INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

INGENIERIA BIOQUÍMICA

METODOS DE ANALISIS QUIMICOS

PRACTICA #9: Determinación del peso molecular de una proteína

empleando cromatografía por exclusión

Profesora: Rosa Martha cabrera Martínez

Fecha de realización: 28/Octubre/2016

RANGEL ALCALA SERGIO DE JESUS

SECCION 1 Grupo: 4IM2

Semestre: Agosto 2016/Diciembre 2016

Fecha de entrega: 7/Noviembre/2016

Objetivos
 Efectuar la separación de proteínas de varias muestras mediante la
técnica de electroforesis en gel de poliacrilamida.
 Determinará cual es el tamaño óptimo de poro del gel, para una mejor
separación de cada las muestras.

Fundamento
La electroforesis es una técnica de separación de moléculas cargadas por migración
en un campo eléctrico. Las moléculas se separan en función de su carga eléctrica,
desplazándose al electrodo de carga contraria y a mayor velocidad mientras mayor
sea la carga de la molécula. Cada molécula se desplaza en el campo eléctrico
alcanzando una velocidad constante, siendo afectado por su carga eléctrica,
tamaño, forma además de intensidad de corriente, voltaje y resistencia del campo
eléctrico.1
Resultados Experimentales
1.-
Tabla 1 Características de los electroferogramas a diferentes %T

Característica 5.5 7.5 10 12.5

%T
Longitud del gel antes de teñir, 7.5 6.7 6.7 5.7
cm, (l)
Longitud del gel después de 8.0 7.4 7.46 8.2
teñir, cm, (l')
Distancia recorrida por el 6.3 5.1 5.6 7.5
colorante, cm, (f)
Suero 7 8 8 11
No de bandas yogurth 4 6 4 8
en: Clara 4 8 7 9
Tabla 2 Movilidad electroforética relativa promedio

%T Muestra/ Valores de m de la Valor Movilidad log

Proteína proteína promedio electroforética (Mx100)
seleccionada (cm) de m(cm) relativa
5.5 Suero 6 6.1 6.3 6.13 0.9122
1.96
Yogurt 5.1 4.9 4.9 4.96 0.7380 2.86

Clara 3.2 3.1 3.3 3.2 0.4761 1.67

7.5 Suero 4.7 4.8 4.9 4.8 0.8521 1.9304
Yogurt 3.9 3.9 3.9 0.6923 1.8402

Clara 2.6 2.5 2.4 2.5 0.4438 1.6471

10 Suero 3.6 3.8 3.8 3.73 0.5987 1.772
Yogurt 3.3 3.2 3.3 3.26 0.5239 1.7192
Clara 2.2 2.2 2.2 2.2 0.3528 1.5475
Suero 2.9 2.9 3 2.93 0.2718 1.4339
12.5 Yogurt 2.8 2.8 2.8 2.8 0.2595 1.4141
Clara 1.1 1.2 1.1 1.13 0.1050 1.0149
Cálculos:

𝐼 𝑚
𝑀 = ( )( )
𝐼′ 𝑓

Ejemplo calculo de M de 10 %T en clara.

6.7 2.2
𝑀=( ) ( ) = 0.35
7.46 5.6

0.35x100= 35
Log 35= 1.54
 Grafica de Ferguson
2.1
y suero= -0.0748x + 2.4396
2
y yogurth= -0.0277x + 1.8342
1.9
y clara= -0.0631x + 2.2685
1.8
Log M x 100

1.7

1.6

1.5

1.4

1.3

1.2
4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
%T

Suero Yogurt Clara de Huevo

En la grafica están las ecuaciones de cada muestra donde:

y= log(Mx100)
x=%T
m=Tamaño molecular relativo de la proteína
b= Carga relativa de la proteína
Suero :
Tamaño molecular relativo de la proteína= 0.0748
Carga relativa de la proteína= 2.4396
Yogurth:
Tamaño molecular relativo de la proteína= 0.0277
Carga relativa de la proteína= 1.8342
Clara :
Tamaño molecular relativo de la proteína= 0.0631
Carga relativa de la proteína= 2.2685
4.-Concluya acerca del tamaño molecular relativo de las proteínas y sus cargas
eléctricas relativas al pH del regulador de trabajo (8.7 a 9.1)
Al comparar las pendientes de las ecuación notamos que es mayor el tamaño
molecular relativo de la proteina de suero, seguida de la clara y por ultimo el yogurth
y sus cargas relativas presentan la misma tendencia (suero,clara,yoguth).
Las cargas eléctricas relativas son negativas pues migran al ánodo (carga positiva)
siendo la mayor la de el suero, seguida de la clara y finalmente el yoguth.
5.- Diga cuál %T recomienda para la separación de proteínas de cada muestra
Tabla 3 %T recomendado

Muestra %T recomendado
Suero 10
Yogurt 12.5
Clara 7.5 y 10
Se toman estos %T porque es donde se tuvo mayor número de bandas,
representando cada una, una proteína, y por ende se tiene una mejor resolución.

