Facultad de Veterinaria

Universidad de Zaragoza

Métodos en Biotecnología

CULTIVOS CELULARES

I.-
I.- PRINCIPIOS Y MÉ
MÉTODOS BÁ
BÁSICOS

II.-
II.- TÉCNICAS Y APLICACIONES

Ana Isabel Alcalde

José
José Emilio Mesonero

TEMARIO

1.-
1.- Monitorizació
Monitorización animal
2.- Cultivo celular I
3.- Cultivo celular II
4.-
4.- Separació
Separación celular
5.-
5.- Viabilidad celular
6.-
6.- Clonació
Clonación, transformació
transformación y transfecció
transfección
7.-
7.- PCR, tipos. Secuenciació
Secuenciación
8.-
- Separació
8. Separaci ó n de proteí
proteínas y proteí
proteínas recombinantes
9.-
9.- Western, Southern,
Southern, Northern blot y marcaje radioactico
10.-
10.- Inmunohistoquí
Inmunohistoquímica,
mica, inmunocitoquí
inmunocitoquímica
y enzimoinmunoensayo

1
 Bibliografía
• Cultivo de células animales. Morgan and
Darling. (Ed Acribia)
• Casas comerciales: Sigma (www.Sigma-Aldrich.com)
Invitrogen (www.invitrogen.com)
• http://www.ub.es/biocel/wbc/tecnicas/tecnicas_
de_cultivo_celular.htm
• http://www.protocol-
online.org/prot/Cell_Biology/Cell_Culture/

http://www.unizar.es/depfarfi/unidad_fisiologia/

DOCENCIA

METODOS EN BIOTECNOLOGÍ
BIOTECNOLOGÍA

TEORÍ
TEORÍA

PROGRAMA

CULTIVOS CELULARES I Y II

2
 CULTIVOS CELULARES

I.- PRINCIPIOS Y MÉTODOS BÁSICOS

INTRODUCCIÓN

3
 Concepto de cultivo celular
Conjunto de té técnicas que permiten el mantenimiento de las
células “in vitro”
vitro”, conservando el má
máximo de sus propiedades
fisioló
fisiológicas, bioquí
bioquímicas y gené
genéticas

Evolución histórica

1885  células de embrió

embrión de pollo
1907  médula espinal embrionaria de anfibios
1916  tripsina para disociar las cé
células
1920-1940  esterilidad y antibió
1920- antibióticos
1952  primera lí
línea celular estable (HeLa
(HeLa,, Henrietta Lacks,
Lacks, tumor cervix)
cervix)

.
European Collection of cell cultures: http://www.ecacc.org.uk
http://www.ecacc.org.uk /

4
 Aplicaciones del cultivo celular

, Efecto proteí
proteína-
na-proteí
proteína)
na)

Áreas de investigación en las que son útiles

los cultivos celulares

- Fisiología y biología celular

- Virología
- Investigación del cáncer
- Inmunología (Ac monoclonales)
- Ingeniería de proteínas (síntesis)
- Aplicaciones diagnósticas
- Aplicaciones médicas (tejidos para transplante)
- Aplicaciones industriales y agronómicas

5
VENTAJAS
- Control preciso del medio
ambiente extracelular
- Homogeneidad de la muestra
- Economí
Economía
- Motivaciones éticas
ASPECTOS TÉCNICOS
DESVENTAJAS
- Técnica sensible (asepsia)
- Cantidad y coste
- Inestabilidad (pasajes)
- Validez del modelo “in vitro”
vitro” (ECVAM
European Center for Validation of
Alternative Methods,
Methods, etc)
6
Tipos de cultivos

- Órganos
- Explantes primarios
- Cultivo celular

Métodos de separación celular

• Centrifugación
• Capacidad de adherencia al vidrio o
plástico
• Mediante unión a anticuerpos específicos
para determinados componentes
celulares
• Unión a anticuerpos acoplados a marcaje
fluorescente
• Microdisección de captura por láser

7
 Separació
Separación de cé
células marcadas
por fluorescencia utilizando lá
láser
y campo elé
eléctrico

Biología de la célula en cultivo

1.-
1.- Selecció
Selección por disgregació
disgregación, adhesió
adhesión y proliferació
proliferación

2.-
2.- Selecció
Selección por tasa de crecimiento hasta confluencia

8
EQUIPAMIENTO Y PRÁCTICA GENERAL

9
EQUIPAMIENTO BÁSICO:

- CABINA DE CULTIVO CELULAR

- ESTUFA - INCUBADOR DE CO2
- MICROSCOPIO DE CONTRASTE DE FASES INVERTIDO
- CENTRÍ
CENTRÍFUGAS
- AUTOCLAVE
- CONGELADORES
- INSTALACIONES DE CRIOGENIA (N2 LÍQUIDO)
- PIPETEADORES

