RESUMEN PARTE IV

ANIMALES TRANSGENICOS (GMO)

MANEJO DE COLONIAS PARA RATONES Y RATAS GM

El factor más importante en la realización del potencial de un estudio que involucra a los animales
GM consiste en la elección del fondo genético utilizado para la embriología inicial y para las
estrategias de cría de seguimiento. Los laboratorios individuales frecuentemente confían en el uso
de cepas favoritas basadas en muchos factores, incluyendo las cepas con las que otros
investigadores en el campo están trabajando, mutaciones conocidas o modificando genes, costo,
disponibilidad, historia de salud y Características. Los investigadores deben revisar las frecuencias
de patologías específicas reportadas para cepas bien conocidas de raza endogámica y de raza
(sellers et al., 2012; Treuting et al., 2012). Se deben evitar las excepcionales frecuencias tumorales
dependientes de la cepa o deficiencias metabólicas para los fenotipos genéticos de modificación
genética previstos (pettan-Brewer y Treuting, 2011). La naturaleza reproductiva y de crianza de las
hembras pseudoembarazadas destinatarias y su genética de color de pelaje también deben
considerarse cuidadosamente. Debido a que las diferentes cepas exhiben diferentes tamaños de
camada promedio, este factor también debe considerarse en la elección de cepas de receptores
de transferencia embrionaria. Las siguientes preguntas deben revisarse antes de proceder con un
programa de modificación genética de ratones o ratas. En el caso de las ratas, parte de esta
información puede no ser conocida, ya que las ratas son relativamente recién llegadas a la
manipulación genética.

(RATAS Y RATONES DIFERENCIAS)

Figura 32,11

FIGURE 32.11 Sitios de unión de nucleasas de sistema de repetición-asociadas palindrómico cortas

regularmente interespaciadas agrupadas y la hendidura resultante del ADN. Edición genómica de
ARN programable mediante sistemas de tipo II Cas9 CRISPR-Cas . La endonucleasa Cas9 (amarilla)
tiene dos sitios activos de nucleósido (RuvC y HNH) que se descomponen de las hebras opuestas
de una molécula de ADN para generar una ruptura de ADN de doble filamento (DSB) de extremo
romo. El escote está dirigido por el ARN CRISPR (CR) asociado que contiene una región de guía que
reconoce una hebra de la secuencia de destino por emparejamiento de base. La enzima requiere
un prototipo corto adyacente del protoespaciador (PAM) inmediatamente adyacente a la región
de la homología como señal de identificación de la blanco auxiliar. La actividad de la Cas9 también
requiere un segundo ARN (crRNA trans-activador (tracrRNA)) que base-pares con la etiqueta
derivada de la repetición del crRNA. El crRNA y el tracrRNA se pueden combinar con el
acoplamiento covalente en un ARN de la solo-guía (sgRNA En humanos y muchos otros tipos de
células, el CAS-inducida, DSBs someterse a la reparación por una unión final no homóloga (NHEJ) o
recombinación homóloga (HR). La reparación de NHEJ resulta en InDels (inserciones cortas o
eliminaciones) y proporciona un medio para interrumpir selectivamente o desactivar los genes
diana. Cuando se proporciona un ADN de donante homóloga, la reparación de recursos humanos
puede afectar al reemplazo de la secuencia para insertar, modificar o eliminar la secuencia en el
sitio. Fuente: Terns y Terns (2014).

● ¿El fondo genético es crítico para el experimento? Si se desea un fondo genético definido, se
debe seleccionar una cepa endogámica con la genética apropiada. La previsibilidad de los efectos
de la genética de fondo en la modificación genética minimiza la variabilidad en la expresión o
fenotipo entre los animales. Si la genética no es aparentemente crítica para el proyecto, entonces
se puede seleccionar un híbrido (cruce entre dos cepas endogámicas) con un vigor superior al
promedio y características reproductoras. En comparación con las cepas endogámicas, muchos
híbridos producen un mayor número de ovocitos que cualquier cepa parental en respuesta a la
superovulación, y estos embriones también pueden exhibir mayor supervivencia a la implantación
después de la manipulación. Los animales híbridos también suelen exhibir características de
fertilidad más fiables y tamaños de camada bastante grandes.

● ¿Cuáles son las características conductuales de las cepas parentales? ¿Son excepcionalmente
agresivos? ¿Suelen canibalizar o descuidar sus camadas recién nacidas? ¿Son madres atentas?

● ¿Cuáles son las características reproductivas de las posibles cepas parentales? ¿Cuáles son los
tamaños de camada promedio? ¿Las hembras responden bien a la estimulación superovulatoria?
¿Los tiempos de gestación suelen ser predecibles?

● ¿Qué tipos de patologías suelen producirse en las cepas que se están considerando? ¿Podrían
estas patologías enmascarar la expresión esperada del Transgene? ¿Podrían las patologías
endógenas mejorar, acentuar o confundir el fenotipo transgénico pronosticado?

● ¿El color de la capa es importante o útil en el proyecto?

