Final Tesis 12-02-18 Final

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE GUERRERO
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICO BIOLÓGICAS

Programa Educativo de Químico Biólogo Parasitólogo
Modulación de la proliferación y supervivencia

celular por variantes de la oncoproteína E6 del
VPH-16 en células C33-A en respuesta a cisplatino
TESIS
Para obtener el título de:
Químico Biólogo Parasitólogo
PRESENTAN:
Huri Haziel Luviano Jaimes
Diego Armando Lechuga Mercado
DIRECTOR DE TESIS
Dr. Oscar Del Moral Hernández
CODIRECTOR DE TESIS
Dra. Verónica Antonio Véjar
CHILPANCINGO, DE LOS BRAVO GRO., FEBRERO DE 2018

EL PRESENTE TRABAJO SE DESARROLLO EN EL LABORATORIO DE
VIROLOGÍA PERTENECIENTE A LA FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICO
BIOLÓGICAS DE LA UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE GUERRERO. 2018
EL FINANCIAMIENTO PARA ESTA INVESTIGACIÓN SE OBTUVO DEL

PROYECTO “EVALUACIÓN IN VITRO DE LOS PROCESOS DE ADHESIÓN
CELULAR Y APOPTOSIS POR EFECTO DE LA EXPRESIÓN DE LA
ONCOPROTEÍNA E6 DE VARIANTES DEL VPH 16 “FONDOS SEP-CONACYT
CLAVE: CB-2015-01-257857”
AGRADECIEMIENTOS
En primer lugar, agradecemos a nuestro director de Tesis el Dr. Oscar del Moral Hernández,
por la oportunidad que nos brindo para colaborar con su grupo de trabajo, por la confianza
depositada en nosotros, por sus consejos y sobre todo por su paciencia; realmente para
nosotros fue un privilegio el haber estado bajo su asesoría durante más de dos años desde el
servicio social. De todo corazón muchas gracias.
A nuestra Codirectora la Dra. Verónica Antonio Véjar por siempre tener la disponibilidad
para resolvernos cualquier duda, por contribuir a la planeación y desarrollo de los
experimentos, por el tiempo dedicado a las correcciones para la mejora de nuestro trabajo,
por proporcionarnos el Cisplatino.
A NUESTRO COMITÉ TUTORIAL:
Al Dr. Daniel Hernández Sotelo por su gran amistad y sobre todo por su tiempo en la
revisión de nuestro trabajo.
A la Dra. Yaneth Castro Coronel por su contribución y aportación para realizar nuestros
ensayos de MTT, por el tiempo empleado en la mejora de nuestro trabajo.
A la Dra. María Elena Moreno Godínez por sus observaciones, aportaciones y sugerencias
para nuestro trabajo.
AGRADECIMIENTO A LOS QUE CONTIBUYERON EN LA ELABORACIÓN
DE ESTE TRABAJO
Un agradecimiento especial a la Dra. Luz del Carmen Alarcón Romero por todas las
aportaciones, consejos y conocimientos aportados a la realización de este trabajo.
LABORATORIO DE BIOLOGÍA CÉLULAR DEL CANCER
Al Dr. Eduardo Castañeda Saucedo y al Dr. Napoleón Navarro Tito por permitirnos
trabajar en el cuarto de cultivo celular, donde se realizó la mayor parte de la fase
experimental.
Al M.C. Juan Carlos “JK” por su disposición a resolvernos dudas respecto al cuarto de
cultivo, por su amistad.
A los M.C Angelica y Monse por su ayuda en el cuarto de cultivo.
LABORATORIO DE BROMATOLOGIA DE ALIMENTOS
A la Dra. Yanik Ixchel Maldonado Astudillo, al Dr. Javier Jiménez Hernández, al Dr.
Ricardo Salazar López, por facilitarnos el uso del espectrofotómetro de micro placas para
realizar la cuantificación de las absorbancias de los ensayos de proliferación celular.
LABORATORIO DE CITOPATOLOGÍA E INMUNOHISTOQUÍMICA
A la M.C. Maggy por capacitarnos en la realización de los ensayos con MTT.
-Huri Haziel Luviano Jaimes

-Diego Armando Lechuga Mercado
DEDICATORIAS
A mi madre:
El esfuerzo y la dedicación que has empeñado a lo largo de mi carrera profesional es
inigualable, gracias Araceli por todo el apoyo. Tú que has sacrificado gran parte de tu vida
para formarme y educarme, por tus innumerables consejos, por tu empatía, tu confianza.
Mamá este logró no solo es mío, también es tuyo. Te amo.
A mis hermanos:
Sin ustedes no tuviera algo llamado “inspiración” así es, son mi inspiración, parte
fundamental de mi vida Walfred y Marijose, gracias por llenarme de alegría cada vez que
los veo, gracias por contagiarme y hacerme recordar de una linda etapa de mi vida “mi
niñez”. Los amo.
A mi familia: Abuelita Martha, Abuelito Juan, Virginia, Daniel Laurel, Blanca Soberanis,
parte fundamental de mis logros en mi vida, muchas gracias por estar ahí conmigo en los
buenos y malos momentos.
Al Dr. Oscar del Moral: por su amistad, su confianza, sus valiosos consejos y sobre todo
por despertar el gran cariño y amor hacia la investigación.
A mis amigos y hermanos:
Gran parte de mi vida y de mi carrera profesional han estado ahí, es por ello que les
agradezco profundamente el poder recibir de su amistad sincera y leal. (Cesar Díaz, Saeed
Santos, Alejandro Gallegos, Sergio Roldan, Isaías Navarrete, Jonhy García, Daniel
Ocampo)
Huri, Nestor, Yanileth, Jorge Erick, Fanny, Cristian, Isai, Aldo, Walter, Yetzeli, Arianna,
Nadia, Zuleica, Yari, Mónica, Kay García, sin duda personajes muy importantes en mi
formación académica con quienes he compartido bastante y me han enseñado un valor
primordial “Amistad”.
A mis compañeros de laboratorio
Compañeros se escucha muy por debajo de lo que ustedes me han brindado, por eso y
más, los considero mis hermanos, personas de las cuales yo confió plenamente. Gracias
por darme ese apoyo incondicional y sobre todo por sentir esa gran hermandad (América,
Norma, Laura, Dorian, Monge, Huri).
A mi compañero de tesis y hermano
Sin duda, la mejor compañía que tuve a lo largo de mi carrera profesional es un honor
compartir contigo esta inmensa labor, te agradezco por la paciencia, el apoyo moral, por tu
sinceridad, el esfuerzo que empeñas a realizar cualquier trabajo, sin duda un gran ejemplo
a seguir. Te quiero hermano.
-Diego Armando Lechuga Mercado

DEDICATORIAS
Espero que estas líneas me permitan transmitir mi más sincero y profundo agradecimiento a todas
esas personas que me han apoyado incondicionalmente.
A mi familia
Primeramente, a mi madre Griselda por su esfuerzo constante en mi formación, por apoyarme en

todo momento, por siempre tener palabras de aliento, por ser mi ejemplo a seguir y ser un pilar en
todos los aspectos de mi vida. No existen palabras para expresar toda mi gratitud.
A mi padre José Juan, ninguna persona es perfecta en esta vida, y los errores cometidos nos permiten
superarnos cada día para ser mejores personas. No me queda más que decirle que lo quiero y espero
tener su apoyo para proyectos futuros.
A mis hermanos Ricardo y Brisceida, son muy importantes para mí, sin importar las discusiones sin
sentido, tengan en cuenta que siempre en mi tendrán a alguien en que confiar. Los quiero.
A mis abuelos maternos Rubén y Ma. de Jesús, por ser el centro de unión de la familia Jaimes Castro,
por velar por mí y mis hermanos desde que tengo memoria, ustedes han demostrado que una familia
unida lo puede todo. Los quiero muchísimo.
A mis tíos y primos maternos por estar ahí siempre, por esos momentos de alegría, de logros y
tristezas compartidas.
A mis amigos
Los “chicos irresponsables”: Abigail, Ivette, Silverio, José Ángel, Roberto, Sinaí, Teacher
(Artemio) e Israel por todos los momentos compartidos.
A Irán, Janet y Chema que a pesar de la distancia siempre han estado al pendiente de mí, para darme
palabras de aliento y ánimos cuando los he necesitado.
A mi amigo Jonathan (†) que, por cuestiones inesperadas de la vida, abandonaste este mundo muy
joven, gracias por brindarme tu amistad sincera, sé que desde el lugar en el que te encuentras
compartes conmigo esta felicidad.
A las chicas del departamento 3 (Néstor, Aldo, Amando y Mario) ustedes son mi segunda familia
con quienes compartí muchísimas cosas (trastes, jabón, etc… ja ja ja ja), muchas gracias por haberme
brindado su amistad, los aprecio mucho y sé que siempre estarán ahí para brindarme su apoyo cuando
lo necesite.
Nestor, Aldo, Amando, Raúl Augusto, Josimar, Jorge Erick, Damaris, Brandon Flores, Jesús,
Isaí, Arianna, Nadia, Yarichiga, Maralhi, Jesús, Wendoly, Melina, Liz, Vianney Pineda, Charlie,
Yunnue, Rey David, Karinita, Brandon, Ime, Brenda Eli, Melissa, Navor, Cristian, Zuleica, Yetzeli,
Mónica, Kay, Josué, Ali, Fercha, Bedolla, con ustedes compartí momentos muy agradables, muchas
gracias por ello, espero seguir conservando su amistad.
A mis camaradas de laboratorio

Muchas gracias por esos momentos de relajo, esos viajes en las que nos la pasamos de lo mejor,
ustedes hicieron que el trabajo de laboratorio fuera relajado, esa complicidad en el laboratorio y en
ese grupo de whatsapp que no tenemos ja ja ja, (Normita de Jesús, AmeLab, Monge, Dorian,
Laurita y Lechuga)
A mi brother y partner de Tesis
Sin dudarlo, si me volvieran a preguntar con quién haría tesis te cambiaria, ok no. Jaja. Fuiste un
excelente compañero de trabajo, amigo y hermano, y no te cambiaria, fuimos un gran equipo, tu apoyo
emocional para sacarnos un momento de risa en el laboratorio en esos momentos de estrés fueron de
lo mejor, espero que tengas éxito en tus futuros planes de vida, ten en cuenta que en mi tendrás a
alguien en quien apoyarte cuando lo necesites, un gran abrazo.
MODULACIÓN DE LA PROLIFERACIÓN Y
SUPERVIVENCIA CELULAR POR VARIANTES DE
LA ONCOPROTEÍNA E6 DEL VPH-16 EN CÉLULAS
C33-A EN RESPUESTA A CISPLATINO
INDICE
Índice de Figuras……………………………………………………………………...………….. i
Índice de Tablas………………………………………………………………………..………… ii
Índice de Anexos…………………………………………………………………………….….. iii
RESUMEN……………………………………………………………………………………….… 1
ABSTRACT…………………………………………………………….………………………….. 2
I. MARCO TEÓRICO ......................................................................................................... 3

