Tinción GRAM

Bacteriología: Madre Enferma Biológica (MED-311)

GUIA DE ESTUDIO PARA LABORATORIO

Elaborado por:

Dr. José J. Marte Santana

Área Ciencias Fisiológicas

Santiago, República Dominicana,

Septiembre de 2004.
 BACTERIOLOGIA

Introducción:

Esta guía de estudio está ideada para facilitar al estudiante las herramientas teóricas que
permitirán comprender los protocolos prácticos para la sesión de laboratorio que
comprende la Tinción GRAM como componente fundamental para la identificación de
agentes microbianos que están en la clasificación de bacterias.

Aquí se reúne principalmente un compendio de cátedras y resúmenes de libros de textos

donde se abarca las características generales y específicas de los géneros bacterianos objetivo
de estudio para el laboratorio así como también la clasificación general de bacterias.

Algoritmo de clasificación Morfológica y Habitat:

Habitat
Morfología Espirales
Treponemas
Borrelias
Intracelular Extracelular Leptospiraea
Ricketsia Clasificación
Clamidia GRAM

Bacilos
Esféricas (cocos) Corynebacteraea
Staphylococcaea Listeriaea
Streptococcaea Bacillus
Sin Pared Celular Enterococcaea Chlostridaea
Micoplasma Neisseraea Enterobacteraea
Vibrios
Heemophilus
Capylobacter
Helicobacter
Pseudomonas
Bordetellaea
Brucellaea
Bacteroides
Micobacteraea
Tinción GRAM:

Algoritmo de laboratorio bacterias GRAM positivas

GRAM (+)

Cocos Bacilos
Clostridium (anaeróbico) Encapsulado
Listeria Sens. Optochina
Bacillus S. Pneumoniae
Catalasa + Catalasa – α
(racimos) (cadenas) Sin capsulado
Staphylo Strepto Hemólisis Res. Optichina
S. Viridans
Coagulasa + Coagulasa – β
S. Aureus Sens. Novobiocina Grupo A
S. Epidermidis S. Pyogenes
Resist. Novobiocina
S. Saprofítico Grupo B
S. Agalactie

γ Enterococos
Peptostreptococos

Algoritmo de laboratorio bacterias GRAM negativas:

GRAM (-)

Cocos Cocoides (bacilos) Bacilos

Ferm. Maltosa (+) Haemophylus

Neisseria Meningitidis Pasteurella
Ferm. Maltosa (-) Brucella
N. Gonorrhoeae Bordetella F. Lactosa (+) F. Lactosa (-)

Rápido Lento Oxidasa - Oxidasa +

Klebsiella Critobacter Shigella Pseudomonas
E. Coli Serratia Salmonella
Enterobacter Otros Proteus
Cocos GRAM positivo: Género Staphylo

Estas bacterias característicamente forman colonias en racimos y poseen una enzima catalasa
que los ayuda a manejar los radicales libres (especies reactivas del oxígeno) producto del
metabolismo aeróbico. Dentro de las características generales de este género tenemos:
1. Aeróbicos o anaeróbicos facultativos
2. No poseen enzima oxidasa
3. Son de fácil crecimiento en los medios convencionales de cultivo
4. No forman esporas sin motilidad
5. Son termorresistentes (45º C)
6. Poseen plásmidos de resistencia a los antibióticos

S. Aureus:
Coco GRAM +, β hemolítico, coagulasa positiva el cual presenta diversas enzimas y
toxinas que le ayudan a su patogenicidad. El factor de virulencia de esta cepa es la
proteína A la cual se fija a la porción Fc de la IgG inhibiendo así la fijación del
sistema de complemento y la fagocitosis. La forma de transmisión puede ser por las
manos y estornudo (vía aérea), heridas por cirugía (es componente de la flora de
mucosa nasal y piel) y está asociado al envenenamiento por comida (food poisoning):
jamón o carnes enlatadas y ensaldas de papas. Prueba PYR + (pirrolidomil
arilamidasa). Toxinas:
a) Enterotoxinas: A-E (termoestables y rápidas)
b) TSST-1: toxina del síndrome de shock tóxico, superantígeno
c) Alfa toxina: preformada que daña las membranas celulares
d) Exfoliatinas: envueltas en el síndrome de piel escaldada e impétigo