● ¿Cuál es el estado de salud mínimo aceptable para el proyecto y dentro de la instalación?

Las cepas de ratones endogámicas utilizadas con mayor frecuencia en la creación de animales GM
son ratones C57BL/6, FVB/N y 129/SvEv, mientras que en ratas, DA, F344 y Wistar se utilizan
comúnmente. Para los procedimientos de transferencia embrionaria, las existencias de origen del
Albino suizo (CD1, ICR) o Sprague Dawley (CD, SD) son muy ampliamente empleadas como
receptores de embriones GM. Algunas características de estas cepas se enumeran en la tabla 32,2.
El ratones C57BL/6 es la cepa endogámica más utilizada para los animales GM. La genética y la
variación fenotípica de esta cepa del ratón se han caracterizado bien durante varias décadas. Las
características reproductivas y maternales de este ratón son justas al promedio, pero la respuesta
de las hembras a las hormonas exógenas inyectadas está por encima de la media; se pueden
recolectar rendimientos relativamente altos de embriones pronucleares después de la
superovulación y el apareamiento. Para los estudios con ratones Knockout, los blastocistos de
ratones C57BL/6 se han utilizado casi exclusivamente como receptores de ESCs genéticamente
diseñados. Estos blastocistos dan lugar de forma fiable a las quimeras ESC, y la genética de color
de capa generalmente facilita el análisis de los ratones nacen vivos.

El FVB/N es otra cepa popular para la microinyección pronuclear porque muchos investigadores
afirman que el pronúcleos de los cigotos es algo más grande y más distintivo que los recogidos de
cepas comparables (Taketo et al., 1991). Estos ratones albinos producen un número relativamente
grande de embriones y son excelentes madres. Los machos de FVB, sin embargo, son
extremadamente agresivos hacia los conespecíficos y generalmente se alojan individualmente por
8 semanas de edad para evitar las lesiones graves causadas por la lucha. El ratón 129S6/SvEv tiene
rasgos reproductivos favorables y muchas de las líneas de ESC disponibles se derivan de las
subcepas 129S6/SV, por lo que los animales quiméricos pueden cruzarse en ratones 129S6/SvEv.
Las líneas del ESC derivadas de los ratones 129S6/SV tienen fama de tener una alta incidencia de
transmisión de la línea germinal y se mantienen fácilmente en la cultura. Los ratones quiméricos,
positivos al Knockout producidos a partir de estas células pueden ser aumentados a 129s6/svev
ratones endogámicas para aumentar y preservar el fondo endogámicas de la línea de Knockout. Se
han notificado variaciones genéticas considerables en las subcepas 129 (Simpson et al., 1997). La
cepa DA o Dark Agouti es una rata endogámica homocigótica en el locus de Agouti (A/A). Esta cepa
es la primera rata de la que se aisló el ESC pluripotente (Li et al., 2008; Buehr et al., 2008). F344
son una rata albina de uso generalizado. Estos se han utilizado para generar blastocistos para la
formación de la quimera de rata. F344s son criadores relativamente buenos para las ratas
endogámicas. Las hembras de Wistar se han utilizado también para generar líneas de rata ESC
(Hirabayashi et al., 2010).

Para producir ratones GM y ratas, es necesario mantener cuatro tipos diferentes de animales
dentro de la colonia de producción. Los cuatro tipos diferentes de ratones o ratas requeridos
pueden ser generados in-House o más comúnmente, comprados comercialmente según sea
necesario para conservar el valioso espacio de las instalaciones:

(i) hembras donantes de embriones (superovulated),

(ii) (II) machos fértiles (criadores probados),
(iii) (III) embrión las hembras destinatarias de la transferencia (pseudopregnant) y
(iv) (IV) machos estériles (vasectomizados).
Para crear embriones para la manipulación genética, las hembras donantes de embriones están
superovuladas, con machos reproductores probados, luego eutanizadas, a menudo por
dislocación cervical, para la recolección de embriones con el fin de preservar la calidad del
embrión, aunque esto puede no ser necesario (Howell et al., 2003). Los protocolos de
superovulación para diversas cepas y poblaciones pueden encontrarse en la literatura, sobre todo
en Popova et al. (2005) y Byers et al. (2006). Los embriones producidos por la superovulación son
entonces manipulados en el laboratorio, y transferidos quirúrgicamente a hembras hechas
pseudoembarazadas por apareamiento con machos vasectomizados. En general, la producción de
30 – 40 embriones para la implantación (15 – 20 por lado) permitirá la implantación en una
hembra receptora. Los números menos que eso tienen menos probabilidades de resultar en un
embarazo exitoso por la hembra receptora. El esfuerzo involucrado en la creación y
caracterización de animales GM es significativo. La sobreexpresión de proteínas o el nocaut
genético frecuentemente resultan en características fenotípicas y genotípicas que desafían las
habilidades de manejo de colonias. Los animales pueden necesitar dosis cronometradas precisas
de compuestos para exhibir fenotipo sin letalidad. Dependiendo de la naturaleza específica y la
ubicación de la modificación, los animales GM pueden exhibir infertilidad, incompetencia inmune,
trastornos de la piel que promueven la infección, o un proceso o un síndrome específico de la
enfermedad, entre otras aberraciones fenotípicas. Cualquiera de estos fenotipos puede afectar la
salud, la longevidad o el rendimiento reproductivo. Por lo tanto, el manejo de colonias de
animales GM es más delicado que el manejo de animales genéticamente no modificados. Se
deben establecer cuatro sistemas de apoyo importantes cuando los investigadores o las
instalaciones comiencen a trabajar con animales GM (y nunca es demasiado tarde para establecer
los sistemas si el trabajo ya ha comenzado):

