Composição quimica da escoria granulada de alto-forao (COSIPA)
Determinações (%)
Resíduo insoiúvel (RI) 2,00
Anidrido silícico (SÍO2) 35,02
Oxido de aluminio (AI2O3) 11,32
Oxido de cálcio ( C a O ) 43,07
Oxido d e magnesio ( M g O ) 5,97
Oxido de ferro ÇÍZ-^ÒT^ 0,03
Oxido de m a n g a n ê s ( M n 2 0 3 ) 0,72
Dióxido de titanio (TÍO2) 0,43
Oxido de sódio ( N a 2 0 ) 0,15
Óxido de potássio (K2O) 0,44
Sulfeto ( S 2 - ) 0,95
Nitrogênio total 0,08
Fósforo total 0,01

3.3.5.3. Meio de cultura sólido contendo matriz de concreto.

Este meio foi elaborado com a seguinte formulação:

Matriz d o concreto(seca e triturada) 0200g

Agarose (grau eletroforese) 0005g

Água destilada lOOOmL

O preparo deste meio foi idêntico ao descrito para o meio de escória granulada de
alto-fomo.

O esquema para o preparo d o s meios sólidos de cultura contendo materiais de


c o n s t m ç ã o em suspensão p o d e ser visto na Figura 23 .

67
1| SUBSTRATO DE INTERESSE
2) AGUA DESTIUDA
1 2 3) AGAROSE EM ÁGUA DESTILADA
AUTOCUWAR SEPARADAMENTE
À 1 2 1 ° C . P 0 R 30 MINUTOS

1+2+3

ESTAS ETAPAS DO PREPARO DO MEIO DEVEM SER EFETUADAS EM FLUXO LAMINAR

Figura 23 : Esquema d o procedimento para a p r o d u ç ã o de meio sólido de cultura contendo


suspensões de materiais de construção.

68
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1. Resultados obtidos em estudo-de-caso

4.1.1. Resultados das análises microbiológicas quantitativas

O s resultados referentes ao estudo-de-caso do concreto deteriorado d o reservatório


de água do Instituto Butantan, são apresentados n a s Tabelas 11, 12, 13 e 14. A Tabela 11
mostra os microrganismos quantificados p o r lOOg de amostra seca. A Tabela 12 mostra o
valor do p H e o teor, e m porcentagem, da umidade das amostras analisadas; estes resultados
referem-se às amostras coletadas em maio de 1992.

Tabela 11: Concentração de microrganismos encontrados por lOOg de amostra seca de


concreto (reservatório de água do Instituto Butantan)
Microrganismos Concentração de microrganismos/100 g de amostra seca

(teste presuntivo) Cl Cl C3

r.thioparus (NMP) 7,5 X 10^ 1,8 X 104 1,8 X 10^

T.thiooxidans (NMP) <2 <2 2 , 2 X 103

T.ferooxidans (NMP) <2 <2 <2

T.denitrißcans (NMP) <2 <2 7,5 X 103

Fungos (UFC) 5,7 X 10^ 1,7 X l o ' 1,3 X l O '

Bactérias heterotróficas (UFC) 2,1 X lO'' 2,5 X 10^ 8,1 X 10^

Bactérias redutoras de sulfato ausente presente não determinado


(teste qualitativo)

C1 = amostra da região c o m eflorescencia

C2 = amostra da região do concreto com corrosão da armadura

C3 = amostra de solo em contato com a base da estrutura de concreto

69
Tabela 12 : Características d a s amostras de concreto deteriorado, e s t u d o - d e - c a s o

Determinações Cl C2 C3

pH 9,0 10,0 9,5

Umidade (%) 56 5 22

4.1.2. Resultados da análise microbiológica em períodos diferentes coleta

As amostras C1 e C 2 foram coletadas em duas épocas diferentes d o a n o , a primeira


amostragem foi feita no final do verão (março) e a segimda no outono (maio). N o t o u - s e que
os resultados da coleta efetuada em maio apresentou u m decréscimo do N M P de
T.thioparus (teste presuntrvo) em relação à coleta efetuada em março. E s t e s resultados
mdicam a importância de serem realizados estudos fiituros para observar a influência da
variação sazonal na biodeterioração deste concreto. O s resultados c o m p a r a t i v o s dos dois
periodos de coleta estão apresentados na Tabela 13.

Tabela 13 : N ú m e r o mais provável de Thiobacillus obtidos do concreto deteriorados em

Cl C2
D a t a da coleta 18/03/92 25/05/92 18/03/92 25/05/92
pH 9,60 8,95 9,70 10,0
T.thioparus 2,4 X \Çp 3,3 X 105 5,0 X 105 1,7 X 104

Os valores obtidos para T.thioparus (teste presuntivo) são expressos em NMP/lOOmL da


suspensão da amostra anabsada.

4.1.3. Resultados da análise quimica da matriz

Os resultados da análise química da matriz, analisada em estudo-de-caso, permitiram


a sua reconstituição de traço (proporção aglomerante : agregado). A Tabela 14 mostra a
composição química em duas regiões diferentes; uma onde o concreto apresentava-se seco e
outra onde o concreto apresentava-se úmido, com vazamento.

70
Tabela 14 : Composição quimica da matriz analisada em estudo-de-caso - reservatório de

Análises A m o s t r a seca Amostra com v a z a m e n t o


massa(%) niassa(%)
Umidade 0,96 0.58
Perda ao fogo 9,10 7,40
Resíduo insolúvel (RI) 74,90 80,03
Oxido d e Silício ( S i 0 2 ) 2,69 2,24
R2O3 ( F e 2 0 3 + AI2O3) 1,82 1,58
Óxido de cálcio ( C a O ) 9,82 7,42
Óxido de magnésio ( M g O ) 0,60 0,53
Sulfato 0,01 0,02
Sulfeto (S2-) 0,01 0,01
Nitrogênio total 0,03 0,01
Fósforo total 0,04 0,05

A reconstituição de traço da matriz, revelou uma proporção 1:4 (cimento:agregado


miúdo), em massa , para a amostra da região seca e uma proporção 1:6 para a amostra da
região c o m vazamento. A diferença n o t r a ç o p o d e ser expbcada pela lixiviação de cimento.

O s resultados da difração de raios X indicaram que a amostra de eflorescéncia


continha calcita. ( C a C 0 3 ) .

4.1.4. Discussão dos resultados

A origem do processo de deterioração do concreto, neste caso específico, parece


decorrer de falhas na execução da obra. A corrosão da armadura é favorecida pela falta de
cobrimento. A carbonatação local, q u e se dá ao longo do tempo, diminui a alcahnidade do
concreto e acelera a corrosão. A u m i d a d e do concreto com conseqüente carbonatação e
diminuição da alcahnidade, parece contribuir para o estabelecimento de condições

ambientais iniciais necessárias para a colonização d o s microrganismos. A hteratura^'*^"


não apresenta dados que evidenciem o crescunento de Thiobacillus neutrofílicos em p H
entre 12 e 11, intervalo em que o concreto ainda n ã o se encontra carbonatado-

A análise química da argamassa deste reservatório de água indicou, pelo teor de


sulfeto encontrado, a possibilidade d o cimento utilizado conter aproximadamente 1 0 % de
adição de escória granulada de alto-forao.

A s bactérias redutoras de sulfato, que produzem gás sulfídrico pela redução d o


sulfato, foram encontradas somente na amostra c o m corrosão da armadura.

71
¡ Conforme se observa na Tabela 11 , as amostras apresentaram bactérias
j heterotróficas, fimgos e mdicação para Thiobacillus, presentes em quanridades
I representativas, coexistindo n o mesmo nicho, embora em amostras distintas. A presença d o s
I* mesmos tipos de microrganismos nas três amostras indica que a contaminação parece vir d o
solo, p o i s este, além de apresentar os mesmos tipos de microrganismos encontrados no
» concreto, apresenta t a m b é m teste para presuntrvo positivo para espécie anaeróbia de
Thiobacillus e para T.thiooxidans (espécie aerobia acidofíhca).

Q u a n d o foram c o m p a r a d o s os resultados obtidos n o estudo-de-caso e os resultados


encontrados na hterat\u-a, observou-se que:

• A mdicação de Thiobacillus com caracteristicas neutrofihcas nas amostras de


eflorescencia e de concreto com corrosão da armadura, permite supor que n o
caso de n ã o ocorrer interrupção deste processo com reparo do concreto, e m
t e m p o hábil, a alcahnidade do concreto p o d e dimmuir a p o n t o de favorecer a
colonização de espécies acidofihcas provenientes do solo para o concreto.
Esta suposição foi levantada quando se comparou os resuhados obtidos neste
estudo c o m os resuhados encontrados por M I L D E ^ ^ ' ^ que observou a
biodeterioração do concreto do esgoto de Hamburgo como sendo um
processo sequencial de desenvolvimento de várias espécies de Thiobacillus;
onde as espécies neutrofíhcas, capazes de crescer em p H neutro e alcalino,
acidificam o meio, favorecendo o crescimento de espécies acidofilicas.

• A concentração de bactérias heterotróficas em quantidades superiores à


concentração de Thiobacillus (teste presuntivo), nas amostras de
eflorescencia e concreto com corrosão da armadura, coincidem parcialmente
com a hipótese apresentada por KARAVAfKO^"*!) para o mecanismo de
biodeterioração do concreto. Esta hipótese supõe que as bactérias
heterotróficas iniciam o processo, crescendo sobre a superfície do concreto
com a formação de nichos anaeróbios. N e s t a s micro-regiões anaeróbias as
bactérias redutoras de sulfato se prohferam, produzindo gás sulfídrico; este,
por sua vez, serve de fonte de energia para as bactérias sulfoxidantes. Esta
associação de microrganismos p o d e estar ocorrendo na amostra de concreto
com c o r r o s ã o da armadura, anahsada neste estudo-de-caso. pois nesta
amostra foram encontradas bactérias heterotróficas, e indicação para
bactérias redutoras de sulfato e Thiobacillus.

72
• A indicação de bactérias redutoras de sulfato, na amostra de concreto com
c o r r o s ã o da armadura exposta, é coincidente com a p r o p o s t a para o
mecanismo d e biocorrosão das armaduras apresentado p o r MOOSAVI^^^)
E interessante observar que, neste estudo-de-caso, as armaduras
I apresentavam-se expostas ao ambiente, p o r t a n t o , em uma condição oxidante.
! » A presença destas bactérias, estritamente anaeróbias, confirma a existência de
n i c h o s anaeróbios e m microrregiões do concreto com armadura exposta

4.2. Testes presuntivos qualitativos para T. thioparus

4.2.1. Resultados dos testes presuntivos em amostras do ambiente


construído
A s características das amostras anahsadas estão descritas na Tabela 5 (Capítulo Dl)
e os resultados estão apresentados na Tabela 15 .

73
Tabela 15 R e s u l t a d o s dos testes presuntivos qualitativos para T.thioparus em amostras
coletadas a partir do ambiente construido
Procedência Amostra T.thioparus pH

ETA Riacho Grande C.4 + + 6,70


São b e r n a r d o do C a m p o ( S . P.)
ETA Riacho Grande C.5 + 7,00
São b e r n a r d o d o C a m p o ( S . P.)
ETA Riacho Grande C.6 + 7,20
São b e r n a r d o do C a m p o ( S . P.)
C a p t a d o r d e água bruta C.7 - 7,90
G u a r a p i r a n g a S ã o Paulo (S.P,)
Captador de água bruta C.8 - 9,50
G u a r a p i r a n g a São Paulo (S.P.)
Captador d e água bruta C.9 - 8,10
G u a r a p i r a n g a S ã o Paulo (S.P.)
Piscina olímpica ( C E P E U S P ) CÍO + + 10,3
C i d a d e Universitária São Paulo (S.P.)
Piscina olímpica ( C E P E U S P ) C.ll + + 8,3
C i d a d e Universitária São Paulo (S.P.)

C.4 = L o d o em c o n t a t o com viga de ferro com corrosão evidente


C.5 = L o d o em c o n t a t o com o concreto em deterioração
C.6 = L o d o coletado do fimdo d o decantador
C.7 = A g r e g a d o g r a ú d o envolvido p o r cimento hidratado
C.8 = Pequena amostra de c o n c r e t o
C.9 = Material superficial raspado do concreto, contendo limbo escuro
C Í O = Estalactites de eflorescencia do concreto com vazamento de uma piscina olímpica
C . l l = Cano apresentando c o r r o s ã o evidente abaixo de uma região do concreto
apresentando v a z a m e n t o de água c o m formação de estalactites.

4.2.2. Discussão dos resultados

O s testes presuntKos qualitativos foram positivos para as amostras procedentes da


E T A do Riacho G i a n d e e da piscma ohmpica do C E P E U S P , Cidade Universitária - S.P..
Para as amostras procedentes d o captador de água b m t a da represa de Guarapiranga t o d o s
os testes tiveram r e s u h a d o s negativos. Algumas considerações são discutidas q u a n t o a estes
resuhados:
• Q u a n t o aos resultados positivos para as amostras da E T A d o Riacho Grande,
São Bernardo do C a m p o :

E interessante observar que as amostras de lodo da E T A do Riacho G r a n d e foram


coletadas de u m decantador de água pré-lratada, já clorada, portanto indicando que os

74

CCK^!Í,:AG \ i LNEHGI,Í, N U C L E A R / S F . ¡PER


Thiobacillus presentes n e s t a s amostras resistiram ao processo de cloração n o t r a t a m e n t o da
água.