Patologías asociadas al Género Staphylo:

1. S. Aureus: gastroenteritis, infecciones cutáneas, abscesos,

foruncilosis, impétigo, sepsis neumonías, endocarditis bacterianas,
infecciones en heridas quirúrgicas
2. S. Epidermidis: Infecciones cutáneas, urinarias, sepsis,
endocarditis
3. S. Saprofítico: Infecciones génito-urinarias y septicemias

Cocos GRAM positivos: Género Strepto

Este grupo de bacterias forman colonias en cadenas y no poseen catalasa haciendo que sean
sensibles a un incremento en la concentración los radicales libres producto del metabolismo
aeróbico. Dentro de sus características tenemos:
1. Anaerobios facultativos
2. Poseen exigencias nutricionales
3. Capacidad variable de hemólisis
4. No poseen motilidad, excepto los enterococos
 5. Poseen cápsula con ácido hialurónico
6. Seroagrupados según la clasificación de Lancefield: carbohidratos de la pared
7. Son serotipados según anticuerpos específicos:
a. Cápsulas para S. Pneumoniae
b. Porteína M para S. Pyogenes

Clasificación general del G. Strepto:

Especie Grupo (Lancefield) Hemólisis Laboratorios

S. Pyogenes A Beta (completa) Sens. Bacitracina
Prueba PYR +
S. Agalactie B Beta Resist. Bacitracina
Hidrolisis con hipurato
Prueba cAMP +
Enterococos D Alfa (parcial), Crece en medio con
Beta o Gamma NaCL 6.5%
(no hemólisis) PYR +
S. Boivs D Alfa o Gamma Crece en NaCL 6.5%
S. Pneumoniae No Alfa Soluble en bilis
Sens. Optochina
S. Agalactie No. Alfa Insoluble en bilis
Resist. Optochina

Diagnóstico de las especies del género:

1. Cultivos con medio de sangre + atmósfera de CO2 al 10%
2. Detección de antígenos específicos
3. Serología: S. Pyogenes
a. Antiestreptolisina O (ASO)
b. Streptozima: hialuronidasa y ADNasa

Patologías Asociadas al género:

1. S. Pyogenes: Toxinas:
a. Piogénica: Faringitis, celulitis, impétigo
b. Toxigénica: Fiebre escarlata, TSST
c. Inmunogénicas: Fiebre reumática, glomerulonefritis aguda
2. S. Agalactie: Infecciones vaginales, sepsis, meningitis neonatal
3. S. Pneumoniae: Pneumonía, otitis, sinusitis, meningitis, sepsis
4. S. Viridans: Caries dental (S. Mutans) endocarditis bacteriana subaguda (S.
Sanguis), meningitis, sepsis
5. E. Faecalis: Infecciones génito urinarias, sepsis, meningitis y endocarditis
 Tinción GRAM

1. Introducción

La importancia del estudio de los agentes patógenos al ser humano comprende un gran
espectro de disciplinas dentro de la medicina de forma tal que se busquen nuevas
alternativas para el abordaje tanto diagnóstico (microbiológico) como de manejo
(farmacológico) de estas entidades para reducir al máximo el riesgo de infección y la
morbimortaidad asociada.

Es por eso que surge como componente básico de las ciencias médica la Microbiología
la cual trata de entender la organización, composición y características de los principales
agentes patógenos al ser humano. Dentro del estudio de los microbios, el abordaje
ocurre clasificándolos de acuerdo al reino biológico a que pertenezca. En esta
clasificación encontramos a las bacterias, hongos, protozoarios, anélidos (platihelmitos
y nematelmitos), virus y priones.

