Saat ini berkembang konsep mengenai mekanisme diferensiasi seksual dari otak selama

perkembangannya tidak hanya mencakup aksi hormone gonad, tetapi juga fungsi gen yg dikodekan oleh
kromosom seks. Efek otak dimediasi oleh tindakan kromosom Y tidak menarik jumlah yang sama dari
kepentingan seperti yang dimediasi oleh gen dikodekan pada kromosom X yang lebih besar, yang
diperkaya dalam gen yang terlibat dalam perkembangan saraf dan kognisi. Dalam beberapa tahun
terakhir, perhatian terhadap fungsi kromosom Y dalam otak selama perkembangan meningkat, karena
keterlibatannya yang diusulkan dalam autisme dan nonsyndromic keterlambatan bicara. Selanjutnya,
analisis neuroimaging dalam kohort langka manusia dengan beragam aneuploidies kromosom seks
menunjukkan bahwa kromosom X dan Y memiliki efek berlawanan pada pengembangan kortikal dan
kortikal ketebalan asimetri.

Kami telah menunjukkan bahwa gen dikodekan beberapa kromosom Y diekspresikan dalam otak selama
perkembangan manusia laki-laki. Dari jumlah tersebut, PCDH11Y dan layak mendapatkan perhatian
khusus karena mereka milik dua keluarga gen bernama protocadherins dan neuroligins, terutama
dinyatakan dalam sistem saraf dan dengan fungsi penting dalam kelangsungan hidup, takdir dari sel
determinasi dan pembentukan dan pematangan sinapsis dalam populasi neuron yang berbeda.
PCDH11Y adalah hal unik untuk manusia sementara PCDH11X hadir dalam kerabat terdekat kita,
simpanse. Acara duplikasi yang ditransfer tersebut PCDH11X untuk kromosom Y berlangsung sekitar
enam MYA lalu. Selama penyelidikan awal PCDH11Y, ketika gen itu digambarkan sebagai satu-satunya
"keuntungan fungsi" gen dalam genom manusia, ada perdebatan mengenai kekhususan manusia.
Pertanyaan itu akhirnya diselesaikan pada tahun 2006 ketika itu menunjukkan bahwa PCHD11Y spesifik
manusia, dan hadir di kedua gorila (Gorilla gorilla) dan simpanse (Pan troglodytes) serta primata non-
manusia lainnya.

NLGN4Y, bersama-sama dengan rekan X homolog, telah diusulkan sebagai kandidat gen untuk gangguan
spektrum autisme. PCDH11X / Y pasangan gen telah disarankan untuk terlibat dalam psikosis, sebagian
karena peran diduga dalam spesiasi manusia dan sebagian karena hubungannya mungkin untuk
perubahan struktural dalam otak. Merupakan langkah penting untuk memahami relevansi fungsional
kemungkinan gen Y-dikodekan untuk pengembangan dimorfisme seksual di otak adalah untuk
menyelidiki apakah X dan Y homolognya dinyatakan secara spesifik seks spasial.

Sampai saat ini, tidak ada penelitian telah dilakukan pada kontribusi genetik X dan gen Y-terkait dengan
perbedaan jenis kelamin dalam otak manusia sebelum aktivasi hormonal. Oleh karena itu sangat
menarik untuk menyelidiki dimorphisms seksual akhirnya disumbangkan oleh gen kromosom terkait
seks sendiri dengan pengaruh minimal hormon. Untuk mendeteksi kontribusi komponen genetik
dikodekan pada kromosom Y untuk perbedaan jenis kelamin dalam otak, kita menggunakan sistem saraf
pusat manusia (CNS) jaringan yang diperoleh sedini mungkin selama pengembangan, sehingga hormon
androgen, seperti testosteron, tidak diungkapkan atau diekspresikan pada tingkat minimum. Memang,
dalam sel-sel Sertoli berkembang di testis, androgen mulai diproduksi sekitar minggu 11 pasca-
kehamilan dan perlahan-lahan mulai mempengaruhi ekspresi gen di otak dengan cara mengaktifkan
setelah minggu 11.
Percobaan ini tidak dapat dilakukan dengan menggunakan konvensional in situ hibridisasi dan teknik
imunofluoresensi karena cross-hibridisasi probe memiliki kesamaan urutan tinggi. Memang, isoform
yang berbeda dari PCDH11Y sekitar 97-99% identitas urutan dengan daerah pengkode isoform homolog
PCDH11X. Kedua deteksi in situ messenger RNA (mRNA) dan imunohistokimia menunjukkan ekspresi
luas PCDH11X dan PCDH11Y dalam otak manusia selama pengembangan, tapi kontribusi masing-masing
gen untuk sinyal yang diamati tidak bisa dibedakan.