1. Virus del papiloma humano ..................................................................................... 3
1.1 Virus del papiloma humano 16 (VPH-16) .............................................................. 3
1.2 Ciclo replicativo del VPH-16 .................................................................................. 4
2. Oncoproteína E6 del VPH-16 ................................................................................... 5
2.1 Papel de la oncoproteína E6 en la proliferación y sobrevivencia celular ............... 6
2.2. Variantes de E6 del VPH-16 ................................................................................ 7
2.3 Potencial oncogénico de las variantes de E6 de VPH-16 ...................................... 8
3. Cisplatino ................................................................................................................ 11
3.1 Mecanismo de acción del cisplatino .................................................................... 12
3.2 Apoptosis inducida por cisplatino ........................................................................ 13
3.3 Mecanismos moleculares de la resistencia de cisplatino en CaCU ..................... 13
II. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ......................................................................... 16
III. JUSTIFICACIÓN ........................................................................................................ 17
IV. HIPÓTESIS ................................................................................................................ 18
V. OBJETIVOS ................................................................................................................ 19
VI. DISEÑO METODOLÓGICO ....................................................................................... 20
6.1. Materiales y métodos ............................................................................................ 21
6.2. Diagrama de trabajo .............................................................................................. 24
VII. RESULTADOS .......................................................................................................... 25
VIII. DISCUSIÓN ............................................................................................................. 31
IX. CONCLUSIONES....................................................................................................... 36
X. PERSPECTIVAS ......................................................................................................... 37
XI. ANEXOS .................................................................................................................... 38
XII. REFERENCIAS ......................................................................................................... 44
i
Índice de figuras
Figura 1. Representación esquemática del genoma de VPH-16………………………..….. 4
Figura 2. Estructura primaria de la oncoproteína E6 de VPH-16………………………….... 5
Figura 3. Caracterización fenotípica del modelo epitelial tridimensional: morfología, patrón
de diferenciación y estado de proliferación………….……...…………………………………. 10
Figura 4. Expresión relativa de E6 en células C33-A transfectadas…………...…………... 25
Figura 5. Cinética de proliferación de células C33-A transfectadas con variantes de E6 del
VPH-16 en condiciones de crecimiento basal……………………………………….………… 26
Figura 6. Citotoxicidad de cisplatino en células C33-A………………………………………. 27
Figura 7. Citotoxicidad de la CI50 de cisplatino en células C33-A transfectadas...………. 28
Figura 8. Cinética de proliferación celular en células C33-A transfectadas con variantes de
E6 del VPH-16 tratadas con cisplatino…………………………..…………………….…….… 30
Figura 9. Correlación entre los niveles del mensajero del oncogén E6 con la proliferación
celular en condiciones basales………………………………………………….……………….43
Figura 10. Cinética dosis-respuesta del tratamiento con cisplatino en células C33-A……..43
Índice de tablas
Tabla 1. Clasificación de los VPH genitales de acuerdo con su potencial oncogénico….... 3
Tabla 2. Principales blancos celulares de E6 y consecuencias funcionales………………... 6
Tabla 3. Clasificación de las variantes de E6 de VPH-16…………………………………….. 8
Tabla 4. Variaciones en la secuencia de nucleótidos y a.a en las variantes de E6 del
VPH-16…………………………………………………………………….….………..………….. 8
Tabla 5. Efectos de las variantes de E6 de VPH-16 sobre la expresión de genes pro y
anti-apoptóticos………………………..………………………..……………………………….. 11
Tabla 6. Características fisicoquímicas del cisplatino………………………………………... 11
Tabla 7. Mecanismos moleculares de resistencia al cisplatino en CaCU……………………14
Tabla 8. Oligonucleótidos utilizados para la PCR en tiempo real…………………………... 22
ii
Índice de anexos
Anexo 1. Extracción de RNA mediante el método Fenol-Cloroformo (TRIZol)…………...38
Anexo 2. Retro transcripción……………………………………………………………...…….39
Anexo 3. Condiciones para la qPCR..................................................................................39
Anexo 4. Reacción para la qPCR ……………………………………..……………………….40
Anexo 5. Método de exclusión de azul de tripano…………………………………...……….40
Anexo 6. Protocolo para ensayo de citotoxicidad por cisplatino…………………...……….41
Anexo 7. Correlación entre los niveles del mensajero del oncogén E6 con la proliferación
celular en condiciones basales…………………………………………….…………………….43
Anexo 8. Cinética dosis-respuesta del tratamiento con cisplatino en células C33-A……..43
iii
“Modulación de la proliferación y supervivencia celular por variantes de la
oncoproteína E6 del VPH-16 en células C33-A en respuesta a cisplatino”
RESUMEN
INTRODUCCIÓN: El Virus del Papiloma Humano de alto riesgo tipo 16 (VPH-16) es
el principal factor de riesgo asociado al desarrollo del Cáncer Cérvico Uterino
(CaCu). Se han reportado distintas variantes genéticas de este virus que difieren en
su prevalencia y en su potencial oncogénico. Por otro lado, se ha observado que el
20% de las pacientes tratadas con fármacos quimioterapéuticos como el cisplatino
generan resistencia al tratamiento. Nuestro grupo de trabajo ha desarrollado un
modelo in vitro de células C33-A transfectadas establemente con la oncoproteína
E6 de las variantes AA-a, AA-c, E-G350, E-A176/G350, E-C188/G350 y la
E-Prototipo del VPH-16, en el cual se realizó un análisis global del perfil de
expresión de genes por ensayos de microarreglos y se encontró que las variantes
de E6 regulan 192 genes de los cuales 24 (12.5%) se encuentran relacionados con
la proliferación celular. OBJETIVO: Evaluar el efecto de la oncoproteína E6 de las
variantes AA-a, AA-c, E-G350, E-A176/G350 y E-C188/G350 en la proliferación de
células C33-A tratadas con cisplatino en comparación con la E-Prototipo (E-P) del
VPH-16. MATERIALES Y MÉTODOS: La concentración inhibidora media (CI50) de
cisplatino se determinó mediante ensayos de proliferación celular con MTT en
células C33-A. Las células C33-A transfectadas con E6 de las variantes del
VPH-16 fueron tratadas con la CI50 de cisplatino por 12, 24 y 48 horas y
posteriormente se analizó su proliferación. RESULTADOS: Se encontró que las
células que expresan la oncoproteína E6 de las variantes E-G350 y AA-c requieren
una concentración mayor de cisplatino para inducir la muerte del 50% de su
población. Las células C33-A/E-G350 fueron las más resistentes al tratamiento con
cisplatino. CONCLUSIONES: Nuestros resultados sugieren que la expresión de la
oncoproteína E6 de las variantes del VPH-16 regula diferencialmente la proliferación
celular y que las variantes AA-c y E-G350 al ser más resistentes a la muerte celular
inducida por cisplatino, podrían tener mayor potencial oncogénico.
Palabras clave: VPH-16, Oncoproteína E6, Cisplatino y Proliferación celular.
Luviano-Jaimes H.H & Lechuga-Mercado D.A

1
ABSTRACT
INTRODUCTION: High-risk Human Papillomavirus type 16 (HPV-16) is the main risk

factor associated with the development Cervical Cancer (CC). Have been reported
that HPV16 genetic variants differ in their prevalence and oncogenic potential. On
the other hand, it has been reported that 20% of patients treated with
chemotherapeutic drugs such as cisplatin generate resistance to treatment. Our
work group has developed an in vitro model of transfected C33-A cells with HPV-16
E6 oncoprotein variants AA-a, AA-c, E-G350, E-A176/G350, E-C188/G350 and the
E-Prototype. A global analysis of gene expression profile by microarray assays found
that E6 variants modulate both positively and negatively 192 genes of which 12.5%
are related to cell proliferation. OBJECTIVE: To evaluate the effect of HPV-16 E6
variants AA-a, AA-c, E-G350, E-A176/G350 y E-C188/G350 and E6 E-Prototype in
proliferation of C33-A cells treated with cisplatin. MATERIAL AND METHODS: The
mean inhibitory concentration (IC50) of cisplatin was determined by cell proliferation
assays with MTT in C33-A cells. Then we treated with IC50 of cisplatin C33-A cells
transfected with the HPV-16 E6 oncoprotein variants and analyzed their proliferation.
RESULTS: The E-G350 and AA-c variants require a higher concentration of cisplatin
to induce the death of 50% of population. The C33-A/E-G350 cells were the most
resistant to treatment with cisplatin. CONCLUSIONS: Our results suggest that the
expression of the HPV-16 differentially regulate cell proliferation. The cells
C33-A/AA-c and C33-A/E-G350, are more resistant to cell death induced by
cisplatin. This characteristic may confer them greater oncogenic potential than
E-Prototype.
Key words: HPV-16, Oncoprotein E6, Cisplatin and Cell Proliferation.

2
I. MARCO TEÓRICO
1. Virus del papiloma humano
El Virus del Papiloma Humano (VPH) pertenece al género Papillomavirus y a la

familia papillomaviridae es un virus desnudo, con cápside icosaédrica que mide de
50-55 nm de diámetro y está compuesta por 72 capsómeros (Howley et al., 2013).
Hasta la fecha se han identificado más de 200 genotipos de VPH, de los cuales más
de 40 pueden propagarse por contacto sexual directo, de piel y membranas
mucosas (American Cancer Society, 2014). En 2006 Muñoz y colaboradores,
propusieron una clasificación de los VPH de acuerdo con su potencial oncogénico
(Tabla 1).
Tabla 1. Clasificación de los VPH genitales de acuerdo con su potencial oncogénico (Muñoz
et al., 2006).
Riesgo oncogénico Genotipos de VPH
Riesgo alto 16,18,31,33,35,45,51,52,56,58 y 59
Riesgo probable alto 26,53,66,68,73 y 82
Riesgo bajo 6,11,13,40, 42,43,44,54,61,70, 72,81, y 89

2,3,7,10,19,27,28,29,30,32,34,55,57,62,
Riesgo indeterminado
67,69,71,74,77,83,84,85,86,87,90 y 91
1.1 Virus del papiloma humano 16 (VPH-16)
El VPH-16 tiene un genoma de DNA de doble cadena circular de una longitud

aproximada de 7,906 pares de bases (pb). El genoma viral (Figura 1) se encuentra
constituido por una región larga de control (LCR) no codificante que regula la
expresión génica y el proceso de replicación viral (Villiers et al., 1999) y 8 genes, los
cuales, codifican para seis proteínas de expresión temprana: tres oncoproteínas
(E5, E6 y E7) que modulan el proceso de transformación celular y dos proteínas
reguladoras (E1 y E2) involucradas en la replicación y transcripción viral. Los dos

3
genes restantes codifican para las proteínas estructurales de expresión tardía

(L1 y L2) que componen la cápside viral (Muñoz et al., 2006).
VPH-16
LCR
Figura 1. Representación esquemática del genoma de VPH-16: Se muestra la disposición de los

genes tempranos no estructurales (E1, E2, E4, E5, E6 y E7), los genes de expresión tardía de la
cápside (L1 y L2) y la región reguladora aguas arriba (LCR). Modificada de (Muñoz et al., 2006).
1.2 Ciclo replicativo del VPH-16
El VPH-16 ingresa a través de micro heridas o por medio de abrasiones en el estrato

basal del epitelio, específicamente en la zona de transformación escamocolumnar
del cérvix uterino (Doorbar, 2005). Una vez que el virus ha ingresado al estrato
basal, la proteína L1 de la cápside se une a los receptores integrina α6-β4 y heparán
sulfato (HSPGs) que solo se expresan en las células basales. La unión virus
receptor desencadena un cambio conformacional en la cápside viral, catalizado por
la proteína chaperona ciclofilina B (CyPB) que expone el dominio N-terminal de la
proteína L2, permitiendo el ingreso del virus a la célula mediante endocitosis
dependiente de clatrina (Bienkowska-Haba et al., 2012). Una vez que el virus ha
entrado a la célula se forman endosomas tempranos que más tarde se fusionaran
con lisosomas permitiendo la degradación de las cápsides virales, mediante el

4
rompimiento de los enlaces disulfuro intracápsomeros (Li et al., 1998; Day et al.,
2003). Posterior a la degradación de la cápside, el DNA viral se trasloca desde el
compartimiento endolisosomal al citoplasma para trasladarse finalmente al núcleo
(Sonnex, 1998).
El ciclo replicativo del virus está regulado por el estadio de diferenciación de las
células que conforman el epitelio estratificado del cérvix uterino (Longworth y
Laimins, 2004). En el estrato basal la expresión de los genes tempranos E1 y E2,
permite que el DNA viral se replique a una tasa muy baja (de 100 a 200 episomas
por célula infectada). Por otra parte, en el estrato suprabasal inicia la expresión de
los genes E2, E5, E6 y E7 que en conjunto contribuyen al mantenimiento del
genoma viral e inducen la proliferación celular. Finalmente, en el estrato granular se
activa la transcripción de los genes tardíos L1 y L2 los cuales participan en la
formación de la cápside viral (Hamid, 2009; Lazarczyk et al., 2009).
2. Oncoproteína E6 del VPH-16
La oncoproteína E6 del VPH-16 (Figura 2) es una fosfoproteína de 151 aminoácidos

(a.a), con un peso molecular aproximado de 18 kDa, se encuentra codificada en el
gen 6 de todos los VPH de alto riesgo (Münger et al., 2004). Su estructura presenta
cuatro cisteínas unidas por una molécula de ion zinc. Las estructuras secundarias
denominadas dedos de zinc están implicadas en su función oncogénica (Wise-
Draper y Wells, 2008).
Figura 2. Estructura primaria de la oncoproteína E6 del VPH-16.

