Clonagem Genica e Ana Lise de Dna PDF

T. A.
BROWN
Professor of Biomolecular Archaeology,
Department of Biomolecular ScÌences,
UMISI Manchester, UK
CLONAGEM
/\
GENICA
E ANALISE DE DNA
Uma introdução
4a Edição
Tiadução:
Henrique Bunselmeyer Ferreira
Biólogo, Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS).
Mestre em Genética, UFRGS.
Doutor em Genética e Biologia Molecular, UFRGS.
Pós-Doutorado no Albert Einstein coltege of Medicine, Nova Iorque, EUA.
Professor adjunto IV do Departamento de Biologia Molecular e Biotecnologia, uFRGS.
orientador do Programa de Pós-Graduação em Biologia celular e Molecular, UFRGS.
Pesquisador associado do Centro de Biotecnologia, UFRGS.
Luciane Maria Pereira Passaglia

Bióloga. UFRGS.
Doutora em Genética e Biologia Molecular, UFRGS.
Pós-Doutorada na Universidade da Califómia, Berkeley, EUA.
Professora adjunta IV do Departamento de Genética, UFRGS.
orientadora do Programa de Pós-Graduação em Genética e Biotogia Molecular, UFRGS.
Pesquisadora associada do centro de Biotecnologia, UFRGS, na âreade Fixação
Biológica do Nitrogênio, e do Departamento de Genética, UFRGS, nas iíreas de
Genética Molecular de Microrganismos e Genética e Biotecnologia vegetal.
2003
1a Edição Sumário
do DNA recombi- Parte 1

ias sobre esses as-
For parte do leitor - Princípios Básicos da Clonagem Gênica e da
de um estudan- Análise de DNA... .... 11
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os termos não- 1 Por que a Clonagem Gênica e aAnálise de DNA São Importantes............... 13
e reforçar o tex-
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2 Veículos pata a Clonagem Gênica: Plasmídeos e Bacteriófagos ............. ...... 25
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Partir de Células .................. 39
p'ara alguns pesqui-
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6 Vetores de Clonagem para E. coli............. ............. 115
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livros-texto
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DNA na Pesquisa
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Estudando aLocalizaçáo e a Estrutura do ....205
certa ou a frase ade-
11 Estudando a Expressão e a Função dos Genes.. .....225
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12 Estudando Genomas ........253
T. A. Brown
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10 SuMÁRto
Parte 3
Aplicações da Clonagem Gênica e da Análise de
DNA na Biotecnologia........ ..2ls
13 Produção de Proteínas a partir de Genes Clonados ..................277
t4 Clonagem Gênica e Análise de DNA na Medicina ...................2gg
15 Clonagem Gênica e Análise de DNA naAgricultura................................... 319
I6 Clonagem Gênica e Análise de DNA na Ciência Forense ........ 335
Glossrário .................... .......347
Índice ............367
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PARTE 1
PRINCIPIOS BASICOS DA
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CnpÍrulo 1
Por Que a Clonagem Gênica e a

Análise de DNA São lmPortantes
O desenvolvimento inicial da genética' I 3 Pol quea clonagem gênica e a PCR são tão
O advento da clonagem gênica e da reação em cadeia importantes, l6

da polìmerase, 14 Como encontrar o seu caminho ao longo deste livro,
O que é clonagem gênica?. I 5 22
OqueéPCR?,16
Em meados do século XIX, Gregor Mendel formulou um conjunto de regras para explicar a
herança de características biológicas, as quais assumiam' basicamente, que cada propriedade
trerediìrária de um organismo é controlada por um fator, chamado de gene, que é uma partícu-
la física presente em algum local na célula. A redescoberta das leis de Mendel, em 1900, mar-
cou o nascimento da genética, a ciência que busca o entendimento do que são esses genes e
de como eles funcionam exatamente.
1.1 O desenvolvimento inicial da genética

Em seus primeiros 30 anos de vida, a nova ciência cresceu a uma velocidade espantosa. A
idéia de que os genes residem em cromossomos foi proposta porW. Sutton' em i903' e fece-
beu suporte experimental de T. H. Morgan, em 1910. Morgan e colaboradores desenvolveram,
então, as técnicas paÍa mapeamento gênico, e, até I922,já haviam produzido uma análise
abrangente das posições relativas de mais de 2.000 genes nos quatro cromossomos da mosca-
das-frutas, a Drosophila melanogaster.
Apesar do brilhantismo desses estudos genéticos clássicos, não houve um real entendi-
mento da natwezamolecular do gene até a década de 1940. De fato, apenas após os experi-
mentos de Avery, Macleod e Mccarty, em 1944, e de Hershey e chase, em 1952, alguém pas-
sou a acreditar que o ácido desoxirribonucléico (DNA) era o material genético: até então, era
geralmente aceito que as proteínas constituíam os genes. A descoberta da função do DNA foi
um grande estímulo para a pesquisa genética, e muitos biólogos famosos (Delbrück, Chargaff,
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14 T. A. Bnowr.r
Crick e Monod estavam entre os mais influentes) contribuíram para a segunda grande era da
genética. Em 14 anos - de 1952 a1966 a estrutura do DNA foi elucidada, o código genéti-
13 O qut
-
co decifrado e os processos de transcrição e de tradução descritos.
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1.2 O advento da clonagem gênica e da reação em rlt

cadeia da polimerase
Esses anos de atividade e descoberta foram seguidos por um peíodo de calmaria, um anticlí-
max, no qual parecia, para alguns biólogos moleculares (como a nova geração de geneticistas
se autodenominava), que havia poucos aspectos de importância fundamental ainda não-escla-
recidos. Na verdade, havia uma frustração em função de as técnicas experimentais disponíveis
no final da década de 1960 não serem suficientemente sofisticadas para permitir o estudo dos
genes com maiores detalhes.
Depois, nos anos de l91I a 1913, a pesquisa genética foi novamente acelerada por uma re-
volução na biologia experimental, conforme descrito na época. Uma metodologia completa-
mente nova começou a ser desenvolvida, viabilizando o planejamento e a realizaçãq se não
com façilidade, pelo menos com sucesso, de experimentos previamente impossíveis. Tais mé-
todos, chamados de tecnologia de DNA recombinante ou de engenharia genética, com ba-
se essencialmente no processo de clonagem gênica, abriram uma nova grande era para a ge-
nética, conduzindo a rápidas e eficientes técnicas de seqüenciamento de DNA, as quais per-
mitiram que as estruturas de genes individuais fossem determinadas. Isso culminou, na déca-
da de 1990, com os projetos de seqüenciamento massivo de genomas, incluindo o projeto hu-
mano, que foi completado em 2000. A partir daí, foram desenvolvidos procedimentos para o
estudo da regulação de genes individuais, o que permitiu que os biólogos moleculares enten-
dessem como aberrações na regulação gênica podem resultar em doenças humanas, como o
câncer. Essas técnicas geraram a biotecnologia moderna, que coloca os genes em funciona-
mento para a produção de proteínas e de outros compostos necessários à medicina e aos pro-
cessos industriais.
Durante a década de 1980, quando o entusiasmo gerado pela revolução da clonagem gê-
nica estava no seu auge, parecia quase impossível imaginar que estava prestes a surgir mais
um processo igualmente inovador e revolucionário. De acordo com o folclore do DNA, Kary
Mullis inventou a reação em cadeia da polimerase (PCR) durante uma viagem de carro aà
longo da costa da Califórnia, em uma noite de 1985. A sua idéia genial foi a concepção de
uma técnica relativamente simples, que funciona como um complemento perfeito para a clo-
nagem gênica. A PCR tornou mais fáceis muitas das técnicas que antes, apesar de possíveis,
eram de difícil execução, quando dependendo apenas da clonagem gênica. Ela estendeu o al-
cance da análise de DNA e fez com que a biologia molecular encontrasse novas aplicações,
inclusive em áreas fora do seu campo tradicional, de medicina, agricultura e biotecnologia. A
ecologia molecular, a arqueologia biomolecular e a ciência forense de DNA são apenas três
das novas disciplinas que surgiram como uma conseqüência direta da invenção da pCR, e os
biólogos moleculares estão buscando novas maneiras de utilizar o DNA para responder ques-
tões sobre a evolução humana e o impacto de mudanças ambientais na biosfera. Trinta ãnos
após a revolução da clonagem gênica, ainda estamos andando em uma montanha-russa,
sem
previsão de final para a excitação provocada por ela.
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Erande era da 1.3 O que é clonagem gênica?

código genéti-
As etapas básicas de um experimento de clonagem gênica são descritas a seguir (Figura 1.1).
(1) Um fragmento de DNA, contendo o gene a ser clonado, é inserido em uma molécula de
DNA, chamada de vetor, para produzir uma quimera ou molécula de DNA recombi-
nante.
um anticlí-
de geneticistas
1Construção de uma molécula de
não-escla-
DNA recombinante
disponíveis
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clonagem gê- da molécula de
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Figura 1.1 Colônias bacterianas

As etapas básicas da clo- crescendo em meio sólido
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16 T. A. Bnowru
(2) O vetor funciona como um veículo que transporta o gene para o interior de uma célula
hospedeira, a qual é, em geral, uma bactéria, embora outros tipos de células vivas pos-
sam tambóm ser utilizados.
(3) No interior da célula hospedeira, o vetor multiplica-se, produzindo numerosas cópias
idênticas não apenas de si próprio, mas também do gene que ele caÍrega.
(4) Quando a célula hospedeira se divide, cópias da molécula de DNA recombinante são
passadas à progênie, na qual o vetor replica-se novamente.
(s) Depois de um grande número de divisões celulares, é produzida uma colônia, ou clone,
de células hospedeiras idênticas. Cada célula do clone contém uma ou mais cópias da
molécula de DNA recombinante; diz-se, então, que o gene carregado pela molécula de
DNA recombinante está clonado.
1.4 O que é PCR?

A reação em cadeia da polimerase é muito diferente da clonagem gênica. Em vez de utilizar
uma série de manipulações envolvendo células vivas, a PCR é executada em um único tubo
de ensaio, a partir da mistura de DNA com um conjunto de reagentes e da sua colocação em
um termociclador, um equipamento que permite que a mistura seja incubada em uma série de
temperaturas que são variadas de uma maneira pré-programada. As etapas básicas de um ex-
perimento de PCR são as seguintes (Figura 1.2):
(1) A mistura é aquecida a94"C, temperatura na qual as pontes de hidrogênio, que mantêm
unidas as duas cadeias da molécula de DNA de fita dupla, são rompidas, causando a
desnaturação da molécula.
(2) A mistura é resfriada a 50 a 60'C. As duas fitas de cada molécula poderiam reunir-se a
essa temperatura, mas a maioria não o faz porque a mistura contém um grande excesso
depequenasmoléculasdeDNA,chamadasdeoligonuclffi
anelam com as moléculas de DNA em posições específicas.
(3) A temperaturaé elevada até 74oC,,con_s_ideradg-óqrlq4!a&_4 atividade da DNA-polime-
.ase a"ffiqËËffi-ËË"na mistura. Ãp;"ndo"-;; mais sobré DNÃìõ'timèi;
ses na página 67. Neste estágio, tudo o que precisamos para entender o processo é que,
durante essa etapa da PCR, a DNA-polimerase de Taqliga-se a uma extremidade de ca-
da iniciador e sintetiza novas fitas de DNA, complementares às moléculas de DNA.
molde. Agora, temos quatro fitas de DNA, em vez das duas com as quais iniciamos a
reação.
(4) A temperatura é novamente elevada até94"C.As moléculas de DNA de fìta dupla, cada
uma das quais consistindo em uma fita da molécula original e uma nova fita de DNA,
desnaturam, gerando fitas simples. Isso inicia um segundo ciclo de desnaturação-anela-
mento-síntese, ao final do qual existem oito fitas de DNA. Com a repetição do ciclo por
,..
| 25 vezes, a molécula de fita dupla com a qual iniciamos é convertida em mais de 50 mi-
i ttrOes de novas moléculas de DNA de fita dupla, cada uma delas uma cópia da região da
{ molécula inicial delimitada pelos sítios de anelamento dos dois iniciadores.
1.5 Por que a clonagem gênica e a PcR são tão importantes

Frguna
A clonagem gênica e a PCR são procedimentos relativamente simples
(Figuras 1.1 e 1.2). Por ns eüapas hási
que, então, elas são consideradas de tanta importância na biologia? Isso se explica principal- darea@ em
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uma colônia, ou clone,

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5', 3',
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ia da região da 3' 5',
5', 3',
Figura 1.2
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i
principal- da reação em ca-
deia da polimerase. 4 Repetição do ciclo 25-30 vezes
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18 T. A. Bnowr'r
mente porque elas permitem a obtenção de uma Íìmostra pura de um gene individual, separa- dual- d
do de todos os outros genes da célula. conjun
gene d
1.5.1 lsolamento de genes por clonagem e SUaS i
Para entender exatamente como a clonagem pode produzir uma amostra pura de um gene, Na
considere o experimento básico da Figura 1.1, mas desenhado de maneira um pouco diferen- é acap
te (Figura 1.3). Nesse exemplo, o fragmento de DNA a ser clonado é um dos membros de uma clones
mistura de muitos fragmentos diferentes, cada um dos quais é portador de um gene diferente que c0
ou de parte de um gene diferente. Na realidade, essa mistura poderia ser todo o complemento sanimÍ
genético de um organismo - de um humano, por exemplo. Cada um desses fragmentos é in- gura l.
serido em uma molécula de vetor distinta, para produzir uma famflia de moléculas de DNA
recombinante, uma das quais é portadora do gene de interesse. Geralmente, apenas uma mo-
lécula de DNA recombinante é transportada para o interior de uma célula hospedeira indivi-
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cópias de apenas uma molécula A clonagem permite que
de DNA recombinante fragmentos de DNA indivi- Figur
duais sejam puriÍicados. O proden
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Ct-orueeeu GÊNtcA E AruÁuse oe DNA 19
individual, separa- dual, de modo que cada clone contém múltiplas cópias de apenas uma molécula, embora o
conjunto final de clones possa conter muitas moléculas de DNA recombinante diferentes. O
gene de interesse está agora separado de todos os outros genes presentes na mistura original
e suas características específicas podem ser estudadas detalhadamente.
pura de um gene, Na prática, a chave para o sucesso ou o fracasso de um experimento de clonagem gênica
ira um pouco diferen- é a capacidade de identificar um determinado clone de interesse em meio aos muitos outros
dos membros de uma clones diferentes que são obtidos. Se considerarmos o genoma da bactéria Escherichia coli,
de um gene diferente que contém pouco mais de 4.000 genes diferentes, poderíamos, em princípio, considerar de-
todo o complemento sanimadora a tarefa de encontrar um determinado gene dentre todos os clones possíveis (Fi-
fragmentos é in- gura 1.4). O problema torna-se ainda mais assustador se lembrarmos que as bactérias são or-
de moléculas de DNA
, apenas uma mo-
la hospedeira indivi-
Uma porção muito

ÍrPE pequena do genoma
de E. coli
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O gene a ser
clonado
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Figura 1.4 Como podemos selecionar

sejam purificados. O problema da ou identificar apenas um gene?
seleção.
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nes o oes anb serp ruaa,,
a
20 T.A.BRowN
ganismos relativamente simples e que o genoma humano contém aproximadamente 10 vezes cleotíden
mais genes. Contudo, conforme explicado no Capítulo 8, vrírias estratégias diferentes podem tas ofiia
ser utilizadas para assegurar a obtenção do gene correto ao final de um experimento de clona-
memo&
gem. Algumas dessas estratégias envolvem modificações do procedimento básico de clona- tmatfoã
gem, de modo a determinar que somente células contendo a molécula de DNA recombinante Umr
desejada possam dividir-se, fazendo com que o clone de interesse seja automaticamente sele-
de rmg
cionado. Outros métodos envolvem técnicas que viabilizam a identificação do clone a paÍir
aindaé r
de uma mistura de muitos clones diferentes.
Depois da sua clonagem, praticamente não existem limites pÍÌra as informações que po-
(r) nr
EN
dem ser obtidas a respeito da estrutura ou da expressão de um gene. A disponibilidade de ma-
frN
terial clonado estimulou o desenvolvimento de métodos analíticos para o estudo de genes,
com a introdução constante de novas técnicas. Os métodos para o estudo da estrutura e da ex-
ft
(F
pressão de um gene clonado são descritos nos Capítulos 10 e 11, respectivamente.
€$Ú
1.5.2 Isolamento de genes Por PCR (?JHá

FC
A reação em cadeia da polimerase também pode ser utilizada para a obtenção de uma amos- ctÍt
tra pura de um gene. Isso ocorre porque a região da molécula de DNA de partida que é copia- sÊÉ
da durante a PCR é o segmento delimitado pelas posições de anelamento dos dois oligonu- hü
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Figura 1.5 rmml

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a
Clotueev GÊrurcn e ANÁLtsE DÊ DNA 21
.10
vezes cleotídeos iniciadores. Se os iniciadores anelam de ambos os lados do gene de interesse, mui-
diferentes podem tas cópias do mesmo serão sintetizadas (Figura 1.5). O resultado é o mesmo de um experi-
de clona- mento de clonagem gênica, mas o problema de seleção não existe, pois o gene desejado ã au-
ml básico de clona- tomaticamente "selecionado", em conseqüência das posições de anelamento dos iniciadores.
D\A recombìnante Um experimento de PCR pode ser completado em poucas horas, ao passo que a obtenção
:,maticamente sele- de um gene por clonagem pode levar semanas ou meses. Por que, entãã, a clonagem gênica
r do clone a partir ainda é uÍilizada? Isso se deve a duas limitações da pCR:
que po- (l) Para que os iniciadores posicionem-se corretamente, em ambos os lados do gene de in-
ilidade de ma- teresse, as seqüências desses sítios de anelamento devem ser conhecidas. É fácit sinteti-
!ì estudo de genes, zar um iniciador com uma seqüência predeterminada (ver p. 1g0), mas se as seqüências
'J,À estrutura e da ex- dos sítios de anelamento são desconhecidas, é impossível a produção de iniciadores ade-
rÊmente. quados. Isso significa que a PCR só pode ser utilizada para isolar genesjá previamente
estudados - o que deve ser feito por clonagem.
(2) Há um limite para a extensão de seqüências de DNA, as quais podem ser copiadas por
:ão de uma amos-
PCR. Cinco quilobases (kb) podem ser copiadas com relativa facitidade e pode-se lidar
com segmentos de até 40 kb com atilizaçáo de técnicas especializadas. Entretanto, tais
urtida que é copia-
segmentos são mais curtos do que a extensão de muitos genes, especialmente aqueles de
r dos dois oligonu-
humanos ou de outros vertebrados. Se é necessária uma versão intacta de um gene lon-
go, a clonagem deve ser utilizada.
A clonagem gênica é, portanto, a única maneira de isolar genes longos ou genes que nun-
ca foram estudados anteriormente. Mas a PCR ainda possui muitas aplicações impórtantes.
Por exempl_o, I4e-g$_o_que_g..qg$êlcia de q,p_ggng seja descoqhecida, ainda pode sei possível
adetgrminação de sgqgp.q-gla-s_.g2ropriadas para um par de iniciadóreg, ô9m uãsê no quêãõ
nheçld.q99tre,,9.geqtiQry.iggggggeqe eqq!y,91_qtte g{Lqm grgatilgg qlt"rylÈ. um
lene que
foi isolado e seqüenciado a partir de, digamos, ôaúunaongoì"ããii",'lìõ.tãrto, ser utilizado
como base para projetar um par de iniciadores pÍÌra o isolamento do gene humano equivalen-
te.
Além disso, existem muitas aplicações nas quais é necessário o isolamento ou a detecção
de genes cujas seqüências já são conhecidas. uma pCR de genes de globina humanos, por
exemplo, é úilizada em testes para verificação da presença de mutações que podem causar a
anemia hemolítica chamada talassemia. A projeção de iniciadores adequados para essa pCR
é fâcil, pois as seqüências dos genes de globina humanos são conhecidui. RpOr a pCR, as có-
pias dos genes são seqüenciadas ou estudadas de alguma outra maneira para determinar
se al-
guma mutação talassêmica está presente.
Uma outra aplicação clínica da PCR envolve a utilização de iniciadores específicos para o
DNA de um vírus patogênico. Um resultado positivo indica que uma amostra contém o vírus
e que a pessoa que a forneceu deve ser tratada para evitar o estabelecimento da
doença. A rea-
ção em cadeia da polimerase é exrremamente se-nsívrel: png_g_Ìg{Ì-tgg-e1q-_cui$-4$_o-p.g de C.e,eç4q
seia -qs4.+!!-*de-.s-d-""tççfues_de*_D']jÃËss'_q_qúgõ-bí;pêÃ".-,]-ã-ãolécuta de DNA na
mt"q191a rniqlll. rltq.pig{t"ifi-q"-a"que
t|í.c"!ig? é -c-gpaz dedetectar vírus nôs estágios mais iniciais
de uma infecção, arlm.qllan$o.as ôtranceJaè r"Càtro no t utu-ónto. Èsu gãno.
sensibilida-
de faz com que a PCR taúbèm possa ser utilizada com DNA proveniente de amostras
de me-
dicina legal, como cabelo ou manchas de sangue secas, ou até mesmo de ossos de pessoas
Figura 1.5 mortas há bastante tempo (Capítulo 16).
lsolamento de ge-
nes por PCR.
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20 T. A. Bnowlr 22 T. A. Bnowrrr
gamsr 1.6 como encontrar o seu caminho ao rongo deste Iivro tc*i
mais 1
uti
ser
Este livro explica como a clonagem gênica, a pcR e outras técnicas de análise de llnmrlllt,
gem.. executadas e descreve as aplicações dessas técnicas na biologia moderna. As apli llllhÌru
gem' I
cobertas nas segunda e terceira partes do livro. A Parte2 descreve como genes e ge i$nnuurrn:,
desejr estudados, enquanto a Parte 3 considera as diversas aplicações da clonagem gênica e LrulilltliltüÌi
ciona na biotecnologia, na medicina, na agricultura e na ciência forense.

ïllllrruurLrdurn
de un
lLtì1ffiÌltilíiilrÍrrL
Na Parte 1, abordamos os princípios básicos. A maioria dos nove capítulos é <

Dr clonagem gênica, pois essa técnica é mais complicada que a pcR. euando você ti iililìtlúillliliïj
dem s
dido como é realizadauma clonagem, játeráentendido muitos dos princípios básicos
terial todologia de análise do DNA. No capítulo 2, tratamos do componente central de um
'ltlìrurmnrunr
ihttut
com a
mento de clonagem - o veículo - que transporta o.gene para o interior de uma célula
pressí
deira e é responsável pela sua replicação. Para funcionar como um veículo de c
molécula de DNA deve ser capaz de entrar em uma célula hospedeira e, uma vez no
1.5.2 lsolar da mesma, deve replicar-se para produzir múltiplas cópias de si mesma. Dois tipos
A rea culas de DNA que ocoÍïem naturalmente satisfazem essas exigências:
tra pu
da du (1) Plasmídeos, que são pequenos círculos de DNA encontrados em bactérias e em
outros organismos. os plasmídeos podem replicar-se independentemente do
mo da célula hospedeira.
(2) cromossomos virais, em especial os cromossomos de bacteriófagos, que são
infectam especificamente bactérias. Durante a infecção, a molécula de DNA
riófago é injetada na céluÌa hospedeira, onde irá replicar-se.
o capítulo 3 descreve como o DNA é purificado a partir de células vivas - tanto

que será clonado quanto o DNA do vetor - e o capítulo 4 cobre as várias técnicas
nipulação em laboratório de moléculas de DNA purificadas. Existem muitas técnicas
so, mas duas são particularmente importantes para a clonagem gênica. A primeira é
gem de um vetor em um ponto específico e a segunda, a sua reparação, de modo a i
gene no veículo previamente clivado (Figura 1.1). Essas e outras técnicas de manipu
DNA foram desenvolvidas como subprodutos de pesquisa básica sobre a síntese e a
ção de DNA em células vivas, sendo que a maioria delas faz uso de enzimas puri
jas propriedades e modo como são utilizadas em estudos envolvendo DNA são
Capítulo 4.
Depois de uma molécula de DNA recombinante ter sido construída, ela deve ser
célula hospedeira, de modo que a replicação possa acontecer. o transporte para o inter
lula hospedeira faz uso de processos naturais para a incorporação de moléculas de D
midial ou viral, os quais, assim como o modo como eles são utilizados na clonagem g,
descritos no capítulo 5. Nos capítulos 6 e 7, são apresentados os tipos mais importan
tores de clonagem e discutidas as suas utilizações. Para concluir a cobertura da clon
nica, tratamos, no Capítulo 8, do problema da seleção (Figura 1.4), antes de
Capítulo 9, a uma descrição mais detalhada da PCR e das técnicas relacionadas a ela
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Cnpírurc 2
Veículos para a Clonagem Gênica:
Plasm ídeos e Bacteriófagos
Plasmídeos. 25 Bacteriófagos, 30
Para ser capaz de afuar como um veículo para a clonagem gênica é necessário que uma molé-
cula de DNA apresente viírias características. Ainda mais importante é que tenúa capacidade
de replicar-se nointerior da célula hospedeira, de modo que numerosas cópias da moiécula de
DNA recombinante pobsam-se*qroduzidas e passadas às células-filhas. Um veículo de clona-
gem também deve ser relativameàte pequeno, preferencialmente com um tamanho inferior a
10 kb, pois grandes moléculas tendem a quebrar-se durante a purificação e são mais dificeis
de ser manipuladas. Dois tipos de moléculas de DNA que satisfazem esses critérios podem ser
encontrados em células bacterianas: plasmídeos e cromossomos bacterianos. Embora os plas-
mídeos sejam utilizados com mais freqüência como vetores de clonagem, dois dos mais im-
portantes tipos de vetor em uso atualmente são derivados de bacteriófagos.
1 Plasmídeos
Garacterísticas básicas dos plasmídeos
Plasmídeos são moléculas de DNA circulares que têm uma existência independente na célu-
la bacteriana (Figura 2.1). Os plasmídeos quase sempre são portadores de um ou mais genes,
que, com freqüência, são responsáveis por características úteis apresentadas pela
bactériã hos-
pedeira. Por exemplo, a capacidade de sobreviver em concentrações normalmente tóxicas
de
antibióticos, como cloranfenicol ou ampicilina, é muitas vezes devida à presença na bactéria
de um plasmídeo portador de genes de resistência a antibiótico. Em laboratório, a resistência
a antibiótico é freqüentemente utilizada como um marcador selecionável paÍa
assegurar que
as bactérias em cultura contêm um determinado plasmídeo (Figura2.2).
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26 T. A. Bnowru
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Plasmídeos nr-ËEfiü
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Plasmídeos
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nfunr1
Figura 2.1
rt4õmcr
Plasm ídeos: elementos genéti- @ffir
Cromossomo bacteriano cos independentes encontra- E&NmlÍI
dos em células bacterianas. CUECNÍrc
EisdcÍe$r
-
Tlgúor
-
Otmanlnr
Resistência à ampicilina Ftuàdm
mhoid
(TftlaLl)
Resistência à tetraciclina
Células de E. coli,
o O 6., algumas contendo RP4
o oox
O \-i @Cétutas com o plasmídeo
\ OCétutas sem o ptasmídeo
\
/ \
Figura2.2
O uso de resistência a antibióti-
co como um marcador selecio-
nável para um plasmídeo. O
plasmídeo RP4 (no topo) é por-
-_,,.7t, tador de genes de resistência à
Meio de Meio de multiplicação
ampicilina, à tetraciclina e à ca- nln23
multiplicação
normal -
+ 50 pg/ml
tetraciclina
namicina. Somente as células EffiS
sem antibiótico de E coli que contêm RP4 (ou
I
I
I um plasmídeo aparentado) são ttslrm
V
Todas as células
V
Somente células contendo
capazes de sobreviver e multi- ffio
plicar-se em um meio com
capazes de RP4 podem multiplicar-se
multiplicar-se quantidades tóxicas de um ou úGüíbil
mais desses antibióticos.
)
erorrp:l Xuv | 'o:sr:uer3 e.rrcl
G
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a
Croruaeeu GÊNlcA E AuÁrtse oe DNA 27
o
ra a produção de suas cópias, enquanto alguns dos plasmídeos maiores são portadores de ge-
nes que codificam enzimas especiais, as quais são específicas para a replicação plasmidial.
Alguns poucos tipos de plasmídeos são também capazes de replicar-se a partir da ry3 in
serção no cromossomo bacteriano (Figura 2.3b). Tais plasmídeoíìãtegratFõíouffisoirios
elementos genéti- porí aol@
encontra- R ïndepénilãntêíã ïméghção támbéú
células bacterianas. ïõrnossornõí'dè baciêriófago3, que serão descritos
mais detalhadamente quando forem considerados (p. 31 ).
2;Nz Tamanho e número de cóPias

O tamanho e o número de cópias de um plasmídeo são importantes sobretudo no que diz res-
peito à clonagem. Já foi mencionada a relevância do tamanho do plasmídeo e afirmado ser um
tamanho inferior a l0 kb desejável para um vetor de clonagem. O tamanho dos plasmídeos
(Iabela 2.1) vana entre aproximadamente 1,0 kb, para os menores, até mais de 250 kb, para
(a)Plasmídeonão-integrativosmídeos
ffilW oâ
o-
,
Cromossomo bacteriano
(b) Epissomo
)-O
Cromossomo Portador
Cromossomo bacteriano do plasmídeo integrado
PlasmÍdeo
a antibióti-
nrmarcador selecio-
plasrnídeo. O
{no topo) é por-
Á,u,"ô""rrr\
@@
de resistência à
eaca- Figura 2.3 /\
as células Estratégias
RP4 (ou de replicação
sao de (a) um
e multi- plasmídeo
com não-integrati-
de um ou vo e de (b)
um epissomo.
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a
28 ï A. Bnowlr
Tabela 2.1 Tamanhos de plasmídeos representativos
Tamanho
Extensão de Massa molecular
Plasmídeo nucleotídeos (kb) (MDa) Organismo
pUCS 2,1 1,8 E. coli

lilffirglci
ColEl 6,4 4,2 E. coli
odhnkh
fim.ttl A$cÉf
RP4 54 36 Pseudomonas e outros lürafË
F 95 63 E. coli ummmfi"rrt
TOL rt7 78 Pseudomonas putida Mrlegrb n
pTiAch5 213 142 A g ro b ac t e rium tumefac ie ns ,ffiXra-l
íih@E€ntËi
üllfhmceff
rffitËr
os maiores, de modo que apenas poucos deles são úteis para autilizaçáo em clonagem. Entre- ffiria- n
tanto, conforme descrito no Capítulo 7, plasmídeos maiores podem, sob alçumas circunstân- @mfirmítnd
cias, ser adaptados para a clonagem. @uffiGWE*
a ürrlllEnF pe
O número de cópias refere-se ao número dè-moléculas de um determinado plasmídeo que
são encontradas normalmente em uma célula bacteriana individual. Os fatores que controlam o 'ffi@Err
número de cópias não são bem-compreendidos, mas sabe-se que cada plasmídeo possui um va-
lor característico, que pode ser de apenas um (em especial para as moléculas grandes) ou igual
ou maior do que 50. Via de regra, um vetor de clonagem útil deve esta.r presente na célula em
múltiplas cópias, para que grandes quanúdades da molécula de DNA recombinante possÍìm ser 'elí Classific
obtidas.
A classifir
trcrí$[iqa cl
2.1.3 Conjugação e compatibilidade
ffiffiõs
Os plasmídeos são divididos em dois g*po!.onlugativos e não-conjugativos. Os plasmí-
deos conjugativos são çarccÍeizados pela capacidade de promover a conilgação sexual en- íll Ph
tre células bacterianas (Figura 2.4),umprocesso que pode resultar na propagação do plasmí- üÍn
deo conjugativo de uma célula para todas as outras células de uma cultura bacteriana. A con- jus
jugação e a transferência do plasmídeo são controladas por um conjunto de genes de trans- í!) Ph
lt
ferência, ou tra, que estão presentes em plasmídeos conjugativos, mas ausentes no tipo não- resis
I conjugativo. Um plasmídeo não-conjugativo pode, contudo, sob algumas circunstâncias, ser oÍr
co-transferido juntamente com um plasmídeo conjugativo, quando ambos estão presentes na pÍop
mesma célula. tlËtx
Vários tipos difererltes de plasmídeos podem ser encontrados em uma mesma célula ao n4s-
l
I mesmo tempo, incluúe mais de um plasmídeo conjugativo diferente. De fato, sabe-se que
células de E. coli podem conter simultaneamente até sete plasmídeos diferentes. para serem
Étfr
I
Cotr
i
ii
capazes de coexistir na mesma célula, os plasmídeos diferentes devem ser compatíveis. Se l{l Plas
l dois plasmídeos são incompatíveis, então um ou outro será rapidamente perdido pela célu- tïnu
Ì
I
la. Diferentes tipos de plasmídeo podem, portanto, ser classificados dentro de ãiferentes l5l Ptrn
grupos de incompatibilidade, com base na possibilidade ou não de coexistirem na mesma pbfl
t
célula. Os plasmídeos de um mesmo grupo de incompatibilidade são freqüentemente simi- tas d
I
I lares entre si quanto a vários aspectos. A base da incompatibilidade não é bem-compreen-