isoform berbeda NLGN4Y berbagi 89-98% urutan identitas dengan wilayah pengkodean dari homolog
NLGN4X isoform. eksperimen RT-PCR pada jaringan otak individu pria dan wanita dewasa ditentukan
bahwa kedua NLGN4X dan NLGN4Y diekspresikan, tetapi pola ekspresi spasial dari setiap gen, terutama
selama perkembangan otak manusia, tidak diketahui. Untuk secara khusus membedakan jaringan dan
distribusi seluler transkrip dari gen homolog X dan Y, kami mendesain strategi menggunakan teknologi
sequencing RNA, bersama-sama dengan imunohistokimia dan padlock probing dalam kombinasi dengan
rolling circle amplification (RCA). Sebagai metode terakhir ini bergantung pada pengenalan target ganda
dan ligasi sinyal tergantung amplifikasi, dapat disesuaikan dengan diskriminasi target yang sangat mirip
seperti varian sambatan, mutasi atau anggota keluarga gen yang sama yang mungkin berbeda oleh satu
atau beberapa urutan nukleotida tunggal. Kami menunjukkan di sini bahwa baik PCDH11Y dan NLGNY
diekspresikan dalam sub-populasi sel tertentu dalam SSP yang lebih jarang mengekspresikan gen
homolog X mereka. Menggunakan kombinasi imunohistokimia dan padlock probing, kami juga
menunjukkan bahwa sel-sel asal yang berbeda PCDH11Y express dan NLGNY di CNS selama awal
pembangunan manusia laki-laki.

Metode

sampel SSP embrio manusia dan persiapan sampel

Sampel diperoleh dari embrio manusia antara 7 dan 11 minggu kehamilan. Usia kehamilan diperkirakan
dari periode menstruasi terakhir dan dari scan ultrasound yang panjang crown-rump janin diukur.
Sampel dibedah setelah penghentian operasi kehamilan dilakukan di University Hospital di Uppsala dan
setelah persetujuan ibu tertulis dan persetujuan dari Komite Etik regional di Uppsala (nomor 2011/329).
Semua prosedur dilakukan dalam anestesi umum dengan pemberian intravena 1 ml alfentanil 0,5 mg /
ml dan 15-20 ml propofol 10 mg / ml. Tidak ada gas untuk inhalasi digunakan selama proses tersebut,
kecuali campuran udara dan oksigen. Prosedur singkat untuk mengevakuasi rongga rahim dilakukan oleh
dokter kandungan dengan aspirasi vakum. Spesimen jaringan sempat terganggu oleh prosedur bedah,
dan jenis jaringan paling banyak utuh berada, di menurun pesanan, MO, SC dan otak tengah. Sebelum
sectioning, contoh jaringan yang tetap untuk setidaknya 16 jam pada 4 ° C di 0,1 M phosphate-buffered
saline (PBS) yang mengandung 4% paraformaldehyde (PFA; Sigma-Aldrich). Sampel kemudian
cryoprotected di 30% sukrosa / PBS. bagian dua belas-mikrometer-tebal dipotong pada mikrotom beku
setelah pemasangan di TissueTec® nama cek), dikumpulkan pada slide mikroskop SuperFrost® Plus (VWR
International), dan disimpan pada -80 ° C sebelum hibridisasi. Sampel untuk RNA urutan yang dibekukan
dengan cepat pada es kering - dingin tabung Eppendorf dan disimpan pada -80 ° C sebelum ekstraksi
RNA. Untuk menentukan jenis kelamin masing-masing embrio, DNA diekstraksi dari jaringan lengan
menggunakan DNasy® Blood & Tissue Kit (Qiagen). PCR pada sampel DNA dilakukan dengan
menggunakan primer spesifik-laki untuk STS sY14 (SRY), (5'-GAATATTCCCGCTCTCCGGA-3 ', 5'-
GCTGGTGCTCCATTCTTGAG-3).