5
2.1 Papel de la oncoproteína E6 en la proliferación y sobrevivencia celular
El principal mecanismo de oncogenicidad de la proteína E6 del VPH-16 es su

capacidad para unirse a la proteína celular ubiquitin ligasa (E6-AP), con la cual
forman el complejo E6/E6AP que induce la degradación de p53 mediante la ruta del
proteosoma (Scheffner et al., 1993). Sin embargo, p53 no es el único blanco celular
de E6. Liu y colaboradores (1999) a partir de la construcción de mutantes de E6
incapaces de degradar p53, lograron identificar otras proteínas celulares
involucradas en procesos biológicos como apoptosis, proliferación, diferenciación
celular, adhesión, ciclo celular y respuesta inmune (Tabla 2). Los autores sugieren
que la regulación por parte de E6 es crucial en el establecimiento de la
carcinogénesis cervical (Moody y Laimins, 2010; Pim et al., 2010).
Tabla 2. Principales blancos celulares de E6 y consecuencias funcionales.

Blancos
Repercusiones funcionales Referencias
celulares de E6
-Inhibición de la transcripción
P53 -Degradación mediada por proteosoma Thomas et al.,1999
-Anulación de los inhibidores cdk y apoptosis
-Desregulación en la transducción de señales en Eun-Kyoung y Jong-
E6BP
proliferación Sup, 2005
-Degradación mediada por proteosoma
Bak Thomas et al.,1998
- Inhibición de la apoptosis
-Activación transcripcional de hTERT
Myc Veldman et al., 2003
-Co-inmortalización de células primarias
-Regula la estabilidad de E6
Zur Hausen., 2002
E6AP Pim y Banks., 2010
-Funge como sustrato objetivo de E6 Scheffner et al.,1993
-UbE3 ligasa para sus blancos
-Degradación de NFX1-91
NFX1-91 -Activación de hTERT Gewin et al., 2004
- Inmortalización celular
-Inhibición de la actividad transcripcional de IRF 3
IRF-3 Ronco et al., 1998
-Inhibición de la señalización inducida por IFN
Bax Ronco et al., 1998
-Inhibición de la apoptosis
-Degradación de FADD Eun-Kyoung y Jong-
FADD
-Supresión de apoptosis mediada por Fas Sup, 2005
-Degradación de la procaspasa 8
Procaspasa 8 Garnett et al., 2006
-Supresión de apoptosis
GADD34/PP1 -Supresión de apoptosis Kazemi et al., 2004
hTERT -Activación de telomerasas Lu et al., 2004

6
-Interferencia en el sistema inmune del hospedero por

Tyk2 el bloqueo de la activación del interferón alfa de la Li et al., 1999
señalización Jak ⁄STAT
Proteínas con
-Cambio de la cinética de la actina Massimi et al., 2004
dominio PDZ
-Perdida de la polaridad celular
TSC2 (tubulina) Activación de la señalización mTOR Lu et al., 2004
BRCA1 -Inhibición de la señalización ER Zhang et al., 2005
-Activación transcripcional de hTERT, causando
myc
proliferación persistente a su vez promoviendo la Gross-Mesilaty, 1998
NFX123 SPI
inmortalización
-Pérdida de adhesión y polaridad celular, así como la Nakagawa y
Familia MAGUK estructura del citoesqueleto. Huibregtse, 2000
-Proliferación celular Thomas et al., 2001
-Previene la acetilación de p53, inhibiendo la
ADA3 Kumar et al., 2002
transcripción de los genes responsables de p53
-Inhibe la formación de complejos de señalización
Eun-Kyoung y Jong-
TNFR1 inductores de apoptosis y transcripción de señales pro- Sup, 2005
apoptóticas.
-Inestabilidad genómica Eun-Kyoung y Jong-
MGMT
-Progresión acelerada del carcinoma cervical Sup, 2005
2.2. Variantes de E6 del VPH-16
El genoma de referencia del VPH-16 fue secuenciado por primera vez en 1985 por
Seedorf y colaboradores, desde entonces se han encontrado variantes genéticas
que surgen de manera natural. Se considera como una variante a un genoma
definido por una combinación única de polimorfismos de un solo nucleótido (SNP),
el cual no debe superar una tasa de mutación del 2% con respecto al genoma de
referencia y un 5% en la LCR (Villiers et al., 2004; Bernard et al., 2010).
Un análisis de prevalencia de las variantes moleculares del VPH-16 realizado a

partir de una colección mundial de muestras cervicales, identificó cinco linajes
principales nombrados de acuerdo con la distribución geográfica original: europeo
(E), asiático americano (AA), asiático (As), africano-1 (Af-1) y africano-2 (Af-2)
(Ho et al., 1993). Un estudio posterior amplió y complemento esta clasificación
adicionando el linaje Norte Americana (NA) (Yamada et al., 1997).
Posteriormente, Cornet y colaboradores en 2012 reclasificaron a las variantes en 4

linajes y 9 sublinajes a partir del análisis de las variaciones intratípicas en el gen

7
que codifica para la proteína E6 y la región LCR del genoma de referencia del
VPH-16 (Tabla 3).
Tabla 3. Clasificación de las variantes de E6 de VPH-16 (Cornet et al., 2012).

Europea Asiática Africana 1 Africana 2 Asiático Americana y
(EAS) (AFR1) (AFR2) Norte Americana (AA/NA)
Sublinajes
Sublinajes Sublinajes Sublinajes
Norte Americana (NA)
Europea (E) AFR1a AFR2a
Asiático Americana 1 (AA1)
Asiática (As) AFR1b AFR2b
Asiático Americana 2 (AA2)
En un estudio realizado en el estado de Guerrero se identificaron 27 variantes de

E6, de las cuales las variantes más frecuentes fueron: E-G350 (34.07%), AA-a
(19.78%), AA-c (10.99%), E-C188/G350 (10.99%) y E-A176/G350 (8.79%) en
mujeres con carcinoma cervical (Ortiz-Ortiz et al., 2015).
2.3 Potencial oncogénico de las variantes de E6 de VPH-16
Diversos trabajos experimentales muestran que las variantes genéticas de la

oncoproteína E6 del VPH-16 se encuentran ligadas al potencial oncogénico del virus
(Zehbe et al., 2001), ya que variaciones en la secuencia de nucleótidos (Tabla 5)
que codifican el gen E6 puede modificar la afinidad de unión a proteínas celulares
blanco y de esta manera contribuir de manera distinta al riesgo a desarrollar CaCu
(Xi et al., 2006; Pillai et al., 2009).
Tabla 4. Variaciones en la secuencia de nucleótidos y a.a en las variantes de E6 del

VPH-16 (Modificada de Huertas-Salgado, 2011).
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 3 3 3 3 4 4 4 5 5
0 1 3 3 4 4 7 8 8 8 8 8 5 5 7 8 8 0 1 3 5 0 2 4 3 3 Cambios de a.a en
9 0 1 2 3 5 6 2 3 5 8 9 6 7 1 6 9 6 0 5 0 3 4 2 2 5 la proteína E6
VPH-16 R T C A G C G G A T T G A C A T T A A C C T A A A A A
E-Prototipo - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - Sin cambios
Asiático Americanas
AA-a - - - - - T - - - - - - - - - a G - - T G - - - g - Q14H/H78Y/L83V
AA-c - - - - - T - - G - - - - - - a G - - T G - - - g - Q14H/I27R/H78Y/L83V
Europeas
E-G350 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - G - - - - - L83V
E-C188/G350 - - - - - - - - - - C - - - - - - - - - G - - - - - E29Q/L83V
E-A176/ G350 - - - - - - A - - - - - - - - - - - - - G - - - - - D25N/L83V
Q: Glutamina; H: Histidina; Y: Tirosina; L: Leucina; V: Valina; I: Isoleucina; R: Arginina; E: Ácido Glutámico; D: Ácido Aspártico;
N: Asparagina, (-) Sin cambios de nucleótidos.

8
En 2001, Berumen y colaboradores a partir 181 muestras cervicales de pacientes

con CaCU y de 181 sujetos control (sin CaCu) de la Ciudad de México, secuenciaron
los genes E6 y L1 para identificar la presencia de variantes génicas del VPH-16.
Reportaron que el 50.8 % de los pacientes y el 11% los controles tuvieron infección
por VPH-16. Los pacientes presentaron una frecuencia de infección por las
variantes AA (23.2%) y las europeas (27.1%). Sin embargo, la frecuencia de
las variantes de AA fue 21 veces mayor en las pacientes con cáncer que en los
controles. Además, encontraron que el riesgo para desarrollar CaCu es 27 veces
más para las pacientes con infección por variantes AA y que el desarrollo de cáncer
inicia de manera temprana, 7.7 años antes que en las pacientes infectadas con las
variantes europeas. En otro estudio se reportó que las mujeres infectadas con las
variantes AA tienen 3.1 veces mayor riesgo de desarrollar una neoplasia
intraepitelial cervical (NIC) de alto grado que las mujeres infectadas con las
variantes europeas. (Fu Xi et al., 2007).
Por otra parte, a partir de un modelo de cultivo tridimensional de queratinocitos

provenientes de prepucio (NIKS), reportaron que las variantes AA de E6 de VPH-16
son capaces de desarrollar un alto grado de hiperplasia y de promover la migración
de queratinocitos basales con capacidad proliferativa desde el estrato basal al
estrato suprabasal, y en menor grado la variante E-Prototipo (Figura 3) (Jackson et
al., 2014).
Además, encontraron que el mensajero de E6 en las variantes AA tuvo una

expresión 22 veces superior a la del RNA mensajero de E6 de E-Prototipo. Así
mismo, la telomerasa humana (hTERT) se encontró sobrexpresada 6.3 veces
respecto a E-Prototipo y observaron una notable disminución de la expresión del
Interferón kappa (INF-k) y de la proteína p53 en las variantes AA. Estos resultados
indican que la variante AA presenta una mayor capacidad para inmortalizar células,
evadir la respuesta inmune e integrarse al genoma del huésped (Jackson et al.,
2014).

9
NIKS E-P AA
A
H&E
B
K5&K10
C
BrdU
Figura 3. Caracterización fenotípica del modelo epitelial tridimensional: morfología, patrón

de diferenciación y estado de proliferación. A) Tinción con hematoxilina y embebida en
formalina fijada en parafina, 200X. B) Microfotografía de superposición inmunofluorescente de
cultivos en balsas embebidos en parafina y fijados con formalina seccionados, 200X. La
fluorescencia verde indica a los queratinocitos basales marcados con queratina 5 (K5) y la
fluorescencia roja indica las células parabasales con queratina 10 (K10); la línea de puntos y
rayas de color blanco representan la membrana basal. Los núcleos fueron marcados con DAPI
(fluorescencia azul). C) Microfotografía de superposición inmunofluorescente de cultivos en
balsas embebidos en parafina y fijados con formalina seccionados tratados con bromo-2-
desoxiuridina (BrdU), 200X. La fluorescencia roja representa el marcador de proliferación BrdU,
incorporado en los núcleos de las células en proliferación; la línea de puntos blancos representa
la membrana basal (Tomado de Jackson et al., 2014).
En el grupo de trabajo se encontró que las variantes de E6 AA-a, AA-c, E-G350,

E-A176/G350 y E-C188/G350 de VPH-16 alteran diferencialmente la expresión de
genes pro-apoptóticos y anti-apoptóticos en células C33-A (Tabla 5), siendo las
variantes AA-c y E-A176/G350 las que alteran la mayor cantidad de genes.