I'
dida, mas acredita-se que eventos que ocoffem durante a replicação são os responsáveis pe-
Ì
1o fenômeno.
2.15 Plasmídc
l
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O fam de(
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ep eÌp e sstu 'ã oq: uau enb rrp ua; elslr oqIJq un ã s?u'BroJ
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9l opu-ÌÌ leqyrq apod 1os o anb erp uaa er:grsrq essou rp oeórnurluo: r a a:o,r anbro4 G
'opÊuâs zJ âro^ os'sãssa ouotr srrp ug.opunu
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:[.ze;sap :s repuÃnb o opìl ..b rrp *ea.o:ernq urn r:n er:5ap
o'âlâp ãuou o zÌp rrog o..Dqreurv.o3sÌJw.rJ,red nas o on anb selp uâL,
rt
"11o,
a
Ct-oruncev GÊurcn e ANÁLtsE oe DNA 29
Célula doadora Célula receptora
Íganismo
Figura2.4
coli TransÍerência de plasmídeo entre
coli células bacterianas por conjuga- Plasmídeo conjugativo
ydomonas e outros ção. As células doadora e recep-
nli tora fixam-se uma à outra por
domonas putida uma Íímbria, um apêndice oco
presente na supedície da célula
fucreium tumefaciens doadora. Uma cópia do plasmÊ
deo é, então, passada paraacé-
lula receptora. Acredita-se que a
transÍerência ocorra através da
Ìão em clonagem. Entre_ fímbria, mas isso ainda não Íoi
l $ob algumas circunstân_ comprovado. A transÍerência por
J
rnunado pÌasmídeo que

tuores que controlam o
outros meios (por exemplo, dire- i
tamente pelas paredes celulares !
das bactérias) permanece sendo
o o
,
uma possibitidade.
possui um va- J
las grandes) ou igual
u'esente na célula em
binante possÍÌm ser 2,1.4 Classificação dos plasmídeos
A classificação mais útil dos plasmídeos de ocorrência natural é baseada na principal carac-
terística codificg!3leleqggng!{lasmidiais. os cinco principais ripos de plasmídeo,
de acor-
do com essa classificação, são osiegÍúteì:-
_sú"rtlos. Os plasmí_
\
sexual en- (l) Plasmídebs de fertilidade ou "F' cÍìrregam apenas genes trae não possuem qualquer
ão do plasmí- outra caracteística além da capacidadei€ promoverem a transferência plasmidial con-
:ucteriana. A con_ jugativa. Exemplo: plasmídeo F de E. coli.
re *genes de trans_ (2) Plasmídeos de resistência ou "R" caÍïegam genes que conferem à bactéria hospedeira
s no tipo não_ resistência a um ou mais agentes antibacterianos, como o cloranfenicol, a
iïrürostâncias, ser ampicilina ou
o mercúrio. Plasmídeos R são muito importantes para a microbiologia cÍnìca, pois
a
presentes na propagação dos mesmos em populações naturais pode ter sérias conseqüências
no trata-
mento de infecções bacterianas. Exemplo: Rp4, comumente encontrà do em pseudomo_
ürmsúna célula ao ^-- -
') (3)
ocorre_ndg rambém em muiras oìúãÀ uâòieú;
ii,uru,r" sabe-se que "ry.ryas
Plasmïiteós-eol codificam ôôtiõinas. pïoti:inas-qìé mã.ram outras bacrérias. Exemolo
Exemplo:
Para serem ColEl de E. coli.
(4) Plasmídeos degradativos permitem que a bactéria hospedeira metabolize
moléculas in-
pela célu- comuns, como o tolueno e o ácido salicílico. Exemplo: ToL de pseudomonas putida.
üe diferentes (s) Plasmídeos de virulência conferem patogenicidade à bactéria hospedeira.
Exemplo:
na mesma plasmídeos Ti Agrobacterium tumefociens,que induzem
de to-or", de galha em plan-
slml- tas dicotiledôneas.
n-
els pe-
2.1-5 Plasmídeos em outros organismos que não bactérias
O fato de os plasmídeos serem bastante comuns em bactérias não implica, de
maneira alguma,
que eles também o sejam em outros organismos. O plasmídeo eucariótico
mais bem caracteri-
zado é o círculo de 2 pm, que ocoÍïe em muitas linhagens da levedura
Saccharomyces cerevi-
IE
*çi o
t
if::''r]:-!.:ì:::rLro-ìoliior's.r.r,ur-rtÌs,e.ruos'rlserprunrrr.lopurnf;]ï:i:::lr:l*tff;:'":ï;'iulfïJ;iï:'ji::Í;üïr"r: 'õ
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nas o ors anb selp uq1 ..
o
"11o,
a
30 T. A. Bnowrrr
siae. A descoberta do plasmídeo de 2 1tm teve um impacto bastante positivo, pois permitiu a
construção de vetores para a clonagem de genes utilizando esse organismo de grande importân-
cia industrial como hospedeiro (p. 140). Contudo, a busca de plasmídeos em outros eucariotos
(como, por exemplo, fungos filamentosos, vegetais e animais) mostrou-se infrutífera, suspeitan-
do-se que muitos organismos superiores simplesmente não abrigam plasmídeos no interior de
suas células.
2.2 Bacteriófagos
2.2.1 Características básicas dos bacterióÍagos F
Bacteriófagos ou fagos, como são comumente conhecidos, são vírus que infectam especifica- Os dois tipos prit
estrutuÍa de Íagos: (i
mente bactérias. Como todoyos vírus, os fagos possuem uma estrutura bastante simples. Eles
e cauda (por exe
consistem meraríente eì-íma molécula de DNA (ou, ocasionalmente, de ácido ribonucléico
{b) filamentoso (po,r
IRNAI) portadora de alguns genes, inclusive vários para a replicação do fago, envolvida por
uma cobertura protetora ou capsídeo, formada por moléculas protéicas (Figura 2.5).
O padrão geral de infecção, que é o mesmo para todos os tipos de fago, é um processo de
três etapas (Figura 2.6).
(1) A partícula do fago fixa-se na superfície externa da bactéria e injeta o seu cromossomo
de DNA no interior da célula.
i
I
(2) A molécula de DNA do fago é replicada, leralmente por enzimas específicas, codifica-
das por genes do seu próprio cromossomo.
(3) Outros genes do fago dirigem a síntese dos componentes protéicos do capsídeo e novas
I partículas virais são montadas e liberadas da bactéria.
Com alguns tipos virais, todo o ciclo de infecção é completado de forma muito rápida,
I possivelmente em menos de 20 minutos. Esse tipo de infecção rápidaé chamado de ciclo líti-
i co, pois a liberação das novas paqtículas virais está associada à lise da célula bacteriana. O as-
I pecto mais caraóterístico de umficlo de infecção lítico é oÉìo Ua síntese das proteínas do
I
capsídeo ocoÍrer imediatamente após a replicação do DNA do fago, cujas moléculas nunca
são maltidas em uma condição estável na célula hospedeira.
2.2.2 Fagos lisogênicos

Diferentemente de um ciclo lítico, a infecção lisogênica é caracteizada pela retenção da molé-
cula de DNA do fago na bactéria hospedeira, possivelmente ao longo de muitos milhares de di-
visões celulares. Com muitos fagos lisogênicos, o DNA viral é inserido no genoma bacteriano,
de uma maneira similar à inserção epissômica (Figura 2.3b). Aforma integrada do DNA do fa-
go (chamada de profago) é quiescente e a bactéria portadora (referida como um lisógeno) é, em
geral, fisiologicamente indistinguível de uma célula não-infectada. Entretanto, o profago acaba
sendo liberado do genoma da bactéria hospedeira e o fago reverte para o modo lítico, lisando a
Fïgura 2
célula. O ciclo de infecção O" l"-Ua. (I),rlq&gg lirgJgqqslpic!, q lqoJg$_qe_ryegra21_
O padrão geral de i
Um número limitado de fagos lisogênicos segue um ciclo de infecção diferente. Quanclo bcçao de uma célu
M13 ou um fago aparentado a ele infecta E. coli, novas partículas virais são continuamente bacteriana por u
montadas e liberadas da célula. O DNA de Ml3 não é integrado no genoma bacteriano e não se bacteÍióúag
torna quiescente. Com esses fagos, a lise celular nunca ocoffe e a bactéria infectada pode conti-
nuar a crescer e a dividir-se, embora a uma velocidade menor do que a de células não-infecta-
das. A Fìgura 2.8 mostra o ciclo de infecção de Ml3.
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âp srp J ffi'âôq: uau anb erp uaa'ãtsrrt orÌlrJq un ã s?u'?JoJ gl opu{reqp:q apod 1os o anb zrp u:1'er:otsrq tssou ep ot5enuguo: e a a:ol anb:o4 G
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aa :nb o opru aluadu ap g'rt:uasn? Bns r eJorlf, opeqgs op oÌiualÌs o'alãp ãruou o zlp ef,o; 9l Ios o 'alãqueuv'of,slf,uef,C 'Ed nes o ots anb sap uaa,,
a
Cr-orueceu GÊuca e ANÁLtsE oe DNA 31
positivo, pois permitiu a

de grande importân-
em outros eucariotos
infrutífera, suspeitan-
no interior de Moléculas
de proteína
(capsídeo)
Figura 2.5 Molécula de DNA

infectam especifica- (ls dois tipos principais de
bastante simples. Eles ffrürra de Íagos: (a) cabeça
de ácido ribonucléico .- ccilrda (por exemplo, l,) e
,ffi flamentoso (por exemplo, (a) Cabeça e cauda (b) Fitamentoso
do fago, envolvida por
M13).
(Figura 2.5).
fago, é um processo de
o seu cromossomo
específicas, codifica- Partícula do fago

DNA
do capsídeo e novas
1 O Íago Íixa-se à bactéria

de forma muito rápida, e injeta o seu DNA
é chamado de ciclo líti-
bacteriana. O as-
tese das proteínas do
cujas moléculas nunca
pela retenção da molé-

muitos milhares de di-
no genoma bacteriano,
do DNA do fa-
3 Os componentes do capsídeo são sintetizados,
componentes I
novas partículas são montadas e liberadas
umlisógeno) é, em do capsÍdeo i
o profago acaba
modo lítico, lisando a
Figura 2.6
na 2.7.
Opdrão geral de in-
diferente.
lhçãode uma célula
is são continuamente bacteriana por um
bacteriano e não se bacterióÍago.
ia infectada pode conti-
de células não-infecta-
ËoriFf l(ìlv 'o:souer3 r:ecí
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aP srP â s?rrr'âôqr tuau anb erp uaa'ãtslr oq1rrqun â seu'ef,oJ ?l opuÌT Jeqp:q epod 1os o enb rrp uea'errgtrsrq essou ep orSenurluoc e 9 a:ol anb:o4 G
'opÌluszqtâtro^c'ssouolseÌpug'opunuoproÌeur'epn8eezalsr:teunello
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!J'zeJsapasrapuzanboopnlenberpuaa'o:anqunerler:8ap
o'ãlâp ãuou o zrp eroJ gl los o 'ãtrâr{ueulr'otrsrtru?J{'red nes o oes enb serp uaa,,
o
a
32 ï. A. Bnowlt
{
I Apesar de haver uma variedade muito grande de bacteriófagos, somente À e M13 chegaram .A n,ljr,à
a desempenhar papéis importantes como vetores de clonagem. As propriedades desses dois fa- lïÌlbfitulr&. flq
I gos serão agora consideradas com maiores detalhes. ,dirr**:'- ts f,c
I
I
\, 'cudus
F:gu
Organização gênica na molécula de DNA de ?', lrtrTars.lË I
gf:ïi3ì ;ü'É i
O l, é um exemplo típico de fago de cabeça e cauda (Figura 2.5a). O DNA está contido na es-
trutura poliédrica da cabeça e a cauda serve para fixar o fago à superfície bacteriana e injetar
o DNA na célula (Figura2.1).
Uma partícula do fago À

fixa-se a uma célula de
E. coli e injeta o seu DNA
-{ï de ì" circulariza DNA de À
Cromossomo bacteriano
/\
/ \ Divisão celular
/ \_
Fr$üe Zg
ffiii,iurrMtM m nitsaÇe':
üm Mrnercfu3r
rirri' :? .
lndução:
\
A O DNA de À desliga-se do
cromossomo bacteriano
B Novas partículas do fago sãd

produzidas (ver etapas 2 e 3
da Fig.2.6)
Gs' Êigura2.7
O ciclo de inÍecção lisogêni-
ca do bacterióÍago 1".
@
i nnwopr
uEÍ'Ës
nm ftLrr"ncËes
Ftgul
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ãp Erp: su'â-\oq: ueu anb erp ual otsrJt or{lrf,q un ê sBu'ero.1 e[ opurT Jeqp:q apod 1os o anb erp ua1'er:glsrq rssou ep oe5enuquo: e a elol enb;o4 IE
oprluas ze_ì JJo-\ os'sâssê ouof, srrp ug'opunu op Jorru e'epn8e ezalsrJl ?un €tIo^ ã zt;sap as repur anb o opnt enb trp uaa o:z:nq un un er:8ap
e:e anb o opn: atu:d:: :p E rr:uasn€ €ns € rroqf, op€qgs op oÌJuaps o'âIep ãuou o zrp uoJ rl Ios o'elêquelüV'otrsnueq'rrd nas o ors anb s?lp u{,,
o
a
Cronneenit GÊnrcn e AruÁuse oe DNA 33
somenteÀeMl3chegaram A molécula de DNA de ì", que tem um tamanho de 49 kb, vem sendo extensivamente es-
ropriedades desses dois fa- tudãATõiËõììõïEhãËëãfu-dõ'€êÌfi õÕ6sõq*ri-en6iã*;íàa"ïm.Emconseqüência
disso, as posições e as identidades da maioria dos genes da molécula de DNA de l, sãoionhe-
cidas (Figura 2.9).Uma característica do mapa genético de À é que os genes relacionados em
termos de função estão agrupados em regiões específicas do genoma. Por exemplo, todos os
O DNA está contido na es- genes que codificam componentes do capsídeo estão agrupados no terço esquerdo da molécu-
perffcie bacteriana e injetar
Fago M13
Fímbria-- DNA de M1 3
O fago M13 fixa-se a uma

fímbria de uma célula de
E. coli e injeta o seu DNA
do DNA de Mt3
Novos fagos Ml3

,rã.ffi"
\enlicaeão
tt
são continuamente f o o" ìm È"go.
::iJ#ff":iii"U% - M13
,m#
de M13
I \ o..u,,ll'i.ïl:ï;"."-^
ffi / \:ïllïïã,i3crescer
\...-
Figura 2.8
O clclo de inÍecção
do bacteriófago
M13.
Figura 2.9
O mapa genético de À,
mostrando as posições
2.7 dos genes importantes e
de infecção lisogêni- o 2 4 6 810 12 14 16 1820222426?83032343638404244464849kb
as Íunções dos agrupa-
do bacterióÍago ),. mentos de genes.
íü u;
:_iLìtil:J \ìlv o
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'::::r1rro:r L:,rrci ociltJl oÀJt Õïu ilo .lnb rrii <t ottlos or11g o :-lrd art;rsr ::ur y
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âp arp â sru 'a oqr uau anb erp uaa.ãlsrrt orl1uq un 9 s?u,ero; ?l opuq reqp:q apod 1os o anb erp uaa.rr:glsrq essou ep orSenu4uo: r a a:ol anb;o4 IE
'oPDu$ zJ âloÀ os'sâssâ ouof, s?Ip ug opunu op forru r'epn8e rzalsut eun Btlo UI
!J'ze3sap as rapur anb o opnl anb rrp ual'otr€Jnq un ?Jrl er:Sep
na :nb o optu aluada: ap g'trtuasm Bns e ?f,oqJ op?q9s op ortruâls o'âlâp ãuou o zÌp eJoJ €Ì Ios o'â]âqueruy'ofsrfu?:{'red nes o ors anb srlp uJL,
a
34 T. A. Bnowlr
la e os genes que controlam a integração do profago no genoma do hospedeiro estão agrupa-

dos na sua região central. O agrupamento de genes relacionados é extremamente importante
paÍa o controle da expressão do genoma de À, pois ele permite que os genes sejam ativados ou
inativados em grupo, e não individualmente. O agrupamento também é importante pata a
construção de vetores de clonagem derivados de ì, (descritos no Capítulo 6).
As Íormas linear e circular do DNA de ?u
Uma segunda característica de À, relevante para a construção de vetores de clonagem, é a con-

formação da molécula de DNA. A molécula mostrada na Figura 2.9 éltnear, com duas extre-
midades livres, e representa o DNA presente na estrutura da cabeça do fago. Essa molécula li-
near consiste em duas fitas de DNA complementares, com bases pareadas de acordo com as
regras de \üatson-Crick (isto é, DNA de fita dupla). Entretanto, em.cada extremidade da
molécula existe um segmento curto, de 12 nucleotídeos, no qual o DNA é de fita simples (Fi-
gura 2.10a). As duas fitas simples são complementaÍes e, portanto, capazes de parear suas ba-
ses entre si para formar uma molécula circular totalmente de fita dupla (Figura 2.10b).
Fitas simples complementares são, com freqüência, referidas como extremidades
ttade'
sivastt ou extremidades coesivas, porque o pareamento de bases entre elas pode unir as duas
extremidades de uma molécula de DNA (ou as extremidades de duas moléculas de DNA di-
ferentes). As extremidades coesivas de 1" são chamadas de sítios cos e têm duas funções dis-
tintas durante o ciclo de infecção de ì,. Primeiramente, elas permitem que a molécula de DNA
linear injetada na célula seja circularizada, o que é um pré-requisito para a inserção no geno-
ma bacteriano (Figura 2.7).
A segunda função dos sítios cos é um pouco diferente e necessária depois que o profago
foi removido do genoma hospedeiro. Nesse estágio, é produzido um grande número de novas
moléculas de DNA de l" pelo mecanismo de replicação por círculo rolante (Figura 2.10c), no
qual uma fita de DNA contínua é "rolada paraforc" da molécula-molde. O resultado é um ca-
tenano, que consiste em uma série de genomas lineares de À unidos pelos seus sítios cos, cu-
ja função é agoraatuar como seqüências de reconhecimento pÍÌra uma endonuclease, que cli-
va o catenano nos sítios cos, produzindo genomas de l" individuais. Essa endonuclease, que é
o produto do gene Á da molécula de DNA de À, cria as extremidades coesivas de fita simples,
além de agir em conjunto com outras proteínas pa.ra empacotar cada genoma de À em uma es-
trutura de cabeça do fago.
( Como se verá no Capítu\6. os processos de clivagem e empacotamento reconhecem ape-
nas os sítios cos e as seqüênciàs imediatamente adjacentes a eles. A mudança da estrutura das
I
J regiões internas degenoma de À, por exemplo, pela inserção de novos genes, não tem efeito
I sobre esses eventos, desde que o tamanho total do genoma de l, não seja demasiadamente al-
I terado.
L
M13: um fago filamentoso
M13 é um exemplo de fago filamentoso (Figura 2.5b) epossui uma estrutura completamente
Frgur
distinta daquela de À. Ademais, a molécula de DNA de M13 é muito menor do que o genoma Asbr
de À, com uma extensão de 6.407 nucleotídeos. Ela é circular e tem a característica incomum siyas
de consistir inteiramente em DNA de fita simples. na br
ÍìorÍÉts
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G
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L
Jp BTp â w'â,\oq: u:u anb erp uaa.ãlsrrl orlTrrq un ã sru.eJoJ gl opuqrrqprq apod 1os o anb rrp ual.errglsrq rssou rp or5enurluo: e a a:ol anbro4 G
'opuuas uJ âf,o^ os'Fsse ouof, serp uã opunu op roreu r'epn8r zalsrrt ?un etlo
u'ze;sap as rapur anb o opnl snb erp uãI'oJ€fnq un eJrl err8ap
u::nb o opru etuadar:p g'rr:uasna ?ns ? uorÌJ oprqts op ortruâlrs o'âlâp ãuou o zrp eloJ €l Ios o'âiâr{ueu\r'o:sriutf,J'red nes o oes anb sBIp uâJ,,
o
a
Croneeeu GÊrurcn e ANÁLtsE oe DNA 35
hospedeiro estão agruPa-

(a) A Íorma lineaÍ da molécula de DNA de À
é extremamente imPortante
os genes sejam ativados ou Extremidade coesiva esquerda Extremidade coesiva direita
é importante para a CCCGCCGCTGGA
6). GGGCGGCGACCT
::::-
(b) A Íorma circular da molécula de DNA de l"
declonagem,éacon-
2.9 élinear, com duas extre-
do fago. Essa molécula li-
pareadas de acordo com as
em cada extremidade da
o DNA é de fita simPles (Fi-
capazes de parear suas ba-
dupla (Figura 2.10b).
ttade'
como extremidades
entre elas pode unir as duas
duas moléculas de DNA di-
cos e têm duas funções dis- (c) Replicação e empacotamento do DNA de À
que a molécula de DNA
para a inserção no geno-
cos cos O catenano
rola para fora
da molécula
depois que o profago de DNA de l.
qT-
um grande número de novas
rolante (Figura 2.10c), no
. O resultado é um ca- A endonuclease
codiÍicada pelo
pelos seus sítios cos, cu-
gene A cliva o
uma endonuclease, que cli- catenano nos
. Essa endonuclease, que é sítios cos
coesivas de fita simples
u-u
o HH
ì
genoma de l,
l"'
"- "rl
o o'
I
mento reconhecem ape-
A mudança da estrutura das H
novos genes, não tem efeito Componentes protéicos
I não seja demasiadamente al- do capsídeo
ççç
Novas partículas de
Íagos são montadas
uma estrutura comPletamente Figura 2.10

muito menor do que o genoma As Íormas linear e circular do DNA de À. (a) A forma linear, mostrando as extremidades
coe-
e tem a caracteística incomum sivas esquerda e direita. (b) O pareamento de bases entre as extremidades coesivas resulta
na forma circular da molécula. (c) A replicação por círculo rolante produz um
catenano de
novas moléculas de DNA linear de À, que são empacotadas individualmente nas
cabeças
do fago à medida que novas partículas de À são montadas.
e"lril-nTrf xì{!- -o-utirr:l er:ii
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a
36 T.A. BRowN
O tamanho menor da molécula de Ml3 implica possuir espaço paÍa um número menor de
genes do que o genoma de À. Isso é possível porque o capsídeo de M13 é construído a partir
de múltiplas cópias de apenas três proteínas (requerendo apenas três genes), ao passo que a
síntese da estrutura de cabeça e cauda de l, envolve mais de 15 proteínas diferentes. Além dis-
so, Ml3 segue um ciclo de infecção mais simples que o de À e não necessita de genes para a
inserção no genoma do hospedeiro.
A injeção de uma molécula de DNA de M13 em uma célula de E. coli ocoÍïe através da
frmbria, a estrutura que conecta duas células durante a conjugação sexual (Figura2.4).Uma
vez no interior da célula, a molécula de fita simples atua como molde para a síntese de uma
fita complementar, resultando em uma molécula de fita dupla normal (Figura 2.11a). Essa
molécula não é inserida no genoma bacteriano, sendo, emvez disso, replicada até que mais de
100 cópias estejam presentes na célula (Figura 2.1 1b). Quando abacténa se divide, cada cé-
lula-filha recebe cópias do genoma do fago, que continua a replicar-se, mantendo, assim, o
seu número total por célula. Conforme mostrado na Figura 2.11c, novas partículas do fago são
continuamente montadas e liberadas, com aproximadamente 1.000 novos fagos sendo produ-
zidos a cada geração de uma célula infectada.
As vantagens de Ml3 como um veículo de clonagem {ü
f V,arios aspectos tornam M13 atraente como base para um veículo de clonagem. Seu genoma
Jt é menor do que 10 kb, um tamanho bem dentro da faixa ideal para um vetor em potencial.
Alé- do que, a forma replicativa (RF) de fita dupla comporta-se de maneira bastante simi-
lar a um plasmídeo e pode ser tratada como tal para propósitos experimentais. Ela é prepara-
da facilmente a partir de uma cultura de células de E. coli infectadas (p. 59-60) e pode ser
**iiff
iÍï:ï|,ffilï::T tg;t 1ll, gene s clonado s em um veror derivado de M 1 3 pode --
rem ser obtidos na forma de DNA de fita simples. Versões de fita simples de genes clonados j
são úteis para viírias técnicas, especialmente para seqüenciamento de DNA e mutagênese ir
,'
vitro (p.212 e243). A utilização de um vetor derivado de M13 é uma maneira fácil e confiá- i
vel para a obtenção de DNA de fita simples para esse tipo de trabalho. )
2.2.3 Vírus como veículos de clonagem para

outros organismos (cl
A maioria dos organismos vivos é infectada por vírus e, por isso, é natural que haja um
grande interesse na possibilidade de que vírus possam ser utilizados como veículos de clo-
nagem para organismos superiores. Isso é especialmente importante quando lembramos que
plasmídeos não são comumente encontrados em oulros organismos. que não bactérias e le-
veduras (p. 31).
De fato, os vírus possuem um potencial considerável como vetores de clonagem para al-
guns tipos de aplicação com células de animais. Os vírus de mamíferos, como o simian vi-
rus 40 (SV40), os adenovírus e os retrovírus, além dos baculovírus, de insetos, são aque-
les que receberam mais atenção até agora. Esses vírus são discutidos com maior profundi-
dade no Capítulo 7.
Figura I
O ciclo r
rem. (a)
replicati
Molécnl
montagí
o
z
IE
*t: o
,ì
G
T
NOJECI JJOA
V
EI Jols I q tp elr€d 3nb tuã L
IE
t,ì
a
Croruncev GÊurcn p AruÁrrse oe DNA 37
um número menor de
(a) lnjeção de DNA de
13éconstruídoapartir A partícula de
Íita simples na célula
genes), ao passo que a M13 injeta seu
hospedeira, seguida
diferentes. Além dis- pela síntese da DNA na célula
necessita de genes para a segunda Íita
DNA de fita
E. coli ocorre através da simples
sexual (Figura 2.4). U ma
para a síntese de uma
(Figura 2.11a). Essa
icada até que mais de
ria se divide, cadacé-
-se, mantendo, assim, o
partículas do fago são
DNA de fita dupla:
fagos sendo produ- lorma replicativa (RF)
(b) Replicação da RF
para produzir novas
clonagem. Seu genoma moléculas de Íita dupla
um vetor em potencial.
7^\
oxo
maneira bastante simi-
imentais. Ela é prepara-
(p. 59-60) e pode ser
derivado de Ml3 pode]

ples de genes clonados \\/^/
DNA e mutagênese in /{
maneira fâcil e confrá-)
A RF replica pelo mecanismo de círculo rolante

para produzir DNA de Íita simples linear
(c) Produção contínua

de Íagos M13
% -##
maduros
é natural que haja um
como veículos de clo- DNA circularizado
quando lembramos que
que não bactérias e le-
de clonagem para al-

ros. como o srmtan vb
, de insetos, são aque-
com maior profundi- Partículas maduras do fago
Figura 2.11
O ciclo de inÍecção de M13, mostrando os diÍerentes tipos de replicação do DNA que ocor-
rem. (a) Após a infecção, a molécula de DNA de Íita simples de M13 é convertida na forma
replicativa (RF) de fita dupla. (b) A RF replica para produzir múltiplas cópias de si própria. (c)
Moléculas de Íita simples são sintetizadas por replicação por círculo rolante e utilizadas na
montagem de novas partículas de M13.
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Cnpírulo 3
uma descrição deta-
Dubuque. [Uma boa in- Purificação de DNA a Partir de Células Vivas
Preparação de DNA celular total, 39 Preparação de DNA de bacteriófagos, 55

Preparação de DNA plasmidial, 47
/ A engenharia genética demanda, em diferentes momentos, a preparação de pelo menos três ti-
I pos distintos de DNA. Primeiramente, um DNA celular total, muitas vezes necessário como
\ ura fonte de material a partir do qual são obtidos os genes a serem clonados. O DNA celular
I total pode ser aquele conseguido a partir de uma cultura de células bacterianas, vegetais ou
,l animais ou de qualquer outro tipo de organismo em estudo.
\ O segundo tipo é um DNA plasmidial puro, cuja preparação dá-se a partir de uma cultura
I bacteriana, seguindo as mesmas etapas básicas que a purificação do DNA celular total, com a
I diferença crucial de que, em algum estágio, o DNA plasmidial deve ser separado do compo-
nente principal de DNA cromospômico também presente na célula.
I
\ Finalmente, PNA de fago é breciso se um veículo de clonagem derivado de bacteriófago
for utilizado. DNA de fago é em geral preparado a partir de partículas virais e não a partir de
células infectadas, de modo que inexiste problema associado à contaminação com DNA bac-
teriano. Entretanto, são imprescindíveis técnicas espeliais para a remoção do capsídeo viral.
Uma exceção é a forma replicativa de fita dupla Oe Mt:, a qual éprep arada apartir de célu-
las de E coli, damesma maneira que um plasmídeo bactenanor/
Preparação de DNA celular total

Os fundamentos da preparação de DNA são mais facilmente compreendidos se for considera-
do primeiramente o tipo mais simples de procedimento de purificação, utilizado quando todo
o complemento de DNA de uma célula bacteriana é necessário. As modificações que se im-
põem para a preparação de DNA de plasmídeos e de fagos podem, então, ser descritas mais
tarde.
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e NOJ€d e30 AE TJ ols I q ep 3lr€d 3nb ruã L
G
o
a
40 T. A. Bnowlr
O procedimento paÍa a preparação de DNA total a partir de uma cultura de células bacte-
nitrr
rianas pode ser dividido em quatro estágios (Figura 3.1).
fato
aoì
(1) As células bacterianas são cultivadas e depois recuperadas da cultura e concentradas.
sad
(2) As células são rompidas para liberar seu conteúdo. rl
(3) Este extrato celular é tratado para a remoção de todos os seus componentes, exceto o i
ì indr
DNA. {
) conl
(4) A solução de DNA resultante é concentrada. I
\ extr
lida,
3.1.1 Multiplicação bacteriana em cultura e recuperação trat(
das células cultivadas ade
A maioria das bactérias pode ser multiplicada sem maiores dificuldades em um meio líquido com
(caldo de cultura). O meio de cultura deve prover uma mistura eqirilibrada dos nutrientes es- uma
senciais, ein concentrações que permitirão o desenvolvimento e a divisão eficiente das bacté-
rias. Os dois meios de cultura típicos são detalhados na Tabela 3.1 .
Tab
M9 é um exemplo de meio definido, no qual todos os componentes são conhecidos. Esse
meio contém uma mistura de nutrientes inorgânicos para prover elementos essenciais, como Mei
Mei
1 As bactérias são cultivadas em

2 As células são recuperadas
meio de cultura e recuperadas
do meio e rompidas para gerar
por centriÍugação um extrato celular
-9'íì-
ï-:'t"f
/\fl CentriÍugação
/\
/--:-- \
= ---
(.-:___:J \Extrato celular
Cultura bacteriana
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uma
-R
tt tos. i
tt
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lt ',tl
Ìas/n
sldac
Dfi
\:-r'---DNA puro P
lume
ODNAé O DNA é puriÍicado a Velor
concentrado paÍtir do extrato celular do dr
téria:
pensi
Figura 3.1
As etapas básicas para a preparação de DNA celular total a partir de uma cultura bacteriana.
IE
,ì
in oJSd 330,\ Bï r9lslq ?p alr€d enb ruã IE
L
G
rt
a
Croruncev GÊuce e ANÁLtsE DE DNA 41
de células bacte- nitrogênio, magnésio e cálcio' além de glicose, como fonte

de carbono e energia. Na prática,
fatores de crescimento adicionais, como elementos-traço e vitaminas,
devem ser adicionados
ao M9 para que ele seja capaz de sustentar o desenvolvimento
e concentradas. bacteriano. A definição preci-
sa dos elementos necessários depende da espécie a ser
cultivada.
O segundo meio descrito na Tabela 3.1, o de Luria-Bertani (LB),
exceto o é um pouco diferente, é
.' indefinido ou complexo, o que significa que a identidade e a quuíiaud" precisas
componentes são desconhecidas. Isso ocorre porque dois dos
dos seus
seus ingredientes, a triptona e o
. extrato de levedura, são misturas complexas, de compostos químicos desconhecidos.
Na rea-
lidade, a triptona supre as bactérias com aminoácidoì e pequenos peptídeos,
enquanto o ex_
trato de levedura (uma preparação seca de células ae levèdura puúui-.nt.
alg".iJury *p."
a demanda por iritrogênio, açúcares e nutrientes orgânicos
e inorgânicos. Meios complicados
:nì um meio líquido como o LB não necessitam de suplementação adiciorial e sustentam
o desenvolvimento de
dos nutrientes es- uma ampla gama de espécies bacterianas.
eficiente das bacté-
Tabela 3.1 A composição de dois meios típicos para o cultivo de

çio conhecidos. Esse células bacterianas
os essenciais, como Meio Componente g/l de meio
Meio M9 NarHPO. 6,0
NH2PO4 3,0
NaCl 0,5
NH4Ct 1,0
MgSO, 0,5
Glicose 2,0
CaCl., 0,015
LB (meio de Luria-Bertani) Triptona 10
Extrato de levedura 5
NaCl 10
-(fato celular
Meios definidos devem ser utilizados quando as bactérias

têm de ser cultivadas sob con-
dições precisamente controladas. Isso, contudo, não énecessário
quando as bactérias estão
sendo cultivadas simplesmente como uma fonte de DNA
no u- meio completo é ade_
quado. Em meio LB, a 37"c e.coT proporcionada", por"uro,
agiiaçao a 150 a 250 rpm em
uma plataforma rotatória. células de çraeão
\ coti dividem-se à*oã" o-u u", a cada 20 minu-
tos, até que a cultura atinja uma densidade máxima de"-
aproximadam*,"_k_:-^^l-_d*;r";
las/ml. o aumenro do nú-mero de célul-as na culrura. po$g. ^gr
10nf-tgr+.g.g p_e. l.p_ lpituta .da den_-
.
iooõ
I*,Ëffiï;õôi 'i;ÌËiãüã'r.ãi,póiiln"ur"
DO corresponde a aproximadamente
compripento de onda, uma unidade; de--
:' i
'
0,g x lOe células/ml. '
Pâra aprêtriáfãçãõõe"üffiëitiàtõïelïilái;ãfëïffiilffim esrar concentradas no menor vo-

lume possível. Por isso' as células da cultura são sedimentadas
por centrif'ugação (Figura 3.3).
velocidades de centrifugação moderadas são suficientes para
r"di-"nt- as bactérias no fun-
do de um tubo de centífuga, o que permite que o meio
de cultura seja removido. Assim, bac-
térias oriundas de 1.000 ml de uma cultura càm densidade
celular -á*i-u podem ser ressus-
pensas em um volume de l0 ml ou menos.
cultura bacteriana.
*ú,=
.,
,v
-'r70-red JJOA e{-{ols t q Yp rlred 3nb urã ít
8l
( [f*\ I \t \\ ..\
rl
Clorunceu GÊHtca e ANÁLlsE oe DNA 43
em uma
óptica (DO). (a)

passa luz de um
da cultura é medi-
- -log,o (intensidade
. em um espectro-
a partir de uma
cr.rlturas com densida- Figura 3.3
Sedimentação de bacté-
rias por centrif ugação.
quais a lise celular é causada pela exposição a agentes químicos que afetam a integridade das
baneiras celulares. Os métodos químicos são mais comumente utilizados quando as células
- por sua vez, é envol- bacterianas devem ser liSadas visando à preparação de DNA.
coli, aprópia parede A lise química via de regra envolve um agente que ataca a parede celular e um outro que
Todas essas barreiras rompe a membrana da célula (Figura 3.4a). Os agentes químicos a serem utilizados dependem
da
da espécie de bactéria envolvida. PanE. colí e organismos aparentados, o enfraquecimento
ididas em métodos fí- paredì celular é, em geral, feito com lisozima, tetracetato de etilenodiamina (EDTA) ou uma
nÉtodos químicos, nos iombinação de ambos. A lisozima é uma enzima que está presente na clara do ovo e em secre-
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nas o ots anb strp ual,,
ffiffiï ;ï;1" ;;õ;J;ã ;'ârãrru'urv'of, slruerg'nd
a
44 T. A. Bnowlr
ções como alâgnmae a saliva, sendo capaz de digerir os compostos

poliméricos que conferem A
ngidez à parede celular. O EDTA, por sua vez, remove íons de magnésio essenciais à preserva- ra de
ção da estrutura global do envoltório celular, além de, também, inibir enzimas celulares capa- ácido
zes de degradar DNA. Sob certas condições, o enfraquecimento da parede celular com lisozi- lentat
ma e EDTA é suficiente para romper as células bacterianas, mas, em geral, um detergente, co- cas fi
mo o dodecilsulfato de sódio (SDS), também é adicionado. Detergentes auxiliam no processo lada I
de lise removendo moléculas de lipídeos, o que provoca o rompimento das membranas celula- com l
res.
Depois de as células terem sido lisadas, a etapa final da preparação do extrato é a remoção
dos resíduos celulares insolúveis. Componentes como frações da parede celular parcialmente
digeridas podem ser sedimentados por centrifugação (Figura 3.4b), deixando o extrato celu-
lar como um sobrenadante razoavelmente limpo.
3.1.3 Purificação de DNA a partir de um extrato celular

Além do DNA, um extrato celular bacteriano contém'quantidades significativas de proteínas
e RNA. Para deixar o DNA em uma forma pura, vários procedimentos podem ser utilizados
na remoção desses contaminantes. Figura 3.5
Remoção de
contaminan-
tes protéicos
por eldração
(a) Lise das células com Íenol.
Rompimento da parede celular

Er
com Í
Rompimento da
probk
membrana celular
mas ir
_-_
?---- Extrato cel u la r
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l- ç-- l^ Polip'r
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vidas
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81"4 Conct
(b) CentriÍugação para remoção dos resíduos celulares
Com Í
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I l :l centriÍugação.
l---- I '--
DNA' RNA' ProteÍnas
Or
Na pn
5Jilil:1É' q Nalr
ácidos
Resíduos celulares
tado sr
- celent,
lução i
Figura 3.4 srrreti

Preparação de um extrato celular: (a) lise das células e (b) centrifugação do extrato celular
para remoção de resíduos insolúveis.
LìüE Ior-r4E]rorElC Til[i . :z

