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FCVA/ UNESP JABOTICABAL

CURSO: Engenharia Agronômica


FUNDAMENTOS DE CROMATOGRAFIA

DOCENTE:
Profa. Dra. Luciana Maria Saran
1. CROMATOGRAFIA
1.1. Histórico
 A palavra cromatografia é de origem grega (kromatos –
cor; graphos – escrita) e foi usada pela 1a vez em 1906,
pelo botânico russo Michael Tswett, para descrever a
separação de pigmentos de plantas em zonas de cores
distintas.

 A partir de 1906 o uso da cromatografia se tornou


popular como um método de identificação e de separação
de substâncias.

 Atualmente, o método aplica-se também a substâncias


incolores, porém o nome original foi mantido.
1. CROMATOGRAFIA
1.1. Histórico éter de
petróleo
 Os termos cromatograma,
cromatografia e método
cromatográfico, aparecem
em dois trabalhos de Tswett,
que descrevem suas
experiências para separar CaCO3
pigmentos de folhas e gemas
de ovo, usando uma coluna
empacotada com CaCO3
finamente dividido (fase
estacionária) e éter de
petróleo (fase móvel). A
separação dos componentes
pode ser verificada por meio
de faixas coloridas na coluna.
1. CROMATOGRAFIA
1.2. Fundamentos do Método
 É um método físico-químico de separação dos
componentes de uma mistura.

 A separação é realizada através da distribuição dos


componentes da mistura entre 2 fases que estão em
contato íntimo.

 Nos processos cromatográficos estão sempre envolvidas


2 fases (fase móvel e fase estacionária), sendo que uma
se locomove através de uma outra.
1. CROMATOGRAFIA
1.2. Fundamentos do Método

 A fase que se move denomina-se fase móvel. Gases


e líquidos são usados como fases móveis.

 A fase que não se move denomina-se fase


estacionária ou suporte. Como fase estacionária, são
empregados sólidos e líquidos.
1. CROMATOGRAFIA
1.2. Fundamentos do Método

 Durante a passagem da fase móvel sobre a fase


estacionária, os componentes da mistura são
distribuídos entre as duas fases, de tal forma que cada
um dos componentes é seletivamente retido pela fase
estacionária, resultando em migrações diferenciais
destes componentes.
Transporte dos Componentes de uma Amostra por
uma Fase Móvel Através de uma Fase Estacionária
2. APLICAÇÕES DA CROMATOGRAFIA

 Identificação de compostos, por comparação com


padrões previamente existentes.

 Purificação de compostos, separando-se as


substâncias indesejáveis.

 Separação dos componentes de uma mistura.

 Em análises qualitativas e quantitativas.


3. CRITÉRIOS PARA A CLASSIFICAÇÃO
DAS DIFERENTES FORMAS DE
CROMATOGRAFIA

 Forma física do sistema cromatográfico.

 Fase móvel empregada.

 Fase estacionária utilizada.

 Modo de separação.
3.1. CLASSIFICAÇÃO PELA FORMA
FÍSICA DO SISTEMA CROMATOGRÁFICO
 A forma física do sistema cromatográfico define a
técnica geral, ou seja, a fase estacionária pode ser
colocada em um tubo cilíndrico ou disposta sobre uma
superfície planar.

 Cromatografia em coluna

 Cromatografia planar:

- cromatografia em papel (CP);

- cromatografia em camada delgada (CCD).


3.2. CLASSIFICAÇÃO PELA FASE
MÓVEL EMPREGADA
 Considerando o estado físico da fase móvel, distingui-se:

- cromatografia líquida: a fase móvel é um líquido.

- cromatografia gasosa: a fase móvel é um gás.

- cromatografia supercrítica: a fase móvel é um


vapor pressurizado, em temperatura acima da sua
temperatura crítica.
3.2. CLASSIFICAÇÃO PELA FASE
MÓVEL EMPREGADA
 Cromatografia Líquida:

- Cromatografia líquida clássica (CLC), na qual a fase


móvel é arrastada através da coluna apenas pela
força da gravidade.

- Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), na


qual são utilizadas fases estacionárias de partículas
menores, sendo necessário o uso de uma bomba de
alta pressão para a eluição da fase móvel.
3.2. CLASSIFICAÇÃO PELA FASE
MÓVEL EMPREGADA
 Cromatografia Gasosa (CG).

 Cromatografia Gasosa de Alta Resolução


(CGAR).

Obs.: A diferença entre os dois tipos está na coluna. Na


CGAR são usadas colunas capilares, enquanto na CG são
empregas colunas de maior diâmetro.
3.3. CLASSIFICAÇÃO PELA FASE
ESTACIONÁRIA UTILIZADA

 Fases estacionárias sólidas

 Fases estacionárias líquidas

 Fases estacionárias quimicamente ligadas


3.4. CLASSIFICAÇÃO PELO MODO
DE SEPARAÇÃO

 De acordo com este critério, as separações


cromatográficas são devidas aos seguintes
mecanismos:

- adsorção

- partição

- troca iônica
DIFERENÇA ENTRE ABSORÇÃO E ADSORÇÃO

 ABSORVER: ato de passar uma substância para o


interior da outra.

