Evaluación de la vacuna oral de rotavirus de cordero de

Lanzhou mediante transfusión pasiva con linfocitos T CD4

+ / CD8 +

La vacuna contra el rotavirus (RV) de cordero de Lanzhou (RV) para niños solo
se usa en China. Dado que no hubo informes sobre la evaluación de LLR, ni
siquiera los datos del ensayo clínico de fase IV, procedemos a la evaluación de
LLR centrándonos en las células T para investigar si la LLR podría inducir la
función potencial relacionada con la protección como vacuna. Cuatro grupos de
ratones desnudos se transfundieron con CD4 + / CD8 +Células T aisladas de
ratones inmunizados con LLR (cebados) y LLR no inmunizados (ingenuos) a
través de intraperitonea (ip) respectivamente. En consecuencia, los ratones de
adopción fueron desafiados con el rotavirus salvaje de origen de ratones EDIM
(Diarrea Epizootica de Ratones Infantiles) por administración intragástrica. Se
recogieron series de muestras fecales / de suero y se eliminó el virus, luego se
analizaron IgA / IgG en suero y IgA secretada. En comparación con los ratones
transfundidos con linfocitos T de ratones naive, los ratones desnudos
transfundidos con linfocitos T CD4 + de ratones cebados inducen un aumento
más rápido de IgA fecal y sérica, y también tienen una duración más corta de la
eliminación del virus. Mientras que no se encontraron diferencias significativas
en la eliminación del virus entre los ratones transfundidos con CD8 +Linfocitos T
aislados de ratones cebados e ingenuos. Por lo tanto, eliminamos los distintos
roles de los linfocitos T CD4 + / CD8 + transfundidos para el aclaramiento de
rotavirus en ratones desnudos, que el aclaramiento viral realizado por los
linfocitos T CD4 + . Mientras tanto, tiene la capacidad de ayudar a la inducción
de la inmunogenicidad específica de LLR. En comparación con la transfusión
de células de ratones cebados e ingenuos, la LLR puede inducir la memoria de
linfocitos T CD4 + , que es un índice potencial para reflejar la inmunogenicidad y
protección, mientras que los linfocitos T CD8 + eliminan el rotavirus mediante
CTL con poca capacidad de memoria.