• Q u a n t o a o s resultados positi\'os para as amostras coletadas do concreto da


piscina olímpica:

A indicação da presença de T.thioparus nas amostras de estalactites d o concreto da


piscina o l í n ç i c a d o C E P E U S P , Cidade Universitária, é coiocidente c o m a indicação da
presença destas bactérias n a s estalactites formadas por eflorescencia d o concreto do
reservatório de água d o Instituto Butantan. É interessante observar que ambas as amostras
apresentavam-se carbonatadas.

O teste presuntivo positivo para T. thioparus na amostra de cano de ferro com


corrosão evidente, situado abaixo do concreto com vazamento de água da piscina olímpica,
indica a possibilidade destas bactérias estarem fazendo parte d o p r o c e s s o de corrosão dessa
liga de ferro nessas condições.

• Q u a n t o a o s resultados negativos das amostras superficiais de concreto do


captador de água bruta da represa de Guarapiranga:

Os resultados negatK'os para o teste presuntivo n a s amostras p r o c e d e n t e s do


captador de água bruta da represa de Guarapiranga não indicam necessariamente ausência
de T. thioparus nestas amostras. Obser\'ou-se uma mudança na coloração do meio de
Postgate modificado para T. thioparus em relação ao controle não inoculado. O controle
permaneceu c o m a coloração vermelha típica do pH inicial do meio = 7 , 4 ; os meios
inoculados, n o entanto, apresentaram coloração carmim mtensa, típica do hidicador
vermelho de fenol em meio alcahno com pH acima de 8,0.

Estas amostras, utilizadas como inoculo, carregavam consigo uma certa quantidade
de cimento hidratado do concreto. Este fato esclarece a mudança na coloração do meio de
cuhura nas amostras moculadas : o hidróxido de cálcio, do cimento hidratado, ao ser
solubilizado, libera íons O H ' elevando o p H do meio. A alcalinização do meio p o d e inibú o
crescimento dos Thiobacillus ou mascarar o teste por neutralização d o ácido produzido.

Estas obser\'ações levantam a questão de que a utihzação d o c o n c r e t o , duetamente


como inoculo, n ã o é aconselhável. Mesmo num teste qualitativo, é necessário usar uma
suspensão do concreto em paralelo com o concreto puro.

75
o aumento da alcalinidade d o meio também foi observado em u m teste de
sobrevivência efetuado com algumas cepas acidofilicas incorporadas na água de
amassamento para a confecção de u m corpo-de-prova de argamassa. Q u a n d o se inoculou os
corpos-de prova em meio liquido 9 K contendo 1% de enxofre com p H inicial de 2,8; o p H
do meio chegava a 9,0 após u m período de sete dias incubação.

4.3. Testes presuntivos qualitativos para T.thioparus, T.thiooxidas e


T.ferrooxidans

4.3.1. Resultados dos teste presuntivos em amostras de areia

F o r a m anahsadas amostras de areias de diferentes procedências, encontrando-se as


características de cada amostra na Tabela 6 Os resultados dos testes presuntivos quahtativos
para T.thioparus, T.thiooxidans e T.ferrooxidans estão apresentados na Tabela 16 .

76
Tabela 16 :Resultado d o teste presuntivo para Thiobacillus de areias de procedencias
diferentes

Procedencia Amostra Microgasnismos


'9 (código)

T.thioparus T.thiooxidans T.ferrooxidans

Biritiba M i r i m A.1 + + + + + +

Biritiba Mirim A.2 + + + + +

Biritiba M i r i m A.3 + - + - -
Biritiba M i r i m A.4 - - + - -
Biritiba Mirim A.5 - - - - -

Jacareí A.6 + + - - -
Jacareí A.7 + + - - -
Jacareí A.8 + - - - -
Itaquaquecetuba A.9 - - + + -
Itaquaquecetuba A.IO - - + + + +
A. 1 = Areia bruta coletada no meio do monte
A.2 = Arelas bruta coleta em um canto do monte
A.3 = Areia lavada (molhada) em contato com o piso
A.4 = Areia lavada (molhada) de região superior do monte
A.5 = Areia lavada após secagem de região superio do monte
A.6 = Areia úmida coletada da região superior do monte
A.7 = Areia úmida coletada de região não exposta à atmosfera
A.8 = Areia úmida em contato com o solo
A.9 = Areia final para distribuição
A. 10 = A r e n h o cimentado por sulfetos

77
4.3.2. Discussão dos resultados
S o m e n t e as a m o s t r a s procedentes do p o r t o de areia de Itaquaquecetuba foram
coletadas n o p r ó p r i o p o r t o , aquelas procedentes d o s p o r t o s de Jacareí e de Biritiba Mirim
foram coletadas a p ó s o transporte, dentro das expectativas de manipulação das areias
destinadas à construção civil.

A literatma n ã o registrava qualquer tipo de d a d o s referentes à presença de


Thiobacillus e m a m o s t r a s de areia destinada à construção civil. O primeiro passo importante
deste estudo foi constatar a ubiqüidade deste gênero de bactérias n a s a m o s t r a s analisadas.

A s amostras provenientes de Biritiba Mirim, coletadas n o Setor de Areias do IPT,


apresentaram algumas variações no teste qualitativo para Thiobacillus provavelmente em
fimção das diferenças n o tratamento efetuado para a p r o d u ç ã o de areia preparada para
ensaio d e cimento í^). N e s t e processo as areias são lavadas com hidróxido de sódio e
submetidas à secagem.

A s amostras de areia bmta, ou seja sem tratamento, apresentaram a indicação para


os três tipos de bactéria. A s amostras de areia lavada, em contato c o m o piso de cimento,
apresentaram indicação para T.thiooxidans e para T.thioparus. U m a amostra de areia
lavada, amda molhada antes da secagem, da região superior do monte apresentou indicação
de T thiooxidans. O teste presuntivo positivo para estas amostras, a p ó s lavagem, hnphca em
uma provável recolonizaão por cepas do ambiente. A areia lavada a p ó s secagem não
apresentou indicação para presença de Thiobacilhis pois não apresenta condições de
umidade a d e q u a d a s ao crescimento microbiano.

A areia proveniente de Jacareí apresentou apenas mdicação de T. thioparus, embora


estivesse exposta a céu aberto com condições ambientais propícias para a contaminação por
outras espécies q u e pudessem estar eventualmente presentes no meio ambiente.

A amostra de areia Itaquaquecetuba, apresentou mdicação para T. thiooxidans. A


presença de T. ferrooxidans foi observada na amostra de arenho, coletada n o porto 5, este
arenito não é utilizado diretamente como areia para construção civil, mas faz parte da
composição da areia final.

E m resumo, observou-se que a utilização da areia diretamente como móculo não


compromete os r e s u h a d o s dos testes presuntivos quahtativos.

78
4.4. Isolamento e identificação preliminar para Thiobacillus

4.4.1. Resultado do processo de isolamento de cepas puras

Partindo-se dos resultados positivos dos testes presuntivos quantitatKos e


qualitativo realizados, efetuou-se o enriquecimento, o isolamento e a purificação de algumas
cepas.

A p ó s o quinto repique em meio liquido efetuou-se o p l a q u e a m e n t o n o respectivo


meio sólido, iniciando-se a etapa de purificação das cepas, onde as colônias de bactérias
isoladas c o m características macrormorfológicas idênticas foram consideradas da mesma
cepa T o d o s o s tipos de colônia foram submetidos à coloração de Gram. A p e n a s as bactérias
Gram-negatrvas foram selecionadas para prosseguir a purificação. N e s t a etapa foram
observadas algumas características distintas da macromorfologia das colônias, sumarizadas
na Tabela 17 .

F o r a m isoladas onze cepas na forma de cultura pura, das quais d e z foram submetidas
a u m conjunto de testes preliminares para identificação de Thiobacillus.

Q u a n d o se comparou as características morfológicas das colônias isoladas com as


características descritas na literatura^'*^) observou-se que:

A s cepas A2Th, A 9 T h , AlOTh apresentam características compatíveis com as


colônias de T.thiooxidans; as cepas A6Th e C 4 R G apresentam características compatíveis
com T.thioparus; as cepas A 2 T f e AIOTf apresentam características compatíveis com
T.ferrooxidans; as cepas C l m e C i e apresentam características compatíveis com Tversutus.
A s características das cepas C l p e C2Ar não comcidiram com alguma espécie em particular.

79
A Tabela 17 :Caracteristicas da macromorforfologia das colônias isoladas

Cepa Procedencia Meio de cultura Características macroscópicas


(Código) (sólido) da colonia

* C2Ar Concreto S6 Colonia p e q u e n a (~1 m m ) , coloração


com armadura rosa,
exposta consistencia gelatmosa
(Instituto Butantan)

Clp Eflorescencia S6 Colônia minúscula (~0,5 mm)transparente


(Instituo Butantan) consistência gelatmosa

Clm Eflorescencia S6 Colonia grande (~3 m m ) de coloração


(Instituo Butantan) levemente
amarelada n o centro, consistência
mucilagenosa

Cíes Eflorescencia S6 Colônia grande (~3 m m ) , espalhada,


(Instituo Butantan) consistênciamucilagenosa, ao envelhecer
adquire coloração amarelada

C4RG L o d o da E T A - S6 Colônia pequena (~1 m m ) , a m a r e l a d a ,


(Riacho Grande) seca,
com aparente deposição de enxofre

A6Tp Areia exposta ao Postgate Colônia pequena (~1 m m ) ,amarelada.


ambiente / I P E N modificado p / seca,com aparente deposição de enxofre
(Jacareí) T.thioparus

A9Th Areia - Postgate Colônia pequena (~ 1 m m ) , amarelada,


(Itaquaquecetuba) modificado p / pastosa, com aparente deposição de
T.thiooxidam enxofreao envelhecer a d q u u e cor ocre
ft
AlOTh Arenito Postgate Colônia pequena (~1 mm), amarelada,
(Itaquaquecetuba) modificado p / pastosa, com aparente deposição de
T. thiooxidam enxofreao envelhecer adquire cor ocre

A2Th Areia coletada no Postgate Colônia pequena (~1 mm),coloração


Setor de arelas do modificado para ocre, seca
IPT T. thiooxidam
(Biritiba Mirim)

AlOTf Arenito "TK" com agarose Colônia mmúscula (< 1 mm), seca,
coloração alaranjada, aspecto ferruginoso
(Itaquaquecetuba)

A2Tf Areia coletada no "TK" com agarose Colônia minúscula (< 1 mm), seca,
Setor de arelas d o I P T coloração alaranjada, aspecto ferruginoso
(Biritiba Mirim)

80
A Figura 24 mostra colonias isoladas das cepa neutrofílica C2Ar ; a Figura 25
mostra colonias isoladas da cepa C l m , ambas em meio sólido S6. E a Figura 26 mostra
colonias isoladas da cepa acídofílica AlOTf; o crescimento das colonias desta cepa evidencia
a oxidação do Fe^"*" com formação de F e ( 0 H ) 3 de cor ferruginosa.

Figura 24 . Cepa C2Ar em meio sólido S 6 (isolada do concreto com armadura exposta d o
reservatório de água do Instituto Butantan) - Ampliação - 2x.

81
Figura. 25 : Cepa C l m em meio sólido S6 ( i s o l a d a da amostra de eflorescencia do concreto
do reservatório de água do Instituto Butantan) - Ampliação ~ 2,5 x.

"•"VI

' .VI.-!

Figura. 26 : Cepa A l O T f era meio "TK" solido com sulfato ferroso (isolada do p o r t o de areia
de Itaquaquecetuba - S . P . ) - Ampliação - 2,5 x.

82

comiaz t.;..tt^-. n i m m w u c í e a h / s p - ipês»


4.4.2. Resultado do estudo do comportamento de cepas puras em meios de
cultura com variação do pH inicial

4.4.2.1. Meio líquido ATCC 238 adaptado para pH inicial = 12


A areia de Itaquaquecetuba apresentou indicação para T.thiooxidans; esta espécie é
a mais agressiva ao concreto por produzir g r a n d e quantidade de ácido sulfiirico como
p r o d u t o final de seu metaboIismo.No caso destas bactérias, p r e s ^ t e s na areia, conseguirem
sobreviver às condições de p H elevado da hidratação d o c ú n a i t o , o concreto produzido
apresentaria mtrinsecamente u m risco potencial de biodeterioração.

Para observar a possihdade da sobrevivência destas bactérias em p H alcalmo, estas


cepas fiaram incubadas e m meio líquido A T C C 2 3 8 c o m 0,5 % de tiossulfato de sódio,
a d a p t a d o para p H inicial 12.

A Figura 27 mostra a variação do p H neste meio após 21 dias d e incubação,


inoculado c o m as cepas AlOTh e A 9 T h

A variação d o p H no meio d o frasco controle n ã o inoculado foi idêntica à dos


frascos inoculados. Estes resuhados mdicaram q u e estas cepas acidofihcas n ã o fi)ram
capazes de crescer e p r o d u z n ácido nestas condições.

13

12 A9Th

- H - AlOTh
pH 11
-A— Controle
10

' "
7 14
21
T e m p o (dias)

Fígiu-a 27 : Variação do p H do meio A T C C 238 contendo 1% (modificado para p H 12)


n o s frascos inoculados com as cepas AlOTh, A 9 T h .

A p ó s este período de incubação foram adicionados a estes meios 100 ml de meio


A T C C 2 3 8 , acidifican do-se o meio c o m ácido sulfiirico esterilizado até que o meio atingisse

83
p H 4,0. N ã o h o u v e mdicação da presença destas cepas a p ó s 14 dias de incubação e m
condições ótimas.