Hasil

RNA sekuensing dari medulla oblongata dan sampel otak tengah dari perempuan dan laki-laki embrio
manusia.

Untuk mengukur ekspresi X dan Y transkrip untuk PCDH11 dan NLGN4 dengan resolusi tinggi dan untuk
mempelajari ekspresi dari anggota lain dari neuroligin dan protocadherin keluarga, kami melakukan RNA
sekuensing sampel SSP dari embrio perempuan dan laki-laki, di 8-11 minggu perkembangan. Kedua RNA
total dan poliA + RNA disekuensing seperti yang dijelaskan di bagian "Metode". file tambahan 1: Tabel
S1 menunjukkan hasil analisis untuk semua gen milik keluarga gen tersebut. Semua hasil disajikan dalam
RPKM (dibaca per kilobase dari transkrip per juta dipetakan dibaca). Sebuah jumlah yang sangat rendah
RPKM dari gen Y-linked yang terdeteksi dalam jaringan perempuan mengkonfirmasikan kekhususan
teknik (Gbr. 1a, b). Tak satu pun dari gen X-linked menunjukkan tingkat ekspresi diferensial signifikan
pada laki-laki dan perempuan baik medulla oblongata (MO) atau otak tengah. Untuk mengkonfirmasi
keakuratan data RNA sekuensing, kami juga membandingkan ekspresi PCDH11X dan NLGN4X dengan
ekspresi ZFX, sebelumnya dilaporkan dalam otak orang dewasa sebagai pelarian dari X inaktivasi.
Gambar 1c menunjukkan bahwa ZFX memiliki sekitar dua kali tingkat ekspresi pada wanita dibandingkan
dengan laki-laki (adjusted nilai p 0,006) setuju dengan hasil sebelumnya.

probe padlock khusus membedakan antara X dan Y homolognya

Kami menggunakan probe padlock dirancang seperti yang dijelaskan di bagian "Metode", sebagai koktail
untuk deteksi transkrip oleh padlock penyelidikan ligasi dan RCA pada bagian dibuat dari jaringan CNS
embrio laki-laki dan perempuan. Karena kelangkaan sampel dari sampel otak perempuan, kami
memutuskan untuk fokus pada MO dan sumsum tulang belakang (SC) untuk di analisis in situ. Kami
mengamati bahwa sementara probe padlock-X khusus terdeteksi transkrip di kedua sampel perempuan
dan laki-laki, probe padlock Y-spesifik hampir secara eksklusif terdeteksi transkrip di bagian jaringan laki-
laki, dengan sangat rendah hibridisasi latar belakang untuk perempuan, membenarkan kekhususan jenis
kelamin Y- probe padlock khusus (Gambar. 2). Rendahnya jumlah sinyal untuk homolognya Y, diamati
dalam jaringan perempuan, kemungkinan besar karena peristiwa mis-ligasi padlock probe Y-spesifik
tetapi bahkan lebih mungkin karena sinyal positif palsu (autofluorescent bergulir produk lingkaran
seperti sinyal) diidentifikasi oleh CellProfiler gambar perangkat lunak analisis. Selain itu, kami
mengamati bahwa kedua PCDH11X / Y dan ekspresi NLGN4X / Y mRNA terutama terbatas pada materi
abu-abu, dengan sangat sedikit ekspresi dalam materi putih ("Wm" pada Gambar. 2g-j). Sebagai sampel
tidak sebanding terhadap jumlah sinyal mutlak, jumlah untuk X dan sinyal Y dinormalisasi untuk
hitungan per 1000 sel. Ketika kita mengkuantifikasi jumlah PCDH11X dan PCDH11Y sinyal di 7 bagian
diperoleh dari jaringan SC perempuan dan 12 bagian dari jaringan laki-laki, kami mengamati bahwa
jumlah sinyal (per 1000 sel) untuk PCDH11X tidak berbeda antara laki-laki dan perempuan baik di SC dan
MO (Gambar. 3), sesuai dengan hasil dari sekuensing RNA dari MO. Rata-rata, 50% dari transkrip
terdeteksi di SC laki-laki sesuai dengan Y transkrip, dan 50% untuk transkrip X. Dalam MO laki-laki,
proporsi adalah 27% Y dan 73% X. Ketika kita mengkuantifikasi sinyal NLGN4X / Y di 8 bagian yang
diperoleh dari jaringan perempuan dan 14 bagian dari laki-laki (Tabel 2), kami tidak menemukan
perbedaan dalam jumlah dari yang diamati sinyal untuk transkrip NLGN4X pada wanita dibandingkan
dengan pria di kedua jenis jaringan. Rata-rata, 56% dari transkrip diamati di SC laki-laki yang Y transkrip,
dan 44% adalah X transkrip. Dalam MO, proporsi adalah 51 dan 49%. Hasil ini berkorelasi dengan baik
dengan tingkat ekspresi diukur dengan RNA sekuensing.