1 . Introducción
La infección por rotavirus (RV) ha sido muy apreciada desde 1973, cuando se
reconoció la asociación entre la infección por rotavirus y la diarrea infantil
aguda(Bishop, 2009). Hasta ahora, el rotavirus es también uno de los principales
agentes etiológicos de la diarrea grave y deshidratante en bebés menores de 5 años en
todo el mundo. La Organización Mundial de la Salud (OMS) ha coordinado la Red
Global de Vigilancia de Rotavirus desde 2008 (Agócs et al., 2014). Aunque no existe un
tratamiento específico, las vacunas con rotavirus vivos atenuadosse ha comprobado que
son eficaces para prevenir la diarrea causada por rotavirus, especialmente en los casos
graves. Hay cinco vacunas contra la infección por rotavirus en el mercado hasta
ahora. Se han utilizado dos vacunas comerciales, RotaTeq y RotaRix, para prevenir la
infección por rotavirus en docenas de países y regiones ( Kollaritsch et al.,
2015 , Desselberger et al., 2009 ), además, se autorizaron dos nuevas vacunas contra el
rotavirus, Rotavac y Rotavin. en India ( Anon, 2016 ) y Vietnam ( Dang et al., 2012 )
respectivamente. Sin embargo, estudios anteriores indicaron que RotaTeq y RotaRix
son menos eficaces en los países en desarrollo que en los desarrollados ( Jiang et al.,
2010).), impidiendo su introducción en otros países, incluyendo China. De hecho, la
vacuna LLR (vacuna contra el rotavirus humano derivada del cordero Lanzhou) ha sido
autorizada para su uso en China desde el año 2000 y es la única vacuna aprobada como
vacuna contra el rotavirus en China hasta ahora ( Soares-Weiser et al., 2012 ). Además,
también hay varias otras vacunas contra el rotavirus completadas o en pruebas clínicas
de fase III en China. Desde 2006 hasta septiembre de 2014, más de 54 millones de dosis
de vacunas LLR se han liberado por lotes. Sin embargo, aún existen varias confusiones
sobre el uso de la LLR, ya que existen informes publicados limitados referidos a la
efectividad preclínica o clínica de la vacuna de la LLR contra
la gastroenteritis infantil ( Fu et al., 2007 , Fu et al., 2012, Fu et al., 2010 , He et al.,
2013 ).
En este artículo, nos centramos en la evaluación de la efectividad de la vacuna LLR en
modelos animales, en lugar de en seres humanos, y tenemos la intención de buscar una
manera de evaluar la efectividad de la LLR para comprender otras vacunas novedosas
mucho antes de la implantación en niños. A destacar, la inmunogenicidad es la
consideración principal en la evaluación de la efectividad de la vacuna. Aunque los
estudios de inmunogenicidad de RotaTeq y RotaRix ya se han realizado en animales y
ensayos clínicos, no se ha encontrado ningún informe relacionado sobre la
inmunogenicidad de LLR. Concluyendo de los estudios previos, IgA e IgG son
indicadores normales que evalúan la inmunogenicidad de las vacunas contra el rotavirus
( Blutt et al., 2012 , Westerman et al., 2005). Además, la correlación exacta de la
protección permaneció indeterminada ( Franco et al., 2006 , Offit, 1994 , Blutt et al.,
2008 ), incluso los niveles de IgA sérica específica de RV y sIgA fecal parecen
correlacionarse mejor con la protección ( Angel et al. al., 2012 , Patel et al.,
2013 ). La inmunidad mediada por células , así como la inmunidad humoral y mucosa ,
y la respuesta inmune innata iniciada más temprana ( Holloway y Coulson, 2013 )
contra el rotavirus también fueron probadas como significativas en animales y seres
humanos ( Franco y Greenberg, 1995 , Jaimes). et al., 2002 ,Jaimes et al.,
2005 , McNeal et al., 1997 ). Ya se ha demostrado que existe una respuesta de las
células T citotóxicas específicas del VD en el huésped, como la transferencia pasiva de
los linfocitos T citotóxicos inmunes (CTL), que, según estudios anteriores, pueden
proteger contra la diarrea inducida por rotavirus agudo en la lactancia. ratones ( Offit y
Dudzik, 1990 ) y eliminan la infección crónica por rotavirus de ratones adultos con
SCID (inmunodeficiencia combinada grave) ( Blutt et al., 2012 ), pero aún no está
claro el papel exacto de los linfocitos T en la prevención de la infección primaria o
la reinfección. .
Por lo tanto, para explorar la respuesta inmunológica de la LLR, especialmente en qué
tipo de linfocitos T y cómo los linfocitos T desempeñan un papel contra el desafío
después del cebado con la vacuna LLR, transfundimos los linfocitos T aislados de
ratones cebados y ratones ingenuos al desnudo ratones . Después del desafío del
rotavirus salvaje de origen de ratón EDIM (Diarrea epizootica de ratones infantes),
evaluamos la respuesta inmunológica en la duración de la infección del virus y la
depuración . Los resultados mostraron que existen diferentes rutas empleadas
por loslinfocitos T CD4 + y CD8 + para evaluar la vacuna contra el rotavirus. Eso sería un
nuevo sustituto en lugar de un anticuerpo sérico insatisfecho .Para ensayo preclínico o
clínico. Esto sugiere que deberíamos prestar más atención al modelo de inmunología
pasiva y la respuesta inmune mediada por células inducida por las vacunas contra el
rotavirus en el proceso de producción y evaluación de las vacunas contra el rotavirus.
2 . materiales y métodos
2.1 . Virus, células y animales.
LLR tiene licencia en China desde 2000. El título de la vacuna LLR utilizada en este
estudio fue de 6.2 lgCCID 50 / ml. La cepa salvaje de rotavirus EDIM (genotipo G16) se
cultivó en células MA104, usando medio RPMI-1640 en 37 ° C, incubadora con5% de
CO 2 . Los ratones hembra de dos semanas de edad y los ratones desnudos(BALB / c)
fueron proporcionados y criados en el Centro para el Experimento Animal, NIFDC
(Institutos Nacionales para el Control de Alimentos y Drogas), y el experimento animal
fue aprobado por The Animal Care & Welfare Comité del NIFDC, China.
2.2 . LLR inmunización y aislamiento de linfocitos T CD4 + y CD8 +
Los ratones BALB / c se dividieron en dos grupos (72 ratones cada grupo) y se
administraron por vía intragástrica con 0,3 ml de vacuna LLR (grupo 1) o solución
salina normal (grupo 2) una vez por semana y tres veces en total. Cuatro días después de
la tercera inmunización , se aislaron los bazos para separar los linfocitos T utilizando un
clasificador de células con el kit de CD4 + / CD8 + Dynabeads FlowComp
Mouse (Invitrogen). Brevemente, 10 μl de CD4 + FITC , CD8 + PE, CD3 +PerCP