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a
CLoruneetr GÊnrcn e AruÁuse oe DNA 45
:,:[iméricos que conferem

A maneira-padrão de desproteinizar um extrato celular é adicionar fenol ou uma mistu-
io essenciais à preserva-
ra de fenol e clorofórmio 1:1. Tais solventes orgânicos precipitam proteínas, mas deixam
: enzimas celulares capa- os
ácidos nucléicos (DNA e RNA) em solução aquosa. Assim, se o eitrato celular é misturado
:e.arede celular com lisozt-
lentamente com o solvente e as fases são separadas por centrifugação, as moléculas protéi-
geral. um detergente, co-
cas ltcam na interface entre as camadas aquosa e orgânica, na forma de uma massa coagu-
l;es auxiliam no processo
lada branca (Figura 3.5). A solução aquosa de ácidos nucléicos pode então ser removida
: rlas membranas celula-
com uma pipeta.
doextratoéaremoção
Ftr:de celular parcialmente
. Jeirando o extrato celu-
Fase aquosa
(DNA + RNA)
lnterface
-.-------------
slsnificativas de proteínas (proteínas
ros podem ser utilizados coaguladas)
Fïgura 3.5
Fenol
Hernoção de
ounüaminan- Extrato celular
hs protéicos Mistura com Separação das Íases
por extração fenol por centrifugação
corn Íenol.
Em alguns extratos celulares, o conteúdo protéico é tão grande que uma única extração
com fenol mostra-se insuficiente para purificar completamente os ácidos nucléicos. Esse
problema poderia ser resolvido pela realização de várias extrações sucessivas com fenol,
mas isso não é desejável, pois cada etapa de mistura e de centrifugação resulta em quebras
____\ nas moléculas de DNA. A solução é, então, tratar o extrato celular com uma protease,
-_ co-
:-_I Extrato celular mo a pronase ou a proteinase K, antes da extração com fenol. Essas enzimas quebram os
,-+ polipeptídeos em unidades menores, as quais são mais facilmente removidas pelo fenol.
Algumas moléculas de RNA, especialmente de RNA-mensageiro (mnNÀ), são remo-
vidas pelo tratamento com fenol, mas a maioria permanece com o DNA na solução aquosa.
A única maneira eficiente de remover o RNA é trataÍ a preparação com a enzima ribonu-
clease, que degrada rapidamente tais moléculas em suas subunidades ribonucleotídicas.
S.1.4 Concentração de amostras de DNA

com freqüência, uma preparação bem-sucedida resulta em uma solução densa de DNA, que
não necessita de qualquer concentração adicional. Entretanto, às vezes, são
obtidas solu-
ções diluídas, sendo, então, importante considerar métodos para o aumento da concentra-
ìNA, proteínas ção do DNA.
O método de concentração utilizado iom mais freqüôncia é a precipitação com etanol.
Na presença de sal (estritamente falando, cátions monovalenter, .o-o os íons de sódio
i [Na-]) e a uma temperatura de -20'C ou menos, o etanol absoluto precipita com eficiência
ácidos nucléicos poliméricos. com uma solução densa de DNA, o etanol pode
I ser deposi_
tado sobre a amostra, provocando a precipitação das moléculas na interfa.ô.
Fes U- truqul ex-
celente consiste em empurrar um bastão de vidro pelo etanol para que ele
mergulhe na so-
I lução de DNA. Quando o bastão é removido, as moléculas de DNA aderem a ele podem
e
ser retiradas da solução na forma de uma longa fibra (Figura 3.6a). Alternativamenre,
lrifugação do extrato celular sã o eta-
G
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LMliãff* mmmJ 5@ì mf ìoçmnIE oP loro e'zpn8e ezarsut Bun rtlo^ "rror "p
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Ios o'ãtrâr{uruv.o:sr:uerg,red nas o ors anb srrp rr"a,,
o
a
46 T. A. Bnowlr
A mul
sar de as r
Figura 3.6 tes em hir
Coleta do DNA por pre- rompirner
Bastão de vidro cipitação com etanol. rianas r-ia
(a) Etanol absoluto é
ta células
depositado sobre uma
de parede
solução concentrada
de DNA do com al
de DNA. As fibras de
DNA podem ser recu- rede celul
peradas com um bas- LÌma r
tão de vidro. (b) Para p@

soluções menos con- nentq!i!
centradas, o etanol é uma ex.tr8
Solução de DNA adicionado (em uma cõm_-d[õi
concentrada proporção de 2,5 volu- tëm qúanì
DNA precipitado
coletado por mes de etanol absolulo não ser su
centriÍugação para 1 volume de solu-
te íìspecto
ção de DNA) e o DNA morìdos
precipitado é coletado 1
por centriÍugação. u*m dc

(CTABt-r
nado a rrrr
nol é misturado com uma solução de DNA diluída, o precipitado pode ser coletado por cen- boidraros-
trifugação (Figura 3.6b) e depois novamente dissolvido em um volume adequado de água. A pois- colet
precipitação com etanol tem a vantagem adicional de deixar cadeias curtas e componentes complero
monoméricos de ácidos nucléicos em solução. Assim, nesse estágio, ribonucleotídeos produ- o RNA po
zidos por tratamento com ribonuclease são perdidos. Um se
sui duas p
3.1.5 Medição da concentração do DNA dissolr,e tr
5er utilizã
É crucial conhecer exatamente quanto do DNA está presente em uma solução quando da exe-
presença (
cução de um experimento de clonagem gênica. Felizmente, a concentração de uma solução de
_ì-8ar. pen
DNA pode ser precisamente medida pela espectrofotometria de absorbância de ultraviole-
químiss5 1
tâ (UV). A quantidade de radiação IfV absorvida por uma solução de DNA é diretamente pro-
lular. mes
porcional à quantidade de DNA na amostra. Via de regra, a absorbância é medida a260 nme,
carìe na cc
nesse comprimento de onda, uma absorbância (Aruo) de 1,0 corresponde a 50 pg de DNA de
lica e é re:
fita dupla por ml.
rnente por
A absorbância de ultravioleta também pode ser utilizada para a verificação da pureza de \-
uma preparação de DNA. Com uma amostra pura de DNA, arazão das absorbâncias a 260 nm
., Euanirlina
moléculas
e a 280 nm (Aruo/Arro) é 1,8. Razões menores que 1,8 indicam que a preparação está contami-
nada com proteínas ou com fenol.
3.1.6 Preparação de DNA celular total de outros organismos t2 Preparaq

que não bactérias
.+prific'a
Bactérias não são os únicos organismos cujo DNA pdde ser necessrírio. DNA celular total de, lal ilg rrma
por exemplo, plantas ou animais pode ser fundamental se o objetivo do projeto de engenharia líquido- x
genética for a clonagem de genes de tais organismos. Embora as etapas básicas da purificação cnraro é d
de DNA sejam as mesmas para qualquer organismo, a introdução de algumas modificações piÍação c-o
pode ser exigida em decomência das características especiais das células que estão sendo uti- qídeos e a
lizadas.
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a
Cr-oruncev GÊrurcn e ANÁLrsE DE DNA 47
A multiplicação das células em meio líquido pode, muitas vezes, não ser adequada, ape-
sar de as culturas de células vegetais e animais estarem se tornando cadavez mais importan-
3.6 Ìes em biologia. Entretanto, as principais modificações são, em geral, exigidas na etapa de
do DNA por pre- nompimento das células. Os agentes químicos utilizados para o rompimento de células bacte-
com etanol.
rianas via de regra não funcionam com outros organismos: a lisozima, por exemplo, não afe-
absoluto é
ta células vegetais. Há enzimas degradantes específicas disponíveis para a maioria dos tipos
sobre uma
de parede celular, mas, muitas vezes, técnicas físicas, como a trituração do material congela-
As Íibras de do com almofariz e gral, são mais eficientes. Células animais, por sua vez, r,áo possuem pa-
IïtA podem ser recu- rede celular e podem ser lisadas por um simples tratamento com detergente.
:eradas com um bas- Uma outra consideração impgrt4nte diz respeito ao conteúdo bioquímico das células a
5o de vidro. (b) Para partiidãs qqAiq_q PNe gs!4 $endo _extraído. Na maioria das bactérias, os principais compo-
soluções menos con- q911e9 b-!og{mi,c-g-q p_{e_sgllgq ell,um extrato celular são pqot_9in4q, DNA e RNA, de modo que
:entradas, o etanol é uma extração com fenol e/ou um tratamento com protease, qe€_ullo pql3,Igfnoç{o_ {o RNA
:dicionado (em uma com rlbonüõléadõarõãüãïmãmostra d;DNCp*". E tr"t-t"J" tu*té-.õn-
:rcporção de 2,5 volu- ^ "él"l'
têm quantidaaeísìÉíìfiiãtliãi-tie õúïioJ"óãmpõtèntãs bioquímicos, esses tratamentos podem
-es de etanol absoluto não ser suficientes para liberar DNA puro. Tecidos vegetais são particularmente difíceis nes-
:ara 1 volume de solu-
re aspecto, pois mg-ip.9*y9_ze_s_g59it9{q1_g-rqndgs ggantidqdes de carboidratos, que não são re-
:áo de DNA) e o DNA
movidos por qx-trgç{g deve ser utilizada.
:recipitado é coletado -c_gq.le_19!_P*ol-t!p-o.933*4b-oldggem $jerryti,va
:,:,r centriÍugação. Um dos métodos disponíveis usa um detergente chamado brometo de cetiltrimetilamônio
{CTAB), que forma um complexo insolúvel com ácidos nucléicos. Quando o CTAB é adicio-
nado a um extrato celular vegetal, o complexo ácido nucléico-CTAB precipita, deixando car-
:er coletado por cen- boidratos, proteínas e outros contaminantes no sobrenadante (Figura 3.7). O precipitado é,de-
adequado de água. A pois. coletado por centrifugação e ressuspenso em NaCl (cloreto de sódio) lM, que desfaz o
:'Jrtas e componentes complexo. Os ácidos nucléicos podem então ser concentrados por precipitação com etanol e
r :n:,nucleotídeos produ- o RNA pode ser removido por tratamento com ribonuclease.
Um segundo método envolve um composto denominado tiocianato de guanidina, que pos-
sui duas propriedades que o tornam útil para a purificação de DNA. Primeiro, ele desnafura e
dissolve todos os compostos bioquímicos que não são ácidos nucléicos, podendo, portanto,
ser utilizado para liberar DNA de virtualmente qualquer tipo de tecido. Em segundo lugar, na
i{tú.icão quando da exe-
presença de tiocianâto de guanidina, o DNA liga-se fortemente a partículas de sílica (Figura
r de uma solução de
-1.$s). permitindo que o DNA seja facilmente recuperado da mistura de outros compostos bio-
de ultraviole-
químicos desnaturados. Uma das possibilidades é a adição de sílica diretamente ao extrato ce-
'\Â é diretamente pro-
lular. mas é mais conveniente que seja utilizada uma coluna cromatográfica. A sflica é colo-
;i' s :úedida a 260 nm e,
cada na coluna e o extrato celular, então, adicionado a ela (Figura 3.8b). O DNA liga-se à sí-
-t 50 pg de DNA de
lica e é retido na coluna, enquanto os compostos bioquímicos desnaturados passam direta-
a:ação da pureza de mente por ela. Depois da lavagem dos últimos contaminantes com a solução de tiocianato de"ì
ubs.rrbâncias a 260 nm . _suanidina, o DNA é recuperado pela adição de água, que desestabiliza as interações entre as -
moléculas de DNA e a sílica.
;ão está contami-
3-2 Preparação de DNA plasmidial

,\ purificação de plasmídeos a partirde uma cultura bacteriana envolve a mesma estratégia ge-
lN-{ celular total de, ral de uma preparação de DNA total. As células contendo plasmídeos são cultivadas em meio
rrüeto de engenharia líquido, sedimentadas por centrifugação e rompidas para a preparação do extrato celular. O
rr',,usicas da purifi cação -rtrato é desproteinizado, o RNA removido e o DNA provavelmente concentrado por preci-
"!lLt FúÍnas modifi caçõe s pitação com etanol. Entretanto, existe uma importante distinção entre a purificação de plas-
,JÌre estão sendo uti- mídeos e a de DNA celular total. Em uma preparação de plasmídeos é sempre necessário se-
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a
48 T. A. Bnowlr
CTAB
\Complexo ácido
Extrato celular
Complexo ácido
nucléico-CTAB precipitado
Precipitação
DNA puro i?[,itli'3;", <--
ribonuclease
Figura 3.7
O método do CïAB para puriÍicação de DNA de vegetais.
parÍÌr o DNA plasmidial da grande quantidade de DNA cromossômico bacteriano que também
está presente nas células.
,\ A separação de ambos os tipos de DNA pode ser bastante difícil, embora essencial se os
t.',
\ì
plasmídeos serão utilizados como veículos de clonagem. Mesmo a presença de quantidades
.. r:
mínimas de DNA bacteriano contaminante em um experimento de clonagem pode levar a re-
o,l.
sultados indesejáveis. Felizmente, há vários métodos disponíveis para a remoção de DNA
,\"
bacteriano durante a purificação de plasmídeos e o uso dos citados métodos, individualmente
"J ou combinados, pode resultar no isolamento de DNA plasmidial bastante puro.
"ï:,'\ , z
3'\\':' I Os métodos são báseados nas várias diferenças físicas existentes entre o DNA plasmidial
"t
r-l e o bacteriano, sendo a mais óbvia o tamanho. Os maiores plasmídeos possuem apenas 87o do
tamanho do cromossomo de E coli e amaiona deles é muito menor do que isso. Técnicas ca-
í-ì pazes de separar moléculas de DNA pequenas de rÌroléculas de DNA grandes deveriam, por-
l! tanto, ser capazes de purificar plasmídeos eficientemente. Figur
\
Além de diferirem no tamanho, plasmídeos e DNA bacteriano também diferem quanto à Purifir
sua conformação. Quando aplicado a um polímero, como o DNA, o termo conformação re- tiociar
fere-se à configuração espacial total da molécula, com as duas conformações mais simples coluni
sendo a linear e a circular. Os plasmídeos e o cromossomo bacteriano são circulares, mas, du-
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a
Clorunceu GÊNrcA E ANÁLrsE oe DNA 49
(a) Ligação do DNA a partículas de sílica
/r-:x @-'t=
Partículas de sílica -'@ .@' Moléculas de DNA
\6\y
\
@
(b) Purificação de DNA por coluna de cromatograÍia
Extrato celular
+ffi
Partículas
Agua
de sílica
W} w ô
ìul
bacteriano que também
difícil, embora essencial se os

l,l
H
a presença de quantidades
de clonagem pode levar a re-
is para a remoção de DNA
métodos. individualmente
bastante puro.
entre o DNA plasmidial
Compostos
bioquímicos
desnaturados
-_ ti-"i-.-/
\:-7 H DNA
possuem apenas 87o do
do que isso. Técnicas ca- Descarte
DNA grandes deveriam, por- i
Figura 3.8
também diferem quanto à Purificação de DNA pelo método do tiocianato de guanidina e da sílica. (a) Na presença do
A, o termo conformação re- tiocianato de guanidina, o DNA liga-se a partículas de sílica. (b) O DNA é puriÍicado em uma
conformações mais simples ooluna crornatográf ica.
no são circulares, mas, du-
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o
a
50 T. A. Bnowrrr
rante a preparação do extrato celular, o cromossomo é sempre quebrado e gera fragmentos

li- :Ìe. Bm r,l
neares. Um método para separação de moléculas circulares de lineares resultará, pãr1anto,
em 1rÌ{ ilir FlÌ
plasmídeos puros. Ê:1i{
;ttl"'t ,Ufittr
3.2.1 Separação com base no tamanho Slll:. ruLl

-ïii,ufillt üf
Em geral, o fracionamento por tamanho é executado no estágio de preparação do extrato
ce- illlutllf iltfi ültff'lìto:
lular. Se as células são lisadas sob condições cuidadosamente controladìs, ocorre apenas uma
-.rmmu
quantidade mínima de quebra do DNA cromossômico. Os fragmentos de DNA resultantes ìr
são ;lr &ú,fuS]!Ì
ainda muito grandes - muito maiores que os plasmídeos e podem ser removidos, juntamen-
- llJ{l tÌIuÍxlLijul
te com os resíduos celulares, por centrifugação. Esse processo é também facilitado pelo fato ,*,tt!tLf:*ringr,ffro
de que o cromossomo bacteriano está fisicamente fixado ao envoltório celular, de modo que r,lii!ffiiirf,$ úe
os fragmentos cromossômicos sedimentam com os resíduos celulares se essa interação nãã
é
rompida. t,e e SWtç
O rompimento das células deve, portanto, ser executado de maneira bastante branda para
4rìilfü$
impedir a quebra generalizada do DNA bacteriano. Paru E. coli e espécies aparentadas a ela. Ítrüt
tllf tiitmliÌ Írìrìriïìtú

a lise controlada é executada conforme mostiado na Figura 3.9. o tratamento com EDTA
e li-
ihdldurmuln
sozima é feito na presença de sacarose, o que impede que as células rompam-se imediatamen-
foruülurrrnur, i&f
,ufu'nmam"dUr
uClLir:q,:tliiu uLlm
tuCiüuu
'üllhf
Cromossomo bacteriano EsÍeroplasto ;p'lirlt,tu1Nrmrirdurur
11|tiì(rrÌtìElI]jlflEl!1tlü,
if,
'Itrìrìilül,iitlr ìüutÌüt[
Lisozima
-llnnlllürr,lll4n|l,
+ EDTA
...........................".............'...* mtnrmmrudii td
Sacarose 25% rÜrt;|íltr 4l:
Plasmídeos
Membrana .'/
celular intacta
Parede celular
rompida
I
I rriton x-t oo
t
lmìtttittüuttllr, lnffi rrïfl ttilttumÌ"ìrìfiMiliüm'
ìo
I
Plasmídeos
o2 ab
\ ^,. llüllür riiilrÌrlllíffiirriiÌìllMll i$MnülilïlrM -
/-
Lisado
clariÍicado
+-
CentriÍugação
IV
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.^ /' '
i ilÌllüiillilü
o-\
'ütflÌn1Imdirxtrudllui
Grandes uulÍÍÍtlü,fl 1 tttjümr uLl
fragmentos Extrato celular

de DNA Figura 3.9 nur| utl[, r||l{ulutü
Resíduos celulares
Preparação lütrr unmnr llirrltttluru
de um lisado
clarificado. Dlrl
{trr illlntnluttu,,idlffulìir
rrtttrrrrnt{ttttu * dim*rnn
\-_ :; r::-.1
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rrpuêr'âlÍll ollluq un r $u'croJ eÌ opuq rrqir:q apod 1os o anb rrp ua1'Ãorrii1"*o.,
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oe5enunuo: e a a:olànb:o4 G
F-rç : fLì--a qT! uf .opunlu op lornu e,epn-Br ezetsrJt €un ?tlo^ g.zeSsap :s rapur anb o opnl anb "p
lw,;: :: I -EDuêsn? Ens e EloÌ]] op?q€s op orluaÌrs o ,êlâp âruou o zÌp €troj ?Ì
erp uâJ.of,ernq un ?nl e,rãap rt
Ìos o,ãlãqu?uv.of,st:ue:g,rrd nes o ors :nb srrp rraa,,
a
CLorunoev GÊNrcA E ANÁLrsE oe DNA 51
r quebrado e gera fragmentos li-

te. Em vez disso, são formados esferoplastos, células com paredes celulares parcialmente de-
: Lineares resultará, portanto, em gradadas, que retêm uma membrana citoplasmáticaintacta. A lise celular é, então, induzida
pela adição de um detergente não-iônico, como o Triton X-100 (detergentes iônicos, como o
SDS, causam quebras cromossômicas). Esse método provoca poucas quebras no DNA bacte-
riano, de modo que a centrifugação resulta em um lisado clariÍicado, consistindo quase que
;io de preparação do extrato ce- inteiramente em DNA plasmidial.
controladas, ocoÍïe apenas uma Contudo, um lisado clarificado ainda conterá, invariavelmente, algum DNA cromossômi-
lmentos de DNA resultantes são co. Ademais, se os próprios plasmídeos são moléculas grandes, eles também podem sedimen-
Ddem ser removidos, juntamen- tar juntamente com os resíduos celulares. Assim, o fracionamento por tamanho raramente é
n é também facilitado pelo fato suficiente por si só, devendo-se considerar modos alternativos para a remoção dos contami-
rur oÌtório celulaq de modo que nantes de DNA bacteriano.
clulares se essa interação não é
\22 Separação com base na conÍormação
b maneira bastante branda para Antes de se considerar como as diferenças conformacionais entre plasmídeos e DNA bacte-
fr e espécies aparentadas a ela, riano podem ser utilizadas para separar os dois tipos de DNA, deve ser analisada mais deta-
O tratamento com EDTA e li- thadamente a estrutura geral do DNA plasmidial. Não é estritamente correto dizer que plas-
- a-r rompam-se imediatamen-
mídeos têm conformação circular, pois círculos de DNA de fita dupla podem, na realidade,
adotar duas configurações alternativas bastante distintas. A maioria dos plasmídeos existe na
célula como moléculas superenroladas (Figura 3.10a). O superenrolamento ocoÍre porque a
hélice dupla do DNA plasmidial é parcialmente desenrolada durante o processo de replicação
plasmidial por enzimas chamadas de topoisomerases (p. 70). A conformação superenrolada
somente pode ser mantida se ambas as fitas polinucleotídicas estiverem intactas, daí o nome
mais técnico de DNA circular covalentemente fechado (ccc, do inglês covalently closed-
circular). Se uma das fitas polinucleotídicas é quebrada, a hélice dupla retorna ao seu estado
normal relaxado e o plasmídeo adota a sua conformação alternativa, denominada de circular
aberta (oc, do inglèsopen-circular) (Figura 3.10b).
- Corte
Figura 3.10
lMurms conformações de DNA de Íita dupla circular:
lmlt srnerenrolado - ambas as Íitas estão intactas;
'Ìh l roular aberto - uma ou ambas as fitas pos- (a) Superenrolado (b) Circular aberto
suem uma quebra.
O superenrolamento é importante na preparação de plasmídeos porque moléculas supe-

renroladas podem ser facilmente separadas de DNA não-superenrolado. Dois métodos dife-
rentes são comumente utilizados, os quais têm capacidade de purificar DNA plasmidial a par-
Figura 3.9 tir de extratos celulares brufos, embora, napráÍica, sejam obtidos resultados melhores quan-
Preparação do um lisado clarificado é primeiramente preparado.
de um lisado
clarificado. Desnaturação alcalina
A base dessa técnica é a existência de uma estreita faixa de pH na qual DNA não-superenro-
lado é desnaturado, enquanto plasmídeos superenrolados não o são. Se, com a adição de hi-
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a
52 T.A.Bnowru
dróxido de sódio a um extrato celular ou a um lisado clarificado, o pH é ajustado para l2,O a cula form
12,5, aspontes de hidrogênio do DNA não-superenrolado são rompidas, o que causa o desen- de de flun
rolamento da hélice dupla e a separação das duas cadeias polinucleotídicas (Figura 3.1 1). Se, de a densr
depois disso, é adicionado ácido, essas fitas de DNA bacteriano desnaturado reagregam-se em de flutuaq
uma massa desorganizada. A rede insolúvel formada pode, então, ser sedimentada por centri- forma um
fugação, deixando o DNA plasmidial puro no sobrenadante. sidade po
ao tratâm
Adem
(EtBr) pc
O bromet
?
5V
DNA linear
4z-
-+-
centes. pr
mento res
/ :ffi\
*ïr" near. O D
/ PIasmídeos
suPerenrolados
-
pH 12,0
a 12,5
-t{3 DNA linear de

de desenr
da densid
apenas a
formam u
i
fita simples pondente

A cen
,,0 método u
io, cado é sul
separado
RNA pru
Centrifugação s9 o tubo
/a
i
plasmidia
ã do dotub
Plasmídeos q3 bq
\
Figura 3-í
PuriÍicação de
1
DNApla
- \ó gura 3.14
superenrolados Sedimento de
sde
de DNA linear r plasmídeos pelo
método de des- tá pronto
DNA linear
naturação alca-
lina.
Uma vantagem adicional desse procedimento é que, sob certas circunstâncias (especifica-
mente, lise celular por SDS e neutralização com acetato de sódio), a maioria das proteínas e
do RNA também se torna insolúvel e pode ser removida pela etapa de centrifugação. A extra-
ção com fenol e o tratamento com ribonuclease podem, portanto, não ser
necessários se o mé-
todo de desnaturação alcalina é utilizado.
CentriÍugação em gradiente de densidade de brometo de

etídeo-cloreto de césio
Essa é uma versão especializada da técnica mais geral de equilíbrio ou centrifugação em
gradiente de densidade. Um gradiente de densidade é produzido pela centrifugação de
uma solução de cloreto de césio (CsCl) a uma velÒcidade muito elevada (Figura 3.12a). O
gradiente é formado porque a força centrífuga elevada puxa os íons de césio e de cloreto em CentriÍugação em,
direção ao fundo do tubo. A migração dos íons no tubo é contrabalançada por difusão, de dade de cloreto ú
modo a levar ao estabelecimento de um gradiente, com as maiores densidades de CsCl em diente de densidac
direção ao fundo. do por centriÍuga@r
Macromoléculas presentes na solução de CsCl quando ela é centrifugada formam bandas (b) Separação d
em pontos distintos do gradiente (Figura 3.12b). O ponto exato onde uma determinada molé- RNA em um gradi
B "Tèmdiasquesãooseupai,Francisco.Âmanhece,osoliáforadizonomedele,osilênciodosábadochoraasuaausência.Ederepentetudooqueera
rt alegria viraìm buraco.Tem dia que tudo o que andei se desfaz.E volta umâ tristeza aguda, a maior do mundo.Em dias como esses,só você faz sentido,
Poique você é a continuação da nossa história.Tem dia que o sol pode brilhar Lindo lá fora,mas é um brilho triste.Tem dia que nem chove,mas é dia de
Ir
t Â nrãc esi:reve para r: iìlho sobrc o pai qur' elr'não tele tentpo par;r corirecer'
!r
II
I
(
o
z
=çq
o para Francisco, I AII-X Ediro.a
I
Cloruneeu GÊr,rrca E ANÁLtsE oe DNA 53
lo. o pH é ajustado para 12,0 a cula forma uma banda depende da sua densidade de flutuação; o DNA possui uma densida-
ompidas, o que causa o desen- de de flutuação de aproximadamente r,7 glcm3 e, portanto, migra até o ponto do gradiente
on-
ucleotídicas (Figura 3.11). Se, de a densidade do cscl é de l,i g/cm3. As moléculas protéicãs, po, ,uu vez,
tê,mdensidades
,
desnaturado reagregam-se em de flutuação muito mais baixas e, por isso, flutuam no topo do gradiente, enquanto o RNA
io. ser sedimentada por centri- forma um sedimento no fundo do tubo (Figura 312b).4 centrifugação em gradientes de den-
sidade pode, pois, separar DNA, RNA e proteínas e é uma alternativa à extração com fenol
e
ao tratamento com ribonuclease para a purificação de DNA.
Ademais, a centrifugação em gradientes de densidade na presença de brometo de etídeo
(EtBr) pode ser utilizadapwa separar DNA superenrolado de moléculas não-superenroladas.
O brometo de etídeo liga-se a moléculas de DNA intercalando-se entre pares de bases adja-
centes, provocando um desenrolamento parcial da hélice dupla (Figura 3.13). Esse desenrola-
mento resulta em um decréscimo na densidade de flutuação de até0,125 glcm3 paraDNA li-
near. O DNA superenrolado, por sua vez, por não ter extremidades livres, tem uma liberdade
de desenrolamento muito restrita e liga-se a uma quantidade limitada de EtBr. O decréscimo
da densidade de flutuação de uma molécula superenrolada é, assim, muito menor, chegando
apenas a aproximadamente 0,085 g/cm3. Em conseqüência disso, moléculas superenroladas
formam uma banda em um gradiente de EtBr-CsCl em uma posição diferente daquela coÍïes-
pondente a DNA linear e circular aberto (Figura3.l4a).
A centrifugação em um gradiente de densidade de brometo de etídeo-cloreto de césio é um
método muito eficiente para a obtenção de DNA plasmidial puro.
Quando um lisado clarifi-
cado é submetido a esse procedimento, os plasmídeos formam bandas em um ponto distinto,
separado do DNA bacteriano linear, com as proteínas flutuando no topo do graãiente e com
o
RNA precipitado no fundo. A posição das bandas de DNA pode ser visualizada iluminando-
se o tubo com radiação ultravioleta, que faz com que o EtBr ligado ao DNA
fluoresça. o DNA
plasmidial puro é removido por aspiração, utilizando-se uma seringa cuja agulha perfura o la-
do do tubo na altura correspondente à amosúa a ser coletada (Figura :.i+U;. O EtBr ligado
Figura 3.11 ao
PuriÍicação de DNA plasmidial é extraído com n-butanol (Figura 3.14c) e o CsCl, removido por diálise (Fi-
plasmídeos pelo gura 3.14d). A preparação plasmidial resultante é praticamente IOOVo pura e o plasmídeo
es-
método de des- tá pronto para ser utilizado como um veículo de clonagem
naturação alca-
lina.
Proteína
rtas circunstâncias (especifi ca-
dio). a maioria das proteínas e
hpa de centrifugação. A extra- 1,60
o. não ser necessários se o mé-
6-
c
è 1,65
e brometo de Aumento da õ
concentração $o t,zo
de CsCI
o
o
uilíbrio ou centrifugação em
E
Ì, t.zs <_ DNA
duzido pela centrifugação de 'õ
c
úto elevada (Figura 3.I2a). O
s íons de césio e de cloreto em Figura 3.12 oo 1,80
Oenhifugação em gradiente de densi-
ntrabalançada por difusão, de
@de de cloreto de césio. (a) Um gra-
riores densidades de CsCl em ,diemte de densidade de CsCl produzi-
RNA
,üu por centrifugação a alta velocidade.
é centrifugada formam bandas (a) (b)
rib) Separação de proteínas, DNA e
r onde uma determinada molé- Hfi,lA em um gradiente de densidade.
B "Temdiasquesãooseupai,Francisco.Âmanhece,osolláforadizonomedele,osilênciodosábadochoraasuaausência.Ederepentetudooqueera
o
lr
alegria vira um buraco.Tem dia que tudo o que andei se desfaz. E voltâ umâ tristeza âguda, a maior do mundo.Em dias como esses, só você lz senrido.
Porque você é a continuação da nossa história.Tèm dia que o sol pode brilhar lindo 1á fora,mas é um brilho triste.Tèm dia que nem chove,mas é dia de
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Â :lic escri:r.c p:rn o úlho sohrc o 1::ì qur clr'nào teve lclrrpc p:rr i:r:lltlcrl.
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Francisr:o. AÌÌX Editur.,
54 T.A.Bnowru
Estrutura química do
brometo de etídeo
Molécula de
EtBr intercalada
)s,+ Â
Figura 3.13
EtBr Desenrolamento par-
+
cial da hélice dupla do
DNA por intercalação
3,4 A de EtBr entre pares
Arcabouço de bases adjacentes.
de açúcar-ÍosÍato >3,4 Â
Par de bases A molécula de DNA
normal, mostrada à
esquerda, é parcial-
mente desenrolada
ao incorporar quatro
ftgnl
Hélice dupla murnftrna@e0
de DNA normal moléculas de EtBr, re-
ffihrmriffilp,or
sultando na estrutura ilümMosnmngnd
"esticada", à direita. ü|uffiffi
ffir.@
3.2.3 Amplificação de plasmídeos

A preparação de DNA plasmidial pode ser dificultada pelo fato de que os plasmídeos repre-
sentam apenas uma pequena porção do DNA total de uma célula bacteriana. O rendimento de
tI Plqnr
uma preparação de DNA plasmidial a partir de uma cultura bacteriana pode, portanto, ser de- Aüfro
cepcionantemente baixo. A amplificação plasmidial é uma das maneiras de aumentar esse
rendimento.
Mu
ffir(@
A amplificação tem por objetivo aumentar o número de cópias de um plasmídeo. Alguns t'
plasmídeos multicópia (aqueles com um número de cópias de 20 ou mais) guardam a pro-
priedade útil de serem capíves de replicar na ausência de sínteseprotéica. Isso contrasta com
o cromossomo bacteriano principal, que é incapaz de replicar sob tais condições. Essa pro-
priedade pode ser utilizada durante a multiplicação das bactérias em cultura para purificação
de DNA plasmidial. Depois que uma densidade celular satisfatória foi atingida, um inibidor
de síntese protéica (por exemplo, cloranfenicol) é acücionado à cultura, que, por sua vez, é en-
tão incubada adicionalmente por mais 12 horas. Durante esse período, as moléculas do plas-
mídeo continuam a replicar, apesar da replicação cromossômica e da divisão celular terem si-
do bloqueadas (Figura 3.15). O resultado é que um número de cópias de plasmídeo de vários
milhares pode ser atingido. A amplificação é, pois, um meio muito eficiente de aumentar o ffiem
rendimento de preparações de plasmídeos multicópia.
ffi
B "Tèmdiasquesãooseupai,Francisco.Amanhece,osolláforadizonomedele,osilênciodosábadochoraasuaausência.Ederepentetudooqueera
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alegria vira um buraco.Tem dia que tudo o que andei se desfaz.E voltâ uma trìsteza âguda, a maior do mundo.Em dias como esses, só você faz sentido.
Porque você é a continuação da nossa história.Tèm dia que o sol pode brilhar lindo 1á fora,mas é um brilho triste.Tèm dia que nem chove,ms é dia de
rt choro. Mas tem sempre um outro dia, Íìlho. Foi você quem me ensinou isso." Quenclo tiìtr irrl dos pcrsonâgcnr lìriNril3ìs. cono c<>lrinua l hrrrórir:
o Â rrãe escrer.c p:tra o fìlho sobrc o pai qrie cÌe nâo tcvc terrrpo prrr conhei:er.
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Cr-ounceu GÊNrcA E AruÁuse oE DNA 55
Proteínas
DNA linear
eoc ---_*
---------------{>
DNA ._l Remoção do DNA
superenrolado superenrolado
com uma seringa
RNA
(a) Um gradiente de (b) Remoção da banda de DNA

Figura 3.13 densidade de EtBr-CsGl
Desenrolamento par- , Mistura com n-butanol e
cial da hélice dupla do I agitação, repouso para
DNA por intercalação V separação das Íases
de EtBr entre pares
de bases adjacentes. Tampão
Solução EtBr na Íase
A molécula de DNA
de DNA orgânica
normal, mostrada à
em tubo
+ -
esquerda, é parcial-
de diálise
mente desenrolada Figura 3.14 DNA na Íase
ao incorporar quatro Furificação de DNA Difusão do para o tampão aquosa
moléculas de EtBr, re- qmrncmidial por centri-
sultando na estrutura ffiuqação em gradien- (d) Remoção do CsCl (c) Extração do EtBr
por diálise com rFbutanol
"esticada", à direita. h de densidade de
EtBr-CsCl.
p de que os plasmídeos repre- til Preparação de DNA de bacterióÍagos