klasifikasi sel berdasarkan profil transkripsi

Gambar 4 menunjukkan distribusi PCDH11X / Y, NLGN4X / Y, dan ACTB (gen housekeeping untuk
pengendalian kualitas jaringan) sinyal di jaringan laki-laki. Kami mengamati bahwa sel sinyal positif
untuk kedua PCDH11X / Y dan NLGN4X / Y yang dalam banyak kasus positif X atau transkrip Y, tetapi
tidak untuk keduanya. Contoh sel-sel ini ditandai dengan panah pada Gambar. 4b, d. Untuk menentukan
apakah sel-sel yang mengekspresikan X dan homolog Y secara eksklusif mutual, kami mengklasifikasikan
sel dengan setidaknya dua sinyal ditugaskan sebagai X-spesifik, Y-yang spesifik atau campuran.
Berdasarkan klasifikasi ini (Tabel 1 dan 2), kami mengamati bahwa untuk kedua pasangan gen homolog,
ada sejumlah sebanding sel di semua tiga kelas sel, menunjukkan bahwa sel-sel secara simultan dapat
mengekspresikan X dan transkrip Y serta pameran mode saling eksklusif ekspresi.

Untuk mengevaluasi bagaimana PCDH11X / Y dan NLGN4X / Y diekspresikan dalam hubungan satu sama
lain, kami hibridisasi bagian secara bersamaan dengan empat set probe gembok menggunakan sistem
deteksi empat warna seperti yang dijelaskan dalam "Metode" bagian (Gambar. 4e). Analisis profil
ekspresi-sel tunggal menunjukkan semua kemungkinan kombinasi dari empat transkrip (Tabel 3).