● un programa de salud de instalaciones establecido, que incluya métodos explícitos para la

importación de animales procedentes de otras instalaciones;

● procedimientos operativos estándar de estrategia de cría explícitos y bien documentados (PTU)

y directrices;

● un sistema de registro meticuloso para datos reproductivos y fenotípicos;

● acceso a un programa interno o externo de criopreservación de embriones o espermatozoides.

Estos sistemas y procedimientos deben ser apoyados y gestionados por personal bien entrenado.

Perfil de salud

Un programa de modificación genética animal debe utilizar siempre animales libres de patógenos
específicos para la producción, para la cría y para el fomento, cuando esté disponible. Para
obtener mejores resultados, los patógenos y los agentes adventicios deben excluirse mediante el
uso de animales de alta calidad, mediante la gestión cuidadosa de la importación de nuevos
animales en la instalación, y lo más importante, adhiriéndose a los SOPs de cuidado y cría de
animales rigurosos. Además, los protocolos de supervisión de la salud diligentes y las estrategias
suaves y rápidas para tratar con los potenciales descubrimientos de agentes no deseados dentro
de la instalación deben estar en su lugar y ser entendidos por todo el personal de cuidado animal e
investigadores. La barrera debe ser monitoreada en un horario regular para todos los agentes
indeseables, utilizando animales centinelas silvestres o animales inmunodeprimados producidos
dentro de la Colonia (ver Shek et al. capítulo 11, en este volumen para más información sobre el
monitoreo de la salud). Los riesgos para la salud animal asociados con una instalación de
modificación genética son más desafiantes que los de las instalaciones que utilizan sólo animales
salvajes de los vendedores, especialmente si esa instalación también realiza rederivaciones. Los
animales de una variedad de fuentes se importan con frecuencia, generalmente sobre una base
semanal. Los perfiles de salud de todos los animales importados deben revisarse cuidadosamente
porque los animales "limpios" de diferentes vendedores o laboratorios tendrán diferentes listas de
agentes excluidos y frecuencias de prueba. Los ratones y las ratas recibidos de los laboratorios
académicos deben ser puestos en cuarentena y ser ensayados por agentes excluidos antes de su
inclusión en un programa de cría.

Algunas instituciones requieren la rederivación de todos los animales, independientemente de su

origen, como medio de minimizar el riesgo. La transferencia de animales y personal entre colonias
o barreras debe regularse de manera estricta. Los animales de investigación que abandonan la
Colonia no deben ser devueltos a la Colonia. Las unidades de producción y cría de la modificación
genética deben mantenerse preferentemente dentro de una barrera separada de la vivienda de
los animales de investigación, que puede gestionarse como una instalación convencional para
hacer el acceso y el uso del investigador más simple, si la salud de la animales no se verán
afectados. Quizás el aspecto más desafiante de la gestión de los animales GM involucra las
estrategias de cría a largo plazo de los linajes importantes. Mantener la calidad de la salud animal
durante los programas de cría continuos, posiblemente plurianuales, de animales críticos presenta
una tarea formidable. Cuando un agente no deseado entra en este tipo de operación, es
extremadamente difícil erradicarlo sin un paréntesis en la producción, la rederivación de los
valiosos animales fundadores, la despoblación de animales reemplazables, y limpiar y desinfectar a
fondo el Instalación. El fomento de los neonatos, las rederivaciones de histerectomía y los
procedimientos de transferencia embrionaria pueden ser críticos para salvar las líneas importantes
después de que se haya descubierto la enfermedad.

Estrategias de cría de colonias

Con todas las líneas de animales GM, sólo un solo animal, el fundador, está disponible inicialmente
para la producción. Puede haber múltiples fundadores de una construcción de la inyección
pronuclear o una transfección ESC, pero cada fundador es único y tiene características únicas (un
ejemplo se puede ver en Feng et al. (2000)) y de vez en cuando muchas líneas se crían antes de la
más útil es Seleccionado. Por lo tanto, es imperativo perpetuar la línea mediante la cría de este
fundador tan rápidamente como sea posible. Obviamente, las colonias pueden ser generadas de
los fundadores masculinos a través de apareamiento polígamo y repetido dentro de un tiempo
relativamente corto. Las estrategias de reproducción de ratones bien planificadas y ejecutadas de
forma fiable son fundamentales para comprender y apreciar plenamente los efectos de la
modificación genética en el fenotipo de un animal. La tabla 32,3 comentarios de los plazos de los
distintos componentes de un programa de ratón GM. El personal de la instalación de modificación
genética debe ser claro con los investigadores acerca de los plazos involucrados. Los patrones
fenotípicos esperados y los posibles efectos sobre la salud, el comportamiento o la fertilidad
deben ser revisados por el investigador y el personal de modificación genética con el personal
veterinario y de cuidado animal. Otros temas que deben discutirse incluyen la importancia del
mantenimiento de registros, la expresión e impresión potencial influenciada por el sexo, y los
indicadores tempranos clave de la patología de la modificación-mediación. Los objetivos
específicos del programa de cría deben ser documentados y revisados por todo el personal
pertinente. Las prioridades deben ser explícitamente claras porque el número de animales
reproductores GM casi siempre será el factor clave de limitación de la tasa para el progreso del
programa de investigación. Los objetivos del programa de cría pueden incluir lo siguiente:

TABLA 32,3 plazos para los componentes de los programas de producción y cría de ratones
transgénicos y Knockout

Adaptado de Monastersky y de Geistfeld (2002). Las ratas serían materialmente bastante similares
en términos de tiempo, pero otros animales podrían tomar más o menos tiempo para alcanzar
estos objetivos.
● estabilización de la modificación genética sobre un fondo genético específico por
retrocruzamiento a una cepa endogámica;

● mejoramiento de la homocigoto (especialmente para los knockouts);

● utilización de cruces hermanos para estabilizar la expresión genética y fenotípica;

● expansión de la Colonia para proporcionar a los animales para la investigación;

● producción de embriones o espermatozoides para la criopreservación;

● rederivación quirúrgica de la línea.

Cuando se identifica a un animal fundador, es importante expandir la línea lo más rápido posible al
aparearse con relaciones de tipo salvaje. Este procedimiento se logra más fácilmente cuando el
fundador es un macho porque puede criar varias hembras cada semana. Las parejas de tipo salvaje
son generalmente de la cepa parental del fundador (o una de las cepas parentales en el caso de la
inyección híbrida de embriones). En la mayoría de los programas y para la mayoría de los linajes,
es aconsejable aparearse para producir descendencia homocigótica tan pronto como sea posible
(tabla 32,4). Para los heterocigotos del Knockout, la producción del genotipo homocigótico (es
decir, nulo) es absolutamente requerida. La evaluación de los genotipos dominantes y de las
inserciones del gene cromosoma-ligadas de Y puede no requerir el estudio homocigótico. Un
fundador transgénico es siempre hemizygous (él) para el Transgene, puesto que no hay DNA
correspondiente en el cromosoma complementario.

TABLA 32,4 esquemas de apareamiento para la generación de animales genéticamente

modificados de diferentes Cigóneas y las ventajas y desventajas de estos esquemas de
apareamiento.
‘+’ terminología clásica alelo de tipo salvaje

“_” alelo mutante

' TG ' se utiliza aquí en el caso de los animales transgénicos hemizygous para evitar la confusión.

Para los animales Knockout/Knockin, sustituya ' − ' por ' TG ' y ' heterocigotos ' por ' hemizygous '.

Todos los demás porcentajes y consideraciones se aplican.

a. todos los porcentajes son aproximados sobre un gran número de crías. Las camadas individuales
pueden contener diferentes distribuciones.

b. suponiendo que no haya mortalidad embrionaria/perinatal asociada con los genes implicados.

Aunque la crianza a la homocigoto se intente generalmente para la mayoría de las líneas

transgénicas dentro de los primeros 6 meses después de que un fundador Nazca, la homocigoto
no puede ser observada siempre debido a la letalidad homocigótica potencial, a la infertilidad
resultando de ciertos transgenes, o problemas con los espermatozoides resultando en esperma de
tipo salvaje outcompitiendo con otros tipos. En todos los experimentos transgénicos, varias líneas
que expresan la misma construcción en diferentes loci de integración deben evaluarse para
descontar el impacto de posibles mutaciones insercionales en patrones de expresión o
supervivencia embrionaria. Si no se obtienen los homocigotos después de que varias camadas de
él × él los apareamientos dentro de un solo linaje se hayan examinado, puede ser asumido que el
genotipo homocigótico deteriora de alguna manera el desarrollo embrionario o fetal. En estos
casos, la mutación insercional no puede ser ignorada como un posible factor, y los estudios para
estas líneas deben ser restringidos al análisis de los animales de él. Las expresiones transgénicas
relacionadas con las funciones endocrinas o glandulares (p. ej., uterinas) también pueden afectar
las capacidades femeninas transgénicas maternales para apoyar la gestación. Si los criadores
homocigolos están disponibles y fértiles, el tiempo y el gasto significativos se pueden ahorrar
puesto que no habrá necesidad de apareamiento de la prueba o de genotyping. La cría de
animales homocigolos, sin embargo, no resulta en la producción de controles de littermate, que a
menudo se desean. Por lo general es prudente mantener unos cuantos revestimientos de
retrocruce en caso de que los homocigotos exhiban la reproducción impugnada debido al fenotipo
y/o a la morbilidad o en el caso extremo de la mortalidad excesiva.