4.4.2.2. Meio sólido S6 e S5

S e g u n d o a literatura, as cepas neutrofflicas e acidofilicas de Thiobacillus, necessitam


de meios d e cultura c o m p H inicial próximo neutralidade o u ácido, req)ectivamente, para
iniciar o crescimento. Estes dados fiaram confirmados c o m os testes de crescimento
realizados e m m e i o s sólidos S6 e S5. A Tabela 18 mostra o c o n ç o r t a m e n t o de várias cepas
isoladas em m e i o sólido S 6 ( p H inicial = 6,6) e S5 ( p H inicial = 4,5).

Tabela 18 : T e s t e de crescimento em meio sólido S6 e S5 d e várias cepas isoladas

Cepa M e i o sólido 8 6 M e i o sólido S 5

C2Ar + -
Clp + -
Cies + -
Clm + -
C4R.G. + -
AlOTh - +

A9Th - +

A2Th - +

AlOTf - -
A2Tf - -

O s resultados obtidos mostraram que nenhuma cepa neutrofihca foi capaz de crescer
em meio de cultura c o m p H micial = 5,0, p o r outro lado nenhuma cepa acidofíhca foi capaz
de crescer em meio de cultura com p H = 6,6.

Conforme descrito p o r G A R C I A Jr(1989), T.ferrooxidam é mibido por c o m p o s t o s


orgânicos c o m o o agar, necessitando de meio sóhdo p r e p a r a d o com agarose. Possivelmente

84
p o r esse motivo as cepas acidofilicas A l O T f e AlOTf^ capazes de oxidar o Fe^"*"» em meio
9K-Fe2''", n ã o cresceram em meio sólido S5.

4.4.2.3. Meio de Postgate modificado para T.thioparus

A s cepas neutrofilicas isoladas da areia d e Jacarei e d o Iodo da E T A do Riacho


G r a n d e apresentaram uma capacidade maior de p r o d u ç ã o de ácido d o que a s cepas
neutrofihcas isoladas do concreto deteriorado do reservatório de água d o Instituto Butantan,
quando incubadas em meio líquido de Postgate modificado para T.thioparus. A Tabela 19
mostra as diferenças de p H final produzido p o r várias cepas neste meio líquido ( p H inicial de
7,4) após 14 dias de mcubação a 28 ± 2 ^ C .

Tabela 19 p H do meio de Postgate modificado para T.thiparus decorrente do metabolismo


de cepas neutrofíhcas de diferentes procedências

Cepa Amostra de origem p H final

Clp Eflorescencia 5,9


(concreto / Instituto Butantan)

C2At Concreto com armadura exposta 5,9


(concreto / Instituto Butantan)

C4RG Lodo ( E T A do Riacho Grande) 4,3

A6Tp Areia 3,7


(coletada no IPEN / Jacareí)

4.4.2.4. Meio de Postgate modificado para T. thiooxidans

As cepas acidofíhcas isoladas das amostras de areia de Biritiba Mirim e de


Itaquaquecetuba, também mostram diferença na p r o d u ç ã o de ácido q u a n d o cultivadas em
meio de Postgate modificado para T.thiooxidans c o m p H inicial d e 4,5 ( 2 0 dias de
mcubação a 28 ± 2 ^ 0 , c o m o mostra a Tabela 20 .

85
Tabela 20 : Valor do p H fínal em meio liquido de P o s t g a t e modificado para T.thiooxidans
após a incubação com algumas cepas acidofihcas
Cepa Amostra p H final
AlOTh Arenito cimentado p o r sulfetos - 1,7
(Itaquaquecetuba)
A9Th Areia para construção civil 1,0
(Itaquaquecetuba)
A2Th Areia bruta 2,7
coletada n o Setor de areias d o I P T
(Biritiba Mirim)

4.4.2.5. Meio ATCC 238 e meio ATCC 238 adaptado para T.thioparus em
comparação com os meios de Postgate modificados para T.thiooxidans e
T.thioparus

Para observar a variação do p H n o meio de cultura hquido das c e p a s acidofihcas


AlOTh e A 9 T h , observou-se o crescunento destas cepas, em fimção d o t e m p o , em dois
meios de cultura diferentes: o meio A T C C 2 3 8 , contendo 1% de enxofre elementar e o meio
de P o s t g a t e modificado para T.thiooxidans, c o m 1% de tiossulfato. A p ó s 14 dias de
mcubação, o p H em meio A T C C 2 3 8 chegou a 0,4 e n o meio de Postgate modificado p /
T. thiooxidam chegou a 1,7

Para observar a variação de p H da cepa neutrofihca A 6 T p em dois m e i o s diferentes,


moculou-se esta cepa em meio A T C C 2 3 8 adaptado c o m 0,5 % de tiossulfato ( p H micial=
7,5) e em meio de Postgate modificado para T.thioparus. A p ó s 14 dias de i a c u b a ç ã o o p H
no meio A T C C 238 chegou a 4,1 e o p H n o segimdo meio chegou a 3,8.

A Figura 28(a) apresenta os valores de p H d o meio hquido A T C C 2 3 8 contendo 1%


de S^ para as cepas acidofihcas A l O T h e A 9 T h ( p H micial =4,5) e 0 , 5 % de tiossulfato de
sódio ( p H micial = 7,4) para a cepa A 6 T p .

A Figura 28(b) apresenta os valores de p H d o meio hquido de P o s t g a t e modificado


para T.thiooxidam (pH micial= 4,5) para a cepa A l O T h , e meio hquido de postgate
modificado para T.thioparus ( p H micial 7,4) para a cepa A ó T p .

86
6

pH
11 pH 4 ^

2.

— (» (
S 10 15 20 5 10 15 20

Tempo Idiae) Tempoldiae)

•AlOTh — A 9 T h A6Tp AlOTh A6Tp

(a) (b)
Figura 28(a): Variação d o p H do meio de cultura líquido A T C C 2 3 8 contendo 1% 8 ° para
as cepas acidofilicas e 0,5 % de N a 2 S 2 0 3 para a cepa AsuJ

Figura 28(b): Variação do meio líqiddo de Postgate modificado para T.thiooxidans para a
cepa AlOTh e meio hquido de P o s t g a t e modificado para T.thioparus para a cepa A 6 T p

4.4.2.6. Discussão dos resultados


Estes resultados confirmaram o s d a d o s da hteratura^^^, 4 3 ) ^ QS Thiobacillus
crescem em fabcas definidas de p H . A s cepas neutrofíhcas miciaram o crescimento em p H
próximo a 7,0 e atmgiram p H final entre 6,0 e 3,8. A s cepas acidofihcas miciaram o
crescimento com p H próximo a 5,0 e atmgiram p H final entre 2,0 e 0,5.

Os resuhados evidenciam que as cepas acidofíhcas, procedentes de Itaquaquecetuba,


não sobrevivem ao p H elevado equivalente ao que ocorre n o s p o r o s do concreto.

As cepas neutrofíhcas, isoladas d a areia procedente de Jacareí, n ã o c o n s e g u ú a m


sobreviver por u m período p r o l o n g a d o (cerca de 30 dias à temperatura ambiente) n o s meios
líquidos testados. A hteratura registra q u e algumas espécies de T.thioparus são sensíveis ao
p H ácido, e concluiu-se que estas cepas isoladas, não sobreviveram p o r causa d o p H
atingido no meio de cuhura.

4.4.3. Resultados da curva de crescimento para observar a concentração de


bactérias no inoculo para os testes de identificação

Visto que estas bactérías isoladas mostraram ser de crescimento lento, este ensaio
ío\ reahzado para observar se o móculo, para os testes de identificação, tería quantidade

87
significativa de bactérias n o terceiro dia de incubação em meio S6/S5, como é proposto por
HUTCHINSON e colaboradores í^^) A Tabela 21 mostra a concentração celular em
fimção do tempo de incubação, em meio de cultura líquido S6 para as cepas neutrofilicas e
meio líquido S5 para uma cepa acidofiílica.

Tabela 21 : Concentração bacteriana em fimção do t e n ç o de incubação, em meio líquido S 6

r~ " " " '~r


T e m p o de C2Ar Clp Clm C4RG AlOTh
incubação Meio S 6 Meio S6 M e i o S6 Meio S6 Meio S5
(Dias) (UFC/mL) (UrC/mL) (UrC/mL) (UFC/mL) (UFC/mL)

contagem inicial 5,9 X 103 2,7 X 10 4 2,7 X 105 6,2 X 104 2,8 X 103

1 2,5 X 105 - 1,6 X 106 5,6 X 104 I , 8 x 104

2 1,1 X 105 - 1,5 X 107 1,1 X 107 l , 9 x 105

3 l , 2 x 108 2,0 X 10 7 l , 2 x 108 l , 6 x 108 7 , 9 x 107

5 6,5 X 108 - - 6,1 X 107 4,7 X 108

6 6,5 X 107 3,1 X 109 9,4 X 108 l , O x 108 6,9 X 109

7 5,8 X 107 3 , 2 x 108 1,0 X 108 1,1 X 108 -

A Figura 29 apresenta as curvas de crescimento, e m fimção do tempo de incubação para as


cepas C2Ar, C4RG, C l m e A l T h .

4.4.3.1. Discussão dos resultados

O s valores obtidos permitiram certiBcar-se de que no terceiro dia de incubação, as


cepas testadas apresentavam entre 107 e 10^ unidades fiarmadoras de colónias p o r mililitro,
portanto garantindo u m inoculo adequado para se efetuarem os testes preliminares de
identificação.

88

COMISCAD KACXN/
10

8.
• •
6.

4:

2.
E
H 1 1 1 1 1 1
2 3 4 5 6

TENRPO (DIAS)

Figura 29(a) Figura 29(b)

0 1 2 3 4 5 6 7

Terrpo (dias)

Figura 29(c) Figura 29(d)

Figura 29(a) : Curva de crescimento da cepa C 2 A r em meio líquido S6


Figura 29(b) : Curva de crescimenro da cepa C4 R G em meio hquido S6
Figura 29(c) : Curva de crescunento da cepa C l m em meio hquido S6
Figura 29(d): Curva de crescimento da cepa A l O T h em meio hquido S5

89
4.4.4. Resultado dos testes preliminares para Identificação de Thiobacillus

Os resultados d o s t e s t e s preliminares para a identificação d a s cepas isoladas são


apresentados na Tabela 22 .

Entre as cepas acidofilicas testadas nenhuma delas foi capaz de crescer em agar
nutriente, portanto t o d a s apresentaram-se autotróficas obrigatórias. D u a s destas cepas
exibiram capacidade d e oxidar o F e 2 + em meio 9K-Fe 2+. Apenas a cepa A I O T f mostrou
capacidade de oxidação d o tiossul&to em meio S5 de 98 % e dimmuição d o p H n o s meios
contendo enxofre e tiossulfato para ababco de 2,0. Esta cepa mostrou características t ç i c a s
de T. ferrooxidam. A cepa A 2 T f apresentou apenas 10 % de oxidação d o tiossulfato n o
meio S5, o p H neste meio c h e g o u a 3,95. Apenas em meio contendo enxofre o p H final
chegou a 1,85. Estes resultados evidenciaram que esta cepa não apresentou as
características típicas p a r a T.ferrooxidam, merecendo portanto, investigações posteríores
para a identificação da espécie.

As cepas acidofíhcas A l O T h e A9Th apresentaram 9 9 % de oxidação do tiossulfato


em meio S5; o p H final neste meio chegou a zero para as duas cepas, em meio contendo
enxofre a cepa A l O T h atmgiu p H = 1,50 e a cepa A9Th atingiu p H 1,20. N o meio SO
contendo 6% de tiossulfato a cepa A l O T h alcançou 4 6 % de oxidação do tiossulfato e a cepa
A9Th alcançou 60%. Estes resuhados apresentaram características típicas para
T.thiooxidam.

A cepa acidofihca A 2 T h apresentou 9 % de oxidação do tiossulfato em meio S5, e


p H final neste meio de 4,20. E m meio contendo enxofre o p H final foi de 4 , 4 3 ; estes dados
são mcompatíveis c o m a espécie T.thiooxidam. Para a identificação desta cepa o u t r o s
ensaios complementares d e v e m ser efetuados.

Entre as chico cepas neutrofilicas testadas, a única cepa que não cresceu em agar
nutriente apresentando p o r t a n t o caracteristica autotrófica obrigatória foi a cepa C 4 R G . Esta
cepa apresentou 9 9 % de oxidação do tiossulfato em meio S6 e p H final deste meio = 4,6.
E m meio contendo enxofre o p H final chegou a 4,00. Esta cepa foi capaz de crescer em
meio sóhdo S8 em condições de anaerobiose, mas não foi capaz de denitrificar em meio S8
hquido nestas condições. Estes resuhados mostraram caracteristicas típicas de T. thioparus.

A s cepas neutrofihcas Clp, Cie, Clm e C2Ar apresentaram caracteristicas


autotróficas facultativas. Todas elas cresceram autotroficamente em meio S6 e
heterotroficamente em agar nutriente. Em meio S6 estas cepas apresentaram oxidação do

90
tiossulfato inferior a 1 0 % da concentração inicial e pH final p r ó x i m o a 7,0; o pH final e m
meio contendo enxofre ficou p r ó x i m o a 6,4. Estas cepas conseguiram crescer e m meio
sólido S8 em condições anaeróbias, p o r é m não apresentaram denitrificação e m meio líquido
S8 nestas condições. A s c e p a s C 2 A r e C l p não cresceram e m meio c o n t e n d o citrato c o m o
fonte de carbono, enquanto as cepas C l m e C i e cresceram n e s t e meio.