anticuerpos y 50 Se añadieron μl de sangre anticoagulada con EDTA de los ratones del
grupo 1 y del grupo 2 en la parte inferior de los tubos BD TruCount. La mezcla se agitó
en vórtex y se hizo reaccionar en oscuridad durante 15 min. Después de agregar 450 μl
de tampón de lisis de glóbulos rojos y la reacción durante otros 15 minutos, la
proporción y el número absoluto de linfocitos T CD4 + y CD8 + se analizaron y
calcularon utilizando citometría de flujo y el software CellQuest. Después de calcular
utilizando la tinción de Typan Blue, las células T CD4 + y CD8 + vivas se transfundieron
por vía intraperitoneal a ratones desnudos lo antes posible.
Antes de la transfusión, los linfocitos T CD4 + y CD8 + que secretan IFN-γ se analizaron
utilizando ELISPOT de acuerdo con las instrucciones del fabricante para evaluar
la inmunidad mediada por células . En resumen, la placa de la mancha inmune se
recubrió con anticuerpo IFN-γ purificado durante la noche, seguido de un bloqueo con
un tampón de bloqueo que contenía un 10% de suero fetal bovino . La vacuna contra el
rotavirus LLR se utilizó como estimulador con 5.0 lgCCID 50 por pocillo en 100 μl de
volumen. Posteriormente, los linfocitos T CD4 + y CD8 + aislados se añadieron con
10 5 por pocillo. Después de incubar a 37 ° C, 5% de CO. Se usaron 2 incubadoras
durante 20 h, el anticuerpo anti-IFN-γ marcado con HRP y el sustrato AEC para la
detección bajo el lector CTL ELISPOT.
2.3 . Transfusión pasiva de linfocitos T aislados a ratones desnudos y desafío con EDIM
Los ratones desnudos se dividieron en cuatro grupos (18 ratones desnudos cada grupo),
que se transfundieron pasivamente con linfocitos T CD4 + aislados de ratones cebados
(grupo 3) o ingenuos (grupo 4), y linfocitos T CD8 + aislados de cebado (grupo 5) o
ratones naïve (grupo 6), respectivamente. Las cantidades de linfocitos T CD4 + y
CD8 + transfundidos fueron 1,5 × 10 6 y 0,75 × 10 6 células / 200 μl respectivamente
para obtener el recuento equivalente de linfocitos T en sangre periférica en ratones
desnudos como en ratones normales. Simultáneamente, los ratones desnudos
transfundidos se desafiaron con 0,3 ml de EDIM (1,2 x 10). 7CCID 50 / ml) por
sonda. Después de la prueba, se observó y evaluó el estado de estos ratones para
determinar si los linfocitos T CD4 + y CD8 + transfundidos desempeñaron un papel en
la eliminación del virus y , de esta manera, se estimaron mediante los índices que
incluyen peso corporal , rotavirus y RV-IgA en materia fecal. los sueros RV-IgA y RV-
IgG, patogenicidad intestinal y distribución viral en el intestino delgado . Para este
propósito, se pesaron cada día desde el día 0 hasta el día 15 y se tomaron muestras de
las heces frescas del día 0 al día 8 para el ensayo de IgA y eliminación
de virus . Las muestras de sangre se recolectaron a través del seno venoso de la órbita
ocular de cuatro ratones seleccionados al azar cada dos días para el ensayo de IgA e
IgG.
2.4 . ELISA para medir el rotavirus, para medir IgA anti-RV, IgG en suero y sIgA en
heces.
El rotavirus en heces se midió utilizando el ensayo de microplaca de rotavirus ProSpecT
(OXOID) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ELISA para medir IgA,
IgG y sIgA específicos de rotavirus se ha utilizado en el hogar. Brevemente, las placas
se recubrieron con virus EDIM diluido durante la noche a 4ºC, seguido de bloqueo a
37ºC durante 2 h y se secaron durante la noche a temperatura ambiente. Luego, el suero
o las heces tratadas se incubaron en las placas recubiertas con una dilución inicial de
1/10. La cantidad de anticuerpo se reflejó por los valores de OD después de la
incubación con un anticuerpo anti- IgA e IgG anti-ratón de cabra conjugado con
HRP . La muestra se consideró positiva cuando la relación muestra OD / OD
negativa ≥ 2.1.
3 . Resultados
3.1 . Aislamiento y transfusión de linfocitos CD4 + / CD8 + T
Con el fin de imitar el estado natural de los linfocitos T CD4 + / CD8 + que circulan en
la sangre periférica de los ratones normales, los relatos de los linfocitos T CD4 + /
CD8 +transfundidos deben ser coherentes con los de los ratones normales. Para lograr
este objetivo, se analizaron la pureza ( Tabla 1 ) y la actividad ( Tabla 2 )
de linfocitos TCD4 + / CD8 + aislados . Posteriormente, se transfundió una concentración
en seriede linfocitos T (linfocitos T CD4 + : 4,5 × 10 6 , 1,5 × 10 6 y 0.5 × 10 6 por
200 μl; Linfocitos CD8 + T: 2.25 × 10 6 , 0.75 × 10 6 y 0.25 × 10 6 por 200 μl). Los
resultados mostraron que, cuando se transfundieron linfocitos T CD4 + y
linfocitos T CD8 + con 1,5 × 10 6 y 0,75 × 10 6 células / 200 μl respectivamente, el
recuento de linfocitos T en sangre periférica de ratones desnudos fue equivalente al de
normal Ratones de la misma edad. El ELISPOT el ensayo mostró que hay una
diferencia menor en los linfocitos T secretores de IFN-γ entre los ratones inmunizados
con LLR y los ratones no inmunizados, es decir, 178.8 vs 110.8
linfocitos T CD4 + secretores de IFN-γ , y 154.8 vs 119.2 CD8 secretores de IFN-
γ + Linfocitos T por 100,000 células como se muestra en la Fig. 1 .
3.2 . Los linfocitos CD4 + / CD8 + T transfundidos pasivamente acortaron la
propagación viral
En el grupo transfundido con 1,5 × 10 6 CD4 cebadas + linfocitos T, los ratones
fueron desafiados con la cepa EDIM y la diseminación viral alcanzado a pico en
el día 1 tras desafiado, seguido de una disminución a negativo en el día 4. El
derramamiento viral en el El grupo transfundido con
1,5 × 10 6 linfocitos T CD4 + no tratados también alcanzó su punto máximo en el
día 1, pero disminuyó a negativo en el día 7, que fue 3 días más tarde que en
el grupo preparado ( Fig. 2 A). En los grupos transfundidos con
0,75 × 10 6linfocitos T CD8 + cebados , el derramamiento viral alcanzó su
punto máximo en el día 1 de la misma manera que en CD4 + grupo, seguido de
una disminución a negativo en el día 5, que fue 1 día más tarde que en el grupo
de 1,5 × 10 6 linfocitosTCD4 + cebados, pero 1 día antes que en el grupo de
0,75 × 10 6 CD8 naïve + Linfocitos T ( Fig. 2 B). Independientemente de los
grupos transfundidos conlinfocitosTCD4 + o CD8 + cebados o sin tratamiento
previo, el derramamiento viral alcanzó su punto máximo en el día 1
simultáneamente. Sin embargo, la eliminación viral se terminaría antes por
transfusión con linfocitos T aislados de ratones cebados que por ratones no
tratados.