! bacteriana. O rendimento de
p;*u pode. portanto. ser de- A diferença fundamental entre a purificação de DNA de fagos e preparações de DNA celular
maneiras de aumentar esse total ou DNA plasmidial ó que, para fagos, o material de partida normalmente não é um ex-
las
Ì trato celular. Isso ocorre porque as partículas de bacteriófagos podem ser obtidas em grande
plasmídeo. Alguns número a partir do meio extracelular de uma cultura bacteriana infectada. Quando uma des-
fpias de um
20 ou mais) guardam a pro-
lb
p protéica. Isso contrasta com
rsob tais condições. Essa pro-
em cultura para purificação
íria foi atingida, um inibidor o (À o %3.3s-
fculrura, que, por sua vez, é en- o oílòì o o
---------------- ooXo-c
íodo, as moléculas do plas-
e da divisãocelular terem si-
?ítt)\t " o lncubação na
presença de
cloranÍenicol
ta!-JY /
cópias de plasmídeo de viírios

muito eficiente de aumentar o
Íï$Ía 3.15 Plasmídeos mulÌicópia DNA Plasmídeos presentes em um
,ffiffifha@o de (número de cópias de 20+) bacteriano número de cópias de 1.000++
Mbsmídeos.
B "Tem dias que são o seu pai, Francisco.Amanhece, o sol lá fora diz o nome dele, o silêncio do sábado chora a sua ausência.E de repente tudo o que era
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alegria vira um buraco.Tèm dia que tudo o que andei se desfaz.E volta uma tristeza aguda, a maior do mundo. Em dias como esses, só você faz sentido.
Porque você é a continuâção dâ nossa história.Tèm dia que o sol pode brilharLindo lá fora,mas é um brilho triste.Tèm dia que nem chove,mas é dia de
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II
(
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o
56 T. A. Bnowrrr
sas culturas é centrifugada, as bactérias são sedimentadas, deixando as partículas de fago em grad(
suspensão (Figura 3.16). As partículas de fago são então coletadas da suspensão e o seu DNA mudi
é extraído por uma simples etapa de desproteinização para remoção do capsídeo viral. N
Esse processo geral é bem mais direto que o procedimento utilizado para preparar DNA rer. P
celular total ou plasmidial. Apesar disso, uma purificação bem-sucedida de quantidades sig- de- er
nificativas de DNA de fago está sujeita a diversos percalços. A principal difìculdade, especial- a pro
mente com ì,, é a multiplicaçáo de células infectadas em cultura de uma maneira tal que o tí-
tulo de fagos extracelulares (o número de partículas de fago por ml de cultura) seja suficien-
temente alto. Em termos práticos, o título máximo que pode ser razoavelmente esperado para
l, é de 1010 por ml; ainda assim, 1010 partículas de ), renderão somente 500 ng de DNA. Gran-
des volumes de cultura, na faixa de 500 a 1.000 ml, são, portanto, necessários se quantidades
substanciais de DNA de l, devem ser obtidas.
3.3.1 Cultivos bacterianos visando à obtenção de altos títulos de l,

Não há problemas maiores em cultivar bactérias em grandes volumes (culturas bacterianas de
50 ú ou mais são comuns em biotecnologia), mas a obtenção de um título máximo de fagos re-
quer certas habilidades. O fago l" que ocorre naturalmente é lisogênico (p. 31) e uma cultura in-
fectada consiste principalmente em células portadoras do profago integrado no DNA bacteria-
no (Figura 2.7). O título de À exffacelular é extremamente baixo sob tais circunstâncias.
Para a obtenção de um alto rendimento de l, extracelular, a cultura deve ser induzida, a fim
de que todas as bactérias entrem na fase lítica do ciclo de infecção, o que resulta na moÍe celu-
lar e na liberação de partículas de 1, no meio. O controle da indução é, normalmente, muito difi-
cil, mas a maioria das linhagens de À de laboratório é portadora de uma mutação termossensí-
vel (ts) no gene cI, o qual é um dos responsáveis pela manutenção do fago no seu estado inte-
\-r. a\
^?? Cultura inÍectada
??O|ç(bactérias+
q,t a^'' fagos extracelulares)
it
-
? ç ç?.
?.trt,?i suspensão de Íagos I
,? ? ? lffir@,üu
Figura 3.16 rtffi,düb",Ntr'üt
- Preparação de uma suspensão ffiM
S S"Oir"r,to de bactérias de Íagos a partir de uma cultura
de bactérias infectadas.
E "Temdiasquesãooseupai,Francisco.Amanhece,osolláforadizonomedele,osilênciodosábadochoraasuaausência.Ederepentetudooqueera
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g A ntãc escrcve plrr o filho sobre o pri que eÌe não telc rcrrpo par:r conhecer.
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Cr-orunoeu GÊt'ttcn r ANÁLtsE oe DNA 57
rando as partículas de fago em grado. Se inativado por uma mutação, o gene cI não funciona mais corretamente, o que leva a
das da suspensão e o seu DNA mudança para a fase lítica do ciclo de infecção.
noção do capsídeo viral. Na mutação clls, o gene cI é funcional a 30oC, temperatura na qual a lisogenia pode ocor-
o utilizado para preparar DNA rer. Porém, a 42"C, o produto do gene clls não funciona adequadamente e a lisogenia não po-
n-sucedida de quantidades sig- de, então, ser mantida. Uma cultura de E. coli infectada com l, clls pode, assim, ser induzida
principal dificuldade, especial- a produzir fagos extracelulares pela transferência de 30"c para 42"c (Figura3.l1).
ra de uma maneira tal que o tí-
or ml de cultura) seja suficien-
r razoavelmente esperado para
Dmente 500 ng de DNA. Gran-
nto. necessários se quantidades
Profago ì.
altos títulos de ?r,
olumes (culturas bacterianas de 30.c

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e um ítulo máximo de fagos re- Sem indução
rgênico (p. 31) e uma cultura in-
rgo integrado no DNA bacteria-
o sob tais circunstâncias.
cultura deve ser induzida, a fim
po, o que resulta na morte celu-
ryão é, normalmente, muito difi-
rde uma mutação termossensí-
nção do fago no seu estado inte- 1",..
lndução
Genoma de À liberado
r-i."
I ""tut",
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+
(
\.-a^,r
Figura 3.17 \
ffi4ao de um lisógeno Novas partículas de fago l,
3.16 ü tu düs por transÍerência
de 30'C Para42'C.
ção de uma suspensão
s a partir de uma cultura
érias inÍectadas.
B "Têmdiasquesãooseupai,Francìsco.Amanhece,osolláforadizonomedele,osilênciodosábadochoraasuaausência.Ederepentetudooqueera
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58 T. A. Bnowr.r
3.3.2 Preparação de fago ?r, não-lisogênico t,33 Coleta de

Embora a maioria das linhagens de À seja lisogênica, muitos vetores de clonagem derivados Os resnm&
desse fago são modificados, por deleções de cI e de outros genes, a fim de que a lisogeniaja- intactal por
mais ocorra. Tais fagos são incapazes de se integrarem no genoma bacteriano e podem infec- l,asòfagor
tar células apenas pelo ciclo lítico (p. 31). pra5 mlu
Com esses fagos, a chave para a obtenção de um alto título reside na maneira pela qual as Aspütí
células são cultivadas, sendo sobremaneira importante o estágio no qual as células são infec- wlaidadcs
tadas pela adição de partículas virais. Se os fagos são adicionados antes de as células estarem porunc
se dividindo na velocidade máxima, todas elas são lisadas rapidamente, resultando em um dE sal úiltr
baixo título (Figura 3.18a). Por outro lado, se os fagos são adicionados quando a densidade de fuup
celular é muito alta, então a cultura jamais será completamente lisada e, novamente, o título sotl"idoenr
de fago será baixo (Figura 3.18b). A situação ideal é quando o estágio da cultura e o tamanho
do inóculo do fago são equilibrados de modo que as células continuem a multiplicar-se, mas tg./l nrmcaçE
que todas elas acabem sendo infectadas e lisadas (Figura 3.18c). Como pode ser imaginado, Aespui
habilidade e experiência são necessárias paÍa ajustar o processo até a perfeição. DÈ'{Apd
rxrtliÍie,E
qlldia&r
studsp
(a) A densidade da cultura é muito baixa slheeq
z lnóculo de ì"
@el;ü
tJ 165r-nl
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Í
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oo Adicão do Íaoo ? -
Todas as células
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f puffi
Bactéria são rapidamente
lisadas = baixo título de fago
Amúrirrd
FoüÍt
(b) A densidade da cultura é muito alta ,eflim&g
rouü:d
aO &'irZ,?" |Nfi,fu
'?'
\ :,2+7ÍzZ"
"'#í 'oo oe?
o o o ??'
A cultura nunca é completamente
lisada = baixo título de Íago
(c) A densidade da cultura é correta
Oe ?l Figura 3.18
Situações que podem
ooo"i"
i!íí''-'dlï+,
ocorrer quando se
oo busca o equilíbrio
correto entre o está-
En,lt
gio da cultura e o ta-
A cultura continua a desenvolver-se, manho do inóculo pa-
mas as células acabam sendb
lisadas = alto título de fago
ra a preparação de Ífr"dmEn
uma amostra de um
Íago não-lisogênico.
B "Tem dias que são o seu pai, Francisco.Amanhece, o sol 1á fora diz o nome dele,o silêncio do sábado chora a sua ausência.E de repente tudo o que era
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Â rnãe escreve para o {ìlho sobre o pai que eÌe não tere ten:po parl cor:hecer.
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p:ira Fr:rncisr:o. I ARX Pditor.
Cloruneev GÊNrcA E Ar.rÁlrsr oe DNA 59
tjtir Coleta de fagos a partir de uma cultura infectada

de clonagem derivados Os restos das células bacterianas lisadas, juntamente com quaisquer células que perrnaneceriìm
.a fim de que a lisogenia ja- intactas, podem ser removidos de uma cultura infectada por centrifugação, deixando as partícu-
bacteriano e podem infec- las do fago em suspensão (Figura 3.16). O problema agorué a redução do volume da suspensão
para 5 ml ou menos, um volume manipulável para a extração de DNA.
reside na maneira pela qual as As partículas do fago são tão pequenas que só podem ser sedimentadas por centrifugação a
no qual as células são infec- velocidades muito elevadas. Por isso, a coleta dos fagos é geralmente feita por precipitação com
antes de as células estarem polietileno-glicol (PEG). O PEG é um composto polimérico de cadeia longa que, na presença
. resultando em um de sal, absorve água e, por isso, faz com que estruturas macromoleculares, como as partículas
ionados quando a densidade de fago, precipitem. O material precipitado pode, então, ser coletado por centrifugação e redis-
lisada e, novamente, o título solvido em um volume adequadamente pequeno (Figura 3.19).
estágio da cultura e o tamanho
tiluem a multiplicar-se, mas ür"4 Purificação de DNA a partir de partículas de fago lv
r. Como pode ser imaginado, A desproteinizaçáo do precipitado de PEG redissolvido é, às vezes, suficiente para a extração de
até a perfeição. são submetidos a uma etapa de purificação inter-
DNA puro do fago, mas, em geral, os fagos l"
mediária. Essa etapa é necessária porque o precipitado de PEG pode conter também uma certa
quantidade de resíduos bacterianos, possivelmente incluindo o indesejável DNA celular. É pos-
sível separar esses contaminantes das partículas de À, por centrifugação em um gradiente de den-
sidade de CsCl. A banda das partículas de l, em um gradiente de CsCl forma-se em uma densi-
dade de 1,45-1,50 g/cm3 6igura 3.20) e pode ser coletada do gradiente como descrito anterior-
mente para bandas de DNA (p. 54 e Figura 3. 14). A remoção do CsCl por dirílise resulta em uma
preparação pura de fagos, a partir da qual o DNA pode ser extraído com fenol ou por tratamen-
to com protease, para a digestão do envoltório protéico do fago.
üLs A purificação do DNA de Ml3 causa alguns problemas

A maioria das diferenças entre os ciclos de infecção de Ml3 e l" representa uma vantagem
para o biólogo molecular que deseja preparar DNA de Ml3. Primeiramente, a forma repli-
cativa de fita dupla de M13 (p. 34 e 36), que se comporta como um plasmídeo de alto nú-
mero de cópias, é facilmente purificada por procedimentos-padrão para a preparação de
DNA plasmidial. Um extrato celular é preparado a partir de células infectadas com Ml3,
r?r8U
q&
Adição tr
I
?.
Figura 3.18 de PEG +({
Situações que podem w"È
a
lta ocorrer quando se
+ NaCl
:s)
Do busca o equilíbrio Figura 3.19
ata Suspensão Partículas de Sedimento de
Ç
correto entre o está- Coleta de partículas
t' de Íagos fago precipitadas partículas de Íago
gio da cultura e o ta- de fago por precipita- + resíduos celulares
manho do inóculo pa- çao com polietileno-
ra a preparação de glicol(PEG).
uma amostra de um
fago não-lisogênico.
B "Temdiasquesãooseupai,Francisco.Amanhece,osolláforadizonomedele,osì1ênciodosábadochoraasuaausência.Ederepenterudooqueera
It
qt
alegria vira um buraco.Tem dia que tudo o que andei se desfaz.E voltâ uma tristezâ eguda, a maior do mundo. Em dias como esses,só você faz sentido.
Porque você é a concinuação da nossa hìstória.Tèm dia que o sol pode brilhar hndo lá fora,mas é um brilho triste.Tèm dia que nem chove,mas é dia de
rl choro.Mas tem sempre um outro dia,filho. Foi você quem me ensinou isso." Quar,lo ialta rur dos personrecnr priur:íp:ìs.colro cortìnua;r histórie?
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Â rràe cscrevc pau o iìlho sobrc o pai q*r'c1c nic lcve tdnrpo prrr r:onlte:cr.
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o r:rrr lirrncisro Alì X F,ììtorr
60 T. A. Bnowr.r
1,35
1,40
1,45
Partículas
de fago l.
1,50
1,55
1,60
Densidade Figura 3.20

de CsCl Purificação de partículas de Íago l,
(g/cms) por centriÍugação em gradiente de
densidade de CsCl.
sendo a forma replicativa separada do DNA bacteriano, por exemplo, por centrifugação em
gradiente de densidade de EtBr-CsCl.
Entretanto, a forma de fita simples do genoma de M13, contida nas partículas extrace-
lulares do fago, é freqüentemente necessária. Nesse aspecto, a grande vantagem em relação
a l, vem do fato de que altos títulos de M13 são mais facilmente obtidos. Como as células
infectadas secretam continuamente partículas de Ml3 para o meio (Figura 2.8), sem a ocor-
rência de lise, um alto título de M13 é obtido simplesmente pela manutenção da cultura in-
fectada até que seja alcançada uma.alta densidade celular. De fato, títulos de 1012 por ml ou
maiores são obtidos com facilidade, sem o emprego de qualquer truque especial. Títulos al- Figun
tos como esses implicam que quantidades significativas de DNA de M13 de fita simples po- Prepa
dem ser preparadas a partir de volumes pequenos de cultura - 5 ml ou menos. Além disso,
como as células infectadas não são lisadas, não há problemas de contaminação da suspen-
são de fagos com resíduos celulares. Conseqüentemente, a etapa de centrifugação em gra-
Leit
diente de densidade de CsCl, necessária para a preparação de fago 1,, é raramente utilizada
Birnboi
com Ml3.
iVlrl
Em resumo, a preparação de DNA de M13 de fita simples envolve o cultivo em peque- Boom-
no volume das bactérias infectadas, centrifugação para sedimentação das células bacteria- (19
nas, precipitação das partículas de fago com PEG, extração com fenol para remoção do en- 494
voltório protéico do fago e precipitação com etanol para concentração do DNA resultante Clewell
(Figura 3.21). fol
Marnu
cul
Radloff
s€d
cr{
Rogers.
mií
Yamam
. tati
7y
Zì,fu-
tÈú
Ct-onneeu GÊNrcA E ANÁLrsE oe DNA 61
(a) Cultura (b) CentriÍugação (c) Adição de PEG

de células para remoção à suspensão de
inÍectadas das células Íagos, centriÍugação
ü
Lz,l +w.."u *Ë
w I de Íagos M13 Fag

Células
sedimentadas
ffi
I I I 3DNA
M13D
por centrifugação em
nas partículas extrace-

grande vantagem em relação
obtidos. Como as células
W
(g) Ressuspensão
do DNA de M13 em
(Í)
da Íase
tr
Remoção
aquosa,
M1 3DNA
N-._
[ïï-
Wr.not
(e) Adição
Íenol
de
para
p'o
Protêína
W
(d) Ressuspensão
do Íago em tampão
um pequeno volume etanol,
adição de remoção do
(Figura 2.8), sem a ocor- centriÍugação capsídeo protéico
manutenção da cultura in-
fato, títulos de 1012 por ml ou
truque especial. Títulos al- Figura 3.21
de Ml3 de fita simples po- Preparação de DNA de M13 a partir de uma cultura bacteriana inÍectada.
5 ml ou menos. Além disso,
de contaminação da suspen-
de centrifugação em gra-
Leituras adicionais
fago 1", é raramente utilizada
i Birnboim, H.C. & Doly, J. (1979) A rapid alkaliae extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA.
Nucleic Acids Research, 7 ,1513-23. [Um método para a preparação de DNA plasmidial.]
b envolve o cultivo em peque- Boom, R., Sol, C.J.A., Salimans, M.M.M., Jansen, C.L., Wertheim van Dillen, P. M. E. & van der Noordaa, J.
inentação das células bacteria- (1990) Rapid and simple method for purification of nucleic acids. Journal of Clinical Microbiotogy, 28,
bm fenol para remoção do en- 495-503. [O método de tiocianato de guanidina e sílica para a purificação de DNA.]
hcentração do DNA resultante Clewell, D.B. (1972) Nature of ColEl plasmid replicationin Escherichia coli inthe presence of chloramphenicol.
Journal of Bacteriology, ll0, 66'1-76. [A base biológica da amplificação de plasmídeos.]
Marmur,J.(1961)Aprocedurefortheisolationofdeoxyribonucleicacidfrommicroorganisms. Journalof MoIe-
cular Biology, 3, 208- 1 8. [Preparação de DNÁ celular total.]
Radloff, R., Bauer, W. & Vinograd, J. (1967) A dye-buoyant-density method for the detection and isolation of clo-
I
sed-circular duplex DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 57,1514-21. [A des-
crição original da centrifugação em gradiente de densidade contendo brometo de etídio.l
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CnpÍru to 4
Manipulação de DNA Purificado
A gama de enzimas para a manipulação de DNA, 64 Ligação: unindo moléculas de DNA, 86

Enzimas para a clivagem de DNA: endonucleases de
restrição, 7 I
Depois de amostras de DNA puras terem sido preparadas, a etapa seguinte em um experimen-
to de clonagem gênica é a construção da molécula de DNA recombinante (Figura 1.1). para
produzir essa molécula recombinante, tanto o vetor como o DNA a ser clonado devem ser cli-
vados em pontos específicos e unidos de uma maneira controlada. A clivagem e a união são
dois exemplos de técnicas de manipulação do DNA, uma grande variedade das quais vem sen-
do desenvolvida nos últimos anos. Além de serem clivadas e reunidas, as moléculas de DNA
podem ser encurtadas, estendidas, copiadas em RNA e em novas moléculas de DNA e modi-
ficadas pela adição ou remoção de grupos químicos específicos. Essas manipulações, que po-
dem, sem exceção, ser realizadas em tubos de ensaio, constituem a fundação não apenas para
a clonagem gênica, mas também para estudos básicos sobre a bioquímica do DNA, a estrutu-
ra dos genes e o controle da expressão gênica.
Quase todas as técnicas de manipulação do DNA utilizam enzimas purificadas. No inte-
rior da célula, tais enzimas paÍicipam de processos essenciais, como a replicação e a transcri-
ção do DNA, a destruição de DNA estranho ou indesejável (por exemplo, o DNA de um vírus
invasor), a reparação de DNA mutado e a recombinação entre diferentes moléculas de DNA.
Depois da purificação a partir de extratos celulares, muitas dessas enzimas podem ser persua-
didas a executar suas reações naturais, ou algo relacionado a elas, sob condições artificiais.
Embora essas reações enzimáticas sejam freqüentemente diretas, a maioria dàlas é impossí-
vel de executar por métodos químicos tradicionais. As enzimas purificadas são, portanto, cru-
ciais para a engenharia genética, fato que levou ao surgimento de um ramo industrial impor-
tante, a partir da preparação, dacaracÍenzação e da comercialização das mesmas. Fornecedo-
res comerciais de enzimas altamente purificadas prestam um serviço essencial ao
biólogo mo-
lecular.
64 T. A. Bnowru
As manipulações de clivagem e de união que constituem a base da clonagem gênica são

executadas por enzimas chamadas endonucleases de restrição (para clivagem) e ligases (pa-
ra a união). A maior parte deste capítulo tratará dos diferentes modos de utilização desses dois
tipos de enzima. Primeiramente, porém, deve ser considerada toda a gama de enzimas para a
manipulação do DNA, para ver exatamente quais os tipos de reações que podem ser executa-
das. Muitas dessas enzimas serão mencionadas em capítulos posteriores, quando da descrição
de procedimentos que fazem uso delas.
4.1 A gama de enzimas para a manipulação de DNA

As enzimas para a manipulação do DNA podem ser agrupadas em cinco grandes classes, de-
pendendo do tipo de reação que catalisam:
(1) Nucleases são enzimas que clivam, encurtam e degradam moléculas de ácidos nucléi-
cos.
(2) Ligases unem moléculas de ácidos nucléicos.
(3) Polimerases fazem cópias de moléculas.
(4) Enzimas modiÍicadoras removem ou adicionam grupos químicos.
(5) Topoisomerases introduzem ou removem superenrolamentos de DNA circular covalen-
temente fechado.
Antes de ver detalhadamente cada uma dessas classes de enzima, dois aspectos devem ser
salientados. O primeiro é que, embora a maioria das enzimas possa ser designada para uma
classe específica, algumas apresentam atividades múltiplas, abrangendo duas ou mais classes.
Mais importante ainda é que muitas polimerases combinam suas capacidades de produzir no-
vas moléculas de DNA com uma atividade degradativa (isto é, de nuclease) de DNA associa-
da. fre nugesr
Em segundo lugar, deve ser observado que, assim como existem as enzimas para a mani- ruüúBfrG
pulação de DNA, há muitas enzimas similares conhecidas que são capazes de agir sobre o ünr,k
RNA. A ribonuclease utilizada paÍa remover RNA contaminante de preparações de DNA (p. mÍilrdh4ç,q
45) é um exemplo desse tipo de enzima. Embora algumas enzimas de manipulação de RNA mrffic
tenham aplicações na clonagem gênica e sejam mencionadas em capítulos posteriores, o en- üumdÍffid
foque, em geral, estará restrito àquelas enzimas com atuação sobre DNA.
lh&Íblil
ü|ffinfuÉ
4.1.1 Nucleases üm[offesr
Nucleases degradam moléculas de DNA quebrando as ligações fosfodiéster que unem nucleo-
tídeos adjacentes em uma fita de DNA. Existem dois tipos diferentes de nuclease (Figura 4.1):
(1) Exonucleases removem um nucleotídeo de cada vez, a pafiir da extremidade de uma üdt
molécula de DNA. m
(2) Endonucleases são capazes de quebrar ligações fosfodiéster no interior da molécula de mfu
DNA. grú
puú
A principal distinção entre as diferentes endonucleases reside no número de htas que são
degradadas quando uma molécula de fita dupla é atacada. A enzima chamada 8a131 (purifi- ]om'crrÉi
cada a partir da bactéria Alteromonas espejiana) é um exemplo de exonuclease que remove
L
Clotlneev GÊNtcA E ANÁLtsE oe DNA 65
I a base da clonagem gênrca são

b (para clivagem) e ligases (pa- (a) Uma exonuclease
tmodos de utilização desses dois
I toda a gama de enzimas para a Clivagem
rreações que podem ser executa-
I +
posteriores, quando da descrição
+ Ponte de hidrogênio
Nucleotídeo
Ligação fosfodiéster
Clivagem
D de DNA D'
-o-
hs em cinco grandes classes, de-
hur moléculas de ácidos nucléi- qog?99999ç9gg99po-o

:q-O-@3-O
m químicos.
rrcntos de DNA circular covalen- (b) Uma endonuclease
enzima, dois aspectos devem ser

as possa ser designada para uma
Srangendo duas ou mais classes.
has capacidades de produzir no-
€, de nuclease) de DNA associa- Figura 4.1
ls reações catalisadas
bxistem as enzimas para a mani- dois tipos diferentes
de nuclease. (a) Uma
fuue são capazes de agir sobre o
wrte de preparações de DNA (p. mruclease, que remove
mdeotídeos a partir da
nzimas de manipulação de RNA
ü€Ínidade de uma mo- +
h em capítulos posteriores, o en- Fctila de DNA. (b) Uma
b sobre DNA. .@ ..@
iaÉonuclease, que que-
tha fgações ÍosÍodiéster
..É -@-
:
internas.
kx fosfodiéster que unem nucleo-
ftrentes de nuclease {Figura 4. I ):
r
nucleotídeos a partir de ambas as fitas de uma molécula de fita dupla (Figura 4.2a). euanto
ia partir da extremidade de uma maior for o tempo de ação da Bal31 sobre um grupo de moléculas de DNA, mais curtos serão
péster no interior da molécula de os fragmentos de DNA resultantes. Já outras enzimas, como a exonuclease III de E coli, de-
gradam apenas uma das fitas da molécula de fita dupla, deixando DNA de fita simples como
: produto (Figura 4.2b).
bside no número de fitas que são
Lenzima chamada Bal3l (purifi- critério pode ser utilizado para classihcar endonucleases. A endonuclease S I (do fwgo Asper-
s oryzae) cliva apenas fitas simples (Figura 4.3a), enquanto a desoxirribonuclease I (DNase I), a
rylo de exonuclease que remove
é preparada a partir de pâncrEas bovino, cliva tanto moléculas de fita simples como de fita dupla (Fi-
66 T. A. Bnowr.r
(a) Bal3l
Ud+o.+O..rcr1c
opo4àóó+q P
(b) Exonuclease lll Fi$

âsrca@sca
das por dibre
5' 3', pcdeendonu
rttttt
pl ì*dease S
ftapenas D
3', 5', tasimples, in
çebras defit
Ces em mol
FrdoÍÍúnaÍile
üfadr.pla-(b,
Figura4.2 s I, que divr
As reações catalisadas pelos diferentes tipos de exonuclea- Íl{A de fita s
se. (a) Bal31 , que remove nucleotídeos a partir de ambas as çEbdefita
-@
+ó Íitas de uma molécula de Íita dupla. (b) Exonuclease lll, que iffiffmendornr
rrlrrl
.Cr. ìC. +-O-GO+O€+ remove nucleotídeos somente a partir da extremidade 3'(ver cËlesüiçãq qu
p. 91 para a descrição das diÍerenças entre as extremidades IIiIA de fita
3'e 5'de um polinucleotídeo). ÌnEapenas(
fiitneíoffirb
gura 4.3b). A DNase I é considerada inespecífica porque ataca o DNA em qualquer ligação fosfodiéster
interna; o resultado final da ação prolongada da DNase I é, portanto, uma mistura de mononucleotídeos
dnris
e oligonucleotídeos muito curtos. Por outro lado, o grupo especial de enzimas chamadas de endonuclea-
deDI\
ses de restrição cliva DNA de fita dupla somente em um número limitado de sítios de reconhecimento
específicos (Figura 4.3c). Tais enzimas, extremamente importantes, são descritas em detalhe na página tffl.l| Èlim
71.
DNA.
4.1.2 Ligases molde
nâÍ s{]
Na célula, a função das ligases é reparafquebras ("descontinuidades") em fitas individuais,
gresp
que surgem em moléculas de DNA de fita dupla durante a replicação do DNA, por exemplo.
As DNA-ligases da maioria dos organismos podem igualmente unir dois fragmentos indivi- a
pÍine
r--- : - :*+::!:- .'+-:-i--!!:==.::

= -,-:
-+1
F
v
í
Ë
I
í.
h
F : i=%___-
F
Cr-orunceu GÊNrcA E ANÁLrsE DE DNA 67
(a) Nuclease 31
Uma quebra
(D (ii)
-@ €...* ..@
I
I
óóó<+ó+o-e
V I
I
.@-@ Y
..@ .@
I
I
V
óó+ +J{+
=*4.@..F àQ
(b) DNase I
(D (ii)
."@
9annffi
-@
I
Figura 4.3 t I
I
Y
fficações catalisa- ..@..@
bpordiÍerentes ti- €4rrtrrrll
o+€..É
I
I ..@€...@
endonuclease. V
S1, que .*-G-.@..É
apenas DNA de
inclusive -FG-.É..@ rrt
çÉÍas de Íita sim- ..F+..F..@
psem moléculas
mÉrninantemente
illadupla. (b) DNa- (c) Uma endonuclease de restrição
c l" que cliva tanto
tipos de exonuclea- mAde Íita simples
ídeos a partir de ambas as
(b) Exonuclease lll, que
mrnb de Íita dupla.
endonuclease
a partir da extremidade 3'(ver que cliva
entre as extremidades llÌ{A de Íita dupla, I
msapenas em um
limitado de sÊ
tios.
qualquer ligação fosfodiéster
mistura de mononucleotídeos
duais de DNA de fita dupla (Figura 4.4). O papel dessas enzimas na construção de moléculas
chamadas de endonuclea-
de DNA recombinantes é descrito na página 84.
de sítios de reconhecimento
itas em detalhe na página
Polimerases
DNA-polimerases são enzimas que sintetizam uma nova fita de DNA, complementaÍ a um
molde de DNA ou RNA preexistente (Figura 4.5a). A maioria das polimerases pode funcio-
") em fitas individuais, nÍÌr somente se o molde possui uma região de fita dupla, que atua com um iniciador (do in-
glês primer) para reação de polimerização.
do DNA, por exemplo.
unir dois fragmentos indivi- Quaffo tipos de DNA-polimerase são utilizados rotineiramente na engenharia genética. O
primeiro é a DNA-polimerase I, geralmente obtida de E. coli. Essa enzima liga-se a uma re-
F
68 T. A. Bnowr'r
(a) Reparo de descontinuidade
Uma descontinuidade
I oNn-tig"r"
i
(b) União de duas moléculas
Figura 4.4
As duas reações catalisadas pela DNA-ligase. (a)
o*o-"n"."
J Reparo de uma descontinuidade - uma ligação
..@.@ ÍosÍodiéster Íaltante em uma das Íitas de uma
rlrrlrrrl
-@O..@ molécula de Íita dupla. (b) União de duas molé-
culas.
gião curta de fita simples (ou quebra) em uma molécula de DNA de fita dupla e, então, sin-
tetizauma fìta completamente nova, degradando a fita preexistente à medida que prossegue
na sua atividade (Figura 4.5b). A DNA-polimerase I é, portanto, um exemplo de enzima com
atividade dupla - polimerização e degradação de DNA.
De fato, as atividades de polimerase e de nuclease da DNA-polimerase I são controladas
por diferentes partes da molécula da enzima. A atividade de nuclease está contida nos primei-
ros 323 aminoácidos do polipeptídeo, de modo que a remoção desse segmento dá origem a
uma enzima modificada, a qual retém a função de polimerase, mas é incapaz de degradar
DNA. Essa enzima modificada, chamada de fragmento de Klenow, pode ainda sintetizar
uma fita de DNA complementar a um molde de fita simples, mas, como não possui atividade
de nuc!959, é incapaz de continuar a síntese depois de a quebra ter sido preenchida (Figura
4.5c). Vrárias outras enzimas - polimerases naturais e versões modificadas possuem proprie- Figura
-
dades similares às do fragmento de Klenow. A principal aplicação do fragmento de Klenow e As rea
dessas polimerases relacionadas a ele é no seqüenciamento de DNA (p.2I2). sintetü
A DNA-polimerase de Taq,utllizada na reação em cadeia da polimerase (PCR) (Figura bras, n
1.2), é' a enzima DNA-polimerase I da bactéria Thermus aquaticus. Esse organismo vive em dftJa qr
fontes termais e muitas de suas enzimas, inclusive a DNA-polirnerase de Taq, são termoestá-
quebr
veis, o que significa que são resistentes à desnaturação por tratamento térmico. É essa a carac-
teística especial da DNA-polimerase de Taq que a torna adequada para a pCR, pois, se não
fosse termoestável, ela seria inativada quando a temperatura da reação é elevada a 94"C para
desnaturar o DNA.
tl.tl Enzim
O tipo final de DNA-polimerase importante para a engenharia genética é a transcriptase Exister
reversa, uma enzima envolvida na replicação de viírios tipos de vírus. A transcriptase reversa de gn4
é única por utilizar RNA como molde, emqez de DNA (Figura 4.5d). A capacidade que essa
enzima tem de sintetizar uma fita de DNA complementar a um molde de RNA ó fundamental (1) r
para a técnica denominada clonagem de DNA complementar (cDNA) (p.112-fi9. n
7, 4
F
F
;
:
:
t
F
E
Crorueeeu GÊNrcA E ANÁLrsE oe DNA 69
(a) A reação básica
s', 3', 5_
A_T_G_C-A-A_T-G-C_A_T_
3',
-A-T-G-C-A-A-T-G-C-A-T- ----ì>
,/ _- à-ì-^- - t - a - c - g - t - t - a - c-c-T-A-
Molde lniciador 3' 5' 3', 5',
Nova Íita sintetizada
(b) DNA-polimerase I
- A-T-G-C-A-A-T-G-C-A-T- -----> -A-T-G-C-A-A-T-G-C-A-T-