Figura 32,12 animales quiméricos, exhibiendo colores de pelaje tanto del blastocisto receptor
Albino como de las células madre embrionarias donantes de Agouti (ESC). El color de la capa
animal se puede utilizar como guía áspera a la cantidad del animal que se compone del ESC.
Generalmente, cuanto más el color de la capa del ESC visible, más probable es que el animal tenga
células germinales compuestas del ESC, permitiendo la transmisión de la modificación genética.
Con ratones quiméricos producidos usando ESC, es importante confirmar la transmisión de la línea
germinal de la inserción transgénica tan pronto como sea posible después de la madurez sexual
del animal fundador. La evidencia fenotípica, más comúnmente un patrón quimérico del capa-
color, no es necesariamente predictiva de la transmisión del del germline, pero puede ofrecer una
pista (Fig. 32,12). El ensayo de amplificación de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para
la secuencia específica de genes de eliminatorias puede realizarse con espermatozoides eyapados
de un fundador macho (es decir, recogido del lavado vaginal poscoital), si se desea. Los ratones
quiméricos ocasionalmente pueden ser hermafroditas estériles (Shomer et al., 1997). Debido a
que la mayoría de las líneas celulares de ES tienen un cariotipo XY, la proporción de sexos de los
ratones quiméricos está sesgada hacia los machos (Robertson et al., 1986). Por regla general,
cualquier ratón quimérico con más de 50% de coloración de pelaje quimérico debe ser criado en
pruebas para confirmar la transmisión transgénica. Puesto que el fenotipo del nocaut puede variar
en diversos fondos genéticos, puede ser útil evaluar una mutación en por lo menos un fondo
endogínico y un exogámica. Porque los ESCs modificados por la recombinación homóloga son
heteroziggous para la secuencia insertada de la DNA, generalmente solamente 50% de la
descendencia de una quimera del del germline acertado × el salvaje-tipo acoplamiento llevará la
mutación (las interrupciones bialélicas son posibles, pero menos frecuentes que las interrupciones
monoalélicas). Por lo tanto, los genotipos de todas las crías deben ser probados. La elección de la
línea ESC determinará el color de la capa de los animales en los que el ESC ha formado el tejido
reproductivo y se ha ido del germline. Con animales quiméricos, se debe producir un mínimo de
tres camadas antes de que se determine que una quimera no tiene aporte de línea germinal de la
ESC inyectada. Según lo discutido previamente, los ratones nocaut nulos homocigótico deben ser
producidos para evaluar los efectos verdaderos de la función de la pérdida-de-gene.

Análisis de genotipos de animales GM

Independientemente de qué estrategias de cría específicas se seleccionan para el estudio de un

linaje, se debe realizar un análisis molecular del genotipo para los criadores. El desempeño de este
programa de control de calidad genética proporcionará una gran tranquilidad porque los errores
de mantenimiento de registros y los revestimientos no planificados pueden ocurrir en los mejores
programas. Ocasionalmente, especialmente con ratones Knockout homocigóticas, la cigoto puede
determinarse por características fenotípicas observando marcadores visuales o bioquímicos de
expresión génica. Sin embargo, los análisis moleculares del DNA de un animal presuntamente del
GM siguen siendo los métodos más confiables del análisis genotípico. En el momento del
ensamblaje de la construcción, y antes de la construcción se utiliza para la modificación genética,
todos los ensayos potencialmente utilizados por el investigador para confirmar la
mutación/Transgene deben optimizarse. La pérdida de animales debido a la edad, mientras que el
análisis para determinar cuáles son los fundadores se ha elaborado es demasiado común. Todos
los criadores de GM, especialmente los fundadores, deben ser analizados ya sea por un ensayo de
hibridación de Southern blot o por amplificación de PCR. Cualquiera de estos ensayos confirmará
la presencia de secuencias modificationspecific y, con la experiencia y el equipo apropiados, puede
ser empleado para detectar cigoto para ciertos transgenes. La confirmación subsecuente del
cigosidad por el acoplamiento de la prueba es altamente recomendada. El acoplamiento de
prueba de un ratón transgénico se debe realizar cuidadosamente. Se debe evaluar un mínimo de
10 crías de cada animal transgénico para confirmar la homocigoto. No es infrecuente realizar un
mínimo de tres apareamientos de la prueba para determinar la frecuencia de la transmitancia del
gene para los animales quiméricos.