 ADSORVER: ligar uma substância a uma


superfície. A superfície adsorve a substância.
Distingue-se de absorver.
FENÔMENOS DE ADSORÇÃO E ABSORÇÃO
NAS ANÁLISES CROMATOGRÁFICAS

Moléculas
menores
penetram
na fase
Cromatografia de Exclusão
Cromatografia de Adsorção estacionária Molecular ou Cromatografia
(gel) de Penetração em Gel
4. CROMATOGRAFIA EM COLUNA
4.1. Cromatografia Líquida Clássica
 Fases estacionárias mais usadas: sílica e alumina.

 A fase estacionária é acondicionada em tubos cilíndricos


de vidro, de diâmetros variados, os quais possuem uma
torneira em sua extremidade inferior.

FONTE: DEGANI, A. L.; CASS, Q. B.; VIEIRA, P. C. Cromatografia um Breve Ensaio. Química Nova na Escola, n. 7, p. 23, 1998.
4. CROMATOGRAFIA EM COLUNA
4.1. Cromatografia Líquida Clássica

 O fluido que entra na coluna é chamado de eluente e o


fluido que emerge ao final da coluna é chamado de
eluato.

eluente eluato
COLUNA
entrada saída

 O processo de passagem de um líquido ou de um gás


por uma coluna cromatográfica é denominado eluição.
Representação Esquemática de uma Separação Cromatográfica

(a) Solução contendo os solutos A e


B, colocados no topo de uma
coluna empacotada com
partículas sólidas e preenchida
com solvente.

(b) Adição de mais solvente no topo


da coluna e escoamento da
mistura pela coluna devido ao
fluxo contínuo de solvente.

(c) O soluto A, com uma afinidade


maior pela fase estacionária do
que o soluto B, permanece mais
tempo ao longo da coluna.
Representação Esquemática de uma Separação Cromatográfica
4.2. Cromatografia Líquida de Alta
Eficiência (CLAE)
 Baseada no uso de suporte com partículas diminutas
responsáveis pela alta eficiência, as quais tornam
necessário o uso de bombas de alta pressão para a
eluição da fase móvel, devido sua baixa
permeabilidade.

 As colunas são geralmente de aço inoxidável.

 Graças ao grande número de fases estacionárias


existentes, é possível realizar análises e separações de
uma ampla gamas de compostos com alta eficiência.
EQUIPAMENTO BÁSICO DE CLAE

a) Reservatório da fase móvel; b) Bomba de alta pressão; c) Válvula


de injeção; d) Coluna; e) Detector; f) Registrador.
FONTE: DEGANI, A. L.; CASS, Q. B.; VIEIRA, P. C. Cromatografia um Breve Ensaio. Química Nova na Escola, n. 7, p. 24, 1998.
EQUIPAMENTO BÁSICO DE CLAE
EQUIPAMENTO PARA DE CLAE
COLUNA PARA CLAE
COMPARTIMENTO ONDE É INSERIDA A COLUNA

27
RESERVATÓRIO DA FASE MÓVEL

28
SISTEMA DE INJEÇÃO AUTOMÁTICA DE AMOSTRA

29
Frasco para Amostra

30
SISTEMA PARA RECEBIMENTO E ARMAZENAMENTO
DOS COMPOSTOS SEPARADOS POR CLAE

31
DETECTORES

32
4.2. Cromatografia Líquida de Alta
Eficiência (CLAE)
 Cromatograma: gráfico que mostra a resposta do
detector em função do tempo de eluição.
 O cromatograma é útil para análises qualitativas e
quantitativas. A posição dos picos no eixo do tempo
podem ser empregadas para identificar os componentes
da amostra, enquanto as áreas dos picos provêm uma
medida quantitativa da quantidade de cada uma das
espécies.
 O tempo de retenção, tr, para cada componente é o
tempo necessário, a partir da injeção da mistura na
coluna, para que o componente alcance o detector.
CROMATOGRAMA MOSTRANDO A SEPARÇÃO
DOS ENANTIÔMEROS DO TETRAMISOL

FONTE: DEGANI, A. L.; CASS, Q. B.; VIEIRA, P. C. Cromatografia um Breve Ensaio.


Química Nova na Escola, n. 7, p. 24, 1998.
5. CROMATOGRAFIA GASOSA
 Mecanismo de separação: baseado na partição dos
componentes de uma amostra entre a fase móvel gasosa
e a fase estacionária (líquido não volátil ou sólido).

 É muito atrativa devido a possibilidade de detecção em


escala de nano a picogramas (10-9 – 10-12 g).

 Principal limitação da técnica: necessidade de que a


amostra seja volátil ou termicamente estável.