-T_A_C-G G-T_A_ - t - a - c - g - t -t - a- c -G-T-A-
Uma quebra N ucleotídeos preexistentes
-_ -/-
são substituídos
catalisadas pela DNA-ligase. (c) O fragmento de Klenow

de - uma ligação
em uma das fitas de uma
. (b) União de duas molá
-f-T-9-9-A-A-r-G-9-l-T- _____> -A-T-G-C-A-A-T-G-C-A-T-
-T-A-C-G G_T-A- -T-A-C-G- t - Ì - a - C-G-T-A-
,
Os nucleotídeos / \\
preexistentes
não são substituídos
- Somente a quebra
DNA de fita dupla e, então, é preenchida
istente à medida que
um exemplo de enzima (d) Transcriptase Íeversa
-polimerase I são controlartes -A-u-c-c-A-A-u-c-g-l-y- -/-l-y-g-g-l-l-y-g-g-f-y-

t v6-T-A-
l'/-t-a-c-g-t-t-a-c-c-T-A-
está contida nos primei-
desse segmento dá origem a /
/**o\ \
. mas é incapaz de degrada
Klenow, pode ainda sintetiza
Molde de RNA Nova Íita
de DNA
aüÌs. como não possui atividade
ter sido preenchida (FiguÍa
Figura 4.5
do fragmento de Klenow e As reações catalisadas por DNA-polimerases. (a) A reação básica: uma nova Íita de DNA é
DNA (p.212). sintetizada na direção de 5'para 3'. (b) DNA-polimerase l, que inicialmente preenche que-
da polimerase (PCR) (Figura bras, mas, depois, continua a sintetizar uma nova Íita, degradando a fita preexistente à me-
. Esse organismo vive em dida que prossegue na sua atividade. (c) O fragmento de Klenow, que somente preenche
quebras. (d) Transcriptase reversa, que utiliza um molde de RNA.
de Taq, são termoestá-
térmico.Éessaacarac-
para a PCR, pois, se não
reação é elevada a 94.C para Enzimas modificadoras de DNA
genética é a transcriptase Existem inúmeras enzimas que modificam moléculas de DNA pela adição ou pela remoção
vírus. A transcriptase reversa de grupos químicos específicos. As mais importantes são as seguintes:
-1.5d). A capacidade que essa
molde de RNA é fundamental (1) Fosfatase alcalina (de E. coli, de tecido intestinal de vitelo ou de camarão iártico), que
remove o grupo fosfato presente na extremidade 5' de uma molécula de DNA (Figura
) @. 172-174t.
o 4.6a).
Ë
70 T. A. Bnowrl
(2) Polinucleotídeo-quinase (de E. coli infectada com fago T4), que tem o efeito inverso
da fosfatase alcalina, adicionando grupos fosfato às extremidades 5'livres (Figura 4.6b).
4.2 Enz
(3) Desoxinucleotidil-transferase terminal (de tecido tímico de vitelo), que adiciona um den
ou mais desoxirribonucleotídeos às extremidades 3'de uma molécula de DNA (Figura
4.6c). Ar
pft
4.1.5 Topoisomerases tru
s€I
A classe final de enzimas para a manipulação de DNA é a das topoisomerases, as quais são
seÍ
capazes de modificar a conformação de DNA circular fechado covalentemente (por exemplo,
moléculas de DNA plasmidial) pela introdução ou remoção de superenrolamentos (p. 50-51). rar
Embora as topoisomerases sejam importantes para o estudo da replicação do DNA, ainda não .cli
ten
foi encontrada uma utilidade efetiva para elas na engenharia genética.
es[
4.7
qu(
des
(a) FosÍatase alcalina
'-ottì"-o,o,o-o--d OH HO
rrlr \#
ry{@q
OH
Poï HO. OH
(b) Polinucleotídeo-quinase
Figura 4.6
As reações catalisa-
HO
W "w
'-o"P
rtttt
oH das por enzimas mo-
diÍicadoras de DNA.
HO
P+oo-.q. OH
P..+o-o44q
HO' 'POï (a) FosÍatase alcali-
na, que remove gru-
pos S'-Íosfato. (b) Po-
(c) Desoxinucleotidil-transÍerase terminal
linucleotídeo-quina-
se, que acrescenta
grupos S'-ÍosÍaÌo. (c)
(i)
s',
..@\
3'J s',
-€...@{4O-F
s',
Desoxinucleotidil-
transÍerase terminal,
que acrescenta deso-
xirribonucleotídeos
(ii)
s', 3',JJ 5' às extremidades 3'
,.- ?fl999ng-
iarrrtll! 1+ afaAfa9Êo+ de polinucleotídeos
J3' 3@tt,*
ç{F.F{F.F.F{>{){F_ @
em moléculas (i) de
Íita simples ou (ii) de Frgrr
Íita dupla. fi,nessilar
ofiiqens pre
mnnnanirulaçÍ
IilD{A ern um r
;ümnbdec
seÍn s€
F
:
;:
F
CLoruecev GÊNtcA E Ar.rÁlrse oe DNA 11
go T4), que tem o efeito inverso

remidades 5'livres (Figura 4.6b).
Enimas para a clivagem de DNA: endonucleases
nico de vitelo), que adiciona um de restrição
; uma molécula de DNA (Figura
A clonagem gênica exige que as moléculas de DNA sejam clivadas de uma maneira
muito
prwisa e reproduível. Isso é ilustrado pela maneira pela qual o vetor é clivado
durante a cons-
rução de uma molécula de DNA recombinante (Figura 4.7a). Cadamolécula
do vetor deve
hs topoisomerases, ser clivada em uma única posição, para abrir o círculo de modo que
as quais são novo DNA possa ser in-
b covalentemente (por exemplo, serido: uma molécula clivada mais de uma vez será quebrada em àois ou mais
fragmentos se-
le superenrolamentos (p. 50-51). 1mn'ados e não será útil como vetor de clonagem. Ademais, cada molécula.de vetor deve ser
la replicação do DNA, ainda não ulivada exatamente na mesma posição do círculo como ficará claro a partir
- de capítulos pos-
genética. uÊÍiores. a clivagem aleatória não é adequada. Deve ficar bem-explicitado que
um tipo muito
cspecial de nuclease é necessário para executar essa manipulação.
Freqüentemente, também é necessário clivar o DNA que está para ser clonado (Figura
4-Tb). Para tanto, há duas razões. Primeira, se o objetivo for a clonàgem
de um único gãne,
que pode consistir em apenas 2 ou 3 kb de DNA, ele deve ser separado por
clivagem das gran-
des (muitas vezes maiores que 80 kb) moléculas de DNA proãuzidas pelo
uso das técnicas I
I
I
I
I
(a) Moléculas de vetor
I
I
I
I
aì-ï\cvasem
\-/Cs c\J
I
I
I
I risura +.e
As reações catalisa-
oas por enzimas mo-
OificaOoras de DNA.
^ \, + ,,--_,\. u
i I (a) FosÍatase atcati-
/-ì (
I n", que remove gru- () \-/
po" S'{osfato. (b) Po-
I linucleotídeo-quina-
Cada molécula de vetor deve ser clivada uma
I :::??"ïï'"ï::as
as cr ivasens devem
I se, que acrescenta
I Otunos s'{osÍato. (c)
(b) A molécula de DNA que contém o gêne a ser clonado
s, I Desoxinucleotidil-
r I transÍerase terminal,
Gene
I que acrescenta deso-
I às extremidades
* || de
xirribonucleotídeos
3'
r\_--{ ,%
polinucleotídeos \
| Íita
"r
motécutas (i)de , .....................*
<.--\
\
| fita dupla. ou (ii) de
simptes Figura 4.7 5- )
,lffi,rmressidade de A,/
Sítios de clivagem
idlluryens precisas - \<
rnmmranipulação de
[MilAem um expe- Fragmentos pequenos
Grande molécula de DNA o suficiente para serem
nmimpntode clona- clonados
gem gênica.
72 T. A. Bnowr.r
preparativas descritas no Capítulo 3. Segunda, grandes moléculas de DNA podem ter de ser
quebradas simplesmente visando à produção de fragmentos suficientemente pequenos para
serem cilïegados pelo vetor. A maioria dos vetores de clonagem exibe uma preferência por
fragmentos de DNA dentro de uma determinada faixa de tamanho; vetores baseados em M13,
por exemplo, são muito ineficientes para a clonagem de moléculas de DNA com uma exten-
são maior que 3 kb.
Endonucleases de restrição purificadas permitem que o biólogo molecular clive molécu-
las de DNA da maneira precisa e reprodutível, necessária para a clonagem gênica. A desco-
berta dessas enzimas, que deu o Prêmio Nobel para W. Arber, H. Smith e D. Nathans, em
1978, foi um dos marcos fundamentais no desenvolvimento da engenharia genética.
4-2.1 A descoberta e a função das endonucleases de restrição

A observação inicial que levou à descoberta das endonucleases de restrição ocorreu no início da
década de 1950, quando foi demonstrado que algumas linhagens bacterianas eram imunes à in-
fecção por bacteriófagos, um fenômeno chamado de restrição controlada pelo hospedeiro.
O mecanismo de restrição não é muito complicado, embora tenham sido necessiírios 20
anos para que ele fosse completamente compreendido. A restrição ocorre porque abactéria
produz uma enzima que degrada o DNA do fago antes que ele tenha tempo de replicar-se e de
dirigir a síntese de novas partículas virais (Figura 4.8a). O DNA da própria bactéria, cuja des-
truição seria obviamente letal, fica protegido do ataque por ser portador de grupos metila adi-
cionais, os quais bloqueiam a ação degradativa da enzima (Figura 4.gb).
Essas enzimas degradativas são denominadas endonucleases de restrição e são sintetiza-
das por muitas, ou talvez por todas, espécies de bactéria; mais de 1.200 enzimas de restrição
diferentes já foram caracterizadas alé agora. São reconhecidas três classes diferentes de endo-
nucleases de restrição, cada uma delas distinguida por um modo um pouco diferente de ação.
As enzimas dos tipos I e III são bastante complexas e têm aplicação limitada na engenharia
genética. As endonucleases de restrição do tipo II, por outro lado, são as enzimas de clivagem
Figur
Afurção de umi
de grande importância para a clonagem gênica.
ünudease de rr
çao em uma c
4-2-2 Endonucleases de restrição do tipo ll clivam o DNA em ffiüeriana: (a) o
seqüências n ucleotíd icas especíÍicas do Íago é clir
mas (b) o DNA
A caracteística principal
das endonucleases de restrição dô tipo II (que, de agora em di4nte,
teriano nãc
serão chamadas apenas de endonucleases de restrição) é que cada uma delas reconhece e cli-
va uma seqüência específica em uma molécula de DNA. Uma determinada enzima cliva o
DNA apenas na seqüência de reconhecimento, deixando qualquer outra seqüência intocada.
Por exemplo, a endonuclease de restrição chamada PvaI (isolada de Proteis vulgaris) cliva 42.3 Extrer
DNA apenas no hexanucleotídeo CGATCG. Já uma segunda ettzimada mesma ba ciéna, cha-
A natu
mada de PvuII, cliva em um hexanucleotídeo diferente, neste caso CAGCTG.
import
Muitas endonucleases de restrição reconhecem sítios-alvo hexanucleotídicos, mas outras
clivam
clivam seqüências de quatro, cinco ou até oito nucleotídeos. Sau3A (de Staphytococcus au-
sultant
reus linhagem 3A) reconhece GATC e AluI (de Arthrobacter luteus) cliva em AGCT. Exisrem
exemp
também exemplos de endonucleases de restrição com seqüências de reconhecimento degene-
Enr
radas, o que significa que elas clivam o DNA em qualquer membro de uma família de sítios
relacionados - Hinfl (de Haemophilus influenzae linhagem R), por exemplo, reconhece
rauml
GANTC, de modo que cliva em GAATC, GATTC, GAGTC e GACTC.
tenar
fÍìs, est
As seqüências de restrição para alguràas das endonucleases de restrição mais freqüente-
determ
mente utilizadas estão listadas na Tabela 4.1.
em cad
pois o I
t
E
rË :<
Ct-oruncev GÊuca e ANÁLtsE oe DNA 73
de DNA podem ter de ser

nte pequenos para
(a) Restrição do DNA do Íago
uma preferência por
rrtores baseados em M13,
de DNA com uma exten-
molecular clive molécu-

gênica. A desco-
Smith e D. Nathans, em
restrição
Endonucleases de restrição
ocoÍïeu no início da ligam-se ao DNA do fago
eram rmunes a ln-
pelo hospedeiro. (b) O DNA bacteriano não é clivado
tenharn sido necessários 20
ocorre porque a bactéria
tempo de replicar-se e de
da própria bactéria, cuja des-
de grupos metila adi-
4.8b).
de restrição e são sintetiza-
1.200 enzimas de restrição
classes diferentes de endo-
um pouco diferente de ação.
limitada na engenharia Figura 4.8
são as enzimas de clivagem frnção de uma en-
de restri-
1ão em uma célula
DNA em briana: (a) o DNA
tb Íago é clivado,
ms (b) o DNA bac-
tr (que, de agora em diante, teriano não o é.
uma delas reconhece e cli-
determinada enzima cliva o
ouffa seqüência intocada
de Proteus vulgaris) cliva- Extremidades cegas e coesivas
ima da mesma bactéria, cha- A natureza exata da clivagem produzida por uma endonuclegse de restrição é de considerável
CAGCTG. importância no projeto de um experimento de clonagem. Müitas endonucleases de restrição
mas outras clivam simplesmente as duas fitas no meig da seqüência de reconhecimento (Figura 4.9a), re-
A, (de Staphylococcus au- sultando em uma extremidade cega (do inglê,s blunt end ou flush end). PvuII e AluI são
) clivaemAGCT. Existem exemplos de enzimas que geram extremidades cegas.
de reconhecimento degene- Entretanto, um grande número de endonucleases de restrição cliva o DNA de uma manei-
de uma família de sítios ra um pouco diferente. Com essas enzimas, as duas Íitas de DNA não são clivadas exatamen-
&), po. exemplo, reconhee te na mesma posição. Em vez disso, a clivagem ocoÍïe de maneira desencontrada nas duas fi-
GACTC. tas, estando os sítios de clivagem geralmente separados por dois a quatro nucleotídeos, o que
de restrição mais freqüente- determina que os fragmentos de DNA resultantes possuam pequenas projeções de fita simples
em cada extremidade (Figura 4.9b). Tais extremidades são chamadas de adesivas ou coesivas,
pois o pareamento de bases entre elas pode reunir os fragmentos da molécula de DNA (lem-
F
t
b
I
74 T.A.Bnowr
Tabela 4.1 As seqüências de reconhecimento para algumas das endonucleases de restrição

mais freqüentemente utilizadas
Seqüência de Extremidade
Enzima Organismo reconhecimentou cega ou coesiva
EcoR.I Escherichia coli GAATTC Coesiva

BamHI B ac illus amy lo liquefac i en s GGATCC Coesiva
BgIII Bacillus globigii AGATCT Coesiva
PvuI Proteus vulgaris CGATCG Coesiva
PvUII Proteus vulgaris CAGCTG Cega
HindIII H ae mo p hi lus influe nzae Ro AAGCTT Coesiva
HinfT H ae mo p hi lu s influe nzae R, GANTC Coesiva
Sau3A Staphylococcus aureus GATC Coesiva
AluI Arthrobacter luteus AGCT Cega
TaqI Thermus aquaticus TCGA Coesiva
HaeIII Haemophìlus aegyptius GGCC Cega
NotI N o cardia otitidis - c aviarum GCGGCCGC Coesiva
sfr S t re ptomy c e s fimb riatus GGCCNNNNNGGCC Coesiva
"A seqüência mostrada corresponde à de uma das fitas, representada na direção de 5' para 3'. Note que
quase todas as seqüências de reconhecimento são palíndromos: quando as duas fitas são consideradas,
elas são lidas da mesma maneira em ambas as direções. Por exemplo:
Er
5'_GAATTC_3'
EcoRl ||lt
3'-CTTAAG-5'
bre que extremidades coesivas foram vistas napâgina 33, durante a descrição da replicação
do fago l,). Uma característica importante dessas endonucleases de restrição é que enzimas
com diferentes seqüências de reconhecimento podem produzir as mesmas extremidades coe-
sivas. BamHI (com a seqüência de reconhecimento GGATCC) e BgIII (AGATCT) são exem-
plos disso - ambas produzem extremidades coesivas GATC (Figura 4.9c). Amesma extremi-
dade coesiva é também produzida por Sau3A, que reconhece somente o tetranucleotídeo
Ê
iQfiloa
GATC. Fragmentos de DNA produzidos por clivagem com qualquer uma dessas enzimas po-
dein ser ligados uns aos outros, pois cada um deles é portador de uma extremidade coesiva
complementar.
rffi
4.2.4 A freqüência de seqüências de reconhecimento em uma tffimcl
molécula de DNA &,q:r
üm
O número de seqüências de reconhecimento para uma determinada endonuclease de restrição dËrn
em uma molécula de DNA de tamanho conhecido pode ser calculado matematicamente. Urm tud
seqüência tetranucleotídica (por exemplo, GATC) deve ocorrer uma vez a cada 4a = 256 nw müü(
cleotídeos, e uma seqüência hexanucleotídica (por exemplo, GGATCC) uma vez a cada 46
= drul
4.096 nucleotídeos. Esses cálculos assumem que os nucleotídeos estão ordenados de manei- frthdl
ra aleatória e que os quatro nucleotídeos diferentes estão presentes nas mesmas proporçõee ü,u
(isto é, um conteúdo de GC = 507o). Na prâtica, nenhuma dessas suposições é completamer rp
te válida. Por exemplo, a molécula de DNA de ),, com 49 kb, deveria conter
te 12 sítios prÌra uma endonuclease de restrição com uma seqüência de reconhecimento mru
F
Crorunoev GÊntcn e ANÁLlsE oe DNA 75
(a) Produção de extremidades cegas
-N-N-A-G-C-T-N-N- AIr^t
_N-N-A_G C_T-N_N-
-N-N_ T-C_G_A-N-N- -N-r$-ï-b c-À-ú-ú-
'N'= A, G, C ou T Extremidades cegas
(b) Produção de extremidades coesivas
-N-NG-A-A-T-T-C-tÈt$-+ ecoRl -N-N-G A-A-T-T-C-N-N-

-N-N-C-T-T-A-A-G-Ì{--N- -N-N-C-T-T-A-A\ G-N-N-
\\
Extremidades coesivas
de 5'para 3'. Note que (c) As mesmas extÍemidades coesivas produzidas

fitas são consideradas, por diÍerentes endonucleases de Íestrição'
Figura 4.9
_N_N_G G_A_T_C-C_N_N-
filclüernidades Pro-
Bam*l
rünftlas por clivagem -*-ru-c- c-T-A-c G-N_N-
übDilA com diÍeren-
(a) Uma ex-
-N_N_A G_A_T-C-T_N-N-
cega produ- Bgttt
a descrição da rePlicação
pÍÁ/ri.(b) Uma -ú-ú-i- c-r-A-c À-ú-ú-
rünmilade coesiva
restrição é que enzimas por EcoRl.
Mmrnas extremidades coe- npsmas extre- IN_N_N G_A-T_C_N-N-N_
ffiSm (AGATCT) são exem- coesivas pro- SauSA
{.9c). A mesma extremi- ürudas por Bam{l, -N-ü-N- c-r-A-c ú-ú-ú-
$iffnente o tetranucleotídeo ftillle SauBA.
uma dessas enzimas Po'
uma extremidade coesiva
nucleotídica. Na realidade, tais sítios de reconhecimento ocorrem com uma freqüência menor
(por exemplo, seis para BglII, cinco pata BamHI e apenas dois para SalI), um reflexo do fato
em uma de que o conteúdo de GC de À é bem merìor do que 50Vo (Figura4.10a).
Além disso, os sítios de restrição em geral não estão distribuídos uniformemente ao longo
de uma molécula de DNA. Se eles estivessem, uma digestão com uma determinada endonu-
endonuclease de restrição
clease de restrição geraria fragmentos com tamanhos aproximadamente iguais. A Figura 4.10b
matematicamente. Uma
nostra os fragmentos produzidos pela clivagem do DNA de l, com BgtII, BamHI e SalI' Em
uma vez a cada 4a = 256 nu-
sada caso, existe uma considerável variação nos tamanhos dos fragmentos, indicando que os
uma vez a cada 46 =
nucleotídeos não estão ordenados aleatoriamente no DNA de À.
s estão ordenados de maneÈ
A lição a ser tilada da Figura 4.10 é que, embora a matemática possa dar uma idéia de
nas mesmas proporçoes
quantos sítios de róstriçao são esperados para uma molécula de DNA, somente uma análise
suposições é comPletamen-
'eria conter aProximadamen- experimental é capazde mostrar o quadro real. Deve-se, portanto, ir adiante para considerar-
sa como as endonucleases de restrição são utilizadas em laboratório'
cia de reconhecimento hexa-
t
76 T.A.Bnowru
caso deven
(a) Sítios de clivagem no DNA de À 4.1 la). São
Obvian
tida de um
antes de se
da para pm
das endoru
podem vari
dio [NaCl],
po [I exiger
te redutor, r
damental q
I egnt- 6 sítios tas de NaC
I eamHl -5sítios bém poden
ocorTa em r
À srn-2sÍtios A coml
estáemum
ção à miso
(b) Tamanhos dos Íragmentos da reação s
já presente
A endo
Bgill
enzima é d
22010
13286 modo que r
qüentemen
r------- 2392
para a cÏl'z
-651
n 415
r60
Bgü+ tS
Oúltin
Bamt'l.l ses de resü
16841 exigências
----.---...-..--7233
r--------------- 677O como aDìti
t-----"---'---- 6527 de resriçã
|_-.....--ì5626 da enzima-
|------------ì5505 Depois
DNA prod
Sa/l
32745 destmída d
1 5258 DNA que'
n 499 "matar" es
outrÍìs é ul
(EDTA) (q
Figura 4.10 4.1le).
Restrição da molécula de DNA de ì,. (a) As posições das seqüências de reconhecimento pa-
ra Bgtll, Bamïl e Sa/ì. (b) Os Íragmentos produzidos por clivagem com cada uma dessas |t!È6 Analisam
endonucleases de restrição; os números correspondem aos tamanhos dos Íragmentos, em
pares de bases. Uma diges
das posiçú
gnal (Figu
4.2.5 Executando uma digestão de restrição no laboratório gem gênic:
Por exemplo, será considerado como digerir uma amostra de DNA de l" (em uma concentra- nho dos fra
ção de 125 pg/ml) com BglII. @e serer
Primeiramente, toda a quantidade de DNA necessiíria deve ser pipetada em um tubo de en- léculas de I
saio. A quantidade de DNA que será restringida depende da natureza do experimento; neste nores, de n
ft
n
F
t,'
I
-L
i.
Clouncev GÊNrcA E ANÁLrsE oe DNA 77
caso devem ser ingeridos 2 trtg de DNA de 1,, que estão contidos em 16 pl da amostra (Figura
4.lla). São, portanto, necessárias micropipetas bastante precisas.
Obviamente, o outro componente principal da reação será a endonuclease de restrição, ob-
tida de um fornecedor comercial como uma solução pura e de concentração conhecida. Mas,
antes de se adicionar a endonuclease de restrição, a solução contendo o DNA deve ser ajusta-
da para prover as condições corretas pÍÌra assegurar a atividade máxima da enzima. A maioria
das endonucleases de restrição funciona adequadamente em pH 7 ,4, mas diferentes enzimas
podem variar nas suas exigências quanto à força iônica (geralmente suprida por cloreto de só-
dio [NaCl]) e à concentração de magnésio (Mg*2) (todas as endonucleases de restrição de ti-
po II exigem Mg*z para o seu funcionamento). É também recomendável a adição de um agen-
te redutor, como o ditiotreitol (DTT), que estabiliza a enz;rmae evita a sua inativação. É fun-
damental que as condições corretas sejam proporcionadas à enzima - concentrações incorre-
tas de NaCl ou Mg*'não somente reduzem a atividade da endonuclease de restrição, mas tam-
bém podem causar alterações na sua especificidade, fazendo com que a clivagem do DNA
ocoÍra em outras seqüências de reconhecimento, não-usuais.
A composição de um tampão adequado para BgIII é mostrada na Tabela 4.2. Esse tampão
está em uma concentração 10 vezes maior do que a de trabalho e é diluído quando da sua adi-
ção à mistura da reação. No exemplo apresentado, um volume final adequado para a mistura
da reação seria de 20 pl, se forem adicionados 2 pl de tampão de Bgill l0 x aos 16 pl de DNA
já presentes (Figura 4.1 lb).
A endonuclease de restrição pode agora ser adicionada. Por convenção, uma unidade de
enzima é definida como a quantidade necessária para clivar 1 pg de DNA em uma hora, de
modo que serão necessárias 2 unidades de BglII para clivar 21tg de DNA de ìu. BgIII é fre-
qüentemente obtida em uma concentração de 4 unidades/pl, de modo que 0,5 pl é suficiente
para a clivagem do DNA. Os ingredientes finais na mistura da reação são, portanto, 0,5 pl de
BgIII + 1,5 pl de água, determinando um volume final de 20 p.l (Figura 4.11c).
O último fator a ser considerado é a temperatura de incubação. A maioria das endonuclea-
ses de restrição, inclusive Bg1II, funciona melhor a3'7"C, mas algumas poucas enzimas têm
exigências diferentes. TaqI, por exemplo, é uma enzima de restrição de Thermus aquaticus e,
como a DNA-polimerase de Tgq, possui uma temperatura de trabalho mais elevada. Digestões
de restrição comTaql devem ser incubadas a 65'C para que seja obtida a atividade máxima
da enzima.
Depois de uma hora, a restrição deve ser completa (Figura 4.1 1d). Se os fragmentos de
DNA produzidos pela restrição destinam-se a experimentos de clonagem, a enzima deve ser
destruída de alguma maneira, para que não possa digerir acidentalmente outras moléculas de
DNA que venham a ser adicionadas em um estágio posterior. Existem várias maneiras de
"matar" essa enzima. Para muitas, uma breve incubação a 70'c é suficiente, enquanto para
outras é utilizada uma extração com fenol ou a adição de ácido etilenodiaminotetracético
(EDTA) (que se liga a íons Mg*2, impedindo a ação da endonuclease de restrição) (Figura
4.1 1e).
de reconhecimento pa-
com cada uma dessas Analisando o resultado de uma clivagem de restrição
dos Íragmentos, em
Uma digestão de restrição resulta em vários fragmentos de DNA, cujos tamanhos dependem
das posições exatas das seqüôncias de reconhecimento para a endonuclease na molécula ori-
ginal (Figura 4.10). Para que as endonucleases de restrição possam ser utilizadas em clona-
gem gênica, é obviamente necessário um método para a determinação do número e do tama-
iA de l, (em uma concentra- nho dos fragmentos de DNA gerados por elas. A ocorrência ou não da clivagem da molécula
pode ser evidenciada com facilidade a partir do teste de viscosidade da solução. Grandes mo-
pipetada em um tubo de en- léculas de DNA resultam em uma solução mais viscosa do que uma contendo moléculas me-
do experimento; neste nores, de modo que a clivagem está associada a um decréscimo na viscosidade. A resolução
78 T. A. Bnowr.r
mâea
(a) Adição de 2 pl (b) Adição de 0,5 pl (c) meflIìa
de tampão de de Bglll + 1 ,5 trrl de dife
deH2O ffi
\ ll
Bglll Ent
forese
\_ ..-.......> de rtm:
I
tr L_l
---------->
u
las de ì
VI
DNA
léculas
Nal
r
2 pg de DNA
de À (16 rrl) I
/lncubação a
sar scp
37'c pot th
(d)
f
/
(e) tr
V----.-
W ,/ DNA de À ctivado
I I -/ídiçàode renot ou EDTA Figura 4.11

I I ou áquecimento a70 C por 15 min
Execução de uma diges-
V tão de restrição em labo-

ratório (ver texto para de-
talhes).
Tabela 4.2 Um tampão lOx adequado para a restrição de DNA com BglII
Componente Concentração (mM)

Tris-HCl, pH7,4 500
MgCl, 100
NaCl 500
Ditiotreitol 10
do número e do tamanho dos produtos de clivagem é, contudo, mais difícil. De fato, por mui-
tos anos esse foi um dos aspectos mais tediosos dos experimentos envolvendo DNA. Tais pru
blemas acabaram sendo resolvidos no início da década de 1970, quando foi desenvolvidaa
técnica da eletroforese em gel.
Separação de moléculas por eletroforese em gel

Moléculas de DNA, assim como proteínas e muitos outros compostos biológicos, são
doras de uma carga elétrica, negativa no caso do DNA. Conseqüentemente, quando
las de DNA são colocadas em um crìmpo elétrico, elas migram em direção ao pólo posi
(Figura4.l2a). A velocidade de migração de uma molécula depende de dois fatores: a sua
Croruneeu GÊNrcn e ANÁLrsE oe DNA 79
ma e a sua razão entre carga e massa. Infelizmente, a maioria das moléculas de DNA possui a
mesma forma e todas têm razões bastante similares entre carga e massa. Portanto, fragmentos
de diferentes tamanhos não podem ser separados por procedimentos-padrão de eletroforese.
Entretanto, o tamanho da molécula de DNA passa a ser um fator considerável se a eletro-
forese for executada em um gel. Um gel, que é via de regra feito de agarose, de acrilamida ou
de uma mistura de ambas, constitui uma rede complexa de poros, através da qual as molécu-
las de DNA devem passar para atingir o eletrodo positivo. Quanto menor for a molécula de
DNA, mais rapidamente ela pode migrar pelo gel. Portanto, a eletroforese em gel separa mo-
léculas de DNA de acordo com seus tamanhos (Figura 4.12b).
Na prática, a composição do gel determina os tamanhos das moléculas de DNA que podem
ser separadas. Um gel de agarose O,SVo com 0,5 cm de espessura, que possui poros relativa-
(a) EletroÍorese-padrão
DNA Tampão
Figura 4.11 r,"uo,o,"."

Execução de uma diges- f
tão de restrição em labo-
ratório (ver texto para de-
talhes).
com BglII O DNA migra em direção

ao ânodo, mas a separação
por classes de tamanho é
incipiente
(b) EletroÍorese em gel
Tampão
A amostra de DNA é aplicada

mais difíciÌ. De fato, por mur- em uma çanaleta formada no próprio gel
envolvendo DNA. Tais pro'
quando foi desenvolvida a
Figura 4.12
postos biológicos, são porta O DNA separa-se em bandas correspondentes
eleúoÍorese-pad rão não se-
a fragmentos de diferentes tamanhos
nte, quando molécu- de DNA de tama-
em direção ao pólo positivo nilirediÍerentes, enquanto (b) a MenoÍ
de dois fatores: a sua for- eletroÍorese em gel o faz.
-
80 T.A.Bnowru
mente grandes, pode ser usado para moléculas na faixa de tamanho qntre 1 e 30 kb, permitin- Auto-ra
do, por exemplo, a clara distinção entre moléculas de 10 e l2kb. No outro extremo da escala, Uma da
um gel de poliacrilamida 4OVo muito delgado (0,3 mm), com poros extremamente pequenos, DNA, A
pode ser utilizado paÍa separÍÌr moléculas de DNA muito menores, na faixa de 1 a 300 pb, per- lizadas i
mitindo a distinção de moléculas cujas extensões diferem em apenas um único nucleotídeo. tecção r
Visualizando moléculas de DNA em um gel Aar

trofores
Coloração de ser vi
A maneira mais fácil de visualizar os resultados de um experimento de eletroforese em gel é O DNA
a sua coloração com um composto que torne o DNA visível. O brometo de etídeo (EtBr),
já Umi
descrito na página 53 como um meio para a visualização de DNA em gradientes de cloreto de dores dt
césio (CsCl), é também rotineiramente utilizado na coloração de DNA em géis de agarose e essa ma
poliacrilamida (Figura 4.13). Bandas mostrando as posições das diferentes classes de tama- lation) <
nho de fragmentos de DNA são claramente visíveis sob irradiação ultravioleta após coloração AT:
com EtBr, desde que esteja presente DNA suficiente. Infelizmente, esse procedimento é bas- A maior
tante perigoso, pois o brometo de etídeo é um agente mutagênico potente e a radiação ultra- quando
violeta utilizada para visualizar o DNA pode causar queimaduras severas. Por essa razão, co- limerase
rantes não-mutagênicos, que coram o DNA de verde ou azul e não requerem irradiação ultra-
violeta para visualização dos resultados, são agora utilizados em muitos laboratórios.
Canaletas para as amostras
Gel de agarose
Suporte plástico
transparente para UV
lncubação em solução de
EtBr 0,5 pg/ml por 15 min
Bandas de DNA
fluorescentes,
Figura 4.13
Visualização de
bandas de DNA em Figura
um gel de agarose da autr
por coloração com dfrlgtda para vis
brometo de etídeo e
irradiação ultraviole-
tro Õ DÌ,lA rne
UV
ta (UV). umlgd de agar
Cr-oruecrv GÊNrcA E ANÁLrsE oe DNA 81
eltre 1 e 30 kb, permitin- Auto-radiografïa de DNA marcado radioativamente

No outro extremo da escala, Uma das desvantagens da coloração é o limite da sua sensibilidade. Se menos de l0 ng de
extremamente pequenos, DNA, aproximadamente, estão presentes em cada banda, é improvável que elas sejam visua-
na faixa de 1 a 300 pb, per- lizadas após a coloração. Para pequenas quantidades de DNA, é necessário um método de de-
um único nucleotídeo. tecção mais sensível.
A auto-radiografia é a resposta paÍa essa demanda. Se o DNA for marcado antes da ele-
troforese, pela incorporação de um marcador radioativo nas moléculas individuais, ele po-
de ser visualizado a partir da colocação de um filme fotográfico sensível a raios X sobre o gel.
de eletroforese em gel é O DNA radioativo expõe o filme, revelando o padrão de bandas (Figura 4.14).
O brometo de etídeo (EtBr), já Uma molécula de DNA é via de regra marcada pela incorporação de nucleotídeos porta-
A em gradientes de cloreto de dores de um isótopo radioativo do fósforo, o "P lFigura 4.15a). Existem vários métodos para
de DNA em géis de agarose e essa marcação, sendo os dois mais populares a translação de quebras (do inglês nicktrans-
diferentes classes de tama- lation) e o preenchimento de extremidades.
ultravioleta após coloração A translação de quebras (nick translation) refere-se à atividade da DNA-polimerase I (p. 68).
te, esse procedimento é bas- A maioria das amostras de DNA purificado contém algumas moléculas quebradas, mesmo
lco potente e a radiação ultra- quando apreparação foi feita da maneira mais cuidadosa possível. Isso significa que a DNA-po-
severas. Por essa razáo, co- limerase I pode ligar-se ao DNA e catalisar a reação de substituição de fita (Figura 4.5b). Tal rea-
não requerem irradiação ultra-
em muitos laboratórios.
Placa de vidro
Gel de agarose secado

em forno
ru Colocação de um filme
sensível a raios X
sobre o gel
Exposição por 12 a 1 00 horas,

revelação do Íilme
Figura 4.13
Visualização de
bandas de DNA em Figura 4.14
um gel de agarose da auto-ra-
por coloração com rügnfia para visuali-
brometo de etídeo e Auto-radiograÍia
de DNA marca-
irradiação ultraviole- em
ta (UV). un gel de agarose.
*
:
t
82 T.A.Bnowru
ção requer um suprimento de nucleoídeos: se um deles estiver marcado radioativamente, a mo-

lécula de DNA também se tornará marcada (Figura 4.15b).
12.7 Estimath
A translação de quebras pode ser utilizadapara marcaÍ qualquer molécula de DNA, mas, A eletrofo
sob certas circunstâncias, ela também pode causar a clivagem do DNA. O preenchimento de grando mi
extremidades é um método mais brando, que raramente provoca a quebra do DNA, mas que, de tamanh
infelizmente, só pode ser utilizado para marcar molóculas que possuem extremidades coesi- trição, pol
vas. A enzimautilizada é o fragmento de Klenow (p. 68), que "preenche" uma extremidade nados os ü
coesiva sintetizando a fita complementar (Figura 4.15c). Assim como na translação de que- O métr
bras, se a reação de preenchimento de extremidades for executada na presença de nucleotí- gração col
deos marcados, o próprio DNA ficará marcado.
Tanto a translação de quebras quanto o preenchimento de extremidades viabili zam a mar- D=a_H.
cação do DNA em um grau tal que mesmo quantidades mínimas podem ser detectadas em gel
na qual D r
por auto-radiografia. Até 2 ng de DNA por banda podem ser visualizadas sob condições
das condiç
ideais.
Em gel
timativa dr
fragmento
(a) [0-3'zP]dATP é executad
NH, cadores de
t- nhos varia
o- o- o- )-c-c\*
Hi/ ll
dos fragmr
.-f--f-o"ì-o-?r, -o tÌ-c--nl"t I
gestão exp
[il1dns nas
o o/o t.," \l - serexecuta