CABINA DE CULTIVO CELULAR

10
ESTUFA - INCUBADOR DE CO2

MICROSCOPIO DE CONTRASTE DE FASES

INVERTIDO

11
 PIPETEADORES

MATERIAL PLÁSTICO

12
 MEDIOS DE CULTIVO

Características:
Medio nutritivo tamponado e isotónico

Composición:
Sales inorgánicas (Ca2+ y Mg2+)
Fuente de energía y aminoácidos
Suplementos : Suero, glutamina y antibióticos

TIPOS DE MEDIOS DE CULTIVO

BME  Medio básico Eagle

DMEM  Medio de Eagle modificado por Dulbecco
RPMI  Medio para cultivo de células en suspensión

13
 Tipos de líneas celulares establecidas
1.- Adherentes: derivadas de órganos
músculo
hígado
células nerviosas
epitelios renal e intestinal
origen neuronal
2.- Suspensión: células inmunitarias

a.- Células primarias (cultivo primario y línea primaria)

b.- Células inmortales
c.- Células transformadas

CULTIVOS PRIMARIOS Y
LÍNEAS PRIMARIAS
Cultivo primario. Cultivo establececido a partir de un tejido u órgano.
Las células mantienen la viabilidad un periodo de tiempo limitado y no
se reproducen en cultivo. En general en cultivo presentan una reducción
en el número total de células vivas a lo largo del tiempo. Ejemplos :
hepatocitos obtenidos de hígado adulto, neuronas, etc...

Línea primaria. Cultivo establecido a partir de un tejido u órgano que se

mantiene un periodo de tiempo limitado pero con reproducción de las
células en el cultivo. Ejemplos : fibroblastos dérmicos, queratinocitos,
células endoteliales de aorta bovina (BAEC), células endoteliales de
cordón umbilical (HUVEC), etc...

Línea inmortal. Cultivo establecido mediante células que pueden

proliferar indefinidamente para lo cual se manipulan genéticamente
con el fin de hacerlas inmortales.

14
Cultivo primario Lí
Línea primaria

15
 Cultivo primario / linea primaria y
linea estable
Finita Continua
Ploidia Diploide / Euploide Heteroploide / Aneuploide
Transformació
Transformación Normal Transformada
Tumorogenicidad No-
No-tumorogé
tumorogénica Tumorogé
Tumorogénica
Dependencia de anclaje Si No
Inhibició
Inhibición por contacto Si No
Limitació
Limitación de crecimiento
Si No
por densidad
Posible mantenerlas
Mantenimiento Cíclico
quiescentes
Requerimientos de suero Elevados Bajos
Eficiencia de clonaje Baja Elevada
Pueden expresar Cromosomales,
Cromosomales,
Marcadores
marcadores especificos enzimá
enzimáticos.. se pierden
Funciones especializadas Se mantienen Se suelen perder
Baja (24 a 96 h tiempo de
Tasa de crecimiento Rápida (12 a 24 h)
replicació
replicación)
Bajo (<10E6 cé
células/ ml, Alto (>10E6 cél/ml, >10E5
Rendimiento en cultivo
<10E5 cél/cm2) cél/cm2)

PROTOCOLO BÁSICO
Extracció
Extracción del órgano o discriminació
discriminación tisular

Disgregació
Disgregación celular mecá
mecánica y enzimá
enzimática (tripsina)

Selecció
Selección por centrifugació
centrifugación

Siembra y mantenimiento del cultivo

16
 1.- Métodos de aislamiento:
específicos de cada tipo celular

A.-
A.- Aislamiento de fibroblastos de pollo
- 10-
10-12 embriones
- Se extrae el embrió
embrión y se eliminan los órganos internos y la cabeza
- Trituració
Trituración y agitació
agitación con tripsina
- Centrifugació
Centrifugación y el precipitado se resuspende con SFB y medio
- Incubació
Incubación en hielo para dispersió
dispersión mecá
mecánica
- Filtració
Filtración con tamiz y se centrifugan y el precipitado se resuspende en DMEM
DMEM
y 10%SFB
- Recuento y siembra

1.- Métodos de aislamiento:

específicos de cada tipo celular

B.-
B.- Aislamiento de hepatocitos de pollo (supervivencia corta)
- Disgregar el hí
hígado por digestió
digestión enzimá
enzimática y EDTA (perfusió
(perfusión)
- Extracció
Extracción y corte mecá
mecánico
- Centrifugació
Centrifugación y el precipitado contiene alta tasa de hepatocitos (Separació
(Separación
de hepatocitos de cé
células de Kupffer,
Kupffer, endoteliales y biliares)
- Lavado y recuento de hepatocitos y siembra

17
 2.- Inmortalización de células primarias

A.- Transfección con genes inmortales (oncogenes de

origen vírico)

gen T grande SV40 (antígeno T), virus DNA de 5Kb

Induce la síntesis de DNA y la replicación

en células quiescentes

Problema: ¿siguen siendo el mismo tipo celular?