E s t a s cepas neutrofilicas autotróficas fecidtativas apresentaram resultados anômalos


e sua classificação, m e s m o a nível de grupo, ficou prejudicada. Considerando-se a utilização
d e citrato c o m o u m critério divisor, pode-se situar as cepas neutrofilicas C 2 A R e C l p c o m o
pertencentes ao grupo O e as cepas neutrofilicas C l m e C i e c o m o pertencentes ao g r u p o la.
N o entanto, algumas q u e s t õ e s discutidas a seguir levantam algumas dúvidas q u a n t o a essa
classificação.

4.4.4.1. Discussão dos resultados dos testes preliminares de identificação

O s resultados das c e p a s acidofilicas AlOTh e A 9 T h permitem evidenciar q u e estas


hnhagens pertencem à especie T. thiooxidam, sem dar m a r g e m a dúvidas. N o entanto, a
cepa acidofihca A 2 T h apresenta resuhados de p H final anômalos em meio S5 e e m meio SO
com enxofre elementar. E m meio hquido de Postgate modificado para T.thioxidam esta
cepa apresenta p H final = 2,7, mdicando que neste meio o tiossulfato é consumido c o m
produção de ácido. E em meio S5, o tiossulfato é consumido sem p r o d u ç ã o significativa de
ácido. E mteressante registrar que as cepas AlOTh e A9Th foram obtidas por
enriquecimento em meio líquido 9 K - S ° e a cepa A2Th foi obtida p o r enriquecknento em
meio Hquido de Postgate modificado para T. thiooxidam.

A cepa acifofihca A I O T f apresentou características fisiológicas que permitem


classificá-la como pertencente a espécie T. ferrooxidam. O mesmo n ã o o c o r r e n d o c o m a
cepa A 2 T f que não apresentou porcentagem de oxidação do tiossulfato e pH final
compatíveis com a espécie em meio hquido S5.

A cepa neutrofíhca C 4 R G apresentou características clássicas q u e permitüam


identificá-la como pertencente à espécie T.thioparus.

A s cepas autotróficas facuhavivas C l m , C i e , C l p e C2Ar foram obtidas p o r


enriquecunento em meio líquido de Postgate modificado para T.thioparus, c o m o posterior
isolamento n o mesmo meio sóhdo, nas mesmas condições que a cepa C 4 R G . E possível
garantir que as cepas não pertencem a espécie T.thioparus, pois crescem heterotroficamente
em agar nutriente.

91

CCM, ! Í : A G I.AC;C.K/L LE E N E F G I A NUCIEAH/SP -


Q u a n d o as c e p a s C2Ar, C l p , C l m e C i e foram cultivadas e m meio líquido S6, (com
p H inicial = 6,6), observou-se u m ligeiro aumento d o p H n o meio ( 6 , 0 a 7 , 0 ) , enquanto que
em meio líquido d e P o s t g a t e modificado para T. thioparus ( c o m p H inicial = 7,4) estas cepas
cresceram acidificando o meio até p H final 6,0. E m b o r a estes dois m e i o s tenham uma
composição m u i t o parecida, n o s seus componentes principais, eles apresentam algumas
diferenças: o p H inicial de cada meio, a concentração inicial de tiossulfato e a solução traços
de elementos, q u e é adicionada somente no meio de P o s t g a t e modificado p a r a T.thioparus.
U m destes fatores, o u o conjunto deles, devem possivehnente contribuir p a r a uma via
metabóhca diferente q u a n d o as mesmas cepas são m o c u l a d a s n e s t e s meios.

D e qualquer maneira, vale observar que t a n t o e m meio S6 q u a n t o e m meio de


Postgate modificado para T.thioparus, as cepas C l p , C i e , C l m e C2Ar apresentam
c o n ç o r t a m e n t o quimiohtotrófico e autotrófico.

A babea p o r c e n t a g e m de oxidação do tiossulfato n o meio S6 levanta as seguintes


questões: é possível uma cultura atingir cerca de 10^ células e m três dias de incubação, e
manter esta c o n c e n t r a ç ã o celular por u m período de 7 dias (ciuva de crescimento pag. 8 9 ) ,
à custa apenas desta baixa concentração de tiossulfato oxidado? Havería nesta condição, a
formação de alguns pohtionatos (tritionatos ou pentationatos) que p o r deconçosição
poderíam regenerar o tiossulfato e, desta forma, manter elevada a sua concentração?
Havería u m sistema enzimático que reduzisse o s p o h t i o n a t o s eventualmente formados e
recuperasse o tiossulfato? T o d a s estas questões levantadas m e r e c e m atenção e m estudos
fiimros para auxüiar a identificação destas cepas autotróficas facultativas.

T R U N D I G E R ( ^ ^ ) observou que algumas bactérias heterotróficas isoladas do solo,


que oxidam tiossulfato, possuem um sistema enzimárico capaz d e oxidar o tiossulfato a
tetrationato e m aerobiose e reduzir o tetrationato a tiossulfato e m anaerobiose, de forma que
estes c o m p o s t o s se mantêm cíchcos em u m p r o c e s s o de oxi-redução. A questão mais
mtrigante é que este processo não gera energia para esses microganismos. E s t e d a d o mostra
a complexidade metabóhca n o s processos de oxidação de c o m p o s t o s hiorgânicos reduzidos
de enxofre p o r microrganismos heterotróficos.

H U T C H I N S O N e colaboradores^^^), consideravam, e m 1969, c o m o representante


do grupo O a espécie então designada "T. trautweinii", que se movimenta p o r flagelos
peritriqueos. A s bactérias móveis do gênero Thiobacillus movimentam-se p o r u m ou mais
flagelos polares, e esta é uma caracteristica morfológica típica deste g ê n e r o . Atualmente as
bactérias do g r u p o O não são consideradas c o m o pertencentes ao g ê n e r o Thiobacillu^^^^.
Portanto as cepas C l p e C2Ar podem não pertencer ao gênero Thiobacillus.

92
A s espécies p e r t e n c e n t e s ao g r u p o l a são apresentadas c o m o s e n d o provavelmente
linhagens de T.versutus s e g u n d o a classificação mais recente de K E L L Y & HARRISON^*^).
A s colónias isoladas desta espécie crescem em ágar c o m aparência d e " o v o fiito". Esta
característica p o d e ser observada na Figura 25 q u e apresenta colónias da cepa Clm
crescendo sobre o meio sólido S6. Esta característica é mais u m indício d e que as cepas
Clm e C i e (que t a b é m possui esta mesma característica) p e r t e n c e m a o grupo la. N o
entanto, o valor do p H final e m meio S6 líquido apresentou-se acuna d o e n e r a d o para este
g m p o . P o r estes motivos, d e v e m ser realizados testes complementares p a r a classificar estas
cepas neutrofilicas autotróficas &cuhativas isoladas neste trabalho.

E interessante observar que embora p o r questões relacionadas à taxonomía do


gênero Thiobacillus as bactérias do grupo O encontrem-se atualmente excluidas deste
gênero, algumas destas h n h a g e n s até então designadas c o m o "T. trautweinii" fiaram
encontradas n o concreto d o esgoto de M e l b o u m e na Autrália(^^) c o m o sendo parte
mtegrante da microbiota daquele concreto.

Segundo K U E N E N & BEUDEKERÍ'*^) as bactérias sulfiaxidantes autotróficas


facultativas possuem uma vantagem adaptativa sobre as bactérias autotróficas obrigatórias
do gênero Thiobacillus, p o i s a sua flexibüidade metabóhca favorece o seu crescimento em
ambientes sujeitos a m u d a n ç a constante devido à colonização de p o p u l a ç õ e s diferentes de
microrganismos.

A p a r t ú dos r e s u h a d o s obtidos e dados da hteratura^^^^elaborou-se u m esquema que


apresenta uma classificação a nível de g m p o s , utilizando-se os seguintes critérios : p H final
em meio S6/S5, formação de gás em meio S8, crescimento em agar nutriente, meio
contendo somente citrato c o m o fonte de energia e prova de motihdade em gota pendente.

A Figura 30 apresenta a seqüência de testes para uma classificação aproximada a


nível de g m p o .

93
Tabela 22 : Resultados dos testes preliminares para identificação de Thiobacillus

Cepas neutrofilicas Cepas acidofilicas

Meio de cultura Critériode avaliação Controle C2Ar Clp Clm Cie C4RG Controle AlOTh A9Th A6Th AIOTf A6Tf

S6/S6 pH final 6,60 6,90 6,95 7,00 6,95 4,6 4,90 0,00 0,00 4,20 0,80 3,95

S6 /S5 Oxidação de tiossulfato 0 1 6 2 5 99 0 99 99 9 98 10


(%)

SO + 6% Oxidação de tiossulfato 0 0 8 0 0 0 0 46 60 0 0 1
tiossulfato (%)

S6 / S5 Inibição S/A - - - - -• S/A - - - - -


+ 4 % fosfato
s3: S6/ S5 Inibição S/A + + + + + S/A + + + + +
m + 5 % NaCl

Enxofre pH final 6,40 6,40 6,44 6,40 6,44- 4,00 4,50 1,50- uo- 4,43- 1,33- 1,85-

S8 Crescimento S/A + + + + + S/A - - - + +



(anaerobiose)
n
Anaerobiose Formação de gás S/A - - - - - S/A - - - - -
S7 Crescimento em S/A - - - + - S/A - - - - -
tiocianato
9K Oxidação de Fe^"*" S/A - - - - - S/A - - - + +
Agar nutriente Crescimento S/A + + + + - S/A - - - - -
2? Citrato Crescimento S/A - - + + - S/A - - - - -
Agar tiossulfato Deposição de S*' S/A - - - - + S/A + + + - -
m ( +) = positivo para os testes de crescimento; e inibição para os testes com NaCl e fosfato,
( - ) = negativo para os testes de crescimento; e ausencia de inibição para os testes com NaCl e fosfato;
(S/A) = Sem alteração no meio controle não inoculado; e

A procedência da amostra e as caracteristicas das cepas analisadas estão apresentadas na Tabela 17 .
CEPA ISOLADA

& i AGAR NUTRIENTE


AUTOTRÓFICAS ESTRITAS AUTOTRÓFICAS FACULTATIVAS

Meio S5 Meio 86
Acidofilicas Neutrofilicas
M e i o SG
Neutrofilicas i
Meio S5 i pH final > 5 . 0
Acidofilicas
pH final
4/ 2.0-2.8 i
Motilidade
Meio 8 8
pH final < 2 , 0 pH f i n a l ^ 6.6 - 5.0 I Grupo 7 |
Denitrífica
em O
anaerobiose I G r u p o l"|
3.5-2.8 iGrupoT]
Oxidação Fe2* vi/
IGrupo 4 ~ | Citrato
vi/
I Grupo S | |G^"PO 6 | 6,6 - 3.5
O
I Grupo 3 Grupo 1 a
{ Grupo O I
pH final
pH final > 6 . 5 6.5 - 5.0

Figura 3 0 : E s q u e m a para classificação de TMobacitIus e m grupos

vO
4.5. Resultados dos testes qualitativos de crescimento de cepas Isoladas
em meio de cultura elaborados com suspensões de materiais de
construção.

E s t e s testes foram idealizados c o m o objetivo de observar-se a possibilidade da


escoria granulada de a k o - f o m o (adicionada ao cimento Portland de ako-fomo, cimento
Portland c o n g o s t o e cimento Portland comum) ser utilizada como substrato p o r cepas de
bactérias isoladas do concreto

A composição química da escória utilizada c o m o substrato neste meio sólido


encontra-se na Tabela 10. T o d o s os elementos químicos necessários a u m meio mineral,
como p o r exen:^)lo o meio S6, são encontrados na escória granulada de aho-fomo.

P o r considerar que t a m b é m seria interessante observar a possibilidade destas cepas


crescerem somente com o s componentes da matriz do concreto exposto ao ambiente,
idealizou-se lun teste com u m meio de cultura de argamassa triturada já e?q)osta ao meio
ambiente. Neste caso, o meio foi preparado com a matriz analisada em estudo-de-caso. A
Tabela 23 siunariza os resultados obtidos para as cepas C 2 A r e C4RG.

Tabela 23 : Teste de crescimento das cepas C 2 A r e C 4 R G em meio de cultura sólido de


escória granulada de alto-fomo e meio de argamassa triturada

Origem da cepa Cepa M e i o sólido M e i o sólido

escória argamassa

Concreto com armadura exposta C2Ar


(reservatório de água- Inst. Butantan)

L o d o aderido ao concreto C4RG


(E.T.A.-Riacho Grande)

( + ) = teste positivo ( - ) = teste negativo


Obs: o s testes foram realizados em triplicata e apresentarm resultados idênticos

A Figura 31 mostra a cepa C2Ar crescendo sobre o meio sólido de uma suspensão
de escória granulada de alto-forao ( C O S I P A ) .

96
t í...-" ' • . j- * ' N ' -.-li . .'.J-.l. 'í'.- . - • *!l

1e

'li
r

Figura 31 : Crescimento em estría da cepa C 2 A r sobre o meio de escória granulada


de alto-fomo ( C O S I P A ) - Ampliação ~2 x.

4.5.1. Discussão dos resultados dos testes de crescimento em meios


elaborados com suspensões de materiais de construção

O s resultados obtidos neste teste de crescimento, em meios sólidos elaborados c o m


suspensão de meteríais de construção, permitem levantar a hipótese de que os nutrientes
necessários à sobrevivência da cepa C2Ar, autotrófica facultativa isolada do concreto,
p o d e m estar contidos nos próprios materiais de construção. N o entanto, é necessário que
sejam realizados estudos mais detalhados envolvendo anáhse química quantitativa que
permita detectar a transformação de cada substância, para investigar quais os nutrientes
consumidos e quais os produtos formados.