/ c'H H-C
,,p,âio(o lt8;i'
,112."8 Mapeame
uma mol(
Até agora-
K
mentos de
(b) Marcação portranslação de quebras (nicktranstationl na anáIiee
sições rela
quando rrm
colTetÍunetr
^é'* DNA Pot I ra .t.l 7).
*-Pt - Umasé
4 1 / +"p-dArp
meiramentr
Quebras
(nicks) trição der"er
marcadas 195, jg tame
de dig€rúõr
(c) Marcação por preenchimento de extremidades
motempo-.
Figura 4.15 [65 x5 gnzir
Marcação radioativa: (a) tirlansnte- i
estrutu ra do cr-32P-triÍos- de rcação q
Ã--**jrK,r' f
Íato de desoxiadenosina guneetrzir
11a-3'ze1oRre;, (b) mar- A cory
cação do DNA por
restrição. sc
\"{\4 translação de quebras
(nick translation), e (c) te resoll"ida
Extremidade coesiva \ Extremidade de um nrirrr
marcação do DNA por
de EcoRl marcada qinis são- ri
preenchimento de ex-
tremidades. zima não te
Cr-oruaoEu GÊucn E ANÁLtsE oe DNA 83
radioativamente, a mo-
4.2.7 Estimativa do tamanho de moléculas de DNA
r molécula de DNA, mas, A eletroforese em gel separa moléculas de DNA de diferentes tamanhos, com as menores mi-
DNA. O preenchimento de grando maiores distâncias em direção ao eletrodo positivo. Se diversos fragmentos
de DNA
a quebra do DNA, mas que, de tamanhos variados estiverem presentes (o resultado bem-sucedido de umã digestão
de res-
m extremidades coesi- trição, por exemplo), então uma série de bandas apareceráno gel. Como podem ser determi-
uma extremidade nados os tamanhos desses fragmentos?
como na translação de que- O método mais preciso ltlliza arelação matemática que correlaciona a velocidade de mi-
na presença de nucleotí- gração com o peso molecular. A fórmula relevante é:
viabilizam mar-
a
D=a-b(logL/t),
podem ser detectadas em gel
naqualDéadistânciapercorrida,Méopesomolecular eaebsãoconstantesquedependem
visualizadas sob condições
das condições de eletroforese.
Em geral, é utilizada uma maneira muito mais simples, embora menos precisa, para a es-
timativa dos tamanhos de fragmentos de DNA. Uma digestão de restrição-padrão,
[ue inclui
fragmentos de tamanhos conhecidos, é usualmente incluída em cada eletroforese em gel que
é executada. Produtos de restrição de DNA de l, são muitas vezes assim utilizados, como
mar-
cadores de tamanho. Por exemplo, HindIII cliva o DNA de À em oito fragmentos, com tama-
nhos variando entre 125 pb, para o menor, e mais de 23 kb, parco maior. Como os tamanhos
dos fragmentos nessa reação de digestão são conhecidos, os tamanhos dos fragmentos na di-
gestão experimental podem ser estimados a partir da comparação das posições relativas
das
bandas nas duas trilhas do gel (Figura 4.16). Embora de precisão limitada, ósse método pode
' ser executado com apenas 57o de eno, o que é satisfatório na maioria dos casos.
tuLg Mapeamento das posições de diÍerentes sítios de restrição em

uma molécula de DNA
Até agora, consideramos como podem ser determinados o número e os tamanhos dos frag-
mentos de DNA produzidos por clivagem com endonucleases de restrição. A próxima etafa
na análise de restrição é a construção de um mapa mostrando, na molécula oe oNR,
as po-
sições relativas das seqüências de reconhecimento de diversas enzimas diferentes.
Somente
quando um mapa de restrição está disponível é que as endonucleases de restrição podem
ser
corretamente selecionadas para uma determinada manipulação de clivagem a executar (Figu-
ra 4.17).
Uma série de digestões de restrição deve ser executada para a construção de um mapa. pri-
meiramente, o número e o tamanho dos fragmentos produzidos por uma endonuclease
de res-
trição devem ser determinados por eletroforese em gel seguida de comparação com marcado-
res de tamanho (Figura 4.18). Essa informação deve, então, ser suplementada
por uma série
de digestões duplas, nas quais o DNA é clivado por duas endonucÈases de restrição
ao mes-
mo tempo. A execução de uma clivagem dupla pode ser possível em uma única etapa,
se am-
Figura 4.15 bas as enzimas tiverem exigências similares quanto a pH, concentração de Mg*2,
eti.Alterna-
Marcação radioativa: (a) tivamente, as duas digestões podem ser executadas uma após a outra, ajustando-se
a mistura
estrutu ra do cr-32P-trifos- de reação após a primeira digestão para suprir um conjunto diferente de
fato de desoxiadenosina condições para a se-
gunda enzima.
([s-3'zP]dATP), (b) mar-
A comparação de resultados de digestões simples e duplas permite que muitos sítios de
cação do DNA por
restrição, se não todos, sejam mapeados (Figura 4. l g). As ambigüidades pàdem
translação de quebras ser geralmen_
(nick translation), e (c) te resolvidas por digestão parcial, executada sob condições que resultam apenas
na clivagem
marcação do DNA por de um número limitado de sítios de restrição em qualquer mãlécula de DNA.
Digestões lar-
preenchimento de ex- ciais são, via de regra, conseguidas pela redução do período de incubação, de moão qu" u
tremidades. zima não tenha tempo suficiente para clivar todos os sítios de restriçat, ou pela incubação"n-
a
84 T. A. Bnowr.r
(a) Estimativa grosseiÍa por visualização direta (b) Estimativa gráÍica precisa
Hiúlll Amostra
1" desconhecida 10
-o
!
23130ob---- ã
z
7,5
941 6 ô
6557
_cerca de 5.000 pb õoc
4361 1r-- P z.s
c
2--- _cerca de 3.200 pb (ú
2322
2027 _cerca de 2.000 pb
F
Fo 012345
3---
Distância migrada (cm)
564
Figura 4.16
Estimativa dos tamanhos de fragmentos de DNA em um gel de agarose. (a) Uma estimativa grosseira
do tamanho dos fragmentos pode ser obtida a partir da vÈualização direta. (b) Uma mediçãJmais pre-
cisa do tamanho dos fragmentos é conseguida utilizando-se as mobilidades de Íragmentol
de À-Hr'ndlll
para a construção de uma curva de calibragem; os tamanhos de Íragmentos
desconhecidos podem,
então, ser determinados a partir das distâncias que migraram.
geneB geneC .geneD

Mapa {enético
Mapa de restrição
legnr I san
ò laamHr À
Para obtenção do gene B, digerir com Bgíl
o
P''- írN;
\
g--_e_
_í-
Figura 4.17
Para obtenção do gene D, digerir com BamHl + Sa/l Utilização de um ma-
pa de restrição para
deÍinir as endonu-
---*,
AAB
ffi ,-il. cleases de restrição
que devem ser utili-
n.---42.,c, ^ ,s*Z)
t*--'À
zadas para a obten-
ção de Íragmentos
Figura 4.1
Uapearne
contendo genes indi- e l(prttta
viduais.
ì
:
F
I
Cronnceu GÊNtcA E ANÁLtsE oe DNA 85
Digestões simples e duplas
Enzima Número de fragmentos Tamanhos (kb)
Xbal 2 24,O;24,5
xhd 2 15,0; 33,5
Kpnl 3 1 ,5; 17,0; 30,0
Xbal + Xhd 3 9,0; 15,0; 24,5

Xbal + Kpnl 4 1,5; 6,0; '17,O;24,0
Gonclusóes:
(1) Como o DNA de ì, é linear, o número de sítios de restrição para cada

012345 enzima é Xbal 1, Xhol 1 e KPnl 2.
Distância migrada (cm)
(2) Os sítios de Xbal e Xhol podem ser mapeados:
Íragmentos de Xbal
Íragmentos de Xhd ,9,0, , 15,0 , , 24,5 ,
Xbal
fragmentos de Xhd , 15,0 , , 33,5 ,
Xhol Xbal
Uma estimativa grosseira A única possibilidade é:
15,0 9,0 24,5
(b) Uma medição mais pre-
de fragmentos de l,-Hr'ndlll
(3) Todos os sítios de Kpnl estão no Íragmento de 24,5 kb de Xbal, pois
desconhecidos podem,
o fragmento de 24,0 kb fica intacto após a digestão dupla com
XbalKpnl.A ordem dos fragmentos de Kpnl somente pode ser
determinada por digestão parcial.
Digestão paÌcial
Enzima Tamanhos dos Íragmentos (kb)
Kpnl - condições limitantes 1 ,5; 17,O; 18,5; 30,0; 31 ,5; 48,5
Conclusões:
(1) Fragmento de 48,5 kb = l, não-clivado.

(2) Os fragrnentos de 1 ,5; 17,0 e 30,0 kb são produtos de digestão completa'
(3) Os fragmentos de 18,5 e 31 ,5 kb são produtos de digestão parcial'
Kpnls
O mapa de Kpnl deve ser:
30,0 1,5 17,O
Figura 4.17 Xhol Xbal Kpnls

Utilização de um ma- Portanto, o mapa completo é:
pa de restrição para 15,0 9,0 6,0 1,5 17,0
deÍinir as endonu-
cleases de restrição
que devem ser utili-
Figura 4.18
zadas para a obten-
Mapeamento de restrição. Este exemplo mostra como as posições dos sítios de Xbal, Xhol
ção de Íragmentos e Kpnl na molécula de DNA de À podem ser determinadas.
contendo genes indi-
viduais.
86 T.A. BRowN
uma temperatura baixa (por exemplo , a 4" C em vez de a 37 " C) , o que limita a atividade da en-
zima.
O resultado de uma digestão parcial é um padrão complexo de bandas em um gel de ele-
troforese. Fragmentos adicionais, com diferentes tamanhos, são visualizados juntamente com
os fragmentos-padrão, produzidos por digestão total. Os fragmentos adicionais correspondem
a moléculas que incluem dois fragmentos de restrição adjacentes, separados por um sítio que
não foi clivado. Os seus tamanhos indicam quais fragmentos de restrição da digestão comple-
ta estão próximos um ao outro na molécula não-clivada (Figura 4.18).
4.3 Ligação: unindo moléculas de DNA

A etapa final na construção de uma molécula de DNA recombinante é a união da molécula do
vetor com o DNA a ser clonado (Figura 4.19). Esse processo é chamado de ligação e a enzi-
ma que catalisa a reação é denominada de DNAJigase. t[ação: a etapa 1
moler
4.3.1 O modo de ação da DNA-ligase
Todas as células vivas produzem DNA-ligases, mas aenzimautilizada em engenharia genéti-
ca é geralmente a purificada de bactérias E. coli que foram infectadas com fago T4. Na célu-
la, essa enzima executa uma função muito importante, reparando quaisquer descontinuidades
que venham a surgir em uma das fitas de uma molécula de fita dupla (Figura 4.4a). Uma des-
continuidade é simplesmente uma posição na qual uma ligação fosfodiéster entre nucleotí-
deos adjacentes está faltando (note a diferença em relação a uma quebra fnick],naqual um ou
mais nucleotídeos estão ausentes). Embora as descontinuidades possam surgir em decorrên-
cia de quebras aleatórias de moléculas de DNA celular, elas também surgem como um resul-
tado natural de processos como a replicação e a recombinação do DNA. Portanto, as ligases
desempenham funções vitais na célula.
Em tubo de ensaio, DNAìigases purificadas, além de repararem descontinuidades de fi-
tas simples, também podem unir moléculas de DNA individuais ou as duas extremidades de
uma mesma molécula. A reação química envolvida na ligação de duas moléculas é exatamen-
te a mesma que ocorre na reparação de descontinuidades, exceto pelo fato de que duas liga-
ções fosfodiéster devem ser estabelecidas, uma para cada fita (Figura 4.20a).
4.3.2 Extremidades coesivas aumentam a eficiência da ligação

A reação de ligação da Figura 4.20a mostra a união de dois fragmentos com extremidades ce-
gas. Embora essa reação possa ser executada em tubo de ensaio, ela não é muito eficiente. Is-
so ocoffe porque a ligase é incapaz de "segurar" a molécula a ser ligada e, por isso, tem que
esperar que as extremidades sejam posicionadas lado a lado por associação casual. Se possí-
vel, ligações de extremidades cegas devem ser executadas cory altas concentrações de DNA,
a fim de aumentar as chances de encontro correto entre as extremidades das moléculas.
Figur
Por outro lado, a ligação de extremidades coesivas complementares é muito mais eficien- ffifrrentes reag
te. Isso ocolre porque extremidades coesivas compatíveis podem parear suas bases entre si por ffigação catalisadr
pontes de hidrogênio (Figura 4.20b), formando uma estrutura relativamente estável, sobre a ffilA-ligase: (a) |
qual a enzima pode atuar. Se as ligações fosfodiéster não forem sintetizadas rapidamente, as ümrÍárrlasdee
extremidades coesivas separam-se de novo. Tais estruturas com bases pareadas, embora tran- ffiescegase (l
sitórias, realmente aumentam a eficiência de ligação, pois estendem o tempo durante o qual qpode ÍÍìoléGllas
as extremidades estão em contato uma com a outra. teínitades cor
Cronncev GÊrurcn e ANÁLtsE oe DNA 87
o que limita a atividade da en-
cene
\
de bandas em um gel de ele-
visualizados juntamente com +B L DNA a ser
adicionais correspondem
clonado
separados por um sítio que
I
restrição da digestão comple- Vetor DNA-lisase
4.18). I
é a união da molécula do
chamado de ligação e aenzi- Figura 4.19
O--""""
Molécula de DNA
lLil#o: a etapa final na construção de uma recombinante
molécula de DNA recombinante.
em engenharia genéti-
com fago T4. Na célu-
quaisquer descontinuidades (a) Ligação de extremidades cegas
(Figura 4.4a). Uma des-
-.oF{rcrcl-o
tr I
re
llr +
fosfodiéster entre nucleotí- -ffi }-+€--a-
quebra fnickl,naqual um ou
possÍÌm surgir em decorrên-
surgem como um resul-
do DNA. Portanto, as ligases
descontinuidades de fi- (b) Ligação de extremidades coesivas

ou as duas extremidades de -o-o-o
lllirtt
#
duas moléculas é exatamen- -.@(H .+
pelo fato de que duas liga-
4.20a).
Descontinuidades
da ligação
\
com extremidades ce-
eta não é rnuito ef,ciente. Is-
ìigada e, por isso, tem que Estrutura transitória mantida
associação casual. Se possí- por pareamênto de bapes
altas concentrações de DNA"
das moléculas.
\
Figura 4.20
é muito mais eficien- reações de
parear suas bases entre si por catalisadas pela
nte estável, sobre a : (a) ligação
sintetizadas rapidamente, as de extremi-
bases pareadas, embora tran- ffis cegas e (b) liga- A DNA-ligase sela as
o tempo durante o qual üfDde moléculas de ex- descontinuidades
üemidades coesivas.
88 T. A. Bnowlr
4.3.3 colocando extremidades coesivas em uma molécula de

extremidades cegas
Pelas razões detalhadas na seção anterior, extremidades coesivas compatíveis são desejáveis
em moléculas de DNA a serem ligadas em um experimento de clonagem gênica. Muitàs ve-
zes, tais extremidades coesivas podem ser obtidas a partir da digestão tanto do vetor quanto
do DNA a ser clonado com a mesma endonuclease de restrição, ou com diferentes enzimas
que produzem a mesma extremidade coesiva, embora isso nem sempre seja possível. É co-
mum ocoffer, por exemplo, que a molécula do vetor tenha extremidades coesivas, mas que os
fragmentos de DNA a serem clonados tenham extremidades cegas. Nessas circunstânciai, três
métodos alternativos podem ser utilizados para colocar as extremidades coesivas corretas nos
fragmentos de DNA.
Oligonucleotídeos de ligação
O primeiro desses métodos envolve o uso de oligonucleotídeos de ligação (/izfters). Esses
oligonucleotídeos são pequenos pedaços de DNA de fita dupla, de seqüência nucleotídica co-
nhecida, que são sintetizados em tubo de ensaio. Um oligonucleotídeo de ligação típico é
mostrado na Figura 4.2la.Ele possui extremidades cegas, mas contém um sítio de restrição, Figura 4
para BamHl no exemplo mostrado. A DNA-ligas e é capaz de ligar tais oligonucleotídeos às Cligonucleotídeos
extremidades de moléculas de DNA maiores, também cegas. Apesar de ser uma ligação de ex- fuação (linkers) e t
tremidades cegas, é possível executaÍ essa reação em particular de maneira bastante eficiente, rrrilÊ:açãs; (a) a eStn
pois oligonucleotídeos sintéticos, como os de ligação, são passíveis de produção em grandes mfípie de um oligo
quantidades e adicionados à mistura de ligação em uma concentração elevada. deotídeo de ligaçã
Mais de um oligonucleotídeo irá ligar-se a cada extremidade da molécula de DNA, produ- {b) a ligação de oli
nucleotídeos a u
zindo a estrutura em cadeia mostrada na Figura4.2lb.Mas a digestão com BamHI cliva as ca-
nnnnlécula de extremi
deias nas seqüências de reconhecimento, produzindo um grande número de oligonucleotídeos
des ceg
clivados e o fragmento de DNA original, agora portador de extremidades coesivas de BamHI.
Esse fragmento modifìcado está pronto para ligação em um vetor de clonagem clivado com
BamHL
Adaptadores
Há um problema em potencial na utilização de oligonucleotídeos adaptadores. Considere o
que iria acontecer se a molécula de extremidades cegas mostrada na Figura 4.21b contivesse
uma ou mais seqüências de reconhecimento de BamHI. Se esse fosse o caso, a etapa de restri-
ção necessiíriapara a clivagem dos oligonucleotídeos de ligação e produção das extremidades
coesivas também clivaria a molécula de extremidades cegas (Figura 4.22). Osfragmentos re-
sultantes teriam as extremidades coesivas coffetas, mas isso não compensaria o pioblema ge-
rado pela quebra em dois pedaços do gene contido no fragmento de extremidadãs cegas.
O segundo método para ligar extremidades coesivas a uma molécula de extremidades ce-
gas foi idealizado para evitar esse problema. Os adaptadores também são oligonucleotídeos
sintéticos curtos. Mas, ao contriírio dos oligonucleotídeos de ligaição, eles são sintetizados
de
maneira a já possuírem uma extremidade coesiva (Figura 4.23a). Obviamente, a idéia é ligar
a
extremidade cega do adaptador às extremidades cegas do fragmento para aprodução de
, uma
nova molécula com extremidades coesivas. O método pode parecer simples, mas, na prâtica,
ele leva ao surgimento de novos problemas. As exÍemidades coesivas de moléculas individuais lllm possível probl
do adaptador podem parear suas bases entre si, formando dímeros (Figura 4.23b), o que faz uuüIzação de oligont
com que a nova molécula de DNA continue tendo extremidades cegas (Figura 4.23c).As @- Compare esüa
ex-
tremidades coesivas poderiam ser recriadas pela digestão com uma endonuclease de restrição, suÌtado desejad
mas isso iria eliminar a vantagem primríria da utilização de adaptadores.
Ba'rrïl, como r
Cr-oruneeu GÊNrcA E ANÁusE oe DNA 89
(a) Um oligonucleotídeo de ligação típico
c-G -A- T-G-G-A-T- C- C-A-T- C-G

compatíveis são desej áveis tlttrlllllttlr
de clonagem gênica. Muitas ve- G-C-r- A€--c {; A-G -G {-A-G-c
digestão tanto do vetor quanto Sítio de BamHl
ou com diferentes enzimas
(b) A utilização de oligonucleotídeos de ligação
nem sempre seja possível. É co'
coeslvas, mas que os Molécula de Oligonucleotídeos
n/
Nessas circunstâncias, três extremidades cegas êê de ligação
êê
coesivas corretas nos ê
a9" DNA-ligase
de Iigação (finfters). Esses

de seqüência nucleotídica co-
de ligação típico é
mas contém um sítio de restrição, Figura 4.21
de ligar tais oligonucleotídeos às
de / "'^r,
BamHl
(Ínkers) e sua
Apesar de ser uma ligação de ex- t*t. ia^de coesivade BamHl
(a) a estrutu-
de maneira bastante eficiente, /
- ì-ï'ú-
de um oligonu-
passíveis de produção em grandes de ligação e
fgação de oligo- 1\
damolécula de DNA, produ- OligonucleotÍdeos
adigestão comBamHI cliva as cade extremidade ligação clivados
número de oligonucleoÍdeos des cegas.
extremidades coesivas de BamHL
vetor de clonagem clivado com
adaptadores. Considere o
na Figura 4.21b contivesse
esse fosse o caso, a etapa de resri-
e produção das extremidades
(Figwa4.22). Os fragmentos re-
BamHl
não compensaria o problema ge-
de extremidades cegas.
uma molécula de extremidades ce-
também são oligonucleotídeos
de ligação, eles são sintetizados de
4-23a). Obviamente, aidéia é ligara
--ttt-- -E-
fragmento, para a produção de uma
Figura4.22
parecer simples, mas, na práticq
possível problema decorrente da
-Éat-- -í- --E-
coesivas de moléculas individuais
de oligonucleotídeos de liga- -í- -í-
dímeros (Figura 4.23b), o que faz
Gompare esta situação com o re- -Ê-
idades cegas (Figura 4.23c). As ex- güado desejado da restrição com Clivagens devidas a
com uma endonuclease de restrição, Berrifll, como mostrado na Figura sítios de EamHl internos
4.21b.
90 T. A. Bnowlr
(a) Um adaptador típico
G_A-T-C_C-C_G-G
ttlt
c-c_c_c
Extremidade coesiva de Bam9l
(b) Adaptadores podem ligar-se uns aos outros

-
-A-T-C-C-C-c-G
lttt Figura 4.23
G-G-C-C-C-T-A- G-G-C-C Os adaptadores e o
problema potencial
decorrente de seu
uso. (a) Adaptador tí-
(c) A nova molécula de DNA ainda possui extremidades cegas pico. (b) Dois adapta-
dores podem ligar-se
um ao outro para pro-
duzir uma molécula
E_ \_ similar a um oligonu-
Adaptadores cleotídeo de ligação,
6_-í
de modo que (c) após
oj a ligação de adapta-
\ DNA-risase
dores a moléculas de
extremidades cegas,
elas ainda apresen-
tam esse tipo de ex-
tremidade, necessi-
Os adaptadores ligam-se tando, portanto, de
uns aos outros uma etapa de restri-
ção.
A resposta para esse problema está na estrutura química precisa das extremidades da mo-
lécula adaptadora. Normalmente, as duas extremidades de uma fita polinucleotídica são qui-
micamente distintas, um fato que se torna claro a partir do exame da estrutura po-
limérica do DNA (Figura 4.24a). Uma das extremidades, chamada"uidudoro
de 5'-terminal, é portaão-
ra de um grupo fosfato (5'-P); a outra, a 3'-terminal, possui um grupo hidroxila (:'-ou).
Na
hélice dupla, as duas fitas são antiparalelas (Figura4.24b), de modo que cada extremidade
de Ftgura
uma molécula de fita dupla consiste em um terminal 5'-P e um terminal 3'-OH. A ligação
nor- mücürçao enfe c
malmente acontece entre as extremidades 5'-p e 3'-OH (Figura 4.24c).
5e 3'de um
As moléculas adaptadoras são sintetizadas de modo que a extremidade cega é a mesma nudeoti
de
um DNA "natural", mas a extremidade coesiva é diferente. O terminal 3'-OH da
extremidade
coesiva é o usual, mas o terminal 5'-P é modificado; ele não possui o grupo fosfato,
sendo, na
verdade, um terminal 5'-oH (Figura 4.25a).4 DNA-ligase é incapaid" fo.-u.
uma ligação
fosfodiéster entre extremidades 5'-oH e 3'-oH. o resultado disso é que, embora Produçã
,errp..
ocoffa o pareamento de bases entre as extremidades coesivas de moléculas adaptadoras, cauda h(
eisa
associação nunca é estabilizada por ligação (Figura 4.25b).
os adaptadores podem, portanto, ser ligados a uma molécula de DNA, mas não uns aos Atécnicad
outros. Depois da ligação dos adaptadores, os terminais 5'-OH anormais são convertidos dagem radi
à DÌrIA de er
forma 5'-P natural por tratamento com a enzimapolinucleotídeo-quinase (p. 70), originando
as subunid:
um fragmento de extremidade coesiva que pode ser inserido em um vetor adequado.
Daé 'rn ex
Í
i
Cloruncev GÊrurcn e AruÁuse oe DNA 91
?, (a) A estrutura de uma

o- Íita polinucleotídica
O-P:O mostrando a distinção
química entre os
o
Um \ terminais 5'-P e 3'-OH
nucleotídeo
Figura 4.23
Os adaptadores e o
problema potencial
-O-P:O
o
decorrente de seu
uso. (a) Adaptador tÊ
\ cF.o__._ïa."
V
pico. (b) Dois adapta-
dores podem ligar-se
um ao outro para pro-
duzir uma molécula o
similar a um oligonu- -o-eço
cleotídeo de ligação, o
de modo que (c) após t"". Base
a ligação de adapta- ",
dores a moléculas de
extremidades cegas,
elas ainda apresen- (b) Na hélice dupla, as Íitas polinucleotídicas çì
OH
tam esse tipo de ex- são antiparalelas
tremidade, necessi- s', 3'
3',
tando, portanto, de "D K

uma etapa de restri-
ção.
3', s',
(c) A ligação acontece entre teÌminais

5'-P e 3'-OH
precisa das extremidades da mo-
E.
r....@e D'
"'ma fita polinucleotídica são qui-
€trame cuidadoso da estrutura po-
de S'-terminal, é portado-
3'-ôôôo-o-o-o-o- 5'
I
um grupo hidroxila (3'-OH). Na

I
modo que cada extremidade de Figura4.24 5' 3'
terminal 3'-OH. A ligação nor- -@o-r@
tttttr
entre os ter- o.-tH_ -,
4.24c). 5'e 3'de um poli- ^,{rcrCrGr:n}r}:f,-
iJC
a ertremidade cega é a mesma de nucleotídeo.
terminal 3'-OH da extremidade
possui o grupo fosfato, sendo, na
é incapaz de formar uma ligação
disso é que, embora semprc Produção de extremidades coesivas por síntese de
de moléculas adaptadoras, essa cauda homopolimérica
A técnica de síntese de cauda homopolimérica (homopolymer tailing) representa uma abor-
de DNA, mas não uns aos
dagem radicalmente diferente para a produção de extremidades coesivas em uma molécula de
{H anormais são convertidos à DNA de extremidades cegas. Um homopolímero é simplesmente um polímero no qual todas
inase (p. 70), originando
as subunidades são iguais. Uma fita de DNA feita inteiramente de, digamos, desoxiguanosi-
em um vetor adequado.
na é um exemplo de homopolímero, que é chamado de polidesoxiguanosina ou poli(dG).
vel o sut
(a) A estÍutura precisa de um adaptadoÌ rimento r
combina
to-o-o-r-c-c-c-c que com
-oto'
,/ -é-ò-ò-ò-Poá
terminá Ho-
-OH modificado
Figura 4.25
O uso de adaptado-
res: (a) A estrutura
real de um adapta-
dor, mostrando o
terminal 5'-OH mo-
diÍicado. (b) Conver-
são das extremida-
des cegas em coesi-
vas pela ligação de
adaptadores.
A síntese de uma cauda envolve a enzima desoxinucleotidil-transferase terminal (p. 70),

que adiciona uma série de nucleotídeos às extremidades 3'-OH de uma molécula de DNA de
fita dupla. Se essa reação é executada na presença de apenas um desoxirribonucleotídeo, é Figura,
produzida uma cauda homopolimérica (Figura 4.26a). gi[nlese de caude
É óbvio que, para ser possível a ligação de duas moléculas adicionadas de cauda, os ho- mmpolimérica (âc
mopolímeros devem ser complementares. Freqüentemente, caudas de polidesoxicitosina (po- wmertailind,
litdcl) são ligadas ao vetor e de poli(dG) são ligadas ao DNA a ser clonado. Quando as mo- úÈse de uma cz
léculas de DNA são misturadas, ocoÍïe o pareamento de bases entre as duas caudas (Figura llrunopolimérica
4.26b). onsfução de
Na prática, as caudas de poli(dG) e poli(dC) em geral não são exatamente do mesmo ta-
mdéorla de DNI
manho, além de as moléculas recombinantes com bases pareadas resultantes apresentarem
mmtÉnnte a part
um wtor e de ul
quebras e descontinuidades (Figura 4.26c). A reparação dessas moléculas é, portanto, um pro-
Gbde DNA, an
cesso de duas etapas, que utiliza a polimerase de Klenow para preenchimento das quebras, se-
dhirnados de ca
guida da ação da DNAJigase, para a síntese das ligações fosfodiéster faltantes. Nem sempre e {c) reparaçã
é necessário que a reação de reparação seja executada em tubo de ensaio. Se as caudas homo- mrmmlárlade DN
poliméricas complementares forem mais longas do que 20 nucleotídeos, são formadas asso- ourtÍnante. dC
ciações por pareamento de bases bastante estáveis. Uma molécula de DNA recombinante 5'-lribsfato de 2
mantida unida por pareamento de base, mas não completamente ligada, é muitas vezes está- soxicitÍ
Cr-ounoeu GÊNrcA E ANÁLrsE oe DNA 93
vel o suficientepara ser introduzida em uma célula hospedeira, no estágio seguinte do expe-
rimento de clonagem (Figura 1.1). Uma vez no interior da hospedeira, a molécula de DNA re-
combinante poderá ser reparada pela DNA-polimerase e pela DNA-ligase da própria çélula,
que completarão a construção iniciada em tubo de ensaio.
(b) Ligação de caudas homopoliméricas
Figura 4.25
O uso de adaptado- G
G
res: (a) A estrutura G
G
real de um adapta-
dor, mostrando o
terminal 5'-OH mo-
diÍicado. (b) Conver- -c^
-c:c^
são das extremida-
des cegas em coesF Vetor - caudas de poli(dC)
ï\----.
vas pela ligação de
adaptadores. G
lnserto dê DNA -
caudas de poli(dG) )
-C6
clc
terminal (p.70),
uma molécula de DNA de Molécula de DNA recombinante
desoxirribonucleotídeo, é Figura 4.26 (c) As etapas de reparação
de cauda ho- 0uebra
ionadas de cauda, os ho- ilmpdimérica (homa --'---r----r-----T--f-G-G-G-G / r---r l-rT-----
II
de polidesoxicitosina (po- pfuner tailing): (a) Ë;-ë-ë-c-c-c
"
ser clonado. Quando as mo- de uma cauda ./"
Descontinuidade
as duas caudas (Figura lliunopolimérica, (b)
ustrução de uma
exatamente do mesmo ta-
rrËqrla de DNA re-
a partir de A polimerase de Klenow
resultantes apresentarem
umìretor e de um in- repara a quebra
las é, portanto, um pre
de DNA, ambos
das quebras, se- r-r--r-r--rG-G
de cauda, -G-G -G -G-G
rrrrrf_c_c_c_c_c_c
faltantes. Nem sempru e (c) reparação da
ensaio. Se as caudas homo- tmÉrlade DNA re- \"""""
Ídeos, são formadas unrnôinante. dCTP = Aìgase repaÍa as
de DNA üi.üilosfato de 2'-de- descontinuidades
ligada, é muitas vezes está soxicitidina.
94 T. A. Bnowr.r
Leituras adicionais
Brown, T.A. (1998) Molecular Biology Labfar. Volume I: Recombinant DNA, 2nd edn. Academic press,
London.
[Contém detalhes a respeito de todos os tipos de enzimas utilizadas na manipulação de DNA e RNA.]
Jacobsen, H., Klenow, H. & Overgaard-Hansen, K. (1974) The N-terminal amino acid sequences
of DNA polymera-
selfromEscherichiacoliandofthelargeandsmallfragmentsobtainedbyalimitedproteolysis. EuropeanJour-
nal of Biochemistry, 45, 623-7 . [Produção do fragmento de Klenow da DNA-polimerase I.]
Lobban, P. & Kaiser, A.D . (1973) Enzymatic end-to-end joining of DNA molecules. Joumal of Molecular Biology.,
79, 453-71. [Ligação.]
McDonell, M.W., Simon, M.N. & Studier, F.W. (1977) Analysis of restriction fragments of T7 DNA and determina-
tion of molecular weights by electrophoresis in neutral and alkaline gels. Journal of Molecular Biotogy, Il0,
1 19-46. [Um exemplo inicial do uso da eletroforese em gel de agarose na análise dos tamanhos de fragmentos
de restrição.l
REBASE: wwwneb.com/rebase/rebase.html [Uma listagem abrangente de todas as endonucleases de restrição co-
nhecidas e dos respectivos sítios de reconhecimento.]
Roústeìn, R.J., Lau, L.F., Bahl, C.P., Narang, N.A. & Wu, R. (1979) Synthetic adaptors for cloning DNA. Methods
in Enzymology, 68, 98-109.
Smith' H.O. & Wilcox, K.W. (1970) A restriction enzyme from Haemophilus influenTae. Journal of Molecular Bioptg;.
51, 379-91. [uma das primeiras descrições completas de uma endonuclease de restrição.]
t\s
cu}
tro(
pan
nÍì5
con
der
mitt
rre{
süEl
c,op
pôÍr
zes
DN.
mili
€tap
bink
i
nig,
$ar c
hém
DTLJ
CnpÍrulo 5
;2nd edn. Academic press, London.
ipulação de DNA
n
e RNA.I
acid sequences of DNA polymera-
lntrodução de DNA em Células Vivas
r limited proteolysis. European Jour-
[-polimerase I.]
ales. Journal of Molecular Biotogy,
iagments olTT DNA and determina-

Iournal of Molecular Biology, ll0,
do, tamanhos de fragmentos
Talir"
hs as endonucleases de restrição co-
{upto., for clo.ning DNA. Methods
v4te Joumal of Molecular Biology,

;de restrição.]
Transformação: a incorporação de DNA por células Introdução de DNA de fagos em células bacterianas,
bacterianas, 98 105
Identificação de recombinantes, l0l Identificação de fagos recombinantes, I 09
Transformação de células não-bacterianas, I l0
As manipulações descritas no Capítulo 4 permitem que o biólogo molecular crie novas molé-
culas de DNA recombinante. A etapa seguinte em um experimento de clonagem gênica é a in-
trodução dessas moléculas em células vivas, geralmente bactérias, que então multiplicam-se
para produzir clones (Figura 1.1). Estritamente falando, a palavra "clonagem" refere-se ape-
nas aos estágios finais do processo e não propriamente à construção da molécula de DNA re-
combinante.
A clonagem serve a dois propósitos principais. Primeiramente, ela permite que um gran-
de número de moléculas de DNA recombinante seja produzido a partir de uma quantidade li-
mitada de material de partida. No início, podem estar disponíveis apenas uns poucos nanogra-
mas de DNA recombinante, mas cada bactéria que incorpora um plasmídeo divide-se subse-
qüentemente várias vezes para produzir uma colônia, na qual cada célula contém múltiplas
cópias da molécula. Viírios microgramas de DNA recombinante podem, via de regra, ser pre-
parados a paÍir de uma única colônia bacteriana, o que representa um aumento de 1.000 ve-
zes sobre a quantidade inicial (Figura 5.1). Se a colônia é uirllizada não como uma fonte de
DNA, mas como um inóculo para uma cultura líquida, as células resultantes podem fornecer
miligramas de DNA, um aumento de um milhão de vezes no rendimento. Dessa maneira, a
etapa de clonagem é capaz de suprir as grandes quantidades de DNA necessárias para estudos
biológico-moleculares da estrutura e da expressão gênicas (Capítulos 10 e 11).
A segunda função importante da clonagem pode ser descrita como de purificação. As ma-
nipulações que resultam em uma molécula de DNA recombinante apenas raramente podem
ser controladas ao ponto de não permitirem que qualquer outra molécula de DNA esteja tam-
bém presente no final do processo. A mistura de ligação pode conter, além da molécula de
DNA recombinante, uma quantidade variável dos seguintes componentes (Figura 5.2a):
96 T.A.Bnown
oo
oOO
Uma única célula contendo
múltiplas ópias de uma
o-ôo_o
ooE molécula de DNA recombinante
Permite a obtenção
de várias pg de DNA
recombinante
lnoculação em 500 ml de
meio líquido, incubação
por 1 I horas
Permite a obtenção de
várias mg de DNA Figura 5.1
._.2
recombinante A clonagem é capazde
gerar grandes quantida-
des de DNA recombi-
nante.
(1) Moléculas de vetor que não foram ligadas.