Fig. 2 . Derramamiento viral en ratones desnudos después de una transfusión de CD4 + (A)
y CD8 + (B) las células T aisladas de ratones desnudos inmunizados-LLR y no inmunizados.

3.3 . Los linfocitos T CD4 + transfundidos pasivamente aumentaron la

producción de sIgA en las heces pero no en los linfocitos T CD8 +
En los grupos transfundidos con 1,5 × 10 6 linfocitos T CD4 + cebados , el sIgA
aumentó rápidamente después del desafío con EDIM y alcanzó el pico y se
mantuvo en el día 3 y el día 4, seguido de una disminución que comenzó desde
el día 5 hasta el negativo en el día 8. Mientras que, sIgA en el grupo de control
aumentó lentamente desde el día 3, alcanzó el pico en el día 5-6 y se mantuvo
durante 1-2 días, seguido de una disminución en el día 7 ( Fig. 3 A). Sin
embargo, en el grupo transfundido con 0,75 × 10 6 linfocitos T CD8 +cebados ,
el sIgA aumentó lentamente desde el día 5, alcanzó el pico y se mantuvo en el
nivel desde el día 6 hasta el día 8, que no mostró diferencias con el grupo
control ( Fig. .3SEGUNDO).

Fig. 3 . Las heces de IgA cambios en ratones desnudos después de una transfusión
con CD4 + (A) y CD8+ (B) las células T aisladas de ratones desnudos inmunizados-LLR y no
inmunizados.

3.4 . Los linfocitos T CD4 + transfundidos pasivamente aumentaron la

producción de IgA e IgG en suero pero no los linfocitos T CD8 +
Los resultados ( Fig. 4 A) mostraron que el suero IgA comenzó a elevarse en el
día 3, alcanzó el pico en el día 7, seguido por una disminución de día 9 en el
grupo transfundido con 1,5 × 10 6 CD4 cebadas + linfocitos T. Sin embargo, en
el grupo de control , la IgA sérica comenzó a aumentar en el día 5, que fue
2 días después en comparación con el grupo anterior, y el valor de la prueba
mostró que había una diferencia significativa en el valor máximo entre los dos
grupos. Como sIgA, la IgA sérica en el grupo se transfundió con 0.75 × 10 6
de CD8 + cebadoLos linfocitos T no mostraron diferencias obvias con el grupo de

control. En los dos grupos, después de la prueba, la IgA sérica comenzó a

aumentar en el día 7, alcanzó el pico en el día 11 y se mantuvo ( Fig. 4 B).