Circunstancias especiales

Las características específicas de una línea adquirida de ratones GM deben entenderse al recibirla.
Es importante discutir la línea con el creador o proveedor antes de usar los animales en
experimentos o programas de cría. Cuando los animales son recién creados en casa, entender los
efectos potenciales de la disrupción génica es igual de importante. Es imperativo que las
idiosincrasias de animales GM raros o caros sean familiares para que su cuidado y crianza se
realicen de manera expediente y eficiente. Por ejemplo, la necesidad probable de las madres
adoptivos, la suplementación dietética, o un ambiente excepcionalmente estéril se debe
incorporar en los protocolos de la cría. La competencia inmune alterada y los requisitos
medioambientales asociados de ciertas líneas pueden ser críticos, y la supervivencia y/o el
rendimiento experimental de estos animales pueden requerir procedimientos de barrera estrictos
y suministros de cría especialmente preparados. Otras características que podrían afectar el
cuidado y el uso de los animales incluiría un comportamiento altamente agresivo o una tendencia
al canibalismo. Todo el personal de cuidado animal debe ser entrenado para detectar el inicio de
eventos fenotípicos específicos tales como crecimiento tumoral, pérdida de cabello, artritis, o
patologías ópticas. Los síndromes potencialmente mortales asociados con la modificación
genética, como la diabetes, los trastornos respiratorios o la obstrucción intestinal, deben
esperarse y administrarse profesionalmente. El bienestar y la comodidad de los animales y el éxito
final del programa de investigación dependen de la formación, la atención y el rendimiento de los
técnicos diarios de cuidado de animales. Se debe tener especial cuidado durante el primer año de
existencia de una colonia para garantizar la supervivencia hasta que se pueda completar la cría de
expansión y la criopreservación embrionaria. Si una línea en particular tiene dificultad para comer
piensos peleteados, es posible que tenga que proporcionar alimento ablandado. Se debe utilizar
suficiente material de anidación para proteger a los cachorros de la hipotermia, especialmente
cuando se utiliza un sistema de enjaula ventilado.

Conservación de registros de colonias

La producción animal transgénica, la evaluación de genotipos, la gestión de colonias y la

observación de fenotipo generan una enorme cantidad de datos que deben registrarse de manera
adecuada y precisa para que puedan ser utilizados para apoyar las conclusiones científicas de la
investigación utilizando los animales. El origen, la historia de cría, y las características individuales
de cada línea de animales GM en una colonia deben ser documentados claramente y deben ser
accesibles. Si estos datos no se guardan, o no se mantienen de manera organizada, no se pueden
cumplir objetivos importantes de investigación y se pueden perder animales valiosos. El
mantenimiento de un pedigrí escrito o basado en computadora para cada linaje individual es
obligatorio. El pedigrí debe notar cualquier cambio en las cepas reproductoras y las fechas y tipos
de disposición de los animales en una notación claramente comprensible. Esta herramienta
permite la fácil correlación de patrones de herencia y expresión, basados en la generación y el
sexo, con patrones fenotípicos y análisis de genotipos. Los gráficos genealógicos se pueden
mantener en cuadernos de laboratorio, utilizando software genealógico para humanos o ratones,
o usando bases de datos específicas del ratón, como el sistema de gestión de colonias JAX basado
en MS Access (http://colonymanagement.jax.org/). Cada miembro individual de un linaje GM debe
ser marcado físicamente, usando transpondedores subcutáneos, etiquetas de oído, o tatuajes.
Todo el personal de investigación y cuidado de los animales debe ser consciente de que el análisis
retrospectivo crítico del patrón de expresión de una línea puede depender de registros precisos de
eventos comunes, incluyendo el rendimiento reproductivo, relaciones sexuales de camada, vida
útil, causas y fechas de la muerte, y el momento de las características fenotípicas. Los patrones de
color de la capa y los fenómenos de impresión también deben ser reportados.

Para cada linaje, la información de biología molecular, incluyendo la construcción de datos y

registros de análisis de genotipos, debe ser accesible cuando sea necesario. Para cada animal
individual, la información grabada debe incluir la fecha de nacimiento, sexo, número de
generación e identificación, código de línea, genotipo, color de pelaje, datos de expresión
fenotípica, información de muestra de genotipo y fenotipo, información de retrocruzamiento, y la
fecha de disposición final (es decir, muerte, experimento, envío a colaborador). La información de
producción puede incluir datos de taponamiento, número y tamaño de camadas, tiempos de
gestación y fechas de parto, camadas perdidas y canibalizadas, y el número de cachorros
destetados producidos. Es obligatorio el uso y la retención de tarjetas de jaula bien mantenidas.
Las tarjetas deben contener todos los datos normales del ratón, además de la nomenclatura
adecuada del animal GM y cualquier fecha de tratamiento y las fechas de cualquier
acontecimiento fenotípico excepcional. Las notas de Backcrossing y Breeding deben especificar los
sexos y genotipos de todos los animales y la proporción de machos a hembras criadas. El uso de
tarjetas de jaula de diferentes colores para cada linaje es útil.