Várias tentativas foram efetuadas para observar o crescimento das cepas A l O T h e


AIOTf em meios líquidos contendo escória granulada de aUo-fomo, porém não foi possível
a obtenção de d a d o s significativos.

97
5. SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS

Constatado o feto de q u e as areias analisadas permitem o crescimento de


Thiobacillus, seria conveniente investigar, e m estudos posteriores, se cepas
neutrofilicas p r o d u t o r a s de ácido sulfiirico, e p o r isso i n ^ o r t a n t e s no
processo de biodeterioração do concreto, p o d e m crescer e m lun concreto
produzido c o m as areias d e onde fi)ram isoladas as cepas.
U m a maneira de investigar esta possibilidade é introduzir quantidades
elevadas de Thiobacillus ( 1 0 ^ ^ células/mL) na água de amassamento de u m
corpo de prova produzido com as areias e cimentos a serem e n t r e g a d o s .
Sugere-se t a m b é m efetuar experimentos e m temperaturas de incubação
diferentes, dentro da febea de variação climática brasileira. A ruptina
periódica de algims corpos de prova, com a aplicação da técnica dos tubos
múltiplos para o N M P de Thiobacillus p o d e mostrar a flutuação da
concentração de Thiobacillus, ao longo do t e m p o .

Para investigar se linhagens de espécies diferentes d o gênero Thiobacillus


podem utilizar o sulfeto de cálcio como fonte de energia, alguns
e?q)erimentos p o d e m ser efetuados:
O primeiro passo é observar se o sulfeto de cálcio, na forma de reagente p.a.,
p o d e ser oxidado em meio de cultura, em condições ótúnas de tertqjeratura e
aeração. E mçortante quantificar todos os possíveis compostos
mtermediários que venham a ser formados durante a oxidação bacteriana.
Caso este primeiro ensaio seja positivo, uma grande variedade de testes c o m
a escória granulada de alto-forao, e com chnentos com adição de escória
devem ser efetuados. Quando o s testes forem realizados com corpos de
prova, duas situações p o d e m ser observadas: com as bactérias moculadas na
água de amassamento, n o mterior do concreto, e, c o m as bactérias moculadas
na água de cura, ou seja na parte externa d o concreto.
O acompanhamento destes testes podem ser efetuados com anáhse
microbiológica periodica, anáhse química e difração de raios X , para observar
possível formação de compostos expansivos, c o m o p o r exemplo, a etringita,
a taumasita e a gipsita.

! ^
98

V" U V- Î- -
A investigação de Thiobacillus denitrificans e de bactérias r e d u t o r a s de
sul&to em amostras de solo e c o n c r e t o são de grande inqjortância para a
compreensão do fenômeno de biodeterioração do concreto em condições
anaeróbias e também da b i o c o r r o s ã o das armaduras de concreto.

Outra questão a ser investigada, é a resistência das bactérias isoladas a


diferentes doses de radiação ionizante.

Sugere-se investigar o u s o d e biocidas na prevenção da biodeterioração do


concreto, enfocando-se a questão da influência destes conq)ostos n o impacto
ambiental das áreas adjacentes ao repositório final para rejeitos radioativos e
a interferência de biocidas na qualidade d o concreto.

Quando algims locais candidatos estiverem estabelecidos para a instalação de


repositório final de rejeitos radioativos, sugere-se que sejam efetuadas
investigações sobre a microbiota destes locais. Um local cujo solo apresente
menor concentração de Thiobacillus e bactérias redutoras de sulfato, oferece
menor risco potencial d e ataque microbiológico.
N o caso da concentração destes microrganismos ser equivatente n o s solos
dos locais candidatos, sugere-se que sejam efemados estudos acelerados que
envolvam a microbiota local, o solo e os materiais de construção a serem
empregados. Espera-se q u e estes estudos possam prever uma composição de
materiais de c o n s t m ç ã o c o m menor potencial de ataque microbiológico local.
A Figura 32 mostra u m plano de trabalho para um estudo desta natureza.

99
Região de interesse

Fatores
Area preliminar
de
rettríçio \ i
Area Potencial
> 4-
Locais candidatos

INVESTIGAÇÃO DA MICROBIOTA

Microrganismos de interesse :
SELEÇÃO DE LOCAL
I Teste menor I
e Bactérias do gênero Thichacüba concentração
quantitativo
• Bactérías autotróficas facultativas
que oxidan tiossulfato menor
concentração equivalente
o Bactérias redutoras de sulfato risco

Cultura pura
i
TESTES PRELIMINARES E M MEIO SÓLIDO :

e Microrganismo isolado • vários tipos de cimentos


X
• Populações mistas de cultura pura a Areias de procedências diversas

Variável com crescimento

Corpos-de-prova inoculados com bactérias isoladas


e Incubados com solo do local candidato

Análise química e difração de raios X

SELEÇSO DE MATERIAIS DE CONSTRUÇÃO

Figura 32 : Plano de trabalho para estudo da biodeterioração do concreto envolvendo


seleção de local e seleção de materiais de construção para repositório final.

100
6. CONSIDERAÇÕES FINAIS

Quanto aos resultados deste trabalho concluiu-se que:

• A ocorrência de bactérias do gênero Thiobacillus em amostras de areia para


constmção civil e amostras de concretos expostos ao ambiente, é u m a
questão q u e ressalva a necessidade de se considerar o fator biológico
interferindo na durabilidade do concreto.

• Para pesquisa qualitativa d e Thiobacillus é possível utilizar a areia


diretamente c o m o inoculo n o meio de cidtura líquido. N o entanto, n ã o é
aconselhável a utilização do concreto duetamente c o m o inoculo, pois o
hidróxido d e cálcio so&e dissolução e alcahniza o meio líquido de cultura,
mascarando a viragem do mdicador ácido-base.

• Os meios mmerais utilizados para os testes presuntivos, enriquecimento e


isolamento de Thiobacillus, embora seletivos para uma determinada espécie
em questão, permitem o crescunento de outras hnhagens n ã o pertencentes à
espécie.

• Algumas cepas autotróficas obrigatórias foram identificadas p o r possuirem


algumas caracteristicas fisiológicas clássicas. Desta forma, identificaram-se
duas cepas de T.thiooxidans, uma cepa de T.ferrooxidans e u m a cepa de
T.thioparus. P o r outro lado, as cepas autotróficas facultativas móveis
apresentaram caracteristicas fisiológicas que dificuharam o p r o c e s s o de
identificação prelbninar.

• A s cepas de T thiooxidans isoladas da areia de Itaquaquecetuba, embora


sejam potencialmente as mais agressivas ao concreto por sua capacidade de
produção de ácido, são mibidas em p H inicial = 12 n o meio de cultura. Este
fato mdica que estas cepas devem ser inibidas pelo p H elevado da água do
p o r o do concreto

• O teste de crescimento em meio de cultura sóhdo elaborado c o m suspensão


de materiais de c o n s t m ç ã o p o d e ser utilizado como u m teste micial de
triagem envolvendo variedade ampla de materiais de construção e
microrganismos de interesse.

101

cor,-:::¿G ucmy. e t L N C R G I A N U C L C A R / S P - \h:•


Vários a p e c t o s observados a partir dos resultados obtidos, possibilitam traçar um
perfil geral a respeito da biodeterioração do concreto n o que se refere s possíveis condições
de u m repositório final de superficie para rejeitos radioativos a ser construído n o Brasil:

Quanto seleção de locais para a instalação de um repositório final :


Apesar da a m o s t r a g e m ter sido aleatória, a ocorrência de Thiobacillus foi
significativa n o s materiais de constmção analisados. P o r ser este o g ê n e r o d e bactérias mais
agressivo ao concreto pela produção de ácido sulfiirico, é recomendável efetuar-se anáüse
microbiológica d o solo n o s locais candidatos instalação de repositório fínal para rejeitos
radioativos. E s t e procedimento pode servir como u m parâmetro para auxiliar na seleção lun
local c o m m e n o r potencial de ataque microbilógico ambiental, e orientar a seleção de
materiais de construção.

Quanto questão da carbonatação do concreto:


Ao se efetuar u m paralelo c o m duas amostras de eflorescencia d o s concretos
estudados, n a s quais os testes presuntivos indicaram presença de Thiobacillus, constatou-se
que ambas apresentaram estalactites em regiões onde ocorria v a z a m e n t o de água. O
vazamento de água favorece a lixiviação da portlandita e faz c o m que esta a o t o m a r contato
com a atmosfera c o n t e n d o dióxido de carbono, seja carbonatada, reduzindo o pH da
superfície d o concreto, o que provavelmente favorece a colonização inicial de cepas
neutrofilicas d o meio ambiente para o concreto.

Segundo HODGKINSONÍ^^) dentro do repositório, p o d e o c o r r e r a formação de


dióxido de carbono c o m o produto do metabolismo de alguns microrganismos sobre os
compostos orgânicos depositados como rejeitos. O dióxido de carbono t e n d e a ser difimdido
n o concreto, carbonatando-o, caso isso ocorra, criam-se condições mais favoráveis para a
colonização de microrganismos na face interna do repositório. P o r t a n t o , a ocorrência desse
fenômeno é também u m parâmetro importante a ser considerado na prevenção da
biodeterioração do concreto. A proteção da face interna com uma resina protetora pode ser
adotada c o m o uma medida preventiva.

102
Quanto seleção dos materiais de construção:
Os testes qualitativos d e crescimento sobre os meios de cultura sólidos, contendo
s u ^ e n s õ e s de materiais de c o n s t r u ç ã o , indicam que a cepa C 2 A r p o d e obter seus nutrientes
a partir destes materiais.

É preciso esclarecer se o s materiais de constmção p o d e m f o m e c e r nutrientes que


venham a ser transformados em p r o d u t o s agressivos pelos microrganismos integrantes da
microbiota superficial do c o n c r e t o .

Atualmente as escorias granuladas de aho-fomo são adicionadas a o s cunentos


Portland de alto-fomo, cimento Portland composto e cimento Portland comiun. A escória
apresenta cerca de 1% de sulfeto de cálcio. P o r se tratar de u m c o m p o s t o inorgânico de
enxofre reduzido, esta substância é potencialmente oxidável p o r bactérias d o género
Thiobacillus neutrofihcas c o m o sugerido por W A K S M A N & JOFFEÍ^^).

Por uma questão preventiva de biodeterioração do concreto, até q u e se confirme a


impossibihdade de cepas Thiobacillus oxidarem este sulfeto, estes tipos de cimento n ã o
devem ser recomendados para a construção de reposhórios finais para rejeitos radioativos.

Entre as causas reconhecidamente geradoras de patologias do concreto, a influencia


dos microrganismos c o m o agente patogénico, nas obras da engenharia civil, n ã o têm sido
esmdada, excetuando-se o s t u b o s de esgoto. Sugere-se que fiíturamente o s estudos sejam
mais a n ç l o s , incluindo este parâmetro. A multidiciplinaridade na ciência, é, t a m b é m neste
caso, benéfica ao conhecünento e aprofimdamento do assunto.

103
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

L A L L S O P P , D . & K E N N E T H J. S. Introduction to Biodeterioration. L o n d o n , Edward


Arnold, 1986.

2 . A S S O C I A Ç Ã O B R A S I L E I R A D E N O R M A S T É C N I C A S . Areia normal para ensaio de


cimento. S ã o P a u l o , 1977. ( N B R 7214/82)

3 . A S S 0 C I A Ç À 0 B R A S I L E I R A D E N O R M A S T É C N I C A S . Análise quimica de cimento


Portland - Determinação com dicromato de potássio. S ã o P a u l o , 1977. (NBR
5742/77).

4 . A S S 0 C I A Ç Ã 0 B R A S I L E I R A D E N O R M A S T É C N I C A S . Análise química de cimento


Portland - Determinação de residuo insoiúvel. São Paulo, 1977. ( N B R 5744/89)

5.ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE NORMAS TÉCNICAS. Cimento Portland comum.


São Paulo, 1991. ( E B - 1 / 9 1 )

, 6 . A S S 0 C I A Ç Ã 0 B R A S I L E I R A D E N O R M A S T É C N I C A S . Cimento Portland composto.


São Paulo, 1991. ( E B - 2 1 3 8 / 9 1 )

* 7.ASS0CIAÇÃ0 BRASILEIRA DE NORMAS TÉCNICAS. Cimento Portland de alto-


• forno. São Paulo, 1991. (EB-208)

8.ASS0CIAÇÃ0 BRASILEIRA DE NORMAS TÉCNICAS. Cimento Portland


pozolânico, cimento Portland comum e cimento Portland composto com adições de
materiais pozolànicos - Análise química - Método de referência. Método de ensaio.
São Paulo, 1991. ( N B R 8347/91)

9.ASS0CIAÇÃ0 BRASILEIRA DE NORMAS TÉCNICAS. Cimento Portland -


Determinação de anidrido sulfúrico. Método de ensaio. São p a u l o , 1989. (NBR
5745/89)

lO.ATÊNCIO, D. & H Y P Ó L l T O , R. Soluções de intemperismo natural e simulado de sulfetos


de Itaquaquecetuba- São Paulo. An. AcadBras.Cienc, 60 ( 3 ) : 3 0 5 - 3 1 9 , 1988.
I

11.ATLAS, R, M. Microbial Ecology: Fundamentals and applications. Philçpines,


I Addison-Wesley,1981.

104
1 2 . B I C Z 0 K , I. La corrosion del hormigón y su proteción. Bilbao ( E s p a ñ a ) , Uribitarte,
1972.