10
Tabla 5. Efectos de las variantes de E6 de VPH-16 sobre la expresión de genes

pro-apoptóticos y anti-apoptóticos (Dorantes-Palma y Solís-Aguirre, 2015. Tesis de
Licenciatura).
Efectos
Variantes
Genes pro-apoptóticos Genes anti-apoptóticos
AA-a *Disminuye la expresión de CD70 *Aumenta la expresión de clAP2 y IGF1-R
*Disminuye la expresión de CD70 y
AA-c HIPK2 --------
*Aumenta la expresión del mRNA BAX
E-A176/G350 *Disminuye la expresión de CD70 y
*Aumenta la expresión de clAP2 y clAP1
SLC25A6
E-A188/G350 *Disminuye la expresión de CD70, BAX,
*Aumenta la expresión de clAP2 y IGF1-R
SLC25A6 y HIPK2
E-G350 *Disminuye la expresión de BAX *Aumenta la expresión de IGF1-R
(- - - -) No hay efectos
3. Cisplatino
La mayoría de los tratamientos contra el CaCU se basan en la inducción de la

muerte celular por apoptosis, mediante la administración de agentes
quimioterapéuticos como leptomicina B, actinomicina D, paclitaxel (Taxol®),
carboplatino y oxaliplatino, que inhiben procesos esenciales en el crecimiento y
proliferación celular como la síntesis del DNA, mRNA y proteínas (Ciccarelli et al.,
1985). Sin embargo, uno de los más utilizados es el cisplatino (cis-
diaminodicloroplatino II, CDDP), un compuesto inorgánico sintético constituido por
un átomo central de Platino (Pt) unido covalentemente a dos moléculas de amonio
(NH3) y dos átomos de cloro (Cl) en la posición cis (Tabla 6).
Tabla 6. Características fisicoquímicas del cisplatino (Petrovie y Todorovic, 2016).
Estructura plana Estructura tridimensional Características

Masa molecular 301.1 g/mol
Densidad 3.74 g/m3
Punto de fusión 270°C
Log Kow -2.19
Solubilidad en agua 2.53 g/L at 25°C
Color Amarillo
Estado de agregación Sólido

11
3.1 Mecanismo de acción del cisplatino
El cisplatino se administra vía intravenosa en solución salina estéril en dosis

aproximadas de 50 -100 mg/m2 en pacientes con cáncer (San Martin et al., 2003).
Una vez en el torrente sanguíneo se mantiene estable debido a la elevada
concentración del ion cloruro (100 mM) que evita su hidrólisis. Este proceso es
importante para su activación ya que un día después de su administración el 98%
de cisplatino total se encuentra unido a la albumina y transferrina, dos proteínas
plasmáticas implicadas en su transporte (Ferraro et al., 2012).
El ingreso del cisplatino hacia la célula se encuentra mediado por el transportador

de cobre humano 1 (hCTR1) y el transportador de cationes orgánicos 3 (OCT3)
expresado en la membrana celular (Lee et al., 2002; Wang y Lippard, 2005; Li et al.,
2012). Una vez en el citoplasma la concentración del ion cloruro (Cl-) disminuye a 3
mM, favoreciendo la activación del cisplatino a través de dos procesos consecutivos
de hidrólisis de los enlaces Pt-Cl donde uno de los ligando cloro se sustituye por
una molécula de agua (H2O) formando el producto cis-[Pt (NH3)2(OH2) Cl]+. La
sustitución adicional del cloro restante conduce a la formación de
cis-[Pt (NH3)2(OH2)2]2+ (Kai-Chi y Deubel, 2005).
El cisplatino hidrolizado es altamente electrófilo, tiene la capacidad para reaccionar

con el DNA nuclear (nDNA), mitocondrial (mtDNA), el RNA, el citoesqueleto celular
y con proteínas citoplasmáticas ricas en grupos tiol (-SH) como el glutatión (GSH) y
la metalotioneína (MT) (Petrović y Todorović, 2016; Galluzzi et al., 2012).
La interacción del cisplatino con el DNA se lleva a cabo en el centro reactivo del
nitrógeno 7 de las bases puricas: Adenina (A) y Guanina (G). Estas interacciones
dan como consecuencia la formación de aductos cruzados entre las cadenas
opuestas del DNA (interstrand crosslink) y dentro de la misma cadena de DNA
(intrastrand crosslink) siendo los aductos 1,2-intrastrand d (GpG) y 1,2-intrastrand d
(ApG) los más frecuentes en un 90% y 10% respectivamente (Dasari y Tchounwou,
2014).

12
La formación de estos aductos origina distorsiones en la estructura del DNA

bloqueando la división celular, la detención de la replicación y transcripción del
material genético con la finalidad de permitir a los mecanismos de reparación del
DNA ejercer su función previa a la activación de la apoptosis (Cohen y Lippard,
2001; Petrović y Todorović, 2016).
3.2 Apoptosis inducida por cisplatino
La apoptosis es un tipo de muerte celular dependiente de energía que conduce a la

contracción celular, condensación de la cromatina, gemación de la membrana,
externalización de fosfatidilserina y activación de una familia de cisteínas proteasas
llamadas caspasas (Salvesen y Dixit,1997; Susan Elmore, 2007).
El estrés oxidativo es uno de los mecanismos más importantes involucrados en la

activación de la apoptosis inducida por cisplatino a través de la formación de
especies reactivas del oxígeno (ROS), que resulta en la activación de la vía de
señalización p38-MAPK que al interactuar con p53 estimula la transcripción de los
genes pro-apoptóticos PUMA y NOXA implicados en la activación de la apoptosis
vía intrínseca (Dasari and Tchounwou, 2014), así mismo la fosforilación de c-Jun
en los residuos de serina 63 y 73 conduce a la formación de AP-1, un factor de
transcripción que promueve la expresión incrementada de genes pro-apoptóticos
tales como TNF-a, Fas-L y Bak (Fan y Chambers, 2001; Kumar y Tchounwou,
2015).
Desafortunadamente, la resistencia a los agentes de platino se desarrolla a través

de adaptaciones celulares, que reducen la absorción, el aumento de la efusión y
secuestro del fármaco, lo que contribuye a la metástasis y al fracaso global del
tratamiento (Lorusso et al., 2014).
3.3 Mecanismos moleculares de la resistencia de cisplatino en CaCU
La resistencia a cisplatino (RCP) es muy compleja y se ha atribuido a diversos

mecanismos moleculares subyacentes como la reducción de la acumulación

13
intracelular del fármaco, el aumento en la reparación del daño al DNA inducido por
cisplatino y la inactivación de la apoptosis. En la tabla 7, se describen los principales
mecanismos de resistencia al cisplatino en CaCU.
Tabla 7. Mecanismos moleculares de resistencia al cisplatino en CaCU
Efectos Mecanismos Evidencias Referencias

La disminución de la expresión del transportador de cobre 1
(CTR1) en células HeLa reduce la captación del cisplatino
Du et al., 2012.
mientras que en células que sobre expresan CTR1 muestran
Reducción en la un aumento de 2.2 veces en la acumulación de cisplatino.
captación de En células KB-CP20 de adenocarcinoma cervical resistentes a
Reducción de la acumulación
cisplatino cisplatino la expresión del transportador de cationes orgánicos

intracelular de cisplatino
3 (OCT3) se encuentra disminuida; la sobreexpresión de OCT3

aumenta la acumulación de cisplatino intracelular y la Li et al., 2012
citotoxicidad, por el contrario, la regulación de OCT3 por siRNA
o inhibidores químicos en células KB-3-1 aumenta la
resistencia a cisplatino
La sobreexpresión de proteínas transportadoras ABC como la
proteína de resistencia a múltiples fármacos MRP1 y
Aumento en la P-glicoproteína aumentan el flujo de salida del cisplatino. Zisowsky et al.,
exportación del La sobre expresión de los transportadores ATP7A y ATP7B se 2007.
cisplatino asoció con la resistencia adquirida al platino en la línea celular
HeLa debido a que están implicadas en la exportación del
cisplatino.
La sobreexpresión de especies nucleófilas con grupos tiol
Inhibición por
como el glutatión (GSH), metionina, metalotioneínas (MT) Galluzzi et al.,
proteínas con
reduce la disponibilidad de cisplatino reactivo, evitando su 2012.
grupos tiol
unión al DNA.
La actividad de caspasa-3, caspasa-8 y caspasa-9 disminuye
Disminución en
en células resistentes a cisplatino. Las células endocervicales Ding et al.,
la actividad de
las caspasas HEN-16-2 resistentes a cisplatino exhiben menor actividad de 2000.
Inactivación de la apoptosis
la caspasa-3
La expresión de la familia Bcl-2 de proteínas anti-apoptóticas,
se encuentra aumentada en células HeLa resistentes a Ding et al.,
Aumento en la cisplatino, así mismo células endocervicales resistentes a 2000.
expresión de múltiples fármacos HEN-16-2 muestran niveles Siddik et al.,
proteínas Bcl-2 significativamente más altos de Bcl-xL y Bag-1 las células 2003.
Anti-apoptóticas parentales sensibles a los fármacos. Además, la Brozovic et al.,
sobreexpresión estable de Bag-1 promueve la resistencia a la 2004.
apoptosis inducida por cisplatino en células C33-A.
La quimioterapia basada en cisplatino para el cáncer de cuello
Disminución de uterino es más beneficiosa para los pacientes que Sultana et al.,
la vía de albergan p53 de tipo salvaje que para los pacientes con p53 2003.
señalización de mutada. Además, los pacientes que responden bien al Garzetti et al.,
p53 cisplatino muestran una mayor proporción de células positivas 1995.
para p53 que los que no responden.

14
La hipermetilación del promotor aberrante y el consecuente

silenciamiento génico son características epigenéticas de la
resistencia a múltiples fármacos. En células de cáncer Bai et al., 2009
escamosas cervicales resistentes a cisplatino se observó que
Cambios epigenéticos
Metilación del el tratamiento con cisplatino combinado con Decitabine un

DNA agente desmetilante aumenta significativamente la sensibilidad
a cisplatino mientras que la eliminación del Decitabine restaura
la resistencia a cisplatino.
La acetilación de histonas tiene una función reguladora crítica
tanto en la transcripción como en la reparación del DNA. En
células de cáncer de pulmón humano resistentes a cisplatino
Modificación de se observó que la sobreexpresión de la acetil-transferasa Tip60 Miyamoto et
Histonas reguló negativamente la expresión de varios genes de al., 2008.
reparación del DNA mientras que la inhibición de la expresión
de Tip60 sensibilizo a las células al cisplatino.
Aumento de la La sobreexpresión del grupo 1 de complementación cruzada

Aumento en la reparación
reparación por de reparación por escisión (ERCC1) en células de cáncer de Park et al.,
escisión de cuello uterino HCA-1R promueve la resistencia a cisplatino, 2011.
del daño al DNA
nucleótidos mientras que la baja expresión de ERCC1 es un factor

(NER) pronóstico se asocia con un beneficio de supervivencia en Hasegawa et
pacientes. al., 2011.
Disminución de La disminución de la expresión de las proteínas de reparación Zhang et al.,
la reparación de MSH2 y PMS2 promueven el desarrollo de la resistencia a 2010.
desajuste del cisplatino en células de cáncer de cuello uterino, mientras que
DNA (MMR) la sobreexpresión de PMS2 en células HeLa aumentó
drásticamente la apoptosis inducida por cisplatino y la actividad
de caspasa-3.
Diversos estudios, proponen disminuir la expresión de E6 en las células cancerosas

para restaurar la función de p53 en células de CaCU y de esta manera inducir la
apoptosis evitando la proliferación celular. Se ha encontrado que en la línea celular
HeLa el cisplatino disminuye la expresión de E6, restaura la función de p53 e induce
la apoptosis de manera dependiente de la dosis y del tiempo de exposición mediante
la vía intrínseca a través de Bax (Liu et al., 2008).
En nuestro laboratorio se encontró que células HaCaT transfectadas con la

oncoproteína E6 de la variante E-G350 del VPH16 requieren una mayor
concentración (10 Mm) de cisplatino a un tiempo de 24 horas de exposición para
reducir su población celular a un 50% en comparación con células HaCaT
transfectadas con E6 de la E-Prototipo. Estos resultados sugieren que la presencia
de la oncoproteína E6 en estas células aumenta la capacidad proliferativa aun
cuando son expuestas a un agente anti-proliferativo como el cisplatino (Rodríguez
Godínez, 2015). Tesis de maestría.