Nomenclatura de los animales GM

La nomenclatura de los animales GM es un objetivo en movimiento, cambiando a medida que las

nuevas tecnologías están disponibles para manipular los genomas. Algunos principios básicos se
aplican, sin embargo, y éstos están relacionados con el nombramiento de los animales
endogámicas y subcriados y con el nombramiento de los genes ratón y rata. Las reglas más
recientes asociadas con el gen de ratones y ratas y la nomenclatura animal están disponibles en la
web en: http://www.informatics.jax.org/mgihome/nomen/index.shtml (para ratones) y
http://rgd.mcw.edu/nomen/nomen. shtml (para ratas; muchos enlaces se refieren a las páginas
disponibles en la página del ratón, ya que las reglas de nomenclatura son a menudo idénticas).
Este Resumen de la nomenclatura de ratones y ratas será breve y cubrirá sólo los fundamentos. Al
igual que con cualquier otro animal, cuando primero se discute el animal, la nomenclatura
binomial o nombre latino se utiliza a menudo. Para las ratas, esto es simple, ya que las ratas de
laboratorio domesticadas son Rattus norvegicus. Para los ratones de laboratorio, sin embargo, es
más complicado ya que son una mezcla de varias especies y subespecies diferentes (Didion y de
Villena, 2013) y se denominan apropiadamente "ratones de laboratorio", no Mus musculus
Musculus o Mus musculus domesticus. Las cepas endogámicas de ratones y ratas se utilizan
predominantemente en la investigación de hoy y a menudo están interrelacionadas (Beck et al.,
2000; Lindsey y Baker, 2005). Los ratones y las ratas se consideran endogámicas cuando se
cumplen ciertos criterios, a saber, que son hermanos asociados, han sido hermanados por 20 o
más generaciones consecutivas, y los miembros de la cepa descienden de un solo par ancestral en
la 20 o la generación subsiguiente ( Comité Internacional de nomenclatura genética estandarizada
para ratones y genoma de rata y Comité de nomenclatura, 2013. La mayoría de los ratones y ratas
incriados utilizados en la investigación hoy en día han sido endogámicas por más de 100
generaciones. Los ratones y ratas endogámicas deben nombrarse con una serie corta y única de
letras mayúsculas y números, comenzando con una letra. Tenga en cuenta que algunas cepas
antiguas no siguen esta Convención de nomenclatura: la ' c ' en BALB/c debe estar en minúsculas,
y todas las cepas 129 comienzan con números. Existe una lista estándar de abreviaturas de cepas
endogámicas y se debe utilizar cuando se llama en otras situaciones de nomenclatura, como el
congénico (genes y el ADN de flanquear transferido a través del apareamiento de una cepa a otra)
o híbrido (un cruce de dos cepas endogámicas) Animales.

Una vez que se establece una cepa endogámica, dado el tiempo puede divergir genéticamente ya
sea a través de heterocigoto residual en animales incompletamente endogámicas, errores
normales de replicación de ADN (deriva genética), o a través de la mezcla deliberada o inadvertida
con otras cepas. Las subcepas endogámicas se forman cuando los animales se separan después de
20 años, pero antes de 40 generaciones de endogamia , si se separan por más de 20 generaciones
de un ancestro común, o si se muestran diferencias genéticas entre los miembros de una cepa por
análisis genético ( Threadgill et al., 1997). Las designaciones de Substrain se indican mediante una
barra diagonal seguida de la designación de subtensión. Las designaciones de Substrain pueden
ser numéricas o alfabéticas. Las designaciones de subtensión alfabética son generalmente códigos
de laboratorio, que son códigos de uno a cinco letras, registrados por un laboratorio, instalación o
investigador con ILAR (http://dels.nas. edu/global/ILAR/Lab-Codes). Ejemplos de algunas cepas
endogámicas y sus subcepas se dan como tabla 32,5. Los ratones y las ratas de la raza, llamados
stocks, no cepas, también están en uso, especialmente en la toxicología y el desarrollo de
fármacos. Los animales de la raza son animales criados para mantener la mayor diversidad
genética posible dentro de una colonia cerrada y muchos de ellos tienen orígenes similares a los
ratones y ratas endogámicas en uso (Chia et al., 2005; Lindsey y Baker, 2005). Muchos proceden
de líneas endogámicas que posteriormente fueron criados para maximizar cualquier heterocigoto
restante y otros son más endogámicas que serían evidentes de su nomenclatura, debido a
acontecimientos tales como la rederivación para la enfermedad. Los animales de raza se
administran generalmente en colonias cerradas y con un sistema de apareamiento para evitar la
cría de parientes cercanos como hermanos o primos. Las acciones de los Outbred también se
nombran con series cortas, únicas de letras mayúsculas y números, también comenzando con una
letra. En el caso de los animales de raza, sin embargo, el código de laboratorio se enumera
primero, seguido de un colon, y luego el nombre de la acción. Si se conoce, el origen del stock
sigue el nombre del stock entre paréntesis. El origen puede ser un código de laboratorio o un
nombre de cepa/stock, por lo que la capitalización puede variar. Los ejemplos de la nomenclatura
de la acción de los subcriados se dan como tabla 32,6.