(2) Fragmentos de DNA que não foram ligados.
(3) Moléculas do vetor que foram recircularizadas sem a inserção de qualquer DNA (vetor
"autoligado").
(4) Moléculas de DNA recombinante portadoras de fragmentos de DNA inseridos incor-
retamente.
Moléculas não-ligadas raramente causam algum problema, pois, mesmo que sejam incor-
poradas por células bacterianas, somente sob circunstâncias excepcionais serão replicadas. É
muito mais provável que esses pedaços de DNA sejam degradados por enzimas da bactéria
hospedeira. Por outro lado, moléculas de vetor autoligadas e Blasmídeos recombinantes incor-
retos são replicados de maneira tão eficiente quanto a molécula desejada (Figura 5.2b). Mes-
mo assim, a purificação da molécula desejada ainda pode ser conseguida por meio da clona-
gem, pois é extremamente incomum que qualquer célula incorpore mais de uma molécula de
DNA. Cada célula dá origem a uma única colônia, de modo que cada um dos clones resultan-
tes consiste em células que contêm a mesma molécula. É claro que colônias diferentes con- Figura 5
têm moléculas diferentes: algumas guardam a molécula de DNA recombinante desejada, ou- A clonaç
tras possuem diferentes moléculas recombinantes e outras, ainda, contêm o vetor autoligado. diÍerents
O problema passa a ser, portanto, a identificação das colônias com plasmídeos recombinantes
corretos.
Cr-orunceu GÊNrcA E ANÁLrsE DE DNA 97
(a) Os produtos da ligação

, Fragmentos de
Moléculas de vetor
não-lisados
\ T*o autoligadas
u
í- L Vo"""
\_-/
ti /--\ ,--Gene
\_-_. \_-,
Moléculas de vetor A molécula de DNA
recombinante
i,r-.-rhÀ^
li::ïï',ï'"Í'"""-^
aìo
\í-ì
desejada
"incorretas"
\----i
(b) Todas as moléculas circulares serão clonadas
Figura 5.1
A clonagem é capaz de
gerar grandes quantida- Célula contendo Célula contendo uma
des de DNA recombi- o vetor autoligado molécula de DNA
nante. recombinante "inconeta"
de qualquer DNA (vetor Célula contendo a

molécula desejada
de DNA I
I
pois, mesmo que sejam incor-
ionais serão replicadas. É
por enzimas da bactéria
recombinantes incor-
/ \
desejada (Figura 5.2b). Mes-
Clone do vetor autoligado \ Clone de uma
conseguida por meio da clona- O clone desejado molécula "incorreta"
mais de uma molécula de
cada um dos clones resultan-
que colônias diferentes con- Figura 5.2
recombinante desejada, ou- A clonagem é análoga a um processo de purificação. A partir de uma mistura de moléculas
, contêm o vetor autoligado. diferentes, podem ser obtidos clones contendo cópias de apenas uma molécula.
plasmídeos recombinantes
98 T.A. Bnowru
Este capítulo trata da maneira pela qual vetores plasmidiais e virais e moléculas recombi-
nantes deles derivadas são introduzidos em células bacterianas. Ao longo do capítulo, ficaní
Itl2 Prepara
evidente que a seleção de colônias contendo moléculas recombinantes em meio a colônias Assim co
com o vetor autoligado é relativamente simples. O mais difícil é a distinção entre clones com fuadamen
a molécula de DNA recombinante correta e todos os demais clones recombinantes, que será do foi obs
tratada no Capítulo 8. lada capu
mM de clr
cloreto de
5.1 TrasÍormação: a incorporação de DNA por Ainda
células bacterianas deterrnina
responsáv
ja qual for
A maioria das espécies de bactéria é capaz de incorporar moléculas de DNA a partir do meio
corporaçã
no qual elas se multiplicam. Muitas vezes, uma molécula de DNA incorporada dessa manei-
exterior ú
ra é degradada, mas, ocasionalmenÍe, ela é capaz de sobreviver e replicar-se na célula hospe-
efetiva mc
deira. Isso acontece sobretudo se a molécula de DNA for um plasmídeo com uma origem de
breve elev
replicação reconhecida pelo hospedeiro.
que térmi(
A incorporação e a manutenção estável de um plasmídeo é em geral detectada a partir da
análise da expressão de genes nele contidos (p. 25).Por exemplo, células de E. coti'são nor-
Seleção r
malmente sensíveis aos efeitos inibitórios da multiplicação proporcionados pelos antibióticos
ampicilina e tetraciclina. Entretanto, células que contêm o plasmídeo pBR322 (p. 116-l l7)" A transfor
um dos primeiros vetores de clonagem a serem desenvolvidos, ainda na década de 1970, são cuidadosar
resistentes a tais antibióticos. Isso ocorrb porque pBR322 é portador de alguns genes especí Possa gera
ficos: um gene que codifica uma p-lactamase, enzima que modifica a ampicilina para de todas as
forma não-tóxica para abacténa, e um conjunto de genes que codificam enzimas que pe+rcnatr
xificam a tetraciclina. A entrada de pBR322 nas células de E. coli pode ser detectada te. Esse últ
as bactérias são transformadas de sensíveis à ampicilina e à tetraciclina(amp'tet') em resi
tes a esses antibióticos (ampotet*).
Em anos mais recentes, o termo transformação foi estendido e passou a incluir a incr-
poração de qualquer molécula de DNA por qualquer tipo de célula, independentemente de eri
sa incorporação resultar ou não em uma alteração detectável na célula e não importando se t
célula envolvida é de uma bactéria, de um fungo, de um animal ou de um vegetal.
5.1.1 Nem todas as espécies de bactéria incorporam DNA

com a mesma eficiência
Na natureza, a transformação provavelmente não é um processo importante para a
de material genético por paÍte das bactérias. Um reflexo disso é que, em laboratório, somerF.
te algumas poucas espécies (especialmente membros dos gêneros Bacillus e
podem ser transformadas com facilidade. Um estudo cuidadoso desses organismos
que eles possuem mecanismos sofisticados para ligação do DNA às células e para a ì
ração do mesmo.
A maioria das espécies de bactéria, inclusive E. coli, incorpora apenas quantidades li
tadas de DNA sob circunstâncias normais. Para transformar tais espécies eficientemente,
bactérias devem passar por alguma forma de tratamento fisico e/ou químico que aumente
suas capacidades de captação de DNA. Células submetidas a esse tratamento são ditas
petentes.
Figura 5Í
aoDNAei
pot
bacterian€
competente
Croruncev GÊNrcA E ANÁLtsE oe DNA 99
e virais e moléculas recombi-

Ao longo do capítulo, ficará
sl.2 Preparação de células de E. colicompetentes
em meio a colônias Assim como muitos dos avanços na tecnologia de DNA recombinante, o desenvolvimento
o distinção entre clones com fundamental em relação à transformação também ocorreu no início da década de 1970, quan-
recombinantes, que será do foi observado que células de E. coli que haviam sido incubadas em uma solução de sal ge-
lada captavam DNA de forma mais eficiente do que células não-tratadas. Uma solução de 50
mM de cloreto de cálcio (CaClr) é usada tradicionalmente, embora outros sais, em especial o
cloreto de rubídio, também sejam eficientes.
Ainda não se sabe exatamente por que esse tratamento funciona. Possivelmente, o CaCl,
determina a precipitação do DNA sobre a superfície externa das células ou, talvez, o sal seja
responsável por algum tipo de alteração na parede celular que favoreça a ligação ao DNA. Se-
ja qual for o caso, a incubação em CaCl, afeta apenas a ligação ao DNA e não a sua efetiva in-
de DNA a partir do meio
corporação pela célula. Quando DNA é adicionado a células tratadas, perÍnanece ligado ao
incorporada dessa manei-
exterior das mesmas, não sendo transportado para o citoplasma nesse estágio (Figura 5.3). A
replicar-se na célula hospe-
efetiva movimentação do DNA para o interior das células competentes é estimulada por uma
com uma origem de
breve elevação da temperatura para 42'C. Mais uma vez, o porquê da efetividade desse cho-
que térmico perïnanece desconhecido
leral detectada a partir da
cÉlulas de E. coli são nor- 6.1.3 Seleção de células transÍormadas
ionados pelos antibióticos
ídeo pBR322 (p. 116-117), A transformação de células competentes é um processo ineficiente, mesmo quando elas são
mla na década de 1970, são cuidadosamente preparadas. Embora 1 ng do vetor plasmidial chamado puC8 (p. I I 8- I 19)
de alguns genes especí- possa gerar de I .000 a I 0.000 transformantes, isso representa a incorporação de apenas 0,0 I 7o
a ampicilina para uma de todas as moléculas disponíveis. Ademais, 10.000 transformantes representam apenas uma
ificam enzimas que desto- pequena proporção do número total de células que estão presentes em uma cultura competen-
te. Esse último fato implica a necessidade de encontrar alguma maneira para distinguir-se en-
@e ser detectada porque
(amp' tet') em resisten-
e passou a incluir a incor-

independentemente de es-
e não importando se a
Plasmídeo ligado
DNA ao exterior da célula
Bactéria normal
mportante para a obtenção

. em laboratório, somen-
Bacillus e Streptococcus)
,lesses organismos revelou
ìrs células e para a incorpo-
apenas quantidades limi- Célula competente Plasm ídeo transportado

es@ies eficientemente, as para o interior da célula
químico que aumente as
tratamento são ditas com-
Figura 5.3
Aligação ao DNA e a
ua incorporação por
uuna célula bacteriana Célula transÍormada
competente.
100 T. A. Bnowlr
tre uma célula que incorporou um plasmídeo dos muitos milhares de células que não foram as cólula
transformadas. resistênc
A resposta para o problema é aúilização de um marcador de seleção presente no plasmí-
deo. Um marcador de seleção é simplesmente um gene que confere uma nova característica à
célula transformada, que não ocorre em uma bactéria não-transformada. Um bom exemplo de W ldentifir
marcador de seleção é o gene de resistência à ampicilina de pBR322. Após um experimento
de transformação com pBR322, somente aquelas células que incorporaÍam o plasmídeo são O plaqut
o*p*t"f e capazes de formar colônias em um meio de ágar que contém ampicilina ou tetraci- formant(
clina (Figura 5.4); não-transformantes, que ainda sáo ampstets, não produzem colônias no tas por cr
meio seletivo. Células transformantes e não-transformantes são, portanto, facilmente distin- tor autol
guidas umas das outras. to de DÌr
A maioria dos vetores de clonagem carrega pelo menos um gene que confere resistência a combin:
antibiótico às células hospedeiras, com a seleção de transformantes sendo feita por plaquea- inativadr
mento em meio de ágar que contém o antibiótico relevante. Tenha em mente, contudo, que a da inatir
resistência ao antibiótico não é devida meramente à presença do plasmídeo nas células trans- pBR322
formadas. O gene de resistência no plasmídeo também deve ser expressado para sintetização
da enzima que destoxifica o antibiótico. A expressão do gene de resistência começa imedia- t21 Seleção
tamente após a transformação, mas leva alguns minutos até que a célula contenha uma quan- deumg
tidade de enzima suficiente para ser capaz de suportar os efeitos tóxicos do antibiótico. Por
O pBR3l
essa razão, as bactérias transformadas não devem ser plaqueadas em meio seletivo imediata-
mente após o tratamento por choque térmico. Em primeiro lugar, elas devem ser colocadas em
tura do r
exemplo
um pequeno volume de meio líquido, na ausência de antibiótico, e incubadas por um cuÍo pe-
sistência
íodo. A replicação plasmidial e a expressão podem então ser iniciadas, de modo que, quando
adiciona
tetracicl
DNA ins
ampicilir
Célula de
Célula de E. coli normal E. coli
(sem plasmídeos)
contendo
plasmídeos
pBR322
Não
sobrevive Sobrevive e produz
uma colônia Fi,
Epessao Íenotípi
Figura 5.4 ihrmuôaçao a 37"C 1
Seleção de célu- mnailes do plaqu

las que contêm ieürÌmrrta a taxa de
plasmídeos uÉÍrcia das transfu
pBR322 por pla- ümntndoseletirrc, p
queamento em MÉrias tiveram te
AgaÍ contendo 40 pg/ml de ampicilina, meio de ágar con- nnffiara síntese c
15 pg/ml de tetraciclina ou uma combinação de ambas tendo ampicilina mms de resistêrrci
e/ou tetraciclina.
Clorurceu GÊrurcn e AruÁlrse oe DNA 101
de células que não foram as células forem plaqueadas e encontrarem o antibiótico, elas já terão sintetizado enzimas de
resistência suficientes para poder sobreviver (Figura 5.5).
seleção presente no plasmí-
uma nova característica à
Um bom exemplo de ü.2 Identificação de recombinantes
22. Após um experimento
orporaram o plasmídeo são O plaqueamento em um meio seletivo permite a distinção entre transformantes e não-trans-
contém ampicilina ou tetraci- formantes. O problema seguinte é determinar quais das colônias transformantes são compos-
. não produzem colônias no tas por células que contêm moléculas de DNA recombinante e quais contêm moléculas de ve-
portanto, facilmente distin- tor autoligadas (Figura 5.2). Na maioria dos vetores de clonagem, a inserção de um fragmen-
to de DNA no plasmídeo destrói a integridade de um dos genes presentes na molécula. Os re-
Eene que confere resistência a combinantes podem, portanto, ser identificados porque a caracteística codificada pelo gene
tes sendo feita por plaquea- inativado não é mais apresentada pelas células hospedeiras (Figura 5.6). Os princípios gerais
em mente, contudo, que a da inativação por inserção são ilustrados por um experimento de clonagem típico usando
plasmídeo nas células trans- pBR322 como vetor.
erpressado para sintetização
resistência começa imedia- 1 Seleção de recombinantes com pBR322: inativação por inserção
a célula contenha uma quan- de um gene de resistência a antibiótico
tóxicos do antibiótico. Por
em meio seletivo imediata- O pBR322 possui vários sítios de restrição únicos, os quais podem ser utilizados para a aber-
elas devem ser colocadas em tura do vetor antes da inserção de um novo fragmento de DNA (Figura 5.7a). BamHI, por
e incubadas por um curto pe- exemplo, cliva pBR322 em apenas uma posição, no agrupamento de genes que codifica a re-
iadas, de modo que, quando sistência à tetraciclina. Uma molécula de pBR322 recombinante, que carÍega um segmento
adicional de DNA no sítio de BamHI (Figura 5.7b), não é mais capaz de conferir resistência à
tetraciclina para a célula hospedeira, pois um dos genes necessários foi interrompido pelo
DNA inserido. Células com essa molécula de pBR322 recombinante ainda são resistentes à
ampicilina, mas são sensíveis à tetraciclina çampRtef).
Proteína de resistência
a antibiótico
Plasmídeo
lmediatamente após
a transÍormação
Figura 5.S
Eryressão Íenotípica. U ma
Figura 5.4 hnòação a37'C por t ho-
Seleção de célu- m antes do plaqueamento
las que contêm rflrrÌenta a taxa de sobrevi-
plasmídeos r€ncia das transformantes
pBR322 por pla- um rneio seletivo, porque as Após incubação a
queamento em lMérias tiveram tempo pa- 37"C por t hora
meio de ágar con- mhiciar a sÍntese das enzi-
tendo ampicilina mas de resistência a anti-
e/ou tetraciclina. biótico.
1O2 T.A.Bnowru
(a) Molécula de vetoÌ normal
--_____-------à Produto do gene
Gene-alvo para
inativação por inserção
(b) Molécula de vetor recombinante
Figura 5.6
lnativação por inserção. (a)
A molécula de vetor não-re-
combinante normal é porta-
dora de um gene cujo pro-
______________-, Sem o produto
duto conÍere uma caracte-
do gene
rística selecionável ou iden-
Oretor de clonagem
tificável à célula hospedei-
llhÍa normal do vetor
lh recombinante cont€
ra. (b) Esse gene é inativa-
adicional de DNA i
do quando novo DNA é in-
serido no vetor; em conse-
fufiI\. Para um rna
qüência disso, o hospedei- de pBR3
Gene-alvo interrompido
ro recombinante não apre-
senta a característica rele-
vante.
tÍ;,n 2 A inativaçi
resistêncii
A seleção de recombinantes de pBR322 é executada da seguinte maneira. Após a transfor- A inativação
mação; as células são plaqueadas em meio com ampicilina e incubadas até que apareçam âs veniente par
colônias (Figura 5.8a). Todas essas colônias são transformantes (lembre-se de que células plasmidiais u
não-transformadas são a^pt e não produzem colônia no meio seletivo), mas somente umas tador do gen
poucas contêm moléculas de pBR322 recombinantes: a maioria tem o plasmídeo normal, au-
enzima p-gal
toligado. Para identificação dos recombinantes, as colônias são plaqueadas em réplica em
lacZ, coma
meio de ágar que contém tetraciclina (Figura 5.8b). Após a incubação, algumas das colônias
dase (Figura
originais desenvolvem-se novamente, enquanto outras, não (Figgra 5.8c). Aquelas que se de-
A p-galar
senvolvem consistem em células portadoras do pBR322 normal, sem inserção de DNA, e,
mais galactor
portanto, de um agrupamento funcional de genes de resistência à tetraciclina (amp*tet*;. As
mo de E. coli
colônias que não se desenvolvem em ágar com tetraciclina são recombinante s (amp*tets); co-
um segmento
mo a posição delas nas placas é conhecida, é possível a recuperação de amostras para estudos
sidase (Figur
adicionais a partir da placa original de ágar com ampicilina.
abrigam um I
Um exper
com ampicilir
lactosidase. C
Croruncev GÊNtcA E ANÁLtsE oe DNA lGl
(a) A molécula normal do vetor
Gene de
resistência
à ampicilina
Agrupamento
de genes de
resistência à
tetraciclina
ampRte4
(b) Uma molécula de pBR322 recombinante
Novo DNA inserido

, Figura 5.6 no sítio de BarnHl
lnativação por inserção. (a)
A molécula de vetor não-re-
combinante normal é porta-
dora de um gene cujo pro-
Figura 5.7
duto conÍere uma caracte-
O vetor de clonagem pBR322: (a) a mo-
rística selecionável ou iden-
Scr.rla normal do vetor e (b) uma molécu-
tificável à célula hospedei-
ür recombinante contêndo um segmento
ra. (b) Esse gene é inativa-
adicional de DNA inserido no sítio de
do quando novo DNA é in-
BarrlÍ{l. Para um mapa mais detalhado ampqteF
serido no vetor; em conse-
de pBR322, ver Figura 6.1.
qüência disso, o hospedei-
ro recombinante não apre-
senta a característica rele-
vante.
W22 A inativação por inserção nem sempre envolve
resistência a antibiótico
inte maneira. Após a transfor- A inativação por inserção de uma resistência a antibiótico constitui-se em uma maneira con-
incubadas até que apareçam as veniente para a identificação de recombinantes. Apesar disso, vários vetores de clonagem
(lembre-se de que células plasmidiais utilizam um sistema diferente. Um dos exemplos é pUCS (Figura 5.9a), que é por-
io seletivo.y. mas somente umas tador do gene de resistência à ampicilina e de um gene chamado lacZ' , que codihca parte da
ia tem o plasmídeo normal, au- enzima B-galactosidase. A clonagem com pUC8 envolve a inativação por inserção do gene
sao plaqueadas em réplica em lacZ' , com os recombinantes sendo identificados pela incapacidade de sintetizar
B-galactosi-
bação, algumas das colônias dase (Figura 5.9b).
5.8c). Aquelas que se de- A B-galactosidase é uma das váriap enzimas envolvidas na quebra de lactose em glicose
sem inserção de DNA, e, mais galactose. Ela é normalmente codificada pelo gene lacZ, que está situado no cromosso-
a à tetraciclina (amp*tef;. As mo de E coli. Algtmas linhagens de E. coli possuem um gene lacZmodifiçado, que não tem
recombinante s Tamp* t ett 7 ; co- um segmento denominado lacZ' , que codifica a porção chamada de peptídeo u da
B-galacto-
de amostras para estudos sidase (Figura 5.10a). Esses mutantes são capazes de sintetizar a enzima somente quando
abrigam um plasmídeo, como pUC8, que é portador do segmento lacZ'faltante do gene.
Um experimento de clonagem com pUCl8 envolve a seleção de transformantes em ágar
com ampicilina, seguida pela identificação de recombinantes com base na atividade de p-ga-
lactosidase. Células portadoras de um plasmídeo pUCS normal são ampR e cap.ves de sinte-
104 T.A. Bnowr
(a) Colônias em meio com ampicilina
(b) Plaqueamento em réplica
I Blocode I I I
I madeira I .l I Cétutasaderidas
I 1..r.,r.'...1 ,/ 1r...r..r......1 ao bloco
Superfície
de toque
' / ï-f-\---
I / de toque I
WM
rncunaçao
meio
Colônias em Meio com
\ /
com ampicilina tetraciclina ColôÀias tetB
@ ueúor de clonagem
(c) Colônias amfteF desenvolvem-se em meio com tetraciclina lnrmltÉcrrla de vetor non
Ímrécula recombiÍìar
I]llll]rÍ| segmento adiciona
Posição de recombinante ampqteÊ
serido no sítio de,
|l]lÍÈepas mais detalhad

ver Figur
Não-recombina nles am pR tef
tem uma cq
Figura 5.8 sídeo,IPTG
Seleção de recombinantes de pBR322 por inativação por inserção do gene de resistência à tes, formadr
tetraciclina. {a) As células são plaqueadas em ágar com ampicilina: todas as transÍormantes binantes, cot
produzem colônias. (b) As colônias são plaqueadas em réplica em meio com tetraciclina. (c) cas. Esse sis
As colônias que se desenvolvem em meio com tetraciclina são amp'tef e, portanto, não-re-
combinantes. Recombinantes (ampBtef) não se desenvolvem, mas suas posições na placa
de ampicilina são conhecidas.
E3 lntroduçã
Existem doi:
tizar B-galactosidase (Figura 5.9a); recombinantes também são ampR, mas são incapazes de
da com um r
produzir B-galactosidase (Figura 5.9b).
A identificação da presença ou da ausência da p-galactosidase é de fato bastante fácil. Em ção e empr
vez de realizat um ensaio para a detecção da quebra de lactose em glicose e galactose, é exe-
cutado um teste para a detecção de uma reação um pouco diferente, também catalisada pela
["3.1 TransÍecçi
enzima. Essa reação envolve um análogo da lactose, chamado X-gal (5-bromo-4-cloro-3-in- Esse process
dolil-B-D-galactopiranosídeo), o qual é degradado pela p-galactosidase em um produto que um fago em
F
Cr-ounoev GÊNtcA E ANÁLrsE oe DNA 105
(a) pUCB
Gene de
resistência
à ampicilina
amf ftgat'
(b) Uma molécula de pUCB recombinante
Figura 5.9
O vetor de clonagem pUCS: (a) a
nrm*écula de vetor normal, (b) uma
nnolécula recombinante contendo
Íun segmento adicional de DNA in-
serido no sítio de BamHl.Para
ampR pgaf
mapas mais detalhados de pUC8,
ver Figuras 6.3 e 6.4.
tem uma cor azul-escuro. Se X-gal (mais um indutor da enzima, como o isopropiltiogalacto-
sídeo, IPTG) for adicionado ao ágar juntamente com ampicilina, as colônias não-recombina-
do gene de resistência à tes, formadas por células que sintetizam B-galactosidase, terão cor.azlul, enquanto as recom-
todas as transÍormantes binantes, com o gene lacZ' intenompido e incapazes de produzir B-galactosidase, serão bran-
rneio com tetraciclina. (c) cas. Esse sistema, chamado de seleção Lac, está resumido na Figura 5.10b.
t=tef e, portanto, não-re-
suas posições na placa
5.3 lntrodução de DNA de fagos em células bacterianas
Existem dois métodos diferentes pelos quais uma molécula de DNA recombinante construí-
, mas são incapazes de
da com um vetor derivado de fago pode ser introduzida em uma célula bacteriana: transfec-
ção e empacotamento in vitro.
é de fato bastante fácil. Em
gÌicose e galactose, é exe-
5.3.1 TransÍecção
. também catalisada pela
(5-bromo-4-cloro-3-in- Esse processo é equivalente à transformação, com a diferença de que o DNA envolvido é o de
em um produto que um fago em vez do de um plasmídeo. Assim como com um plasmídeo, o DNA de fago puri-
:
106 T. A. Bnowrl
No segundo sil
(a) A Íunção do gene tacz' mutação em um 91
E. coli lacZ'- +pUC8 uma das linhagens
linhagens é capaz
to do gene mutado
tos de todas as ou
Molêculas
oQo mistura de empacc
incompletas
) I
culturas celulares-
./9oQ Moléculas
de B-galac-
tosidase
pUCS completas
- Fragmento da p-galactosidase codiÍicado pelo gene bacteriano
e Fragmenlo da B-galactosidase codificado pelo gene plasmidial
Figura 5.10
c Molécula de P-galactosidase completa
A base teórica da ina-
(b) Seleção de recombinantes de pUCB tivação por inserção
do gene lacZ'presen-
'+ X-gal + IPTG te em pUC8. (a) Os
genes bacteriano e
Colônia azul = não-recombinante
plasmidial comple-
mentam-se um ao ou-
Colônia branca = recombinante
tro para produzirem
uma molécula de p-
galactosidase Íuncio-
colônias azuis = p-galactosidase sintetizada nal. (b)Os recombi-
X-gal-+ produto azul nantes são seleciona-
Colônias brancas = p-galactosidase não-sintetizada dos a partir do pla-
X-gal-+ sem produto azul queamento em ágar
contendo X-gal e
IPTG.
ficado ou uma molécula de fago recombinante é misturado com células de E. coli competen-
tes, com a incorporação do DNA induzida por choque térmico. Figura 5.11
Empacotamento in vi-
5.3.2 Empacotamento in vitro Íro. (a) Síntese das
proteínas do capsídeo
A transfecção com moléculas de DNA de l, não é um processo muito eficiente quando com-
de i, pela linhagem de
parada com a infecção de uma cultura de células com partículas de fago l, maduras. Seria,
E coli SMR10, que é
portanto, útil se moléculas de l" recombinantes pudessem ser empacotadas na estrutura de ca- portadora de um Íago
beça e cauda de l, em um tubo de ensaio. que possui sítios cos
Isso pode parecer difícil, mas, na realidade. é um processo de execução relativamente ffictivos. (b) Síntese
simples. O empacotamento exige diversas proteínas codificadas pelo genoma de 1,, mas elas üconjuntos incomple-
podem ser preparadas em uma alta concentração a partir de células infectadas com linhagens tos de proteínas de
defectivas de fago 1,, com a possibilidade de utilizarem-se dois sistemas diferentes. Com o capsídeo de l. pelas li-
sistema de linhagem única, o fago l, defectivo é portador de uma mutação nos sítios cos, de nhagens de E. coli
modo que eles não são reconhecidos pela nuclease que normalmente çliva os catenanos de À EflB2688 e 8H82690.
(c) Uma mistura de li-
durante a replicação do fago (p. 33-3a). Portanto, o fago defectivo é incapaz de replicar-se,
sados celulares provê
embora ele dirija a síntese de todas as proteínas neçessárias ao empacotamento. As proteínas
ioonjunto completo de
acumulam-se na bactéria e são purificadas a partir de culturas de E. coli infectadas com o l, poteínas de capsídeo
mutado, podendo ser utilizadas para o empacotamento in vitro de moléculas de l, recombi- @pode empacotar mo-
nantes (Figura 5. I 1a). léculas de DNA de l"
em tubo de ensaio.
l
Crorunceu GÊwtcn e AruÁlrse oe DNA 107
No segundo sistema, duas linhagens defectivas de l, são necessiírias,

ambas portando uma
mutação em um gene que codifica um dos componentes
do envoltório protéico do fago: em
uma das linhagens, a mutação é no gene D e, na ãut,a,
é no gene E (Figura 2.9). Nenhuma das
linhagens é capaz de completar um ciclo de infecção
em E. cori,pois, na ausência do produ_
to do gene mutado, a estrutura completa do capsídeo
não pode ser montada. Assim, os produ_
tos de todas as outras proteínas do envoltórió acumuram-se
na célula (Figura 5.1rb). uma
mistura de empacotamento pode, portanto, ser preparada pela
combinação de lisados de duas
culturas celulares, uma infectada com a linhagem ãe o
À e a outra infeàtaoa com a linhagem
Figura 5.10
(a) Um sistema de êmpacotamento de linhagem
A base teórica da ina- única
tivação por inserção
dogene lacZ'presen- Proteínas de
DNA de l.
te em pUC8. (a) Os À acumulam-se
genes bacteriano e na célula
plasmidial comple-
mentam-se um ao ou-
tro para produzirem E coli SMR10 _ o DNA
de À possui sítios cos deÍectivos
uma molécula de B-
galactosidase Íuncio-
(b) Um sistema de empacotamento de duas linhagens
nal. (b) Os recombi-
nantes são seleciona-
dos a partir do pla-
queamento em ágar
contendo X-gal e
IPTG.
E. coliBHB26SA E. coliBHB2690
Figura 5.11 À deÍectivo para a Àdefectivo para a
síntese da proteína E (a) síntese da proteína D @
Empacotamenlo in vi-
Íro. (a) Síntese das
Futeínas do capsídeo (c) Empacotamento in vitro
eficiente quando com-
ü I pela linhagem de
fago À maduras. Seria, E ooli SMR10, que é cos
I cos
I cos
na estrutura de ca- poÍtadora de um Íago I cos
r Catenanos de DNA de À
gue possui sítios cos
Oo
relativamente Èrbctivos. (b) Síntese
üconjuntos incomple-
o-_t +o Proteínas de À de SMRIO
genoma de 1,, mas elas
+ +C ou de uma mistura de
com linhagens tos de proteínas de
\+ + c BHB2688 + BHB2690
s diferentes. Com o oapsídeo de À pelas li-
nhagens de E. coli o.-. j *
nos sítios cos, de
cliva os catenanos de À
incapaz de replicar-se,
E-182688 e 8H82690.
{c) Uma mistura de li-
"o
. As proteínas
coli infectadas com o À
sados celulares provê
omnjunto completo de
Foteínas de capsídeo
oô
H H
'
Partícutas de fago À
las de l, recombi- contendo moléculas
epode empacotar mo-
léculas de DNA de ì. ç de DNA empacotadas
r
em tubo de ensaio.
108 T.A. BRowN
-.
E A mistura contém, então, todos os componentes necessários para o empacotamento de clareamento rel
moléculas de l" recombinantes em partículas de fago maduras (Figura 5.11c). zonas mais clan
Com qualquer um dos dois sistemas, as moléculas empacotadas são introduzidas em célu- O resultado
las de E coll simplesmente pela adição dos fagos montados à cultura bacteriana. A partir daí l, ou de M13 é.
ocorre o processo infectivo normal de 1". é derivada de ru
las virais idêntir
5.3.3 A inÍecção por fago é visualizada como placas em combinantes.
um meio de ágar
O estágio final do ciclo infectivo do fago é a lise celular (p. 3l). Se as células infectadas são
espalhadas em um meio de ágar sólido imediatamente após a adição do fago, ou imediatamen-
5.4 IdentiÍicaçã
te após a transfecção com DNA viral, a lise celular pode ser visualizada na forma de placas
Há diversas ma
sobre um tapete de bactérias (Figura 5.12a). Cada placa étmazona de clareamento, produzi-
guintes.
da à medida que os fagos lisam as células, infectam bactérias vizinhas que acabam sendo li-
sadas e assim por diante (Figura5.l2b).
5.4.1 Inativação p
Tanto l, como M13 formam placas. Com À, tais placas são verdadeiras, eis que produzidas
por lise celular. Com M13, por outro lado, elas se apresentam um pouco diferentes, pois esse
utilizado col
fago não lisa as células hospedeiras (p.32). Em vez disso, Ml3 causa um decréscimo na ve- Todos os vetorc
locidade de multiplicação das células infectadas, que é suficiente para produzir uma zona de dos de ì,, são p
inativa a síntesr
recombinantes
contendo fagos
5.13a).
(a) Placas em um tapete de bactérias
5.4,2 lnativação p
Vários tipos de
Tapete formado pela
ne cI (posição !
multiplicação conÍluenté de bactérias alteração na mc
tes com o gene
aparente para u
Uma placa - uma zona de
clareamento
5.4.3 Seleção utili
(b) Placas líticas O fago l, nornu
grada de um fq
Tapete de bactérias
// com o profago
.,,',jilt í. t'&-
i-'.r..; i,ï.:1. +. que a inserção <
.Í;on'ij': ,,u"" - todas as bactérias Íoram combinantes ir

''iÈiilir,",iìii'.{kl.i;
"ÌÏ- hospedeiras em
:"*:',ïï,:ï:ïXï,ïiï"n"" Figura 5.12
formam placas,
Placas de bacterióÍago.
(a) A aparência das placas em
um tapete de bactérias. (b) Pla-
r[4.4 Seleção con
(c) Placas de M13 cas produzidas por um Íago que O sistema de er
lisa a célula hospedeira (por de inserir na esl
exemplo, l. no ciclo de infecção la menor que 3,
As placas contêm bactérias lítico); as placas contêm células deleção de gral
de multiplicação lenta lisadas e muitas partículas de
+ partículas do fago M13 de modo que tê
Íago. (c) Placas produzidas por
partículas virais
M13; essas placas contêm bac-
térias de multiplicação lenta e o tamanho total
muitas partículas de Íago M13. tores, somente I
Crorunoeu GÊrurcn e ANÁLrsE DE DNA 109
paÍa o empacotamento de clareamento relativo em um tapete bacteriano. Embora não sejam placas verdadeiras, essas
5.1 1c). zonas mais claras são visualmente idênticas a placas de fago normais (Figura 5.12c).
são introduzidas em célu- O resultado final de um experimento de clonagem gênica utilizando um vetor derivado de
bacteriana. A partir daí À ou de Ml3 é, portanto, uma placa de âgar coberta com placas de fagos. Cada placa de fago
é derivada de uma célula individual transfectada ou infectada, que contém, portanto, partícu-
las virais idênticas. Tais partículas podem ou conter moléculas de vetor autoligadas ou ser re-
combinantes.
Se as células infectadas são

do fago. ou imediatamen-
5.4 Identificação de Íagos recombinantes
'uadana
forma de placas
Há diversas maneiras para distinguir placas recombinantes. As mais importantes são as se-
de clareamento. produzi-
guintes.
que acabam sendo li-
rn4.1 lnativação por inserção de um gene lacZ'presente no fago
iras, eis que produzidas
pouco diferentes, pois esse
utilizado como vetor
€ausa um decréscimo na ve- Todos os vetores de clonagem derivados de Ml3 (p. l2l-122), além de vários vetores deriva-
para produzir uma zona de dos de i,, são portadores de uma cópia do gene lacZ'. A inserção de novo DNA nesse gene
inatiya a síntese de B-galactosidase, exatamente como acontece com o plasmídeo pUCS. Os
recombinantes são identificados por plaqueamento das células em ágar com X-gal: placas
contendo fagos normais são azuis, enquanto placas recombinantes são incolores (Figura
5. I 3a).
t 4.2 lnativação por inserção do gene c{ de l,

Viírios tipos de vetores de clonagem derivados de l, possuem sítios de restrição únicos no ge-
ne cI (posição 38 no mapa da Figura 2.9). A inativação por inserção desse gene provoca uma
alteração na morfologia das placas. As placas normais são "turvas", enquanto as recombinan-
tes com o gene cI interrompido são "claras" (Figura 5.13b). A diferença entre elas é bastante
aparente para um olho treinado.
n4.3 Seleção utilizando o fenótipo Spi