15
II. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
¿La proliferación y supervivencia celular en respuesta al cisplatino dependerá de la

variante de E6 del VPH-16 que expresen las células C33-A?

16
III. JUSTIFICACIÓN
El CaCU en México ocupa el segundo lugar como causa de muerte por tumores
malignos dentro de la población femenina, siendo el VPH-16 el principal factor de
riesgo asociado con el desarrollo de dicha neoplasia. Existen distintas variantes de
E6 del VPH-16, las cuales difieren en su prevalencia y en su potencial oncogénico.
En el estado de Guerrero las variantes AA-a, AA-c, E-A176/G350, E-A188/G350 y
E-G350 son las más frecuentes. Se ha observado que la respuesta al tratamiento
con fármacos quimioterapéuticos como el cisplatino se ve afectada dependiendo de
la variante de VPH presente en el tumor. En estudios realizados en nuestro
laboratorio, se encontró que las células HACAT que expresan la oncoproteína E6
de la variante E-G350 del VPH-16 fueron más resistentes al tratamiento con
cisplatino que las células que expresan la oncoproteína E6 de E-Prototipo. A la
fecha no existen estudios que evalúen el efecto de las variantes de E6 del VPH-16
en células de CaCU tratadas con cisplatino, por lo que se plantea evaluar el efecto
de la expresión de las variantes AA-a, AA-c, E-G350, E-A176/G-350 y E-C188/G350
de E6 del VPH-16 sobre la proliferación y supervivencia celular en respuesta al
cisplatino. Los resultados de este estudio contribuirán al conocimiento de la biología
del CaCU y de los mecanismos usados por las variantes de E6 del VPH-16 para
inducir la resistencia a quimioterapéuticos.

17
IV. HIPÓTESIS
Las células C33-A transfectadas establemente con las variantes AA-a, AA-c,
E-G350, E-A176/G350 y E-C188/G350 de E6 del VPH-16 tratadas con cisplatino,
presentarán mayor proliferación y supervivencia que las células transfectadas con
la E-Prototipo. Sin embargo, se espera que las células transfectadas con las
variantes AA proliferen y sobrevivan más que aquellas transfectadas con las
variantes Europeas.

18
V. OBJETIVOS
Objetivo general:
 Evaluar el efecto de la expresión de las variantes AA-a, AA-c, E-G350,
E-A176/G350, E-C188/G350 y la E-Prototipo de E6 del VPH-16 en la
proliferación de células C33-A tratadas con cisplatino.
Objetivos específicos:
 Determinar los niveles de expresión de las variantes AA-a, AA-c, E-G350,
E-A176/G350, E-C188/G350 y la E-Prototipo de la oncoproteína E6 del VPH-16
en células C33-A.
 Determinar la concentración inhibitoria 50 (CI50) de cisplatino en células C33-A.
 Determinar la tasa de proliferación y supervivencia celular en células C33-A que
expresan las variantes AA-a, AA-c, E-G350, E-A176/G350, E-C188/G350 y la
E-Prototipo de la oncoproteína E6 del VPH-16 en condiciones basales.
 Correlacionar la proliferación y supervivencia celular en respuesta al cisplatino
con los niveles de expresión de las variantes AA-a, AA-c, E-G350, E-A176/G350,
E-C188/G350 y la E-Prototipo de la oncoproteína E6 del VPH-16.

19
VI. DISEÑO METODOLÓGICO
1.- Tipo de estudio

Experimental
2.- Criterios de selección de los sistemas de estudio:

Células C33-A: Células de carcinoma de células escamosas negativas a la
infección por VPH.
Variantes de E6 del VPH-16: AA-a, AA-c, E-G350, E-A176/G350 y E-C188/G350.
3.- Características del grupo control y experimental:

a) Grupo control
1) Células C33-A.
2) Células C33-A-MOCK (transfectadas con el plásmido pEGFP-N1).
3) Células C33-A transfectadas con E-Prototipo del VPH-16.
b) Grupo experimental
4) Células C33-A transfectadas con E6 de la variante AA-a.
5) Células C33-A transfectadas con E6 de la variante AA-c.
6) Células C33-A transfectadas con E6 de la variante E-G350.
7) Células C33-A transfectadas con E6 de la variante E-A176/G350.
8) Células C33-A transfectadas con E6 de la variante E-C188/G350.
4.- Número de comparaciones

Tres repeticiones independientes
5.- Variables
a) De respuesta: Alteración en la proliferación y supervivencia celular en respuesta
a cisplatino.
b) De exposición: Expresión de las variantes de la oncoproteína E6 del VPH-16 en
células C33-A.
c) Modificadoras de efecto: Número de pases de los cultivos celulares de las
células transfectadas.

20
6.- Consideraciones éticas y de seguridad

Todos los procedimientos se realizaron bajo la Norma Oficial Mexicana NOM-087-
ECOL-SSA1-2002, Protección ambiental - Salud ambiental - Residuos peligrosos
biológico-infecciosos (RPBI) - Clasificación y especificaciones de manejo y la NOM-
052-SEMARNAT-2005, que establece las características, el procedimiento de
identificación, clasificación y los listados de los residuos peligrosos. El trabajo de
laboratorio se realizó bajo la reglamentación de bioseguridad y procedimientos de
los laboratorios de Virología (LV) y Biología Celular del Cáncer (LBCC) de la
Facultad de Ciencias Químico Biológicas (FCQB).
7.- Análisis estadístico

Se determinaron diferencias estadísticamente significativas con la con la prueba de
ANOVA en el programa GraphPad Prism 6 mediante un análisis utilizando la prueba
de comparación múltiple de Dunnette considerando un valor de p<0.05 como
significativo.
6.1. Materiales y métodos

a) Cultivo celular
Células C33-A transfectadas
Se realizó cultivo de la línea celular C33-A de CaCu bajo las siguientes condiciones:
las células se crecieron a 37°C en 5% de CO2, en Medio de Eagle modificado por
Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de suero fetal bovino (SFB) (Gibco®, Life
Technologies, USA), 100 U/mL de Geneticina y 100 µg/mL Estreptomicina. Todas
las células fueron cultivadas bajo las mismas condiciones.
b) Extracción de RNA
La extracción de RNA total se realizó por el método de TRIzol (Invitrogen)
(ANEXO1). Se utilizaron células C33-A transfectadas establemente con la E6 de las
variantes AA-a, AA-c, E-G350, E-A176/G350 y E-C188/G350 del VPH-16, así como
células transfectadas con E-Prototipo, con el vector pEGFN1 y sin transfectar. Se
partió de cultivos celulares en cajas P-100 a una confluencia del 80%, posterior a la

21
extracción se realizó tratamiento con DNAsa utilizando 1µL de enzima por cada
500µg/µL de RNA.
c) Retrotranscripción (RT)
El cDNA fue sintetizado a partir del RNA total extraído mediante retrotranscripción
(ANEXO 2) utilizando 500 ng de RNA, además de la enzima transcriptasa inversa
SuperScript III (200 u/µL), DDT (4 µL) y oligo dT (Invitrogen) (0.5µg /µL).
d) PCR en tiempo real (qPCR)

La PCR-tiempo real para la cuantificación de E6 se realizó por el método de SYBR
Green (ANEXO 3 y 4). Todas las reacciones se llevaron a cabo en equipo ABI
PRISM modelo 7500 Real Time PCR System de Applied Biosystems, usado el PCR
Máster Mix Power SYBER® Green de Applied Biosystems y los iniciadores
específicos para los genes blanco (Tabla 8). Los valores de expresión relativa fueron
obtenidos mediante el método 2-∆∆ct, ajustados a la expresión del gen endógeno
Gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH). Los resultados fueron
comparados con la E-Prototipo y graficados como expresión relativa en el programa
GraphPad Prims 6.
El cálculo de la expresión relativa de E6 se realizó con los Cts obtenidos por qPCR
por el método 2--∆∆ct para la obtención del fold change (número de veces que cambia
un gen respecto al control). Se consideró como control células C33-A transfectadas
con la variante E-Prototipo contra las cuales fueron comparados los fold change de
las células del grupo experimental. Así mismo, los datos obtenidos en los ensayos
de proliferación celular se compararon entre las células transfectadas con las
variantes de E6 vs las células transfectadas con E6 de E-Prototipo.
Tabla 8. Oligonucleótidos utilizados para la PCR en tiempo real.
Primers (5´-3´) Tamaño del
Gen T.M (°C)
S(Sentido), Anti sentido (A) amplificado
S: GACCCCTTCATTGACCTCAAC
GAPDH 449 pb 58
A: GTGGCAGTGATGGCATGGAC
E6 S: ATGCACCAAAAGAGAACTGCAATGT 141 pb 61
A: ACGTCGCAGTAACTGTTGCTTGCA

22
e) Determinación de la cinética de proliferación en condiciones basales
Para la cinética de proliferación, se sembraron 20,000 células viables por pozo en

placas de cultivo de 96 pozos (CorningCostar®) contabilizadas mediante el método
de exclusión de azul de tripano (ANEXO 5). Se dejaron adherir 12 horas y
posteriormente se monitoreo la proliferación celular con el Kit CellTiter 96® Non-
Radioactive (PROMEGA) (ANEXO 6) a las 0, 12, 24 y 48 horas. Se consideró como
control el tiempo de 0 horas. La densidad óptica (DO) se midió en un
espectofotómetro de microplacas EpochTM (Biotek) a 570 nm con 15 segundos de
agitación. El porcentaje de proliferación se calculó mediante la fórmula: (DO de
grupo tx/DO de grupo ctrl x 100) con la cual se trazó una curva graficando el
porcentaje de proliferación contra el tiempo de incubación en el programa GraphPad
Prims 6
f) Determinación de la concentración inhibitoria media (CI50) de cisplatino
En placas de cultivo de 96 pozos (CorningCostar®), se sembraron 20,000 células

viables por pozo contabilizadas mediante el método de exclusión de azul de tripano
y se incubaron durante 18 horas a 37°C en una atmósfera húmeda con 5% CO2 y
al día siguiente se trataron con cisplatino (ZURIDRY®) a concentraciones finales de
10, 20 y 35 µM; consecutivamente las placas se incubaron durante 12, 24 y 48 horas
a 37°C en una atmósfera con 5% de CO2.
Posterior al tratamiento con cisplatino, se realizó el ensayo de proliferación celular
con el Kit CellTiter 96® Non-Radioactive (PROMEGA) donde la densidad óptica
(DO) se midió en un espectofotómetro de microplacas EpochTM (Biotek) a 570 nm
con 15 seg de agitación. El porcentaje de proliferación se calculó mediante la
fórmula: (DO de grupo tx/DO de grupo ctrl x 100) con la cual se trazó una curva
dosis-respuesta graficando él porcentaje de proliferación contra el tiempo de
exposición en el programa GraphPad Prims 6.