distribusi spasial diferensial dari X dan Y mengekspresikan sel dalam SSP

Untuk melakukan analisis terhadap pola distribusi spasial dan obyektif menyelidiki apakah transkrip
untuk PCDH11X, PCDH11Y, NLGN4X dan NLGN4Y didistribusikan berbeda-beda dalam CNS serta untuk
memvisualisasikan luasnya tumpang tindih daerah dengan X dan sinyal Y, kami membandingkan data
gambar kami dengan satu set data gambar acak. Sebagai langkah pertama, dengan tiga sasaran dalam
pikiran, kita dihasilkan kernel plot estimasi kepadatan seperti yang dijelaskan di bagian "Metode" dan
diplot X dan sinyal Y kepadatan ke gambar dari SC dan MO bagian jaringan (Gambar. 5). Di SC, kepadatan
sinyal dari kedua NLGN4X dan PCDH11X bervariasi di setiap bagian jaringan, dengan kepadatan sinyal
jelas lebih tinggi di tanduk ventral daripada di tanduk dorsal di kedua jaringan perempuan (Gambar. 5a,
b, e-f). Berbeda dengan homolog X, NLGN4Y disajikan pemerataan seluruh SC, menunjukkan bahwa ada
sel-sel yang lebih rentan untuk mengekspresikan homolog Y dari homolog X di beberapa bagian
penampang, yaitu di tanduk dorsal (Gbr. 5f). PCDH11Y tidak menunjukkan perbedaan yang konsisten
distribusi sinyal antara daerah ventral dan dorsal (Gambar. 5e). pola ekspresi yang berbeda juga diamati
ketika kita menganalisis bagian dari MO (Gambar. 5c, d, g-h). Benar, kepadatan plot menunjukkan
bagaimana PCDH11X tampaknya diungkapkan patch-wise di kedua jaringan MO pria dan wanita saat
PCDH11Y menunjukkan pola ekspresi yang lebih merata, sampai batas yang lebih besar daripada
PCDH11X terbatas pada pinggiran jaringan. Demikian pula, transkrip NLGN4Y muncul untuk
didistribusikan secara homogen selama bagian jaringan, sedangkan kepadatan transkrip NLGN4X
bervariasi di seluruh jaringan.

Kami kemudian membandingkan dengan data lapangan untuk sampel laki-laki dengan data acak set dan
merencanakan piksel yang warna lebih terwakili oleh lebih dari 3 deviasi standar dibandingkan dengan
nilai rata-rata dari 100 randomizations seperti yang dijelaskan di bagian "Metode". Untuk NLGN4X dan Y,
kita melihat penyimpangan dalam representasi piksel Y-dominan dari data acak. X piksel dominan
umumnya kurang terwakili sementara piksel Y-dominan lebih terwakili dalam data kami (Gbr. 6a)
dibandingkan dengan kumpulan data acak. Hal ini konsisten dengan pengamatan bahwa ekspresi
NLGN4X terbatas pada beberapa daerah sementara NLGN4Y lebih universal dinyatakan. Kami juga
melihat kecenderungan ke bawah-representasi piksel campuran. Ketika merencanakan piksel
menyimpang lebih dari 3 SD, kami mengamati prevalensi lebih tinggi dari transkrip NLGN4Y di bagian
perifer dari SC (Gambar. 6b). Contoh tambahan diberikan dalam tambahan berkas 2: Gambar S1. Untuk
PCDH11 di MO, kita amati kepadatan sinyal tinggi untuk kedua PCDH11X dan Y dalam inti olivary (OL),
tapi kami juga melihat di bawah representasi piksel intensitas campuran, menunjuk ke arah ekspresi
terkotak dari PCDH11X dan PCDH11Y. Ketika membandingkan sampel yang dianalisis data acak masing-
masing dengan 95 interval% confidence (sesuai dengan tingkat signifikansi 0,05), kita jelas melihat
terlalu banyak jumlah piksel NLGN4Y-dominan di SC dan otak sampel, sementara di MO, tren yang
kurang jelas dan perbedaan antara data dan simulasi acak secara statistik tidak signifikan (Gambar. 6c).
Kami tidak mengamati pola yang konsisten untuk NGLN4X di semua sampel. Untuk PCDH11X / Y,
mayoritas sampel menunjukkan penyimpangan yang kuat dari keacakan, dan lagi, piksel Y-dominan lebih
terwakili dan tidak ada pola yang stabil ditemukan untuk piksel X-dominan (Gambar. 6d).