6.- Escriba la reacción completa para la copolimerización de la acrilamida y la bis-

acrilamida por radicales libres, ¿qué función tienen el TEMED y el persulfato de
amonio?
El radical persulfato activa al TEMED, el cual a su vez activa al monómero de
acrilamida para que polimerice. Las cadenas de poliacrilamida son entrecruzadas
al azar por la bisacrilamida, formándose una red que puede ser regulada variando
las condiciones de la reacción y las concentraciones de los monómeros.
7.- Mencione una aplicación de la electroforesis preparativa y una de la
electroforesis analítica.
Electroforesis preparativa: Separar y purificar proteínas.

Electroforesis analítica: La separación de los componentes de la muestra de

acuerdo con su punto isoeléctrico, que además se puede medir, pues se conoce la
geometría del gradiente de pH fijado al gel.

8.- Defina velocidad de migración y movilidad electroforética, explique la

diferencia.

La velocidad de migración es proporcional al producto de su carga efectiva y el

gradiente de potencial eléctrico e inversamente proporcional al coeficiente de
fricción relativo a la talla y forma de la molécula, o sea, a la resistencia que le
ofrece el medio.
La movilidad electroforética (Me) es un caso particular de la velocidad de
migración de un ión, cuando se aplica un campo eléctrico de 1 V/cm. La velocidad
de migración electroforética depende de la densidad de carga de la molécula
(relación carga / peso), del voltaje aplicado y de la porosidad del gel de
electroforesis.2

9.-Defina el término electroferograma

Un electroferograma es un conjunto de los resultados de un análisis realizado

por electroforesis secuenciación automática,puede referirse al soporte de la
electroforesis ya realizado el corrimiento y evidenciándose la separación con
ayuda de un colorante.

10.- ¿Qué otros catalizadores se pueden utilizar para llevar a cabo la

polimerización?

 peróxidos orgánicos o azoderivados.

 yoduros metálicos, alquilos metálicos
 peróxido de hidrógeno u otros peróxidos de alquilo por hierro
 Radiación ionizante: partículas α, partículas β, rayos γ o rayos X.

Discusión
Se realizaron distintos geles de poliacrilamida con distintos %T, modificando la
cantidad de bisacrilamida para entrecruzar el gel, esto para poder comparar cuál de
ellos es el tamaño de poro más adecuado para separar las proteínas de cada
muestra, y a su vez obtener su carga eléctrica relativa y tamaño molecular relativo
por medio de gráficas de Ferguson. Estos geles se sometieron a una diferencia de
potencial de un ánodo a un cátodo, migraron, por lo que se observa que tienen carga
negativa. Las muestras estaban en solución de sacarosa para proporcionarles
densidad y que fuera más fácil agregarlas al gel, también estaban en colorante azul
de bromofenol para observar el movimiento de la proteina. Al dejar correr las
muestras sólo se observó una línea al final del corrimiento, se desnaturalizó con
TCA y su posterior tinción con azul de coomassie G-250, dejándolo varias sesiones
después de la práctica para evidenciar las distintas bandas de cada proteína. Se
observó que varió el %T óptimo para cada muestra, entre los 7.5, 10 y 12.5%. Para
obtener el %T óptimo se tomó en cuenta cuantas bandas se observaban para cada
muestra. Al realizar las gráficas de Ferguson se notó que estas no seguían una
tendencia tan lineal, probablemente debido a que el gel de 5.5% no separó
adecuadamente a las proteínas al tener poco entrecruzamiento. Observamos la
pendiente para saber quien tiene el mayor tamaño molecular relativo, quedando
mayor el suero, laclara y finalmente el yogurth, al comparar estos con los pesos
moleculares teóricos quedaron en el mismo orden. Para las cargas relativas las 3
quedaron muy similares siendo la más grande el suero, seguido de la clara y el
yogurth.
Conclusión
 La Electroforesis es una técnica útil en la separación de moléculas
que puede ser ya sea con base a su carga eléctrica o en su peso
molecular.
 el grado de entrecruzamiento a utilizar en una electroforesis es de
vital importancia para una buena resolución de la técnica que nos
permita apreciar el número total de bandas que puede arrojar una
muestra y evitar el traslape de estas.
 Hubo una correcta interpretación de los errores presentados por el
tamaño de poro de la concentración 5.5%
Referencias bibliográficas
1. http://www3.uah.es/jcdiez/biologia%20sanitaria/metodos%20biologia%20mo
le cular/practicas.pdf
2. http://www.bvs.sld.cu/revistas/uni/vol1_2_00/uni07200.htm
3. http://diccionario.raing.es/es/lema/electroferograma
4. Rubinson, Kenneth A & J.F. Rubinnson. 2001. Análisis Instrumental. Editorial
Prentice Hall, Madrid, España; 847pp.