23
6.2. Diagrama de trabajo
Cultivo celular de transfectantes

estables de C33-A y controles
E6 de la variante
 C33-A
 AA-a
 MOCK
E6 de E-Prototipo  AA-c

del VPH-16  E-G350
Determinación  E-A176/G350
de la CI50  E-C188/G350
Tratamiento con Sin tratamiento

cisplatino CI50 con cisplatino
Determinación de la Cuantificación de
proliferación y la expresión del
supervivencia celular mensajero de E6
Determinación de la
proliferación celular en
condiciones basales
Análisis y discusión
Conclusiones

24
VII. RESULTADOS
Las células C33-A/E-A176/G350 y C33-A/AA-c expresan los mayores niveles

del RNA mensajero de E6 del VPH-16.
La expresión de los RNAs mensajeros de E6 del VPH-16 en células C33-A

transfectadas con E6 de las variantes AA-a, AA-c, E-G350, E-A176/G350,
E-C188/G350 y la E-Prototipo fue analizada mediante RT-qPCR utilizando el
sistema SYBR-Green. La expresión relativa de E6 fue obtenida mediante el método
2-∆∆ct, normalizado con la expresión del gen constitutivo GAPDH. Como se observa
en la Figura 4, la expresión de los mensajeros de E6 fue similar en los grupos
analizados a excepción de las células C33A/AA-c y C33-A/E-A176/G350 las cuales
mostraron los mayores niveles de expresión con 4.37 y 6.23 veces más respecto a
C33-A/E-Prototipo (p=0.0013).
8 *
E x p r e s ió n r e la t iv a m R N A ( E 6 /G A P D H )
0
0
0
0
-A
-a
-c
K
5
5
p
C
3
3
A
A
3
ti
O
/G
/G
-G
3
/A
/A
to
C
/M
8
/E
-A
-A
ro
8
-A
-A
1
3
3
-P
-A
-C
3
3
3
3
C
C
/E
3
/E
/E
C
C
-A
-A
-A
3
3
3
3
C
Figura 4. Expresión relativa de E6 en células C33-A transfectadas. La gráfica muestra la

comparación relativa del nivel de expresión del mRNA de E6 del VPH-16 de las células
C33A-A/E-P vs las células transfectadas con las variantes Asiático Americanas y Europeas de
E6 del VPH-16. Se graficaron las medias ± desviaciones estándar de tres experimentos
independientes. Anova de una vía, prueba de comparación múltiple de Dunnette. *p<0.05.

25
Las células C33-A/E-A176/G350 tienen la mayor proliferación celular en

condiciones basales.
La cinética de proliferación celular de las variantes de E6 del VPH-16 en células

C33-A en condiciones basales fue determinada a tiempos de incubación de 0,12,
24 y 48 horas post-adhesión. Como se observa en la Figura 5, las células
C33-A/A176/G350 presentaron más proliferación celular que las demás células
transfectadas.
800
750
700
% d e p ro life ra c ió n c e lu la r
650
600
550
350
300
250
200
150
100
rs rs rs rs
h h h h
0 2 4 8
1 2 4
T ie m p o d e in c u b a c ió n
C 3 3 -A C 3 3 - A /E - P r o to tip o C 3 3 - A /A A - c C 3 3 - A /E - C 1 8 8 /G 3 5 0
C 3 3 - A /M o c k C 3 3 - A /A A - a C 3 3 - A /E - G 3 5 0 C 3 3 - A /E - A 1 7 6 /G 3 5 0
Figura 5. Cinética de proliferación de células C33-A transfectadas con variantes de E6 del

VPH-16 en condiciones de crecimiento basal. La gráfica muestra la proliferación de células
C33-A transfectadas con las variantes de E6 en condiciones basales de crecimiento a diferentes
tiempos de incubación (0,12, 24 y 48 horas) determinado por el Kit CellTiter 96® Non-Radioactive
Cell Proliferation Assay. Se graficaron las medias ± desviaciones estándar de tres experimentos
independientes.

26
La CI50 de cisplatino es similar en células C33-A y C33-A/MOCK
La concentración inhibitoria media fue determinada en células C33-A y

C33-A/MOCK tratadas a concentraciones de 0 µM, 10 µM, 20 µM y 35 µM de
cisplatino expuestas a tiempos de 0, 12, 24 y 48 horas. En la figura 6 se muestra
que la concentración de 10 µM de cisplatino induce la muerte del 53.2% de las
células a 24 horas de exposición. Así mismo, se observó que en las células C33-A
una concentración de 10 µM de cisplatino a 24 horas de exposición indujo la muerte
del 46.8% de las células C33-A/MOCK (Figura 6); por el contrario, al realizar la
regresión lineal de los datos obtenidos se obtuvo que teóricamente una
concentración de 11.48 µM de cisplatino induce la muerte del 50% de las células
(Figura 10/ANEXO 7) por lo que se decidió usar esta concentración para los
experimentos posteriores.
125
100
75
0 µM
10 µM
50
20 µM
35 µM
25
0
rs
rs
rs
rs
h
Figura 6. Citotoxicidad de cisplatino en células C33-A y C33-A/MOCK. La gráfica muestra el

0
8
1
porcentaje de proliferación de células C33-A (líneas continuas de colores) y C33-A/MOCK (líneas

punteadas de colores) expuestasT ieamdiferentes
p o d e econcentraciones
x p o s ic ió n adec cisplatino
is p la tin(10,
o 20 y 35 µM) a
diferentes tiempos de exposición (12, 24 y 48 horas) determinado con el Kit CellTiter 96® Non-
Radioactive Cell Proliferation Assay. Se graficaron las medias ± desviaciones estándar de tres
experimentos independientes. Las líneas punteadas (- - -) indican la CI50.

27
Las células C33-A/E-G350 proliferan más en respuesta al cisplatino (CI50)
Se analizó la proliferación celular después de 24 h postratamiento con la CI50 de

cisplatino. Como se observa en la Figura 7 la proliferación celular varía entre las
células C33-A transfectadas con las variantes de E6 del VPH-16. Se encontró que
Las células C33-A/G350 tuvieron el mayor porcentaje de proliferación (80.5%) con
1.58 veces más que las C33-A/E-Prototipo. Por el contrario, las células C33-A/E-
A176/G350 tuvieron el menor porcentaje de proliferación celular (57.5%), mientras
que las células C33-A/AA-a, C33-A/AA-c, C33-A/E-C188/G350 proliferan 1.45
(78.25%), 1.49 (80.5%), y 1.38 (74.75%) veces más que las C33-A/E-Prototipo
respectivamente (p=0.0003).
125
*
**
% d e p r o l if e r a c i ó n c e l u l a r
100
75
50
C I5 0
25
0
-a
-c
0
o
k
0
-A
5
c
5
p
3
3
o
ti
3
/A
/A
/G
/G
-G
3
/M
to
C
-A
-A
8
ro
/E
-A
8
3
1
-A
-P
3
-A
-C
3
3
/E
C
/E
3
/E
-A
-A
-A
3
3
3
3
3
3
C
Figura 7. Citotoxicidad de la CI50 de cisplatino en células C33-A transfectadas. La gráfica

muestra la comparación de la proliferación celular entre las células C33-A/E-Prototipo vs las
variantes Asiático Americanas y Europeas de E6 del VPH-16 posterior al tratamiento con
cisplatino a una concentración de 10 µM por 24 horas (CI50). Se graficaron las medias y
Las células C33-A/E-G350 y C33-A/AA-a son más resistentes a la citotoxicidad
desviaciones estándar de tres experimentos independientes. ANOVA de una vía, prueba de
por cisplatino
comparación múltiple de Dunnette. *p<0.05, **p<0.01.

28
Las células C33-A/E-G350 y C33-A/AA-c son más resistentes a la citotoxicidad

por cisplatino
Debido a las diferencias observadas en la proliferación celular, se analizó el
comportamiento de las células en estudio con respecto al tratamiento con cisplatino
a diferentes concentraciones y tiempos de exposición. Como se observa en la
Figura 8, las células C33-A/G350 requirieron una mayor concentración de cisplatino
para matar el 50% de la población celular (30 µM=CI70/C33-A), seguidas por las
C33-A/AA-c que requieren una concentración >20 µM (CI61/C33-A), mientras que
para las células C33-A/AA-a y C33-A/E-Prototipo una concentración de 20 µM y
12 µM (CI51/C33-A) respectivamente son suficientes para inducir el mismo efecto a
las 24 horas de exposición. Por el contrario, las células C33-A/E-C176/G350,
C33-A/E-A188/350 y C33-A/E-Prototipo presentaron mayor sensibilidad al
tratamiento con cisplatino.
Se observó que las células C33-A/AA-c son más sensibles a altas concentraciones
de cisplatino (30 µM) ya que antes de las 24 horas de tratamiento murió más del
80% de las células. Por otro lado, a las 48 horas de exposición se observó que sin
importar la concentración empleada de cisplatino la proliferación celular disminuye
más del 90% en todas células.

29
125 C 3 3 -A /A A -a 125 C 3 3 -A /A A -c
100 100
75 75
50 50
25 25
0 0
rs rs rs rs rs rs rs rs
h h h h h h h h
0 2 4 8 0 2 4 8
1 2 4 1 2 4
T ie m p o d e e x p o s ic ió n a c is p la tin o T ie m p o d e e x p o s ic ió n a c is p la tin o
125 125
C 3 3 -A /E -P r o to tip o C 3 3 - A /E - G 3 5 0
100 100
75 75
50 50
25 25
0 0
rs rs rs rs
rs
rs
rs
rs
h h h h
h
h
0 2 4 8
0
8
1 2 4
1
4
125 125
C 3 3 - A /E -A 1 7 6 /G 3 5 0 C 3 3 -A /E - C 1 8 8 /G 3 5 0
100 100
75 75
50 50
25 25
0 0
rs
rs
rs
rs
rs
rs
rs
rs
h
h
0
8
1
Figura 8. Cinética de proliferación en células C33-A transfectadas con variantes de E6 del

VPH-16 tratadas con cisplatino. Se muestra la cinética de proliferación de células C33-A
transfectadas con variantes de E6 del VPH-16 expuestas a concentraciones de 10 µM (línea
verde), 20 µM (línea roja) y 35 µM (línea azul), a diferentes tiempos de exposición. Se graficaron
las medias y desviaciones estándar de tres experimentos independientes. La línea punteada
(- -) indica la CI50.