Ketika membandingkan jumlah ventral dan dorsal untuk transkrip homolog di sumsum tulang belakang
sebagai rasio antara X dan transkrip Y (file tambahan 3: Tabel S2), kami menemukan bahwa NLGN4X
pada wanita menunjukkan ekspresi yang lebih tinggi di SC ventral (n = 5, t tes, satu ekor, p = 0,045)
dibandingkan dengan dorsal. PCDH11X tidak menunjukkan perbedaan yang signifikan dalam ekspresi
daerah pada wanita (n = 2, t tes, satu ekor, p = 0,08). Baik NLGN4Y maupun PCDH11Y disajikan
perbedaan yang signifikan di punggung untuk pola ekspresi ventral pada laki-laki. Ini menegaskan hasil
dari analisis estimasi kepadatan Kernel (KDE) plot, sebagai over-representasi Y-dominan piksel (terletak
di wilayah dorsal) diharapkan ketika transkrip homolog Y lebih homogen terdistribusi dan transkrip X
homolog sebagian besar terbatas pada wilayah ventral. Juga, di bawah-representasi piksel X-dominan
diharapkan untuk pola ekspresi berkerumun transkrip X homolog karena ini untuk tumpang tindih
sebagian besar dengan sinyal transkrip Y mengakibatkan piksel campuran di wilayah ventral.
Pengamatan ini menunjukkan kepada kita bahwa terdapat populasi yang berbeda dari sel-sel di SSP
sehubungan dengan ekspresi X atau Y homolog. Dengan kata lain, hasil kami menunjukkan bahwa
dimorfisme seksual spasial dalam ekspresi kedua gen ada.
Penentuan identitas selular dari Y mengekspresikan sel menggunakan kombinasi imunohistokimia
dengan padlock probing

Untuk menentukan prekursor, glial atau identitas neuronal dari sel-sel yang positif untuk PCDH11X / Y
dan NLGN4X / Y di MO, kami menggabungkan padlock probe hibridisasi dengan label imunohistokimia
seperti yang dijelaskan di bagian "Metode". Kami menggunakan Neun antibodi, diketahui neuron label,
antibodi Olig2, yang sel noda prekursor untuk oligodendrocytes, dan antibodi Sox10, yang noda saraf
sel progenitor yang akan menimbulkan kedua sel saraf dan glial dalam SSP. Gambar 7a menunjukkan
bahwa Neun+ dan sel NeuN- mengekspresikan PCDH11X dan PCDH11Y transkrip. Sebagai contoh, olivary
inti (ON) wilayah berisi PCDH11X dan Y sinyal tetapi tidak ada pewarnaan Neun. Demikian pula, Gambar.
7b menunjukkan juga tumpang tindih parsial antara NLGNX dan Y sinyal dan Neun pewarnaan.
menariknya, NLGN4X dan Y sinyal yang diamati pada lapisan ependymal ("Ep" pada Gambar. 7b)
sementara sinyal untuk PCDH11X dan Y yang jarang di wilayah ini (tidak ditampilkan). Ep adalah lapisan
dari sel-sel glial berasal dan bermigrasi. pewarnaan Olig2 ditunjukkan pada Gambar. 7c, d. Hanya
sebagian kecil dari Olig2 + sel dan Sox10 + sel yang terdapat sinyal untuk PCDH11X, PCDH11Y, NLGN4X
atau NLGN4Y, menunjukkan ekspresi parsial X dan gen gametolog Y di prekursor sel saraf(Gambar. 7e, f).
Selain label prekursor untuk oligodendrocytes, Olig2 dikenal diekspresikan dalam neuron motorik.
Selanjutnya, seperti yang dijelaskan di bagian yang berhubungan dengan analisis kepadatan peta di atas,
kami mengamati peningkatan ekspresi PCDH11X dan NLGN4X di tanduk ventral dari SC, sebuah daerah
yang dikenal mengandung beberapa inti untuk motor neuron. Oleh karena itu, kami juga melakukan
dikombinasikan padlock menyelidik dengan immunostaining untuk Islet-1 antibodi, yang dikenal untuk
label motor neuron, di tanduk menengah dan ventral dari SC [32]. file tambahan 4: Gambar S2
menunjukkan bahwa kami menemukan co-lokalisasi PCDH11X dan sinyal Y dan Islet-1 di beberapa sel
yang positif. Hal ini menunjukkan bahwa PCDH11X dan Y disajikan di motor sel diferensiasi neuron
selama tahap-tahap awal pembangunan daripada di neuron sensorik, yang dikenal untuk menempati
tanduk dorsal SC. Kesimpulannya, baik PCDH11X dan Y dan NLGNX dan Y diekspresikan dalam heterogen
sub-populasi sel di kondisi perkembangan yang berbeda, termasuk mengembangkan neuron dan
prekursor glial.