1 3 . B 0 R Z A N 1 , W. Corrosão p o r microrganismos. In: A Q U A R O N E , E . ; B O R Z A N I , W . ;


A L M E I D A LEMA U . D E . Biotecnologia- Tópicos de microbiologia Industrial. São
Paulo, Edgard Blücher, 1975.

1 4 . B U C K L E Y , L. P.; P H I L I P O S E , K. E ; T O R O K , J. Engineered barriers and their mfluence


on source behavior. In: INTERNATIONAL ATOMIC ENERGY AGENCY.
Management of Low and Intermediate Level Radioative Wastes: proceedings of
international symposium on...held in Stockholm, May 16-20 1988. Vienna, 1989.
p. 147-161 ( I A E A - S M - 3 0 3 / 1 2 0 )

1 5 . C A L M E T , D. P.. Ocean disposal of radioactive waste: Status report. Int At Energy


Agency BulL, 4 : 4 7 - 5 0 , 1989.

1 6 . C 0 L A S A N T 1 , R.; C O U T T S , D . ; P U G H , S.Y.R. A N D R O S E V E A R , A.. Microbiology


radioactive waste disposal; review of the N I R E X research p r o g r a m , January 1989.
HarweU (UK), United K i n g d o m Nirex, Ltd., Mar 1990. ( N S S / R 1 3 1 )

17.C0MISSÀ0 NACIONAL DE ENERGIA NUCLEAR Gerência de rejeitos radioativos


em instalações radiativas. Rio de Janeiro, 1985. ( C N E N - N E - 6 . 0 5 )

1 8 . C 0 M I S S Ã 0 NACIONAL DE ENERGIA NUCLEAR. Seleção e escolha de locais para


depósitos de rejeitos radioativos. Rio de Janeuo, 1989. ( C N E N - N E - 6 . 0 6 )

19.COMISSÃO NACIONAL DE ENERGIA N U C L E A R Licenciamento de instalações


radiativas. Rio de Janeiro , 1984. ( C N E N - N E - 6 . 0 2 )

2 0 . C O M P A N H I A DE T E C N O L O G I A D E S A N E A M E N T O A M B I E N T A L . Determinação
do N.M.P. de Bactérias Redutoras de Sulfato (Desulfovíbrio) pela Técnica dos Tubos
Múltiplos. São Paulo, 1989. (L5.210)

2 1 . C O M P A N H I A DE T E C N O L O G I A DE S A N E A M E N T O A M B I E N T A L . Thiobacillus -
Determinação do Número Mais Provável pela Técnica dos Tubos Múltiplos. São
PauIo,1991. (L5.217)

22.COMPANH1A DE T E C N O L O G I A DE SANEAMENTO AMBIENTAL. Bactérias


Heterotróficas - Contagem em placas. São Paulo, 1986 (L5.201)

105

COW
23.COMPANHIA D E TECNOLOGIA DE SANEAMENTO AMBIENTAL. Isolamento e
Contagem de fungos em Águas, Esgotos e Resíduos sólidos. São Paulo, 1988.
(L5.204)

24.COMPANHIA D E TECNOLOGIA DE SANEAMENTO AMBIENTAL. Método semi-


automático para determinação de Nitrogênio KJEDAHL Total em água. São
Paulo, 1982. (Relatório nO 034/82/GAG)

25.COMPANHIA D E TECNOLOGIA DE SANEAMENTO AMBIENTAL. Método semi-


automático para determinação de Fósforo Total, Inorgânico, Orgânico e Fosfato
Ácido Hidrolizável em água. São Paulo, 1981. ( 0 3 3 / G A G )

2 6 . D R O Z D , G.Ya. Activity of microorganisms in p o r e s o f concrete. Appl Biochenu


Microbiol , 2 2 ( 6 ) : 6 9 7 - 7 0 1 , 1986.

2 7 . E M M E L , T ; B R I L L , H ; SAND. W. A N D B O C K , E. Screening for biocides t o inhibit


biogenic sulfiiric acid corrosion in sewage pipelines. In: H O U G T O N , D.R.; SMITH,
R,N.; E G G I N S , H . O . W . eds. Biodeterioration 7: selected papers present at the seventh
International Symposium, held in Cambridge, Set.6-11,1987. London, Elsexier, s.d.
p . 118-22.

2 8 . F O R D , T. & M I T C H E L L , R. The ecology of Microbial Corrosion. Adv. Microb. EcoL ,11:


2 3 1 - 2 6 3 , 1990.

2 9 . F R A N Z E N , H. R.; E I D E L M A N , F.; P O N T E D E I R O , E.. W a s t e management in BrazU. In:


INTERNATIONAL ATOMIC ENERGY AGENCY. Management of Low and
Intermediate Level Radioative Wastes: proceedings of international symposium
on...held in Stockholm, May 16-20 1988. y/ierm&, 1989. ( I A E A - S M - 3 0 3 / 1 2 0 )

30.GARCIA J R , O. Isolamento e Purificação de Thiobacillus ferrooxidans e sua


aplicação na biometalurgia do Urânio. Campinas, 1989. (Tese de doutoramento do
D e p a r t a m e n t o de Genérica da Universidade Estadual de Campmas)

3 1 . G R A G N O L I N O , G. & T U O V I N E N , O .H. The role of sulphate-reducmg and sulphur-


oxidizing bacteria m the localized corrosion of u o n - b a s e aUoys - a review. Int
Biodeterior. , 2 0 ( 1 ) : 9-26, 1984.

106
3 2 . H O D G K I N S O N , D . P , and C O O P E R M. J ., eds. Nirex Safety Assessment Research
Programe. Annual R e p o r t for 1985/86 Nirex Report N ^ 34. H a r w e l l ( U K ) , United
Kingdom Nirex, L t d . , Jan. 1987. p: 44-51 (UKN-34)

3 3 . H U T C H I N S O N , M. ; J O H N S T O N E , K. 1. ; W H I T E , D . T h e t a x o n o m y o f certam
ThiobacilH. / . Gen. Microbiol , 4 1 : 357-366, 1965.

3 4 . H U T C H I N S O N , M. ; J O H N S T O N E , K. I. ; W H I T E , D . T h e t a x o n o m y o f Anaerobic
Thiobacilü. J. Gen. Microbiol , 4 4 : 17-23. 1967.

35.HUTCHINSON, M. ; JOHNST0NE,K.I. ; WHITE, D. Taxonomy of the genus


Thiobacillus: t h e o u t c o m e of numerical taxonomy apphed t o t h e g r o u p as a whole. /.
Gen. Microbiol., 5 7 : 3 9 7 - 4 1 0 , 1969.

36.INSTITUTO DE P E S Q U I S A S TECNOLÓGICAS DO E S T A D O D E S Ã O PAULO.


Boletim IPT 25, 1940.

37.INTERNATIONAL ATOMIC ENERGY AGENCY. Shallow ground disposal of


radioactive waste. Vienna, 1981. ( I A E A - S S - 5 3 )

38.INTERNATIONAL A T O M I C ENERGY AGENCY. Design, construction, operation,


shutdown and surveillance of repositories for solid radioactive wates in shallow
ground Vienna, 1984. (IAEA-SS-63)

39.INTERNATIONAL A T O M I C ENERGY AGENCY. Safety análisis methodologies for


radioactive waste repositories in shalow ground. Vienna, 1984. ( ( I A E A - S S - 6 4 )

40. I N T E R N A T I O N A L A T O M I C E N E R G Y A G E N C Y . Acceptance criteria for disposal of


radioactive wastes in shallow ground and rock cavities. Vienna, 1985. (IAEA-SS-71)

4 1 . K A R A V A I K 0 , G. I. ; Z H E R E B Y A T E V A , T. V. Bacterial corrosion o f concrete. Dokl


Akad. Nauk S.S.S.R., 306{2): 477-481, 1989.

42.KELLY, D. P. Biochemistry of the chemohtotrophic oxidation o f morganic sulphur. Philos.


Trans. Soc. Lond B , 298: 499-528,1982.

43. K E L L Y , D. P. & H A R R I S O N , A. P. Aerobic chemolithotrophic bacteria and associeted


organisms. Genus Thiobacillus, Beijerinck 1904 b , 597 j j j . Staley, J. T. ; Bryant,

107
M. P. ; Pfening, N . T . and Holt, J.R. (eds). Bergey's manual of systematic bacteriology.
B a h i m o r e , WiUiams & Wilkings, 1989, V . 3 ; sec.20 p . 1842-1853.

4 4 . K E R G E R , B . D . ; N I C H O L S , P. D . ; A N T W O R T H , C. P . ; S A N D . W . ; B O C K , £ . ; C O X ,
J.C.; A N G W O R T H , T. A. and W H I T E , C. D.. Signature fetty acids in t h e polar lipids
of acid-producing Thiobacillus spp,: metoxy, cyclopropyl,a^ha-hidroxy-cyclopropyl and
branched and normal monoenoic fetty acids. FEMS Microbiol Ecol , 3 8 : 61-11, 1986.

4 5 . K E R G E R , B . D . ; N I C H O L S , P. D. ; S A N D , W. ; B O C K , E. ; W H I T E , D . C. Association
of acid p r o d u c i n g thiobacilh with degradation of concrete: analysis b y "signature" fetty
acids from t h e polar hpids and hpopolysaccharide. / . Ind. Microbiol , 2: 6 3 - 6 9 , 1987.

4 6 . K U E N E N , J.G. & B E U D E K E R , R. F. Microbiology o f thiobacilh and other sulphur-


oxidizing autotrophs, mixotrophs and heterotrophs. Philos. Trans. Soc Lond. B 298:
4 7 3 - 4 9 7 , 1982.

47. L A T O R R E , W . C. & G A Y L A R D , C.C. coods. Biodeterioração: anais do Simpósio


Latino americano de... realizado emCampos do Jordão, 30 Agosto - 2 Setembro,
1992.

4 8 . L E N I N G E R , A. L. Princípios de bioquímica. São Paulo, Sarvier, 1988.

4 9 . L O P E S , E. S.; O L I V E I R A , M. L. C. ; IGUE, T. Levantamento da atividade de


microrganismos envolvidos na oxidação do enxofre em solos do estado de São Paulo.
In: C I Ê N C I A d o solo: Anais do XV congresso brasileiro de... , realizado em
Campinas, 14 a 17 de j u n h o , 1975.

5 0 . M c G A H A N , D. J.. Survey of microbiological effects in low-level radioactive waste


disposed of to land. Harwell, United Kingdom Atomic Energy Authority, 1987.
( A E R E R 12477).

5 1 . M I L D E , K. ; S A N D , W. ; W O L F F , W . ; BOCK, E. Thiobacilh of the c o r r o d e d concrete


walls of the H a m b u r g sewer system. / Gen Microbiol., 129: 1327-1333, 1983.

5 2 . M O O S A V I , A. N . ; D A W S O N , J. L.; KING, R. A. The effect of sulphate-reducmg bacteria


on t h e corrosion of reinforced concrete. In: Dexter S.C. ed. Biologically induced
corrosion: Proceedings of the International conference on...held in Gaithersburg,
M.D., June, 1985. Houston, T X . , Nat. Assoc. of Corrosion Engmeered, 1985. p. 2 9 1 -
3 0 8 . (International Corrosion Conference Series; N A C E - 8 ) .

108
5 3 . M O U R A , R.de A. Técnicas de Laboratório 3" ed. Rio de Janeiro, A t h e n e u Rio de Janeiro,
1987. p : 188.

5 4 . P A N K H A M A , I. P . Hidrogen metabolism in Sulphate Reducing Bacteria and its role in


anaerobic corrosion. Biofouling. , 1: 27-47, 1988.

5 5 . P A N K H U R S T , E. S.. Polarografic evidence of the production of polythionates dming the


bacterial oxidation o f thiossulfate. J. Gen Microbiol , 3 4 : 4 2 7 - 4 3 9 , 1964.

56.PARKER, C. D . T h e corrosion of concrete. I. The isolation o f a specie o f bacterium


associated with t h e corrosion of concrete exposed t o atmosphere containning hidrogen
sulphide. / . Biol Exper. Med ScL 2 3 : 81-90, 1945.

57.PARKER, C. D . T h e corrosion of concrete. H. The ftmction o f TJiiobacilitis concretivorus


(nov.spec) in t h e corrosion of concrete exposed t o atmospheres containing hidrogen
sulfide. / . Biol Exper. Med. ScL 2 3 : 91-98, 1945.

58.PARKER, C. D . & PR1ST,J. The oxidation of morganic c o m p o u n d s o f sulphur by various


sulphur bacteria. / . Gen. Microbiol 8: 344-364, 1953.

59.PARKER, C. D. Bacteriology of corrosion process. In: MELBOURNE AND


METROPOLITAN BOARDOF WORKS. Hidrogen Sulphide Corrosion of Concrete
Sewers. M e l b o u r n e , 1965. Pt.6. Section 1 (Technical Paper n ^ A.8).

60.PARON, M. R & S A N T O S , J. E. Estimativa do n ú m e r o de tiobacilos em sedimentos


aquáricos (represa d o L o b o , Brotas - Ituapma, SP). Ciênc. e Cult 36(9): 1592-
1596,1983.

6 1 . P A R S O N S , P. J.. Movement of radioactive wate through soil 3. Investigating the


migration of fission products from high-ionic liquid deposited in soil. ChaUi River,
Ontario, A t o m i c Energy of Canada, Aug. 1961. ( C E R - 1 0 1 8 ; A E C L - 1 3 2 5 )

6 2 . P E D E R S E N , K.. Potential efiFects of bacteria on radionuchde transport from a Swedish


high level nuclear w a s t e repository. Technical Report SKF-TR 90-05, 1990.