30
VIII. DISCUSIÓN
La quimioterapia ha sido tradicionalmente considerada como el tratamiento

estándar para pacientes con CaCU avanzado o recurrente dando resultados muy
limitados debido a que las pacientes ya han sido tratadas previamente con
radioterapia, cirugía o en combinación. Por lo que es muy importante determinar las
concentraciones que puedan ejercer el efecto deseado (Hinojosa-García y Dueñas-
Gonzales, 2000). Existen reportes de estudios que han analizado los mecanismos
moleculares subyacentes a la resistencia al cisplatino en el CaCU (Haiyan et al.,
2016), sin embargo, a la fecha no existen reportes donde se analice de forma
detallada la resistencia al cisplatino generada por el efecto de variantes de la
oncoproteína E6 del VPH-16 en ese tipo de cáncer. Por lo tanto, en este trabajo
analizamos la proliferación y supervivencia celular en respuesta al tratamiento con
cisplatino en células C33-A que expresan la oncoproteína E6 de variantes del VPH-
16. Nuestros resultados sugieren que en células C33-A, la oncoproteína E6 de las
variantes del VPH-16 modula diferencialmente la proliferación celular en respuesta
a cisplatino. En este trabajo, encontramos que las células que más resisten al
tratamiento de cisplatino son las C33-A/E-G350 y las C33-A/AA-c. Aunque existen
varias razones por las cuales pudieran proliferar, nosotros consideramos que una
posible explicación a este comportamiento es la expresión diferencial de genes
inducidos por la presencia de estas variantes de E6 en las células C33-A.
Recientemente se ha reportado que la oncoproteina E6 de las variantes que
nosotros estudiamos es capaz de regular 387 genes de los cuales el 12.5% se
encuentran relacionados con la proliferación celular (IGF1-R, THSB1, KLF5, CD70
y TGFBR2) y que la variante AA-c desregula la mitad de estos genes en células
C33-A (Zacapala-Gómez et al, 2015).
La oncoproteína E6 de la variante AA-c en células C33-A, induce la sobrexpresión

del factor de Kruppel 5 (KLF5) respecto a la E-Prototipo. KLF5 es un factor de
transcripción altamente expresado en células con capacidad proliferativa, que
regula la transcripción de genes involucrados en la angiogénesis, control del ciclo

31
celular, apoptosis, migración, supervivencia y proliferación celular (Conkright et al.,

1999; Jin-Tang y Ceshi Chen, 2009). Se ha reportado que la sobreexpresión de
KLF5 en células HeLa promueve la resistencia a la muerte celular inducida por
TNF-α a través de la disminución en la actividad de la caspasa-3, por el contrario,
el Knock-Down de KLF5 promueve el aumento de la muerte celular y la disminución
de la proliferación celular (Suzuki et al., 2007).
Así mismo, en un estudio previo de en el grupo de trabajo, se encontró que las

variantes de E6 modulan diferencialmente la expresión de los genes pro-apoptóticos
(BAX, CD70 y HIPK2) y anti-apoptóticos (cIAP1 e IRF1) en la misma línea celular.
Teóricamente la disminución del mensajero de HIPK2 y el incremento en la
expresión de BAX en las células C33-A/AA-c sugiere que estas células presentarán
mayor sensibilidad a la apoptosis que las C33-A/E-Prototipo, sin embargo, nuestros
resultados contradicen este hecho debido a que las células C33-A/AA-c presentaron
una proliferación celular 1.45 veces mayor que C33-A/E-Prototipo, sugiriendo de
esta manera que C33-A/AA-c podría estar induciendo resistencia a la apoptosis
mediante una vía alterna no relacionada con BAX (Dorantes-Palma y Solís-Aguirre,
2015 Tesis de licenciatura).
Los resultados obtenidos en este estudio demuestran que las células C33-A/G350
presentan un mayor porcentaje de proliferación celular (85.5%) con respecto a las
células C33-A/E-Prototipo (54%). Un estudio realizado en el grupo de trabajo
demostró que las células que expresan E6/EG350 presentan una disminución en
los niveles de expresión del mensajero de BAX, así como un aumento significativo
(p<0.029) en la expresión del gel anti-apoptótico IGF1-R (Dorantes-Palma y Solís-
Aguirre, 2015 Tesis de licenciatura). La sobreexpresión de IGF1-R favorece la
supervivencia celular a través de la inhibición de la apoptosis mediante la vía
PI3K-AKT a través de la activación de la Ser/Thr cinasa mTOR y la consecuente
fosforilación e inactivación de los miembros de la familia Bcl-2 pro-apoptóticos como
BAD, BAX, Caspasa 9, GSK-3 y FoxO3a, además activa las vías de señalización

32
Ras-MARK promoviendo la proliferación celular (Brumatti y Salmanidis, 2010;

Zhang et al., 2011).
Por otra parte, la disminución de la expresión del gen pro-apoptótico CD70, podría
estar implicada en la resistencia a la muerte celular inducida por cisplatino en células
C33-A/AA-a, así como el aumento en la expresión del inhibidor celular de proteínas
de apoptosis 2 (cIAP2) y del receptor del factor de crecimiento similar a la insulina
(IRF1-R). Este último altamente sobreexpresado en la mayoría de los tejidos
malignos, donde funciona como un agente anti-apoptótico promoviendo la
supervivencia y mayor resistencia a la muerte celular (Schwarz y Li, 2009).
Cuando analizamos la expresión del mensajero de E6 encontramos que las células

C33-A/E-A176/G350 expresaron mayores niveles respecto a las demás células en
estudio. Además, encontramos que las células que expresan mayores niveles de
E6 proliferan más con respecto a las células que expresan niveles bajos de la
oncoproteína viral (Figura 10/ANEXO 7); sin embargo, cuando se analizó la
proliferación celular en respuesta al tratamiento con cisplatino se encontró que las
células C33-A/E-A176/G350 fueron más sensibles al tratamiento que las células que
expresaron bajos niveles de E6. Estos resultados son difíciles de explicar, sin
embargo, se ha reportado que los niveles de RNA mensajero de E6 en células
infectadas con VPH-16 son diferentes, debido a que el intrón I de E6 del VPH-16 se
procesa por splicing alternativo donde además de la forma funcional (E6) se
generan isoformas truncadas (E6*I y E6*II) (Del Moral-Hernández et al., 2010). Se
ha reportado que la expresión de isoforma E6*I es antagonista a los efectos
oncogénicos de E6, de la cual se ha reportado que promueve la disminución de
formación de tumores en ratones desnudos (Filippova et al., 2014); por el contrario,
la expresión de la isoforma E6*II ha sido relacionada con la progresión de la
gravedad del CaCU debido a que su expresión se encuentra aumentada en lesiones
de alto grado en comparación con la expresión de E6*I (Pastuszak-Lewandoska et
al., 2014). Resultados de nuestro grupo de trabajo sugieren que el patrón de splicing
es heterogéneo en las células C33-A transfectadas con las variantes de E6 del VPH-

33
16 debido a que las proporciones entre el pre-mRNA E6 y las isoformas E6*I/E6*II

varían dependiendo de la variante de E6 en cuestión.
Se ha demostrado que la expresión de la isoforma E6*I en células SiHa y CaSKi

aumenta el estrés oxidativo y favorece la disminución de dos enzimas antioxidantes
importantes, la superóxido dismutasa (SOD) y la glutatión peroxidasa (Gpx)
(Vonetta et al., 2014). También se sabe que E6*I promueve la disminución del
antioxidante glutatión (GSH), aumenta la despolarización de la membrana
mitocondrial alterando la vía de fosforilación oxidativa y aumenta el estrés oxidativo
favoreciendo de esta manera la inducción de la apoptosis (Evans et al., 2016). Por
lo tanto, se podría especular que las células que expresen en mayor proporción la
isoforma E6*I con respecto a E6 serán más sensibles al tratamiento con cisplatino.
Sin embargo, el proceso de muerte celular es muy complejo y se necesitan más
estudios para corroborar esta hipótesis.
La línea celular C33-A presenta una mutación puntual en el gen p53 en el dominio
de unión al DNA (DBD) en el codón 273 (CGT→TGT) que se traduce en la
sustitución del aminoácido Arginina (Arg) por cisteína (Cys) resultando en la
producción de una proteína aberrante (Crook et al., 1991). En este modelo de
estudio las mutaciones alteran la función de p53 por lo que, en presencia de estrés
oxidativo inducido por el cisplatino, p53 no sería capaz de activar la transcripción de
sus genes blanco y por lo tanto la activación de la vía intrínseca de la apoptosis no
podría progresar (Cho et al.,1994; Rangel-López et al., 2006). De acuerdo con
nuestros resultados podríamos sugerir que el cisplatino en C33-A genera muerte
celular por una vía independiente de p53.
En conjunto, nuestros resultados sugieren que las variantes de E6 del VPH-16

regulan diferencialmente los procesos celulares implicados en la proliferación
celular; sin embargo, es necesario medir la expresión a nivel de proteína de todos
los genes analizados en otros trabajos ya que existe regulación postranscripcional
en la mayoría de ellos. Por otro lado, es necesario medir la muerte celular en células
C33-A inducida por cisplatino y determinar los mecanismos moleculares de

34
resistencia como la reducción de la acumulación intracelular de cisplatino, el

aumento en la reparación del daño al DNA y la inactivación de la apoptosis, para
conocer el nivel de participación de los genes involucrados. Este trabajo contribuye
al conocimiento de uno de los mecanismos usados por las variantes de E6 del
VPH-16 para inducir resistencia a los agentes quimioterapéuticos usados en el
tratamiento del cáncer cérvico uterino, lo que podría contribuir a la toma de
decisiones para una terapia personalizada en el tratamiento del CaCU.

35
IX. CONCLUSIONES
 Las variantes AA-a, AA-c, E-G350, E-A176/G350 y E-C188/G350 de E6 del

VPH-16 afectan diferencialmente los procesos de proliferación y supervivencia
celular en comparación con la E-Prototipo en las células C33-A en respuesta al
tratamiento con cisplatino, lo cual podría conferirles distinto potencial
oncogénico.
 Las células C33A/AA-c y C33-A/E-G350 requieren una mayor concentración de
cisplatino que las células C33-A/AA-a y C33-A/E-Prototipo para inducir la muerte
de la población celular en cultivo, lo que sugiere que estas células son más
resistentes a la muerte celular inducida por cisplatino y por lo tanto podrían
presentar mayor potencial oncogénico.
 El cisplatino inhibe el crecimiento de las células C33-A de manera dependiente
de la concentración y tiempo de exposición dentro de las primeras 24 horas de
tratamiento a bajas concentraciones de cisplatino (10 µM y 20 µM), pero no a
altas concentraciones.
 El nivel expresado de los mensajeros de la oncoproteína E6 del VPH-16 en las
células C33-A/E-A176/G350, no corresponde con el efecto observado en la
proliferación y supervivencia celular en respuesta al tratamiento con cisplatino,
lo que sugiere que procesos post-transcripcionales del mensajero de E6, podrían
estar regulando la expresión y función de la oncoproteína E6.

36
X. PERSPECTIVAS
 Determinar los niveles de expresión a nivel de proteína de los genes KLF5,

HIPK2, BAX e IGF1-R en células C33-A transfectadas con las variantes AA-a,
AA-c, E-G350, E-C188/G350, E-A176/G350 y E-Prototipo de la oncoproteína E6
del VPH-16.
 Determinar el mecanismo de muerte celular inducido por las variantes para
conocer el nivel de participación de los genes involucrados.
 Evaluar el estrés oxidativo en células C33-A transfectadas con las variantes de
E6 del VPH-16.
 Evaluar el ciclo celular en células C33-A transfectadas con las variantes de E6
del VPH-16 antes y después del tratamiento con cisplatino.
 Analizar la proliferación y supervivencia celular en respuesta al tratamiento
combinado del cisplatino con otros quimioterapéuticos y con antioxidantes.

37
XI. ANEXOS
ANEXO 1
Extracción de RNA mediante el método Fenol-Cloroformo (Trizol)
1. A partir de cultivos en cajas P100, se realizará 3 lavados con 2 mL de PBS
2. Agregar 350 µL de TRIZOL e incubar en hielo 5 min.
3. Raspar las células y pasar a un tubo eppendorf estéril de 1.5 mL
4. Agregar 200 µL de cloroformo frio (10µL X c/200 de Trizol), homogenizar, dar
vórtex e incubar en hielo 3 min.
5. Centrifugar a 12 000 rpm a 4°C durante 10 min.
6. Separar la fase acuosa en un nuevo tubo eppendorf estéril previamente
rotulado con el nombre de la muestra, evitando tomar residuos de Trizol.
7. Adicionar a la fase acuosa 500 µL de Isopropanol frio, homogenizar y se
dejará toda la noche a -80°C.
8. Centrifugar a 12 000 rpm durante 12 min. a 4°C, decantar el sobrenadante y
conservar el botón celular.
9. Agregar 200 µL de etanol frio al 70%, homogenizar, dar vórtex hasta
deshacer el botón.
10. Centrifugar a 12 000 rpm durante 12 min. a 4°C, decantar el sobrenadante
por inversión.
11. Secar el botón colocando el tubo boca abajo con la tapa abierta por 30 min.
12. Resuspender el botón en 25 µL de agua destilada con DPC
13. Cuantificar.