 Os gases usados como fase móvel devem ter elevada


pureza e ser inertes em relação a fase estacionária. Os
gases mais usados são: H2, N2 e He (gases de arraste).
5. CROMATOGRAFIA GASOSA
 Nesta modalidade de cromatografia uma amostra líquida
volátil ou gasosa, é injetada através de um septo (um
disco de borracha) para dentro de uma entrada de
injeção aquecida, onde é rapidamente vaporizada. O
vapor é arrastado através da coluna por meio de um gás
de arraste (He, N2 ou H2) e os analitos separados fluem
pelo detector, cuja resposta é observada em um
computador.
DIAGRAMA ESQUEMÁTICO DE UM CROMATÓGRAFO A GÁS
CROMATÓGRAFO A GÁS

Forno da Coluna

39
CROMATÓGRAFO A GÁS

Coluna

40
FORNO DE UM CROMATÓGRAFO A GÁS

Coluna

41
ENTRADAS PARA INJEÇÃO DA AMOSTRA

42
SERINGAS PARA INJEÇÃO DE
AMOSTRAS LÍQUIDAS

43
SERINGA PARA INJEÇÃO DE
AMOSTRA GASOSA

44
CROMATOGRAMA NA TELA DO MONITOR DO COMPUTADOR
ACOPLADO AO CROMATÓGRAFO

45
5. CROMATOGRAFIA GASOSA
 Classificação:

- Cromatografia Gás-Líquido (CGL)

. Fase móvel: gasosa


. Fase estacionária: líquido não-volátil que recobre a
coluna internamente ou um suporte sólido finamente
dividido

. Mecanismo de separação: partição

46
5. CROMATOGRAFIA GASOSA

 Classificação:

- Cromatografia Gás-Sólido (CGS)

. Fase móvel: gasosa

. Fase estacionária: sólida

. Mecanismo de separação: adsorção

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5. CROMATOGRAFIA GASOSA
 São empregadas colunas capilares estreitas e compridas,
feitas de sílica fundida(SiO2) recobertas com poliimida (um
plástico capaz de resistir até 350ºC) para suportar e
proteger a coluna da umidade atmosférica.
 Colunas:
. Diâmetro interno: 0,10 a 0,53 nm

. Comprimento: 15 a 100 m, sendo comum com 30 m

(a) Dimensões normais de uma coluna capilar por cromatografia a gás. (b) Coluna de sílica 48
fundida . O diâmetro da armação que suporta a coluna, é de 0,2 m (ou 20 cm) e os
comprimentos usuais da coluna são de 15 a 100 m.
COLUNA CAPILAR PARA
CROMATOGRAFIA GASOSA

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COLUNAS CROMATOGRÁFICAS USADAS EM CG
(a) Coluna capilar de parede
recoberta: caracteriza-se por
um filme, com a espessura de
0,1 e 0,5 µm, da fase
estacionária líquida sobre a
parede interna da coluna.

(b) Coluna capilar recoberta


com um suporte: tem
partículas sólidas, presas na
parede interna da coluna,
(a) (b) (c) recobertas com a fase
estacionária líquida.

(c) Coluna capilar com camada porosa: contém uma fase estacionária
sólida sobre a parede interna da coluna. Neste caso, as partículas sólidas
são a fase estacionária ativa.
OUTROS TIPOS DE COLUNA PARA CG

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REPRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICA DE UM CROMATOGRAMA GASOSO,
MOSTRANDO COMO SÃO MEDIDOS OS TEMPOS DE RETENÇÃO
6. ANÁLISE QUANTITATIVA POR CROMATOGRAFIA

 A análise quantitativa em cromatografia é baseada em


estabelecer o valor da área da banda cromatográfica.

 Na CG e na CLAE a banda é registrada como um pico


que, idealmente deve ter formato gaussiano.

 A área do pico é proporcional a quantidade da


substância na amostra analisada.

 Equipamentos com integradores eletrônicos, dispensam


a medida manual da área dos picos.
6. ANÁLISE QUANTITATIVA POR CROMATOGRAFIA

 Cálculo da área do pico: a área do pico pode ser calculada


traçando-se tangentes dos dois lados do pico. A
intersecção destas duas tangentes com a linha de base
fornece um triângulo cuja área pode ser calculada pela
seguinte fórmula:
A = (a . wb)/2
 Na equação acima:
A = área do pico
a = altura do pico
wb = largura do pico na linha de base
6. ANÁLISE QUANTITATIVA POR CROMATOGRAFIA

 Construção da Curva Analítica ou Curva de


Calibração:

1. Preparam-se várias soluções da substância a ser


quantificada, em diferentes concentrações.

2. Obtém-se o cromatograma correspondente a cada


uma delas.

3. Em um gráfico relacionam-se as áreas obtidas com as


concentrações e a partir do gráfico, pode-se calcular a
concentração desta substância na amostra.
CURVA ANALÍTICA OU CURVA DE CALIBRAÇÃO
CURVA ANALÍTICA OU CURVA DE CALIBRAÇÃO

220

C (g L-1) Área
200

(mm2)
180
2,8 117

Área (mm )
2
5,7 135 160

8,4 162 140 Y = 91,31 + 8,49X

11,2 194 120

14,1 207
100
2 4 6 8 10 12 14 16
-1
C (g L )