TABLA 32,5 ejemplos de cepas endogámicas y sus subcepas

Los nombres de los genes en ratas y ratones se coordinan entre especies y con la nomenclatura
genética humana, lo que significa que en muchos casos, los genes homólogas de los tres
organismos tendrán el mismo nombre y símbolo. Los nombres de genes completos de ratones y
ratas no están en cursiva, ni tampoco los nombres de las proteínas producidas por los genes. Los
símbolos de genes de ratón y rata suelen ser de tres a cinco caracteres (pero no más de 10) y están
en cursiva en la impresión. Los símbolos del gene comienzan típicamente con las letras
mayúsculas, a menos que el símbolo del gene sea el de una mutación conocida solamente por un
nombre fenotípico, en cuyo caso el símbolo del gene comienza con una letra minúscula. Cuando se
clona el nuevo gen denotado únicamente con una designación fenotípica, se le asigna un símbolo
basado en función. El alelo más común de un gene en la población se llama típicamente el
"salvaje-tipo" y es el nombre del gene sin ninguna designación alélica. Los alelos de los genes se
denotan por la adición de superíndices a los genes y a menudo son nombrados por los fenotipos
que inducen en los animales. Los alelos que comienzan con mayúsculas son dominantes; los alelos
que comienzan con letras minúsculas son recesivos. Las nuevas formas aleleicas de genes pueden
ser creadas por la ingeniería genética o ocurrir a través de procesos naturales. Los animales
Congénicos se crean cuando los alelos, ya sean naturales o humanos modificados, se transfieren
entre los fondos genéticos endogámicas. Finalmente, en ratones y ratas, los genes son
modificados por los humanos. En ratones transgénicos, se nombra al ratón, luego se nombra el
gen recién insertado, precedido por ' TG '. este nombre de gene no está en cursiva, ya que no es el
propio material genético del ratón o de la rata. En el caso del material genético endógeno
modificado por la tecnología, el gen modificado está en cursiva y la información sobre la
modificación está contenida en un superíndice alélico (a través de la modificación genética, se ha
creado un alelo). Las modificaciones realizadas a través de la recombinación homóloga en ESC se
denotan como ' TM ', mientras que las realizadas a través del uso de endonucleasas programables
se denotan ' en '. Si un gen ha sido golpeado, su nombre está presente en el alelo entre paréntesis.
Algunos ejemplos de la nomenclatura simple de la modificación del gene se dan en la Figura 32,13.

Figura 32,13 ejemplos de nomenclatura para genes de ratones o ratas. A los fines de la ilustración,
se ha elegido un gen, el receptor de leptina (Lepr en la nomenclatura genética del ratón). Los
animales con estas modificaciones genéticas pueden no existir realmente.

Preservación de los animales GM

La criopreservación de embriones preimplantacionales recolectados a partir de animales GM

permite el almacenamiento a largo plazo de líneas valiosas por un período infinito de tiempo y la
subsiguiente capacidad de regenerar una colonia de animales vivos en el futuro (Guan et al.,
2012). Los embriones criopreservados están protegidos contra la mutación genética y la deriva y la
contaminación genética, así como la mayoría de las catástrofes y los gastos de cría se evitan. Los
embriones criopreservados también pueden utilizarse para apoyar en el futuro las reclamaciones
de patentes, evitar las restricciones internacionales de cuarentena de animales y la rederivación
de la transferencia embrionaria relativamente rentable (Reetz et al., 1988). El nitrógeno líquido no
es estéril, sin embargo, y los animales reconstituidos de germoplasma criopreservado siempre
deben ser puestos en cuarentena y probados para los agentes excluidos antes de ser liberados en
una colonia. Las líneas valiosas que no están en la demanda actual o inminente deben ser
criopreservadas tan pronto como sea factible, preferiblemente como homozigotos para facilitar el
análisis futuro y la cría de líneas reconstituidas. Cuando los embriones criopreservantes, los
embriones del lote deben ser siempre reconstituidos, implantados, y ratones vivos producidos
para demostrar que esto es posible, antes de que la criopreservación se considere exitosa. Los
principales vendedores de roedores ofrecen este servicio, al igual que muchos núcleos de
modificación genética en varias instituciones. La capacidad de congelar y recuperar el esperma de
ratón viable, mótilo y con capacidad de fertilización es otra forma sencilla de preservar animales
valiosos contra el cambio o el desastre (Nakagata, 2000). Los kits están disponibles en muchos de
los principales proveedores de ratones. Los costos de criopreservación de embriones o
espermatozoides son bajos en comparación con los costos de recrear un ratón o rata GM y toda la
investigación asociada con ella. Se debe alentar encarecidamente a los investigadores a que crien
animales que sean esenciales para su investigación.

ENCONTRAR RECURSOS PARA RATONES Y RATAS

Los investigadores a menudo están interesados en la adquisición de animales o ESC o que pueden
no estar disponibles de vendedores comerciales o información sobre genes, alelos, o fenotipos de
animales. Los recursos están disponibles en línea para muchos de estos elementos, y algunos de
los más prominentes se enumeran y sus funciones se explican brevemente en la tabla 32,7. Estos
también han sido revisados en Ringwald y Eppig (2011) y Donahue et al. (2012).

TABLA 32,7 algunos recursos disponibles en línea para localizar ratones y ratas modificados
genéticamente, ESC del ratón e información sobre los genes ratón y rata, los fenómenos del ratón
y las fuentes de ratones y ratas modificados genéticamente