38
ANEXO 2.
Retrotranscripción
1. Rotular 2 tubos eppendorf de como “A” y “B”. El tubo A para el RNA y el B para
el mix de reacción. Será para 40 µL.
2. En el tubo “A” agregar 500 µL de RNA y 1 µL del oligo dT e incubar a 65°C por
10 minutos.
3. Se preparará el mix de reacción en el tubo “B”.
Reactivos 1 Reacción
Buffer 8 µL
DNTPs 4 µL
Agua estéril 21 µL
DTT 4 µL
Super Script 1 µL
4. Finalizado el tiempo de incubación del tubo “A” se adicionará el mix del tubo “B”.
5. Incubar en baño metabólico a 22°C por 10 min.
6. Incubar a 37°C por una hora en el termociclador.
7. Incubar a 95°C durante 5 min en el termociclador.
8. Colocar en hielo durante 5 min y centrifugar a 14000 rpm durante 5 seg.
9. Adicionar 80 µL de agua DEPC y almacenar a -80°C hasta su uso.
(Invitrogen, 2004).
ANEXO 3.
Condiciones para la qPCR.

Fase Temperatura (°C) Tiempo (min) Ciclos
Desnaturalización 95 10
inicial
Desnaturalización 95 1 40
Alineación/ 58 1
Extensión

39
ANEXO 4.
Reacción para la qPCR.
Reactivos 1 Reacción (10 µL)

Oligo F 0.15 µL
Oligo R 0.15 µL
Agua estéril 3.74 µL
SYBR Green 5 µL
cDNA 1 µL
ANEXO 5
Método de exclusión de azul de tripano
1. Homogeneizar la suspensión celular (en medio de cultivo o PSB).
2. En un tubo eppendorf colocar 10 µL de la suspensión celular y agregar 90 µL de
azul tripano al 0.4%.
3. Mezclar la suspensión celular con azul tripano por pipeteo de 5 a 8 veces.
4. Colocar 10 µL de la mezcla en cada cámara del hemocitómetro.
5. Colocar el hemocitómetro en el microscopio y localizar la retícula grabada.
6. Dejar sedimentar las células de 1-2 minutos y proceder al conteo.
7. Contar por separado a las células azules (muertas) y a las células birefringentes
o blancas (vivas) que sean observadas encada uno de los cuadros por considerar.
8. La cuenta celular para cada cuadrante externo (cuadros 4x4, figura A; uno de los
cuales es ampliado en la figura B) deberá oscilar entre 20-50 células, teniendo un
total de células para los cuatro cuadrantes 4x4 de 80-200 células. Las células
localizadas en los márgenes externos de cada esquina (marcados en rojo) NO
deberán ser incluidas en las cuentas.

40
9. Cuando existe una densidad celular mayor a 50 células por cuadrante 4x4, se
procederá al conteo del cuadrante central. Pueden contarse las células de todos los
cuadros secundarios, o si se prefiere, los 4 cuados secundarios de las esquinas y
el central.
10. Calcular los resultados mediante las fórmulas:
Para cuadros 4x4
Cuenta total de células vivas ÷ número de cuadros 4x4 evaluados × factor de
dilución × 10,000.
Para todos los cuadros del central
Cuenta total de células vivas ÷ 100 (100% cuadros) × factor de dilución × 10,000.
Para 5 cuadros del central
Cuenta total de células vivas ÷ 20 (20% cuadros) × factor de dilución × 10,000.
ANEXO 6
Protocolo para ensayo de citotoxicidad con cisplatino
A) Preparación de las placas de ensayo y cultivo de células

1. Cultivar células C33-A (S/T y transfectadas) en medio MEM (Advance Gibco)
suplementado con 5% (v/v) de suero fetal bovino, 1% de Estrepto-penicilina
y en su caso 1% de G418
2. Cultivar las células en la fase logarítmica utilizando tripsina-EDTA.
Determinar el número de células viables mediante azul de tripano, y preparar
una suspensión de células a una concentración de 222,000 (2.22x10 5)
células / mL de medio.
3. Dispensar 90 µL de la suspensión celular (que contiene 20, 000 células) en
cada pozo de una placa de cultivo de 96 pozos.
4. Incubar durante la noche (18-24 hrs) a 37°C en atmosfera húmeda, 5% CO2
5. Preparar las diluciones de cisplatino en el medio anterior a concentraciones
de (10, 20 y 35 µM), en ausencia de luz.

41
6. Retirar el medio de cultivo de cada uno de los pozos y agregar 100 µL de las
suspensiones de cisplatino previamente preparadas a cada pozo. El control
negativo no debe contener cisplatino.
7. Incubar durante (12, 24 y 48 horas) a 37°C en una atmosfera húmeda, 5%
de CO2
8. Retirar el tratamiento con cisplatino y realizar un lavado con 100 µL de PBS
1X a cada pozo cuidadosamente para evitar remoción de células adheridas.
9. Agregar 100 µL de medio MEM suplementado con 5% (v/v) de suero fetal
bovino y 15 µL de Dye solution a cada pozo.
Dye solution es un irritante. Evite el contacto con piel y ojos.
10. Incubar la placa durante 4 horas a 37°C en una atmosfera húmeda, 5% CO 2

11. Añadir 100 µL de Solubilization Solution / Stop Mix a cada pozo
PRECAUCIÓN: La solución Solubilization Solution / Stop Mix contiene un
disolvente orgánico se recomienda que se utilice una campana de extracción
durante su uso. Una vez terminado el ensayo el ensayo el contenido de la placa
se eliminará en residuos orgánicos.
12. Incubar durante 1 hora 37°C en una atmosfera húmeda, 5% CO2

13. Disolver los cristales de formazán con la ayuda de una pipeta automática
evitando la formación de burbujas debido a que pueden interferir con el
registro de valores de absorbancia.
14. Leer las absorbancias en un lector de placas de 96 pozos a 570 nm. Si el
lector de placas cuenta con un dispositivo de agitación se recomienda usarlo
antes de la lectura para asegurar una solución uniformemente coloreada.
Cálculos:
El porcentaje de proliferación celular se calcula mediante la siguiente formula.
𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑑𝑒𝑙 𝑔𝑟𝑢𝑝𝑜 𝑡𝑟𝑎𝑡𝑎𝑑𝑜

% Proliferación = x 100
𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑑𝑒𝑙 𝑔𝑟𝑢𝑝𝑜 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙

42
ANEXO 7
N iv e le s d e e x p r e s ió n d e l R N A m d e E 6
8
r = 0 .8 3 7 4 ; p < 0 .0 5
6
0
0 200 400 600 800
% P r o lif e r a c ió n c e lu la r
Figura 9. Correlación entre los niveles del mensajero del oncogén E6 con la proliferación
celular en condiciones basales. Puntos ( ) variantes de E6 del VPH-16; la pendiente,
correlación lineal estimada basada en la r de Spearman.
ANEXO 8
125
9 8 .5 6 - y
X=
% P r o lif e r a c ió n c e lu la r
100 4 5 .7 5
75
50
C I 5 0 = 1 1 .4 8 µ M
25
0
0 .0 0 .5 1 .0 1 .5 2 .0
L o g ( µ M ) c is p la t in o
Figura 10. Cinética dosis-respuesta del tratamiento con cisplatino en células C33-A. Se
muestra la cinética de proliferación de células C33-A expuestas a concentraciones de 0 µM,
10 µM, 20 µM y 35 µM. determinado por ensayo de proliferación celular. Se graficaron las
medias. La línea punteada indica la CI50.

43
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UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE GUERRERO

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICO BIOLÓGICAS

Modulación de la proliferación y supervivencia

CHILPANCINGO, DE LOS BRAVO GRO., FEBRERO DE 2018

EL FINANCIAMIENTO PARA ESTA INVESTIGACIÓN SE OBTUVO DEL

A NUESTRO COMITÉ TUTORIAL:

LABORATORIO DE BIOLOGÍA CÉLULAR DEL CANCER

LABORATORIO DE BROMATOLOGIA DE ALIMENTOS

LABORATORIO DE CITOPATOLOGÍA E INMUNOHISTOQUÍMICA

A la M.C. Maggy por capacitarnos en la realización de los ensayos con MTT.

-Huri Haziel Luviano Jaimes

-Diego Armando Lechuga Mercado

Primeramente, a mi madre Griselda por su esfuerzo constante en mi formación, por apoyarme en

A mis camaradas de laboratorio

I. MARCO TEÓRICO ......................................................................................................... 3

Palabras clave: VPH-16, Oncoproteína E6, Cisplatino y Proliferación celular.

Luviano-Jaimes H.H & Lechuga-Mercado D.A

INTRODUCTION: High-risk Human Papillomavirus type 16 (HPV-16) is the main risk

Key words: HPV-16, Oncoprotein E6, Cisplatin and Cell Proliferation.

Luviano-Jaimes H.H & Lechuga-Mercado D.A

1. Virus del papiloma humano

El Virus del Papiloma Humano (VPH) pertenece al género Papillomavirus y a la

Riesgo oncogénico Genotipos de VPH

Riesgo alto 16,18,31,33,35,45,51,52,56,58 y 59

Riesgo probable alto 26,53,66,68,73 y 82

Riesgo bajo 6,11,13,40, 42,43,44,54,61,70, 72,81, y 89

1.1 Virus del papiloma humano 16 (VPH-16)

El VPH-16 tiene un genoma de DNA de doble cadena circular de una longitud

Luviano-Jaimes H.H & Lechuga-Mercado D.A

genes restantes codifican para las proteínas estructurales de expresión tardía

Figura 1. Representación esquemática del genoma de VPH-16: Se muestra la disposición de los

1.2 Ciclo replicativo del VPH-16

El VPH-16 ingresa a través de micro heridas o por medio de abrasiones en el estrato

Luviano-Jaimes H.H & Lechuga-Mercado D.A

2. Oncoproteína E6 del VPH-16

La oncoproteína E6 del VPH-16 (Figura 2) es una fosfoproteína de 151 aminoácidos

Figura 2. Estructura primaria de la oncoproteína E6 del VPH-16.

Luviano-Jaimes H.H & Lechuga-Mercado D.A

2.1 Papel de la oncoproteína E6 en la proliferación y sobrevivencia celular

El principal mecanismo de oncogenicidad de la proteína E6 del VPH-16 es su

Tabla 2. Principales blancos celulares de E6 y consecuencias funcionales.

Luviano-Jaimes H.H & Lechuga-Mercado D.A

-Interferencia en el sistema inmune del hospedero por

2.2. Variantes de E6 del VPH-16

Un análisis de prevalencia de las variantes moleculares del VPH-16 realizado a

Posteriormente, Cornet y colaboradores en 2012 reclasificaron a las variantes en 4

Luviano-Jaimes H.H & Lechuga-Mercado D.A

Tabla 3. Clasificación de las variantes de E6 de VPH-16 (Cornet et al., 2012).

En un estudio realizado en el estado de Guerrero se identificaron 27 variantes de

2.3 Potencial oncogénico de las variantes de E6 de VPH-16

Diversos trabajos experimentales muestran que las variantes genéticas de la

Tabla 4. Variaciones en la secuencia de nucleótidos y a.a en las variantes de E6 del

Luviano-Jaimes H.H & Lechuga-Mercado D.A

En 2001, Berumen y colaboradores a partir 181 muestras cervicales de pacientes

Por otra parte, a partir de un modelo de cultivo tridimensional de queratinocitos

Además, encontraron que el mensajero de E6 en las variantes AA tuvo una

Luviano-Jaimes H.H & Lechuga-Mercado D.A

Figura 3. Caracterización fenotípica del modelo epitelial tridimensional: morfología, patrón

En el grupo de trabajo se encontró que las variantes de E6 AA-a, AA-c, E-G350,

Luviano-Jaimes H.H & Lechuga-Mercado D.A

Tabla 5. Efectos de las variantes de E6 de VPH-16 sobre la expresión de genes

La mayoría de los tratamientos contra el CaCU se basan en la inducción de la

Tabla 6. Características fisicoquímicas del cisplatino (Petrovie y Todorovic, 2016).