Fibroblastos humanos

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Células en cultivo. A) Micrografías de
contraste de fase de fibroblastos en
cultivo. B) Micrografías de mioblastos
en cultivo mostrando las células
fusionadas para formar células
musculares multinucleadas. C) Células
precursoras de oligodendrocitos en
cultivo. D) Células de tabaco en cultivo

QUERATINOCITOS

19
HEPATOCITOS DE RATA

HEPATOCITOS DE PERRO

20
HEPATOCITOS DE MONO

HEPATOCITOS HUMANOS

21
 EPITELIO PIGMENTARIO
HUMANO DE LA RETINA

CELULAS ENDOTELIALES DE
CORDON UMBILICAL HUMANO

22
CELULAS DE MUSCULATURA
LISA HUMANA

LÍNEAS CELULARES CONTINUAS

23
 Protocolo de manejo

1.-
1.- Preparació
Preparación

- Acondicionar la cabina (esterilidad: UV)

- Medios de cultivo y suplementos a 37º
37ºC
- Material plá
plástico al alcance de la mano

2.-
2.- Control de los cultivos celulares

- Observar el color del medio del cultivo (amarillento, rojo pú

- Observació
Observación al microscopio
púrpura, turbidez)
(tapiz, grado de confluencia, etc)
(cé
(células redondas y membranas lisas)

Protocolo de manejo

3.-
3.- Disgregació
Disgregación y Recuento de cé
células

- Cámara de Neubauer  Recuento

- Dilució
Dilución con Tripá
Tripán azul  Viabilidad

-Células en suspensió
suspensión: Dilució
Dilución 1:1 con Tripá
Tripán Azul

- Células adherentes: Lavado con PBS

Tripsina-
Tripsina-EDTA
Medio y centrifugació
centrifugación
Resuspensió
Resuspensión
Tripan azul 2:1

24
 SECUENCIA DE DESPEGUE DE LAS CÉ
CÉLULAS

Cuadrícula de la cámara de Neubauer

Nº de cé
células = 10.000 x dilució
dilución x cé
células contadas

25
 Protocolo de manejo

4.-
4.- Subcultivo de cé
células

suspensión: 105/ml-
- Células en suspensió /ml-8x105/ml
- Células adherentes entre 2,5x105 y 5x105 para una caja de 25 cm2

y entre 4x10-4 y 5x104 /pocillo en una caja de 24 pocillos

Tabla de guía para la siembra

recipiente Área de Número de Volumen

crecimiento células de medio
cm2 adherentes ml
x 106
Placa 90 mm 49 1 10
Placa 60 mm 21 0.4 5
Placa 35 mm 8 0.15 3
24 pocillos 2 0.04 1
12 pocillos 4.5 0.09 2
6 pocillos 9.6 0.2 3-4
Frasco 25 cm2 25 0.5 5-10
Frasco 75 cm2 75 1.5 15-
15-30
Frasco 162 cm2 162 3 30-
30-50

26
 Congelación de las células
de un determinado pasaje

Material: Viales de crioconservació

crioconservación (2 ml)
Glicerol (concentració
(concentración final 10%)
Medio de cultivo con SFB elevado (30%)

Concentració
Concentración celular: entre 1 y 3 x106 células/1,5 ml

Protocolo de manejo

5.-
5.- Elaboració
Elaboración de una curva de crecimiento

27
 Protocolo de manejo

5.-
5.- Elaboració
Elaboración de una curva de crecimiento

Líneas celulares derivadas de gliomas humanos. Caracterizació

Caracterización
inmunofenotí
inmunofenotípica y molecular

LN405, PGFA+ T98, p53 + T98, EGFR +

H4, PGFA - H4, p53 - SW1783, EGFR +

PGFA p53 EGFR

28
3T3-SA FIBROBLASTOS DE RATÓN

3T3-L1 FIBROSBLASTOS DE RATÓN

29
M6 CARCINOMA DE COLON

MDCK EPITELIO INTESTINAL

DE PERRO

30
SH-SY5Y NEUROBLASTOMA

HepG2-HEPATOMA

31
 Células COS (riñón mono)

CHO-K1 (Ovario de hamster chino)

32
ECV-304 (endoteliales)

33