Los agentes bacterianos entonces se pueden clasificar por múltiples formas de acuerdo a
la características morfológicas, medios de cultivos y tinción. El mejor acceso a esta
clasificación va de acuerdo a una característica muy distinguible en las bacterias, su pared
celular. De acuerdo a esta condición se tiene a disposición la principal forma de tinción
para las bacterias, la tinción GRAM, donde se toma en cuenta la proporción de
péptidoglucano que conforma la pared de estos patógenos, haciendo que este medio de
tinción coloree de una forma si las bacterias poseen una gran proporción de este
compuesto (GRAM positivo) o aquellas con una proporción reducida (GRAM
negativos) luego de haber4
realizado el proceso de cultivo de manera que se pueda contar
con una cantidad (1 x 10 ) suficiente de colonias para hacer correctamente el proceso de
tinción.

2. Objetivos

2.1 Teóricos:
2.1.1 Estudiar la clasificación general de las bacterias
2.1.2 Estudiar los principales medios de cultivo bacteriano
2.1.3 Analizar las principales características de los cocos GRAM positivos y
negativos
2.1.4 Estudiar las características del género Staphilo.
2.1.5 Estudiar las características del género Strepto.

2.2 Prácticos:
2.2.1 Analizar los proceso de tinción bacteriana
2.2.2 Realizar el proceso de tinción GRAM
2.2.3 Interpretar los resultados de la tinción GRAM
3. Materiales

3.1 Biológico:
a) Cultivos bacterianos diversos

3.2 Equipos:
a) Portaobjetos: varios
b) Agua destilada estéril: 10mL
c) Guantes: varios
d) Asa bacteriológica
e) Mechero de alcohol o gas: uno por mesa
f) Rejilla de tinción
g) Microscopio: dos por mesa
h) Aceite de inmersión para microscopio: uno por mesa

3.3 Reactivos:
a) Set de tinción GRAM

4. Procedimiento

4.1 Procesamiento de la muestra

4.1.1 Se toma cuidadosamente el plato de cultivo bacteriano con las manos

cubiertas con guantes como forma de evitar contacto directo con el germen
cultivado.

4.1.2 Con el asa bacteriológica esterilizada (por flameo), se toma una pequeña
muestra del cultivo y se deposita sobre una gota de agua esterilizada en un
portaobjetos limpio y debidamente rotulado y se distribuye homogéneamente
por la plaquita sin dispersarlo mucho o dejarlo muy compacto para luego
proceder al proceso de fijación.

4.1.3 Inmediatamente se distribuye el contenido el asa bacteriológica la

misma se procede a esterilizar nuevamente previo a su empaquetamiento y
almacenaje.

4.1.4 Para fijar la muestra a la plaquita o portaobjetos se procede al proceso

de flameo que consiste en tener un mechero de gas o alcohol encendido y
pasar el portaobjetos a 2cm de distancia de la flama de manera ondulante
hasta que el contenido líquido esté casi seco, luego se deja secar con la
temperatura ambiente y finalmente como factor de seguridad para la fijación
se vuelve a pasar por el mechero por tres ocasiones sin dejar que se queme el
contenido en ningún momento.
4.2 Tinción GRAM

4.2.1 Paso 1: Se toma la plaquita fijada con la muestra del cultivo y se

procede a cubrirla completamente con cristal violeta por un minuto, luego se
elimina el exceso con abundante agua.

4.2.2 Paso 2: Con el portaobjetos escurrido se procede a llenarlo con

solución de lugol completamente por encima de la muestra fijada por un
minuto y luego se elimina el exceso con abundante agua.

4.2.3 Paso 3: Se procede entonces a cubrir la plaquita con alcohol-acetona

por 10 segundos para lavar con abundante agua.

4.2.4 Paso 4: Por último el portaobjetos con la muestra se le añade suficiente

tinción de zafranina por un minuto para entonces proceder a lavar el exceso
de la tinción.

4.2.5 La plaquita teñida se procede a secar y a observar en el microscopio.

4.3 Interpretación de los resultados

4.3.1 Para identificar el tipo de bacteria cultivada y teñida con GRAM se

utiliza un microscopio de laboratorio con una resolución de 100X

4.3.2 La plaquita se le agrega una gota de aceite para microscopio de

inmersión como forma de darle nitidez y calidad a la imagen amplificada.

4.3.3 Luego de montarla y observarla en el microscopio, el diagnostico se

hará de acuerdo a la morfología, la agrupación y la coloración de la bacteria
con ayuda del asistente a profesor asignado a cada grupo.