63.PERFETTIN1, J.. Étude de l'altération d'un matériau d'esenrobage des déchets


radioactifs, le ciment CPA, par des microorganisms hétérotrophes isolés de milieux
naturels. Marseille. 1989. (Thèse de Docteur en Sciences. Université de Droit,
d'Économie et de Sciences d'Aix-Marseille III).

109
6 4 . P H I L I P O S E , K. E. 500 Years concrete for a radioactive waste repository. Chalk River,
Ontario, Atomic E n e r g y o f Canada Limited, March 1988. ( A E C L - 9 7 2 1 ) .

6 5 . R I B A S SILVA, M . Étude de la microstructure du béton sous influence de variations


hygrométriques importantes. Paris, 1990. (Thèse doctorat de L ' É C O L E N A T I O N A L E
DES PONTS ET CHAUSSÉSS)

6 6 . R I G D O N , J. R & B E A R D S L E Y , C . W . Corrosion of concrete by A u t o t r o p h e s . Corrosion,


14: 206-208, 1958.

67.RINGEARD,C. Ultimate disposal of low and mediiun radioactive w a s t e m France. In:


B A S C H W I T Z , R.; K O H O U T , R ; MAREK, J ; R I C H T E R , P. I. ; S L A T E , S. C.eds.
Proceedings of the 1993 International Conference on Nuclear Waste Management
and Environmental Remediation helding on Prague, September 5-11,1993. Vol 3 :
p . 17-24.

6 8 . R O S E , A H . Economic Microbiology Vol 6: Microbial Biodeterioration. London,


Academic, 1981.

6 9 . R U P E L A , O.P. & T A U R O , P. Isolation and characterization of thiobacillus from alkah


sods. Soil BioLBiochem. , 5: 891-897, 1973.

7 0 . R U S H B R O O K , P.E.. A survey of possible microbiological effects withm shallow land


disposal sites designed to accept intermediate-level radioactive wastes. Harwell,
U K A E A Atomic Energy Research Estabihshment, 1985. ( A E R E R 11408)

7 1 . S A N D , W. & B O C K , E. Concrete corrosion m the Hamburg sewer system. Environ.


Technol. Lett , 5: 517-528, 1984.

7 2 . S A N D , W. & B O C K , E. Biogenic sulfiiric acid attack m sewage systems. In: H O U G T O N ,


DR; SMITFI, R N . ; E G G 1 N S , H . 0 . W . eds. Biodeterioration 7: selected papers
present at the seventh International Symposium, held in Cambridge, Set6-ll,1987.
London, Elsexier, s.d. p . 113-17.

73. S A N D , W. & B O C K , E.. Biodeterioration of ceramic materials by biogenic acids. Int


Biodeterior. , 21. 175-183. 1991.

110
74. S A N D , W. & B O C K , E.. Biodeterioration o f mineral materials by m i c r o o r g a n i s m s -
Biogenic sulfiiric and nitric acid corrosion o f concrete and natural stone. GeomigrobioL
/ , 9 : 129-138, 1991.

7 5 . S A N D , W. , B O C K , E & W H I T E , C. D. Biotest system for rapid evaluation o f concrete


resistence t o sulphur-oxidizing bacteria. Mat Performance, 26 N 0 3 : 14-17, 1987.

76.SAND,W.. Importance o f hidrogen sulfide, thiosulfete, methyhnercaptan for g r o w t h o f


thiobacilli during simulation of concrete corrosion. AppL Environ. Microbiol , 53(7):
1645-1648, 1987.

77.SHIRAKAWA, M . A., A T E N C I O , D. , G A R C I A Jr., O e RZYSKI, B. M.. Ocorrência de


Bacterias do gênero Thiobacillus associadas a processo de intemperismo d e sulfetos da
Formação Itaquaquecetuba, Bacia de São Paulo An. Acad. Bras. Ciênc. , 6 3 ( 1 ) : 8 9 - 9 0 ,
1991.

78.SHIRAKAWA, M.A., G A R C I A Jr, O E R Z Y S K I , B. M.. Isolamento e purificação de


Thiobacillus ferrooxidam e Thiobacillus thiooxidam do Porto de areia de
Itaquaquecetuba - São Paulo. Rev. Microbiol , 22, ( 3 ) , s u p l í , 1991.

79.SHIRAKAWA, M A., S A T O , M. I., S A N C H E S , P.S., C I N C O T T O , M . A. & R Z Y S K I , B .


M. Deterioração do concreto associada ocorrência de Thiobacillus. In: L A T O R R E ,
W C. & G A Y L A R D , C.C. coords. Biodeterioração: anais do Simpósio Latino
americano de ... realizado em Campos do Jordão, 30 Agosto - 2 Setembro, 1992.
p.200-10.

80. S I L V E R M A N , M. P. & L U N D G R E N , G.. Studies on the chemoautotrophic iron bacterium


Ferrobacillus ferrooxidam.1. An improved medium and a har\'estmg p r o c e d u r e for
securing high ceU yields. / . Bacterial, TT.òAl-òAl. 1959.

81.SUAREZ, A. A., R Z Y S K I , B . M., M A R U M O , J. T , S H I R A K A W A , M . A. and M I Y A K E ,


E. T.. Evaluation of engineered barrier materials for surface disposal facilities.
(Paper present at the 1st Research Coordinated Meetmg, held m Sellafield,21-25,
October), 1991.

82.TAYLOR, B. F.; H O A R E , D. S.; H O A R E , S. L.. Thiobacillus denitrificam as an obhgate


chemohthotroph Isolation and growth studies. Arch. Mikrobiol , 7 8 : 193-204, 1971.

Ill
8 3 . T A Y L O R , C. B. & H U T C H I N S O N , G. H.. C o r r o â o n o f concrete caused by sulphur-
oxidizing bacteria. J.S.C.I. ,66. 54-57, 1947.

84.THORNTON JK, R T. Acid attack of concrete caused by sulfiu- bacteria action. / Am.
Cone Inst, 7 5 : 5 7 7 - 5 8 4 , 1978.

8 5 . T R U D I N G E R , P . A . M e t a b o h s m o f thiosulfate and tetrathionate by heterotrophic bacteria


from sou. / . BacterioL 93(3): 550-559, 1967.

8 6 . T U O V I N E N , O. R & H S U , J. Aerobic and anaerobic microorganisms m tubercules of the


Columbus,Ohio, w a t e r distribution system AppL Environ. MicrobioL , 44(N03): 7 6 1 -
764, 1982.

8 7 . V I D E L A , H. A. C o r r o s ã o Microbiológica. Editora Edgard Blücher L t d a . , 1 9 8 1 .

88.VISHNLAC, W. & S A N T E R , M . The Thiobacilh. BacterioL Rev., 2 1 : 195-213. 1957.

8 9 . V O G E L , A. I. Análise inorgânica quantitativa. 4^ ed. .Rio de Janeiro. Guanabara Dois,


1981.

9 0 . V O I N O V I T C H , I. L'analyse rapide des ciments. Chim. AnaL , 50(6): 334-348, 1968.

9 1 . W A K S M A N , S. & J O F F E , J. S. Microorganisms concerned m the oxidation o f sulfiir m


the soil. II. Tliiobacillus thiooxidans, a new sulfiu-oxidiziag organism isolated from the
soil. J. BacterioL , 7: 239-257,1922.

9 2 . W O O L L E Y , D.; J O N E S , G L . & H A P P O L D , F C . Some metabohc differences between


Thiobacillus thioparus, T.denitrificans and Tthiocyanoxidans J.gen MicrobioL ,
29:311-316, 1962.

9 3 . Z U L O A G A , P.; G R Á V A L O S , J. M. El Cabril a near surface repository of I/LLW in Spam


In: B A S C H W I T Z , R ; K O H O U T , R ; M A R E K , J ; R I C H T E R , P. I. ; S L A T E , S. C. eds.
Proceedings of the 1993 International Conference on Nuclear Waste Management
and Environmental Remediation helding on Prague, September 5-11,1993. Vol 3:
p.25-30.

112
ANEXO I
SOLUÇÕES

o Solução de traços de elementos i^'^hA


(solução usada na c o m p o s i ç ã o do meio de Postgate modificado)

H3BO3 2,90 g
MnCl2.4H20- 1,80 g
i ZnS04.7H20 0,20 g
[(NH4)6Mo7024.4H20] 0,03 g
C0CI2.6H2O 0,08 g
FeS04.7H20 1,90 g
; CUSO4.7H2O- 0,10 g
Água destuada 1000 m L

Pesar os reagentes e acrescentar 1000 m L de água destUada e homogeneizar. Aquecer


lentamente até completa dissolução, t o m a n d o cuidado para que não seja atinjida a temperatura de
ebuüção. Esterilizar p o r filtração c o m membrana de porosidade 0,20 p m . A r m a z e n a r em frasco
I e s c i u o , b e m v e d a d o , em geladeira.

Água de dilulçãoí^'')

Solução estoque A 1,25 mL


Solução estoque B 5,00 m L
Água destilada lOOOmL
p H final após esterilização: 7,2 ± 0,1

Preparar a solução e s t o q u e A com a seguinte composição:


KH2PO4 34,00 g
Água destilada 1000 m L

Dissolver o fr)sfato de potássio monobásico em 500 m L de água destilada, ajustar o pH


para 7,2 ± 0 , 1 , com solução de hidróxido de sódio IN e completar o v o l u m e para um htro de
água destilada. Esterhzar e m autoclave a 121 ±2^C durante 15 minutos. A r m a z e n a r em geladeira.
A n t e s da utilização da solução estoque A, deve-se verificar se não há evidencia de contaminação
microbiana. E m caso afirmativo, descartar a solução.

Preparar a solução e s t o q u e B com a segumte composição:


MgCl2.6H20 81,10 g
Água destilada 1000 mL

Dissolver o cloreto de magnesio em 500 mL de água destilada e completar o volume para


lun litro de água destilada; armazenar em geladeira.

113
Adicionar 1,25 m L da solução e s t o q u e A e 5 m L da solução estoque B e conq)letar o
volume para u m litro d e água destilada. Distribuir em frascos de diluição, quantidades adequadas
que assegurem, a p ó s esterilização em autoclave a 121 ± ^ C durante 15 min., volumes d e 90 mL
+-2mL.

• R e a g e n t e s p a r a c o l o r a ç ã o d e G r a m (^2) .J

Cristal violeta de H u c k e r :
Solução A :
Cristal violeta 2 g
Álcool etílico a 9 5 % - 20 m L

Solução B :
Oxalato de amónio 0,8 g
Água destilada 80 m L
Filtrar e m papel de filtro após 24 h s

Lugol:
N u m gral, j u n t a r 1 g de iodo, 2 g de iodeto de potássio e triturar. Adicionar e m pequenas
quantidades o v o l u m e de 300 m L de água destilada. Preparar em quantidade suficiente que seja
utilizada antes de 30 dias.

C o r a n t e d e f u n d o d e H u c k e r (solução e s t o q u e ) :
Dissolver 2,5 g de safranina em 100 m L de álcool etílico. Para usar, jimtar 10 m L desta
solução estoque em 90 m L de água destilada.

H4
ANEXO 11

MEIOS DE CULTURA

• Meios de cultura para T.thioparus


M e i o líquido de P o s d a t e modificado para T.thioparusi^^) (em concentração
simples)

Na2S203.5H2a 5,00 g
NH4CI 1,00 g
K2HPO4 3,00 g
CaCl2 0,10 g
MgS04.6H20 0,50 g
Solução t r a ç o s de elementos 1,00 m L (ver A n e x o O)
Vermelho de fenol- 0,018 g
Água destilada 1000 m L
p H final a p ó s esterilização 7,4
Pesar t o d o s os reagentes, exceto a solução t r a ç o s de elementos e acrescentar 1000 m L de
água destilada fiia. Aquecer, agitando freqüentemente até a completa dissolução dos reagentes,
t o m a n d o cuidado para n ã o atmgir a temperatma de ebuhção. Ajustar o p H para 7,4 com N a O H -
I N . Esterilizar em autoclave a 121 ± 2^C durante 15 mm. Estabilizar o meio a temperatiua de
450c a 5 0 ^ 0 e juntar 1,0 m L da solução de t r a ç o s de elementos estéril recentemente preparada.
Distribuir assepticamente, c o m agitação constante, em tubos de ensaio esterilizados. Armazenar
sob refrigeração p o r período máximo de duas semanas.
Para a elaboração do meio de concentração dupla, pesar o d o b r o de reagentes para o
m e s m o volume de meio de concentração simples.

Meio sólido d e P o s t g a t e modificado p a r a T.titioparus


Pesar a mesma quantidade de reagentes para o preparo de 1 htro de meio hquido de
Postgate modificado para T.thioparus, porém adicionar 500 m L de água destilada, obtendo um
meio de concentração dupla. E m outro erlenmeyer pesar 15 g de agar e adicionar 500mL de água
destilada. Aquecer até completa dissolução d o agar. Autoclavar separadamente e misturar o
conteúdo dos dois dos frascos quando ambos atigirem a temperatura aproximada de 50^C, para
se obter o meio sóhdo de concentração simples. Distribuir cerca de 20 m L e m placas de Petri
previamente esterilizadas.

115
M e i o líquido A T C C 238 a d a p t a d o para T.thioparus ( 0 , 5 % de tiossulfato de sódio)

KH2PO4 0,lg
NH4CI- 0,lg
MgCl2.6H20- 0,lg
CaCl2 0,lg
Na2S203.5H20- 5,0g
Água destilada lOOOmL
Pesar todos os c o n ç o s t o s , dissolvê-los separadamente, juntar as soluções e c o n ç l e t a r o
volume para 1000 mL com água destilada. Ajustar o p H c o m N a O H I N para 7,5 ± 0,2 Esterilizar
em autoclave a 121 ± 2^C durante 15 minutos. Armazemar e m geladeira por imi período máximo
de duas semanas.

• Meios de cultura para T.thiooxidans Q ii

M e i o Uquido de Postgate modificado para T thiooxidans ( ^ l ) ( c o n c e n t r a ç ã o simples)

Na2S203.5H20- 5,00 g
NH4CI- 1,00 g ^ K
K2HPO4 3,00g
CaCl2 0 , 1 0 g o!L
• MgS04.7H20 0,50 g k.
Solução traços de elementos- 1,00 m L (ver Anexo I)
Vermelho de f e n o l - 0,018 g
Verde de bromocresol 0,01 g
Água destilada 1000 m L
p H final após esterilização : 4,5
Proceder da mesma forma c o m o para o preparo d o meio hquido d e P o s t g a t e modificado
para T.thioparus, ajustar o p H para 4,5 c o m H2SO4 - ION.

Meio sólido de Postgate modificado para T.thioxidans


Pesar os mesmos reagentes que n o item anterior e dissolver em 500 m L de água destilada,
para obter concentração dupla. Em fiasco separado, pesar 15 g de agar e adicionar 500 m L de
água destilada. Aquecer até completa dissolução d o agar. Autoclavar os frascos, separadamente,
a 121 ±20C p o r 15 min.. Quando as soluções atingirem uma temperatura aproximada de 50OC,
misturar o conteúdo dos frascos e distribuir o meio em placas de Petri, previamente esterilizadas.

116
Meio líquido A T C C 2 3 8 a d a p t a d o c o m 1 % de 8 «
KH2PO4 0,lg
NH4CL- 0,lg
MgCl2.6H20- 0,lg
CaCl2 0,lg
Enxofre elementar 10,0g
H2O destilada lOOOmL
Dissolver os sais separadamente e m água destilada e c o n ç l e t a r o volume até 1000 m L ,
ajustar o p H para 4,2 c o m H C l e esterilizar e m autoclave a 121 ± 2^C p o r 20 min.
Esterilizar separadamente o enxofre por tindaUzação ( 3 0 minutos e m vapor fluente
dtuante três dias consecutivos). Utilizar 1 g de enxofre para 100 m L de meio líquido.

Meio hquido A T C C 2 3 8 a d a p t a d o c o m 1 % de S» ( p H =12)


Proceder como n o meio anterior, ajustando o p H final c o m N a O H 10 N

Meio sólido A T C C 238-tiossulfato-agar(30) Ç^t


KH2PO4 0,lg
NH4C 0,lg
MgCl2.6H20 0,lg
CaCl2 0,lg
Na2S203.5H20- 5,0g
Água destilada lOOOmL
Agar 15g
Dissolver o s sais, separadamente, em água destilada até completar 500 m L de volume,
ajustar o p H para 4,2 c o m H C l e esterilizar e m autoclave a 121 ± 2^C p o r 20 min. Dissolver
separadamente o agar em água destilada e esterilizar nas mesmas condições. A p ó s a esterilização
esperar que ambas as soluções atinjam temperatura de aproximadamente 50OC, e misturar as
duas soluções Este esfiiamento prévio do agar é fundamental para evitar a sua hidrólise. A p ó s a
mistma das duas soluções distribuir o meio em placas de Petri, previamente esterilizados.

Meio 9 K - S 0 (21)
Solução 1: (sais de base)
(NH4)2S04 3,00 g
KCl 0,10 g
K2HPO4 0,50 g
MgS04.7H20- 0,50 g
Ca(N03)2 0,01 g
H2SO4(10N)- 1,00 m L
Água destilada 1000 m L
p H final após esterilização : 2,8 a 3,0
Para o preparo desta solução, pesar os reagentes e acrescentar 1000 m L de água destilada
fiia. Ajustar o p H para 2,8 a 3,0.com H2SO4 -10 N. Dissolver os sais p o r aquecimento agitando
freqüentemente até a ebulição, evitar aquecimento excessivo. Esterilizar em autoclave a 121 ±
2^C durante 15 min. A p ó s a esterilização, estabilizar a temperatura para 5 5 ° C . Adicionar 1 g de
enxofre elementar, esterilizado separadamente por tindalização, para cada 100 ml de meio Hquido
da solução 1.

11
• Meios de cuitura para T ferrooxidans
M e i o h q u i d o 9K-re2+(21)

Solução 1: (sais de base)


Preparar a mesma formulação da Solução 1 d o meio 9K-S**, p o r é m , adicionar 700 ml de
água destilada.

Sohição 2:
FeS04.7H20- 44,22 g í
Água destilada, qsp 300 m L
Pesar 44,22 g de sulfato ferroso, colocar e m u m balão voliunétrico d e 300 m L e
c o n ç l e t a r o volume c o m água destilada acidificada c o m H2SO4 - lON ( p H 2,8). Homogeneizar
até completa dissolução esterilizar p o r filtração em membrana com porosidade d e 0,22 p m
Preparo do meio 9K-Fe2+ : juntar 700 m L da solução 1 e 3 0 0 m L da s o l u ç ã o 2 com
t o d o s os cuidados de assepsia.

M e i o " T K " sólido p a r a T.ferrooxidansi^^)

Solução A
(NH4)2 SO4 0,5g
K2HPO4 0,5g
MgS04.7H20 0,5g
H2O destilada lOOOmL

Solução B
FeS04.7H20 167g
H2O destilada 1 OOOmL
Dissolver separadamente o s sais referentes á solução A, juntar o s solutos, completar com
água destilada até 1000 mL, ajustar o p H para 1,8 c o m H2SO4 concentrado e autoclavar a 121 ±
2^C p o r 15 min. A solução B deve ser filtrada p o r membrana de 0,22 p m a p ó s o ajuste do p H
para 1,8 c o m com H2SO4 concentrado. A s soluções devem ser estocadas separadamente em
geladeira ( 4 ° C ) e no momento d o uso , utilizar uma proporção de 4:1 respectivamente da
solução A e B. Para de obter o meio sólido "TK" deve-se preparar o meio em concentração dupla
em u m frasco e uma solução de agarose 0 , 5 % em outro, esterilizando a agarose e m autoclave nas
condições da solução A. Misturar o conteúdo d o s dois frascos quando a m b o s estiverem a
aproximadamente SO^C e distribuir em placas de Petri préviamante esterilizadas.

• IVIeio de cultura para indicação de espécie anaeróbia (T.denitrifícans)


Utilizou-se o meio líquido de Postgate modificado para T.íhiopanis, adicionando-se a
esse meio, 2,0 g/L de nitrato de potássio e I g / L de bicarbonato de sódio

118
• Meio de Starkey para bactérias suifato-redutoras {DesulfovibríoY^^^
Lactato de sódio 3,5 g
NH4CI- 1,0 g
K2HPO4 0,5 g
MgS04.7H2a 2,0 g
Na2S04 0,5 g
CaCl2.2H20- 0,1 g
(NH4)2SO4.FeSO4.6H20 0,001 g
Agua destilada 1000 m L
p H final após esterilização : 7,2
Pesar t o d o s o s reagentes e acrescentar 1000 m L de água destilada fiia. A q u e c e r , agitando
freqüentemente, até completa dissohiçã d o s sais, tomando cuidado para que n ã o seja atingida a
t e n ç e r a t u r a de ebulição. Ajustar o p H para 7,2 com N a O H - IN. Distribuir e m t u b o s de ensaio.
Esterilizar em autoclave a 121 ± 2 0 C p o r 15 min.

• Meio Agar triptona glicose extrato de levedura para contagem de de


bactérias heterotróficas(22)

Meio A g a r T r i p t o n a Glicose E x t r a t o d e L e v e d u r a ( " P l a t e C o u n t A g a r " )


Triptona 5,0 g
Extrato de levediu-a 2,5 g
Dextrose 1,0 g
Agar- 15,0 g
Água destilada 1000 m L
p H final após esterilização: 7,0
Pesar 23,5 g do meio desidratado "Plate Count Agar" e acrescentar 1000 m L de água
destilada fiia, d e k a n d o em repouso durante, aproximadamente 15 min. A q u e c e r agitando
freqüentemente, até completa fiisão do meio, t o m a n d o cuidado para que não atinja a temperamra
de ebulição, se necessário, ajustar o p H para 7,0 com solução de N a O H - IN. Esterilizar em
autoclave a 121 ± 2 ° C durante 15 minutos.

• Agar Sabourand Dextrose para contagem de fungos(23)


Neopeptona 10 g
Glicose (dextrose)- 40 g
Agar- 15 g
Água destilada 1000 m L
p H Final a p ó s esterilização: 5,6
Pesar 65 g do meio desidratado "Sabourand Dextrose Agar" e acrescentar 1000 m L de
água destilada fiia. Aquecer agitando freqüentemente até completa fiasão d o meio. Tomar
cuidado para que n ã o seja atingida a temperatura de ebulição. Distribuir em v o l u m e s de 8 a 10
m L em tubos de ensaio c o m diâmetro de 16 mm x 150 nun. Tamponar e esterilizar em autoclave
a 121 ± 20c durante 15 min.

119
• Meios de cultura para os testes preliminares de identificação
para Thiobacillusf^^^^

Meio líquido mineral básico S O


Na2HP04 1,2 g
KH2PO4 1,8 g
MgS04.7H20- 0,1 g
(NH4)2S04 0,1 g
CaCl2 0,03 g
FeCl3.6H20 0,02 g
MnS04.4H20- 0,02 g
Água destilada . 1000 m L
Preparo: Pesar o s sais e dissolver separadamente. Jimtar posteriormente e cortçletar o
volxune para 1000 mi com água destilada.

Meio S 6 líquido ( p a r a cepas neutrofilicas)


Adicionar 10 g de tiossulfato de sódio ( N a 2 S 2 0 3 . 5 H 2 0 ) para 1000 m L d e Meio líquido
mineral básico SO. Esterlizar e m autoclave a 121±20C durante 15 minutos.

Meio S 8 ( para Thiobacillus denitrificans )


Adicionar ao meio mineral básico S O : 0,5 g de N a H C 0 3 e 2,5 g KNO3 para 1000 m L
de meio SO. Distribuir e m t u b o s d e ensaio contendo tubo de D u h r a m Esterlizar p o r autoclave a
121120C durante 15 mmutos.

Meio SS ( para cepas acidofQicas)


Neste caso, o meio mineral básico S O n ã o deve conter N a 2 H P 0 4 , utiliza-se somente 2 g
de KH2PO4 como fonte de fosfato. Adicionar também 1 g de NaCl e m 1000 m L d e meio mmeral
SO. Esterlizar em autoclave a 121 ± 2 ° C durante 15 minutos.

Meio S 7
Adiconar 0,02 g Í*>ÍH4CNS em 1000 m L de meio mmeral básico S O . Esterlizar e m
autoclave a 121 ±2'^C durante 15 minutos.

Meio S O + 6 % d e tiossulfato
Adicionar 60 g de N a 2 S 2 O 5 H 2 0 a o s demais compostos da fórmula d o meio mineral
básico S O e completar o v o l u m e par 1000 m L de água destilada estéril. Esterhzar e m autoclave a
121 ±20C durante 15 minutos.

Meio S 6 ou S 5 + 4 % d e fosfato
Adicionar 4 0 g C a 3 ( P 0 4 ) 2 a o s demais componentes do meio S6 o u S 5 . Completar o
volume com água destilada a t é 1000 mL. Esterihzar em autoclave p o r 15 min a 121.±20C

Meio S6 ou S 5 + 5 % d e NaCl
Adicionar 50 g d e NaCl aos demais componentes do meio S6 o u S5. Completar o volume
com água destilada até 1000 mL. Esterilizar em autoclave por 15 min. a 121.±20C

120

COMISCtC KÍ,C:CK/L CE E N E R G I A N U C L E R I R / S P -
M e i o S 6 ou M e i o S 5 c o m enxofre elementar

Substitui-se o tiossulfato dos meio S6 ou S5 p o r enxofre 8 ° c o m o fonte d e energia ( 1 %


em relação a o v o l u m e do meio). Esterilizar o enxofre, separadamente, p o r tindalização. e \
acrescentar ao meio liquido esterilizado em autoclave p o r 15 minutos a 121 ±2^C. \

M e i o sólido d e Citrato d e S i m m o n s

NaCl- 5,0 g
MgS04.7H20- 0,2 g
(NH4) H2PO4 1,0 g
K2HPO4 1,0 g
Citrato de sódio 2,0-5,0 g
Ágar- 20,0 g
Azul de bromotimol- 0,08 g (solução a 0 , 0 0 2 % )
Água destilada 1000 mL

Pesar t o d o s os c o n ç o n e n t e s e adicionar 1000 m L de água destilada. Distribuir em tubos


de ensaio. Esterilizar em autoclave por 15 minutos à temperatura de 121 ± 2 0 C . M a n t e r os tubos
inclinados até solidificação do meio.

Agar nutriente

Extrato de carne 3g
4 Peptona lOg
Agar 15g
Água destilada 1 OOOmL

Pesar os componentes e adicionar 1000 mL de água destilada. Ajustar o p H para 7,2 com
N a O H IN. Distribuir em t u b o s de ensaio e esterilizar por 15 minutos à temperatura de 121 ±
2 ° C . Manter os tubos inclinados até solidificação do meio.

121

Você também pode gostar