O fago l" normalmente não pode infectar células de E. coli que já possuem uma forma inte-
grada de um fago aparentado chamado P2.Diz-se, por isso, que l, é Spi- (sensível à inibição
, com o profago P2). Alguns vetores de clonagem derivados de l, foram projetados de modo
que a inserção de um novo DNA cause uma mudança de Spi* para Spi-, permitindo que os re-
combinantes infectem células portadoras de profagos P2. Tais células são utilizadas como
hospedeiras em experimentos de clonagem com esses vetores; assim, somente recombinantes
5.12
formam placas, pois só eles são Spi (Figura 5.13c).
de bacterióÍago.
aparência das placas em
tâpete de bactérias. (b) pla- f.4.4 Seleção com base no tamanho'do genoma de l,
produzidas por um Íago que O sistema de empacotamento de À, que monta as partículas virais maduras, somente é capaz
a célula hospedeira (por de inserir na estrutura da cabeça moléculas com tamanho entre 37 e 52kb. Qualquer molécu-
l, no ciclo de inÍecção la menor que 37 kb não é empacotada. Muitos vetores derivados de À foram construídos pela
as placas contêm células
deleção de grandes segmentos da molécula de DNA que compõe o genoma do fago (p. 130),
e muitas partículas de
de modo que têm um tamanho inferior a 37 kb. Esses vetores só podem ser empacotados em
(c) Placas produzidas por
partículas virais maduras depois de o DNA adicional ter sido inserido neles, fazendo com que
; essas placas contêm bac-
de multiplicação lenta e o tamanho total do genoma seja maior do que 37 kb (Figura 5.13d). Portanto, com esses ve-
partículas de Íago M13. tores, somente os fagos recombinantes podem ser replicados.
espécies bi
(a) lnativação por inserção do gene tacZ, poração de
Saccharon,
mais sohst
Ágar+X-gal +IPTG
Placa clara = recombinante 5.5.1 Transforn
Placa azul = não- Para a mai,
recombinante celular. Cél
te transforn
cio (Figura
(b) lnativação por inserção do gene l,cl de celular.
fungos e ve
Placa clara = recombinante
gura 5.14b
ainda pode
Placa turva = não- células são
recombinante ria de poror
na célula. A
gradativas r
Em conr
cos para a ir
(c) Seleção utilizando o Íenótipo Spi
pipeta muitr
Profago P2 transformac
seqüenteme
Somente um fago À volve o bon
recombinante é capaz culas de our
de inÍectar a célula rados sobre
chamada de
l, não-recombinante
5.5.2 Transform
a célula
Para animai
(d) Seleção com base no tamanho do genoma de l. sim, um org
Sítios cos partir de cél
|#--r-r--rr-t /t\
tì t
mento de pr
gramíneas.
' Catenanodel, ì
transformad
ïamanho correto Muito pequeno Figura 5.13 esse DNA cl
-
para empacotamento para ser empacotado Estratégias para a 7.13b). Anin
seleção de Íagos re-
que a obtenç
combinantes.
lizada com r
do oviduto, r
(p. l6l_162)
5.5 TransÍormação de células não-bacterianas
Métodos para a introdução de DNA em leveduras, fungos, animais e vegetais também são ne-
cessários, se tais organismos devem ser utilizados como hospedeiros para a clonagem gênica.
Em termos gerais, a incubação das células em solução de sal só é eficiente para umas poucas
Croruncev GÊrurcn e AruÁuse oe DNA 111
espécies bacterianas, embora um tratamento com cloreto ou acetato de lítio aumente a incor-
poração de DNA por células de levedura e seja freqüentemente utilizado na transformação de
Saccharomyces cerevisiae.Para a maioria dos organismos superiores, entretanto, métodos
mais sofìsticados são necessários.
55.1 Transformação de células individuais

Para a maioria dos organismos, a principal barreira para a incorporação de DNA é a parede
celular. Células animais em cultura, que em geral não possuem parede celular, são facilmen-
te transformadas, sobretudo se o DNA for precipitado na superficie celular com fosfato de cál-
cio (Figura 5.14a). Para outros tipos de cólulas, a resposta é muitas vezes a remoção da pare-
de celular. Há enzimas disponíveis que degradam paredes celulares de células de leveduras,
fungos e vegetais e, sob condições adequadas, podem ser obtidos protoplastos intactos (Fi-
gura 5.14b), os quais, via de regra, incorporam DNA com facilidade, mas a transformação
ainda pode ser estimulada por técnicas especiais, como a eletroporação. Na eletroporação, as
células são submetidas a um pulso elétrico curto, que, acredita-se, induz a formação transitó-
ria de poros na membrana celular, pelos quais as moléculas de DNA são capazes de penetrar
na célula. Após a transformação, os protoplastos são lavados para a remoção das enzimas de-
gradativas e a parede celular é espontaneamente reconstituída.
Em contraste com os sistemas de transformação descritos até agora, há dois métodos físi-
cos irara a introdução de DNA em células. O primeiro deles é a microinjeção, que utiliza uma
pipeta muito fina para injetar moléculas de DNA diretamente nos núcleos das células a serem
transformadas (Figura 5.15a). A técnica foi inicialmente aplicada a células animais, mas sub-
seqüentemente aplicada também, com sucesso, em células vegetais. Um segundo método en-
volve o bombardeamento das células com microprojéteis de alta velocidade, em geral paÍí-
culas de ouro ou tungstênio, que foram recobertas com DNA. Esses microprojéteis são dispa-
rados sobre as células por uma pistola de partículas (Figura 5.15b). A técnica incomum é
- -
chamada de biobalística e já foi utilizada com diversos tipos diferentes de célula.
t5.2 TransÍormação de organismos inteiros

Para animais e plantas, o produto final desejado pode não ser uma célula transformada, mas,
sim, um organismo transformado. Plantas podem ser regeneradas com relativa facilidade a
partir de células em cultura, embora tenham sido encontrados problemas paÍa o desenvolvi-
mento de procedimentos de regeneração para espécies de monocotiledôneas, como cereais e
gramíneas. Uma única célula vegetal transformada pode, portanto, dar origem a uma planta
transformada, que será portadora do DNA clonado em cada uma de suas células e transmitirá
Figura 5.13 esse DNA clonado a sua progênie, depois da floração e da produção de sementes (ver Figura
Estratégias para a 7.13b). Animais, é claro, não podem ser regenerados a partir de células em cultura, de modo
seleção de Íagos re-
que a obtenção de animais transformados exige uma abordagem mais sutil. Uma técnica uti-
combinantes.
lizada com mamíferos, como os camundongos, é baseada na remoção de óvulos fecundados
do oviduto, que são microinjetados com DNA e reimplantados no trato reprodutivo da mãe
(p.161-162).
e vegetais também são ne-

iros para a clonagem gênica.
é efiçiente para umas poucas
T. A. BRowN
a) Precipitação de DNA sobÍe células animais Leituras adici

Calvin, N.M. ó
_ _-__- Solução de fosfato de cálcio of Bacteir

Capecchi, M.R
cells. Cell,
gq.- DNA precipitado sobre a
Cohen, S.N., C
superfície das células
formation
Monocamada de células animais 69,2tt0-1
Hammer, R.E.,
(b) TransÍormação de protoplastos vêgetais jection. Na
#
Hohn, B. & Mr
dings of th
Hegeneraçao Klein, T.M., W
-*y_
I
da planta I
into living
Mandel, M. & l
154-62. tT
* da parede celular Figura 5.14
Estratégias para a
Célula vegetal Protoplasto Célula vegetal Planta introdução de novo
transÍormada transformada DNA em células ani-
mais e vegetais.
(a) Microinjeção
(b) TransÍormação com microprojéteis
Microprojéteis
Pino de disparo
-n Células-alvo
â
Carga
. N células-alvo
n ::Sl bomoarceaoas Figura 5.15
a
:i[$ "ot microprojéteis Dois métodos Íísicos
para a introdução de
DNA em células.
-----=:-
Ct-oruacer,a GÊrurcn e ANÁLtsE oe DNA 1 l3
ras adicionais
calvin, N.M. & Hanawalt, PC. (1988) High effrciency transformation of bacterial cells by
electrop oration. Journal
of B ac t e rio lo gy, 17 0, 27 96-g0l.
Capecchi, M.R. (1980) High efficiency transformation by direct microinjection
of DNA into cultured mammalian
cells. C e I l, 22,47 9 -88.
Cohen, S'N., Chang, A.VY', Hsu,L. et al. (1972) Nonchromosomal antibiotic resistance
in bacteria: genetic trans-
formation of Escherichia cali by R-factor DNA. Proceedings of the National Academy of
Sciences of the IJSA,
69,2ll0-14. [Transformação de uma bactéria com um plasmídeo.]
Hammer,R.E.,Pursel,V.G.,Rexroad,C.E. etal.(L981)Productionoftransgenicrabbits,sheepandpigsbymicroin-
jection. N ature, 315, 680-83.
Hohn,B'&Murray,K.(Lg77)PackagingrecombinantDNAmoleculesintobacteriophageparticles
invitro.procee-
dingsoftheNationalAcademyof SciencesoftheUSA,T4,3259-63.[Empacotamento invitro.]
Klein' T'M', Wolf, E.D., Wu, R. & Sanford, J.C. (1987) High velocity microprojectiles for delivering
nucleic acids
into living cells. Nature, 327,70-73. [Biobalística.]
Mandel, M. & Higa' A. (1970) Calcium-dependent bacteriophage DNA infecÍion. Journal
of Molecular Biotogy, 53,
I 54-62. [Transfecção.]
Figura 5.14
Estratégias para a
introdução de novo
DNA em células ani-
mais e vegetais.
Figura 5.15
Dois métodos físicos
para a introdução de
DNA em células.
Cnpírulo 6
Vetores de Clonagem para E. coli
Vetores de clonagem baseados em plasmídeos de E. l, e outros vetores de alta capacidade permitem que
coli. 1 l5 bibliotecas genômicas sejam construídas, 136
Vetores de clonagem baseados no bacteriófago M I 3, Vetores para outras bactérias, I 37
122
Vetorés de clonagem baseados no bacteriófago À,
t29
As técnicas experimentais básicas envolvidas na clonagem gênica já foram descritas. Os Ca-

pítulos 3,4 e 5 mostraram como o DNA pode ser purificado de extratos celulares, como mo-
léculas de DNA recombinantes podem ser construídas em um tubo de ensaio, como molécu-
las de DNA podem ser reintroduzidas em células vivas e como clones recombinantes podem
ser distinguidos. Agora deve-se olhar mais atentamente paÍa o vetor de clonagem propriamen-
te dito, a fïm de analisar a variedade de vetores disponíveis para o biologista molecular e pa-
ra entender as propriedades e utilizações de cada tipo individual.
A maior variedade de vetores de clonagem que existe é para a utilização de E. coli como
organismo hospedeiro. Isso não é surpreendente, tendo em vista o papel central que essa bac-
téria tem exercido na pesquisa básica nos últimos 50 anos. A imensa riqueza de informações
existente a respeito da microbiologia, bioquímica e genética de E. coli signihca que, virtual-
mente, todos os estudos fundamentais de estrutura e função gênica foram realizados tendo es-
sa bactéria como organismo experimental. Recentemente, a clonagem gênica e a pesquisa bio-
lógica molecular têm se tornado mutualmente sinergísticas - avanços na clonagem gênica têm
atuado como estímulo para a pesquisa, enquanto as necessidades da pesquisa têm acelerado o
desenvolvimento de novos e mais sofisticados vetores de clonagem.
Neste capítulo, serão descritos os tipõs mais importantes de vetores de clonagem para E.
coli e desÍacadas as utilizações específicas das moléculas representativas. No Capítulo 7, os
vetores de clonagem para leveduras, fungos, plantas e animais serão considerados.
t 1 vetores de clonagem baseados em plasmídeos de E. coti

Os vetores de clonagem mais simples e os mais amplamente utilizados na clonagem gênica
são aqueles baseados em plasmídeos bacterianos pequenos. Um grande número de vetores
plasmidiais diferentes está disponível para auÍilização em E. coli,muitos obtidos de fornece-
dores comerciais. Eles combinam a facilidade de purificação com propriedades desejáveis,
116 T. A. Bnown
tais como alta eficiência de tfansformação, marcadores convenientes para a seleção de trans-
formantes e recombinantes e a capacidade para clonagem de pedaços de DNA razoavelmen-
te grandes (até cerca de 8 kb). A maioria dos experimentos de clonagem gênica de "rotina" faz
uso de um ou outro desses vetores plasmidiais.
Um dos primeiros vetores a ser desenvolvido - e ainda um dos mais populares hoje em
dia - é o pBR322, o qual foi introduzido no Capítulo 5 para ilustrar os princípios gerais da se-
leção na transformação e a identificação dos recombinantes (p. 98). Este estudo de vetores
plasmidiais de E. coli será iniciado a partir de uma visão mais aproximada do pBR322.
6.1.1 A nomenclatura dos vetores de clonagem plasmidiais Um mapa de pB

O nome "pBR322" obedece às regras gerais para a nomenclatura de vetores: nes de resistên
(er1, a origem
. "p" indica que ele é realmente um plasmídeo.
. "BR" identifica o laboratório no qual o vetor foi originalmente construído (BR cones-
ponde a Bolívar e Rodrigues, pesquisadores que desenvolveram o pBR322).
c "322" distingue esse plasmídeo de outros desenvolvidos no mesmo laboratório (existem
tambéni plasmídeos chamados pBR325, pBR327, pBR328, etc.).
6.1.2 As propriedades úteis do pBR322

O mapa genético e físico do pBR322 (Figura 6.1) fornece uma indicação darazão pela qual
esse plasmídeo tem se tornado um vetor de clonagem tão popular.
A primeira característica útil do pBR322 é o seu tamanho. No Capítulo 2 foi determinado
que um vetor de clonagem deve ter um tamanho menor do que 10 kb para evitar problemas,
tais como a quebra do DNA durante a purificação. O pBR322 possui 4.363 pb, o que signifi-
ca que não somente o próprio vetor pode ser purificado com facilidade, mas também o podem
as moléculas de DNA recombinantes construídas apartir dele. Mesmo com 6 kb de DNA adi-
cionais, uma molécula de pBR322 recombinante ainda apresenta um tamanho manipulável.
A segunda característica do pBR322 é que, conforme descrito no Capítulo 5, ele contém
dois grupos de genes para resistência a antibióticos. Tanto resistência à ampicilina quanto à
tetraciclina podem ser utilizadas como marcas de seleção para células contendo o plasmídeo,
e cada gene marcador contém sítios de restrição únicos, que podem ser utilizados em experi-
mentos de clonagem. A inserção de um DNA novo em um pBR322 que tenha sido clivado
com Psfl, PvuIou ScaI inativa o gene que confere resistência à ampicilina (o*po),e inserções
utilizando qualquer uma das oito endonucleases (principalmente BamHI e HindIII) inativam
a resistência à tetraciclina. Essa grande variedade de sítios de restrição, que pode ser utiliza-
da para a inativação por inserção, confirma que o pBR322 pode ser utilizado para clonar frag-
mentos de DNA com qualquer um dos viírios tipos de extremidades coesivas.
Uma terceira vantagem do pBR322 é que ele apresenta um número de cópias relativamen-
te alto. Geralmente existem cerca de 15 moléculas presentes em uma célula de E. coli Írans-
formada, mas esse número pode ser aumentado, para até 1 .Õ00 a 3.000, pela amplificação do
plasmídeo na presença de um inibidor da síntese protéica, tal como cloranfenicol (p. 54). Uma
cultura de E. coli, portanto, fornece um bom rendimento de moléculas de pBR322 recombi-
nantes. Flgu
o oeag
6.1.3 O pedigreedo pBR322 @:(a)as
q,ações envo
A extraordinária conveniência do pBR322 como um vetor de clonagem não apareceu ao aca- na construç
so' O plasmídeo foi, na verdade, planejado de modo que se possibilita à construção final ter ffie(b)t
essas propriedades desejáveis.As linhas gerais do esquema utilizado para construir o pBR322 orrn das orbe
são mostradas na Figura 6.2a. Conforme pode ser observado, sua construção foi um trabalho p8l
CLoruncrv GÊNrcA E ANÁLtsE DE DNA 117
para a seleção de trans-

de DNA razoavelmen- EcoRl Hird,lll
gênica de "rotina" faz
dos mais populares hoje em

os princípios gerais da se-
98). Este estudo de vetores
proximada do pBR322.
Figura 6.1
Lfm mapa de pBR322 mostrando as posições dos ge-
ms de resistência à ampicilina (amp\ e à tetraciclina
(eÔ, a origem de replicação (ori) e alguns dos sítios
de restrição mais imPortantes.
construído (BR corres-
'eram o pBR322).
mesmo laboratório (existem
(a) Construção de pBR322

*7--\_
z\
[ï/v
indicação darazão pela qual Fragmento Í
recrrcuranzaoo \ R6_5 ì/
(
No Capítulo 2 foi determinado
e l0 kb para evitar problemas,
possú 4.363 pb, o que signifi-
rnÀ /
l/
*'l-< Ecolt* \.--/
drdade, mas também o podem /=.-< EcoRt. {PSC101)

Áttr,rÀ EcoRl.
Fragmento de EcoRl .\--/
u1,\
trlíesmo com 6 kb de DNA adi-
EcoRl
um tamanho manipulável. ampR
dentro do éítio de
// ./
w
no Capítulo 5, ele contém
istência à ampicilina quanto à Tn33\
/-\ ;.- EcoRl\9{
ó'à
t
ulas contendo o plasmídeo,
ser utilizados em experi- ,'r"/--\'".
@
22 que tenha sido clivado
*mpicilina (o*p*), e inserções
BamHI e HindIII) inativam
restrição, que pode ser utiliza-
\--l-{*t""À
tef
ser utilizado para clonar frag-
de cópias relativamen-
uma célula de E. coli ïrans-
@ uors ÌragmenÌos
ligados
ee,
tef
a 3.000, pela amplificação do ori

cloranfenicol (p. 54). Uma (b) As origens de pBR322
las de pBR322 recombi-
Figura 6.2
O pedigree de
pBR322: (a) as mani-
pulações envolvidas
não apareceu ao aca- na construção de
ibilitaà construção final ter pBR322 e (b) um re-
para construir o pBR322 sumo das origens de
construção foi um trabalho pBR322.
-
a
-::
a
1 í I T. A. Bnowr'r
iírduo que exigiu a utilização hábil e muito bem feita das técnicas de manipulação do DNA des- (2) A dele
critas no Capítulo 4. Um resumo dos resultados de tais manipulações é fomecido na Figura 6.2b, pBR32
a partir da qual pode ser observado que o pBR322, de fato, compreende DNA derivado de três transfe
plasmídeos naturalmente existentes. O gene ampR estáoriginalmente presente no plasmídeo ca, evit
Rl, um plasmídeo típico de resistência a antibióticos, que é encontrado em populações natu- nante t
rais de E. coli (p.29). O gene tetR é derryado de R6-5, um segundo plasmídeo de resistência a molecr
antibióticos. A origem de replicação de pBR322, a qual comanda a multiplicação do vetor nas popula
células hospedeiras, é original de pMB l, que é bastante relacionado ao plasmídeo produtor de sua m€
colicilina ColEl (p. 29). so acor
te peril
6.1.4 Outros vetores plasmidiais típicos para E. coli pUCS: um
O pBR322.foi desenvolvido no final da década de l9lo, e o primeiro trabalho científico des-
Esse vetor fc
crevendo sua utilização foi publicado em 19'.''...Desde então, muitos outros vetores de clona-
da inativaçã<
gem plasmidiais foram construídos, a maioria derivada de pBR322, por meio de manipula-
6.3b) é deriv
ções semelhantes àquelas resumidas na Figura 6.2a. Não haveria sentido em tentar descrever neçam. A se
todos esses vetores, principalmente porque muitos são variações de um mesmo tema. Três
contém mais
exemplos adicionais serão suficientes para ilustrar as características mais importantes apre-
pados em un
sentadas pela ampla variedade de vetores de clonagem plasmidiais disponível atualmente pa-
O pUCS
ra os engenheiros genéticos.
lares vetores
pBR327: um plasmídeo com alto número de cópias na construçã
de replicaçã
O pBR327 (Figura 6.3a) foi construído pela remoção de um segmento de 1.089 pb de
mesmo anter
pni:ZZ. Essa deleção manteve os genes o*p* e tef intactos, mas alterou as capacidades re-
nado, obtido
plicativas e conjugativas do plasmídeo resultante. Como resultado, pBR327 difere de pBR322
tes.
de duas maneiras importantes:
A segund
um processo
(1) O pBR327 apresenta um número de cópias superior ao pBR322, estando presente com
lina e X-gal
cerca de 30 a 40 moléculas por célula de E. coli. Isso não é de grande relevância quan-
cedimento el
do a preocupaçáo é o rendimento do plasmí-
para o outro
deo, uma vez que ambos os plasmídeos podem
(a) pBR327 na metade ú
ser amplificados para um número de cópias su-
perior a 1.000. No entanto, o número de cópias A terceiri
EcoRl Hr'ndlll
Scal o qual permi
superior de pBR327 em células normais torna
mos, EcoRl
Pvul esse vetor mais adequado. caso o objetivo do
pulações adi,
experimento seja o estudo das função do gene
ra 6.4a). Out
clonado. Nesses casos, a dosagem gênica tor-
cem uma fle
na-se importante, pois, com a existência de
nados (Figru
mais cópias de um gene clonado, maior a pro-
mo que os a!
babilidade de que o efeito do gene clonado nas
células hospedeiras seja detectado. O pBR327,
um membro
corresponder
com seu alto número de cópias, é, portanto, a
de DNA ou i
melhor opção para esse tipo de trabalho do que
procediment
(b) pUCB pBR322.
pGEM3Z:
/"*A
t
2.t5'r pD
, ))
O pGEM3Z
lacZ',
mente do me
este íi
ori /acz7ÁAgrupamento de sítios
\ \€7- Figura 6.3
(ver Figura 6.4a)
Dois vetores de clonagem plasmidiais de E
coli.
CroNeoeM GÊr.rrcr e AnÁuse or DNA 1 19
manipulação do DNA des- (2) A deleção também eliminou a capacidade conjugativa de pBR322, transformando
é fomecido na Figura 6.2b, pBR327 em um plasmídeo não-conjugativo, que náo é capaz de comandar a sua própria
DNA derivado de três transferência para outras células de E. coli. Isso é importante para a contenção biotógi-
presente no plasmídeo ca, evitando a possibilidade de que uma molécula de um plasmídeo pBR327 recombi-
em populações nafu- nante escape de um tubo de ensaio e colonize bactérias do intestino de um biologista
plasmídeo de resistência a molecular descuidado. Em contraste, pBR322 poderia, teoricamente, ser passado para
a multiplicação do vetor nas populações naturais de E. coli por conjugação, embora, de fato, pBR322 também pos-
ao plasmídeo produtor de sua meios de proteção (apesar de menos sofisticados) para minimizar as chances de is-
so acontecer. O pBR327 é, portanto, preferível, caso o gene clonado seja potencialmen-
te perigoso na ocorrência de um acidente.
pUGS: um plasmídeo de seleção Lac

trabalho científico des-
Esse vetor foi mencionado no Capítulo 5, quando a identificação de recombinantes por meio
[os outros vetores de clona-
da inativação por inserção do gene da B-galactosidase foi descrira (p. 10a). O pUCS (Figura
312. por meio de manipula-
rentido em tentar descrever 6.3b) é derivado de pBR322, embora somente a origem de replicação e o gene amp* perma-
neçÍìm. A seqüência de nucleotídeos do gene amp* foimodificada, de tal forma que ela não
de um mesmo tema. Três
cas mals rmportantes apre-
contém mais os sítios de restrição únicos; todos aqueles sítios de clonagem estão agora agru-
pados em um segmento curto do gene lacZ'presente no pUC8.
disponível atualmente pa-
O pUC8 possui três vantagens importantes, que o levaram a se tornaÍ um dos mais popu-
lares vetores de clonagem para E. coli. A primeira delas é casual: as manipulações envolvidas
na construção do pUCS foram acompanhadas por uma mutação inesperada, dentro da origem
segmento de 1.089 pb de de replicação, que resultou no plasmídeo apresentando um número de cópias de 500 a 700,
alterou as capacidades re- mesmo antes da amplificação, o que tem um efeito significativo no rendimento do DNA clo-
pBR327 difere de pBR322 nado, obtido a partir de células de E. coli transformadas com plasmídeos pUC8 recombinan-
tes.
A segunda vantagem é que a identificação de células recombinantes pode ser realizada em
estando presente com um processo de uma única etapa, por meio do plaqueamento em meio ágar contendo ampici-
é de grande relevância quan- lina e X-gal (p. 105). Com ambos. pBR322 e pBR327, a seleção de recombinantes é um pro-
é o rendimento do plasmí- cedimento em duas etapas, necessitando de placas-réplicas, de um meio com um antibiótico
ambos os plasmídeos podem para o outro (p. 103). Um experimento de clonagem com pUC8 pode, portanto, ser realizado
pam um número de cópias su- na metade do tempo necessário para com pBR322 ou pBR327.
entanto, o número de cópias A terceira vantagem de pUC8 está relacionada com o agrupamento dos sítios de restrição,
l7 em células normais torna o qual permite que um fragrnento de DNA com duas extremidades.coesivas diferentes (diga-
dequado, caso o objetivo do mos, -EcoRI em uma extremidade e BamHI na outra) seja clonado sem a utilização de mani-
o estudo das função do gene pulações adicionais, tais como a ligação de uma molécula de ligação (do inglês linker) (Figu-
cuÌsos, a dosagem gênica tor- ra 6.4a). Outros vetores pUC carregam combinações diferentes de sítios de restrição e forne-
pois, com a existência de cem uma flexibilidade ainda maior para os tipos de fragmentos de DNA que podem ser clo-
gene clonado, maior a pro- nados (Figura 6.4b). Ademais, o agrupamento de sítios de restrição em tais vetores é o mes-
o efeito do gene clonado nas mo que os agrupÍÌmentos nas séries de vetores M I 3 equivalentes (p. I25). O DNA clonado em
seja detecrado. o pBR327, um membro de uma série pUC pode, portanto, ser transferido diretamente para o seu M13mp
ro de cópias, é, portanto, a correspondente, de tal forma que este pode ser analisado por intermédio de seqüenciamento
essetipo de trabalho do que de DNA ou mutagênese in vitro (Figura 6.4c; ver páginas 2ll e 244 para a descrição desses
procedimentos).
pGEM3Z: transcrição in vitro do DNA clonado

I o pGEM3Z (Figura 6.5a) é muito semelhante a um vetor puc: ele contém os genes amp* e
J
i lacZ', último contendo um agmpamento de sítios de restrição, além de ser quase exata-
esÍe
l mente do mesmo tamanho. A diferença é que o pGBM3Zpossui dois pedaços de DNA extras,
I
b clonagem plasmidiais de E
12O T. A. Bnowr,r
(a) Sítios de restrição em pUCB

RNA-pol
fragment
zado con
que objet
síntese dr
Hitúlll Os pr
Psll cias-paú
Sali, Accl, Hirrcll
BamHl é específ
Smal, Xmal limerase
EcoRl li com ur
para utili
(lembre-
do que or
(b) Sítios de restrição em pUCIB I a21tgr
padrão dr
Hindlll
Sphl
puc18 Psfl
SaÃ, Accl, Hincll
Xbal
BamHl
Smal, Xmal
Kpnl
EcoRl
(c)TransÍerência de um Íragmento de DNA de pUCS para Mt3mp8
pUCS recombinante
BamHl
(:_1ï'
DNA novo
Sítios de restrição
Figura 6.4
com BamHl e EcoRl Os plasmídeos pUC. (a)
Clivagem EcoRl \ O agrupamento de sÊ
com EanrHl \ \ tios de restrição no int+
e EcoRl
rior do gene lacZ'de
pUC8. (b) O agrupa-
mento de sítios de res-
trição em pUC18. (c)
TransÍerência de um
fragmento de DNA de Figul
pUCS para M13mp8. pGEM3z. (a) Ma
Ëí. (b) Síntese de
itmÌuf,fo. R = agrupaÍ
cada um atuando como sítio de reconhecimento para a ligação de uma
üsÍtios de restriçã
enzima RNA-polimera EcoRl, Sac{,
rase. Essas duas seqüências promotoras situam-se em cada um dos lados
do ug*pì-"nto
dos sítios de restrição utilizados para a introdução de um DNA novo em uma
M, Smal, BanrHl,
molécula de Sat, Acd, Hircll,
pGElú3Z.Isso significa que, se uma molécul a de pGBM3Zrecombinante for misturada Sphl e H
com
--=.-
Ct-oruncev GÊrurcn e ANÁLrsE oe DNA 121
RNA-polimerase purificada em um tubo de ensaio, a transcrição ocorrerá e cópias de RNA do

fragmento clonado serão sintetizadas (Figura 6.5b). O RNA que é produzido poderá ser utili-
zado como uma sonda de hibridizaçáo (p. 174), ou poderá ser necessário para experimentos
que objetivam o estudo do processamento de RNA (por exemplo, a remoção de íntrons) ou
síntese de proteínas.
Os promotores presentes no pGEM3Z e nos demais vetores desse tipo não são seqüên-
cias-padrão reconhecidas pela RNA-polimerase de E. coli.Ao contriírio, um dos promotores
é específico para a RNA-polimerase codificada pelo bacteriófago T7 e o outro pela RNA-po-
limerase do fago SP6. Essas RNA-polimerases são sintetizadas durante a infecção de E. co-
/i com um ou outro fago e são responsáveis pela transcrição dos genes do fago. Sua escolha
para utilização na transcrição in vitro deve-se ao fato de essas enzimas serem muito ativas
(lembre-se de que um ciclo lítico de infecção inteiro leva somente 20 minutos [30], de mo-
do que os genes do fago devem ser transcritos muito rapidamente) e capazes de sintetizar de
I a21tg de RNA por minuto, substancialmente mais do que pode ser produzido pela enzima-
padrão de E. coli.
(a) pGEM3Z
Promotor de T7
Promotor de SP6
(b) Síntese de RNA rn viÍro
Promotor de T7
Figura 6.4
Os plasmídeos pUC. (a)
O agrupamento de sí-
tios de restrição no int+
rior do gene lacZ'de
pUC8. (b) O agrupa-
mento de sítios de res-
trição em pUC18. (c)
TransÍerência de um
Íragmento de DNA de Figura 6.5
pUCS para M13mp8. pGEM3Z. (a) Mapa do
ffiÍ. (b) Síntese de RNA
rflmuúfo. R = agrupamento
iüsítios de restrição pa-
de uma enzima RNA-polime- Transcritos de RNA
ra EcoRl, Sacl, Kpnl,
dos lados do agrupamento *d" Smal, BamHl, Xbal,
novo em uma molécula de &t, Accl, Hirrcll, Psl|,
inante for misturada com Sphl e Hidlll.
-- l
çt.z vel(.,rËì' qg ur(rrrageilr uaìteau(,st rr(J uaulerr(,rag(, tut tr,
A exigência mais importante para qualquer vetor de clonagem é que ele possua uma manelra
de se replicar em uma célula hospedeira. Para vetores plasmidiais, essa necessidade é fácil de
satisfazer, uma vez que seqüências de DNA relativamente curtas são capazes de atuar como
origens de replicação plasmidial, e a maioria das enzimas necessárias para a replicação, se não
todas, é fornecida pela célula hospedeira. Manipulações elaboradas, tais como aquelas que re-
sultaram no pBR322 (Figura 6.2a), sáo, portanto, possíveis, contanto que a construção final
tenha uma origem de replicação intacta e funcional.
Com bacteriófagos, tais como Ml3, a situação em relação à replicação é mais complexa.
Moléculas de fago, em geral, contêm vários genes essenciais à replicação, incluindo aqueles
que codificam componentes do capsídeo protéico do fago e enzimas replicativas específicas
para o DNA do fago. Alteração ou deleção de qualquer um desses genes irá impedir ou des-
truir a capacidade replicativa da molécula resultante. Existe, pois, uma liberdade muito me-
nor paÍa se modificar moléculas de DNA de fago, e, via de regra, os vetores de clonagem de
fago são apenas levemente diferentes das moléculas parentais.
Os p'roblemas na construção de um vetor de clonagem de fago são ilustrados consideran-
do M13. O genoma normal de M13 possui 6,4 kb de comprimento, a maioria ocupada por l0
genes extremamente compactados (Figura 6.6), cada um essencial para a replicação do fago.
Há somente uma única seqüência intergênica, de 507 nucleotídeos, dentro da qual novas mo-
léculas de DNA podem ser inseridas, sem causar a intemrpção de um desses genes, e, na ver-
dade, essa região inclui a origem de replicação, que ela própria deve permanecer intacta. Cla-
ramente, há apenas um limitado espaço para modificação no genoma de Ml3. Figura 6.7
@wstrução de (a)
No entanto, será relembrado que a maior atração de M13 é a oportunidade que ele ofere-
M13mp1, e (b)
ce de obtenção de versões de fita simples do DNA clonado (p. 36).Tal característica tem afua-
a partir dc
do como estímulo para o desenvolvimento de vetores de clonagem M13. ggímÍna de M13 dc
li:o selvagem,
6.2.1 Desenvolvimento do vetor de clonagem M13mp2
O primeiro passo na construção de um vetor de clonagem M13 foi a introdução do gene lacT
dentro da seqüência intergênica. Isso originou Ml3mpl, o qual forma placas azuis em meio deo o tral
ágar com X-gal (Figura 6.7a). utilizandc
M13mpl não tem qualquer sítio único de restrição no gene lacZ'.Ele contém, no entanto, possui un
o hexanucleotídeo GGATTC próximo ao início do gene. Uma única substituição de nucleoú- de ácido i
M13mp2
Ml3n
des coesil
tinguidos
Hl3mp7
O próxim,
adicionais
údeo curt<
tios de res
clonagem
6.8b). um
lI e PsrI). I
te o gene I
Figura 6.6 de uma en
O genoma de M13, mostrando as posições dos genes I ao X
Cr-oruneev GÊrurcn e AruÁusr oe DNA 123
(a) Construção de M13mp1
ele possua uma maneira

Clivagem, lacZ'
essa necessidade é fácil de ligação
são capazes de atuar como
para a replicação, se não
tais como aquelas que re-
,uz*-\, M13 M13mp1
que a construção final
replicação é mais complexa- (b) Construção de M13mp2

incluindo aqueles
imas replicativas específi cas Mutagênese EcoRl
senes irá impedir ou des- in vitro
i:s.- uma liberdade muito me-
............................*
on lacz
os vetores de clonagem de
M13mp1 M'l3mp2
úo ilustrados consideran-
.a maioria ocupada por 10
met - thr-met - ile - thr - asp - ser - ;n1ç;edogenelacZ,
iaÌ para a replicação do fago.
dentro da qual novas mo-
-AïG ACC ATG ATT ACG GAT TCA- emM13mp1
*
um desses genes, e, na ver-
'e perÍnanecer intacta. Cla-
Figura 6.7
- thr -met - ile - thr - asn - ser -
met lpiçi6 dogenelacZ'
-ATG ACC ATG AT-r ACG AAT TCA- emM13mp2
Gonstrução de (a) *
crportunidade que ele ofere-
M13mp1, e (b)
r. Tal caracteística tem atua-
fil&np2, a partir do
gEnoma de M13 do EcoRl
tipo selvagem.
foi a introduçáo do gene lacT

tbrma placas azuis em meio deo o transformará em GAATTC, o qual é um sítio para EcoRI. Essa alteração foi realizada
utilizando-se mutagênese in vitro (p.2aD, resultando no Ml3mp2 (Figura 6.7b). M13mp2
Z'. Ele contém, no entanto, possui um gene lacZ'levemente alterado (o sexto códon agora especifica asparagina, emvez
substituição de nucleoú- de ácido aspártico), mas a enzima B-galactosidase produzida pelas células infectadas com
M13mp2 ainda é perfeitamente funcional.
Ml3mp2 é o vetor de clonagem M13 mais simples. Fragmentos de DNA com extremida-
des coesivas de EcoRI podem ser inseridos no sítio de clonagem, sendo os recombinantes dis-
tinguidos como placas claras em meio ágar com X-gal.
M13mp7: sítios de clonagem simétricos

O próximo passo no desenvolvimento de vetores M13 foi a introdução de sítios de restrição
adicionais dentro do gene lacZ', obtido pela síntese em um tubo de ensaio de um oligonucleo-
tídeo curto, chamado de sítio de policlonagem (polylinker), qle consiste em uma série de sí-
tios de restrição que possui extremidades coesivas de EcoRI (Figura 6.8a). Esse sítio de poli-
clonagem foi inserido dentro daquele de EcoRI de Ml3mp2, originando M13mp7 (Figura
6.8b), um vetor mais complexo, com quatro sítios de clonagem possíveis (EcoRI, BamH\ Sa-
il e PstI). O sítio de policlonagem foi projetado de tal forma que ele não interrompe totalmen-
te o gene lacZ'; urna fase de leitura é mantida por intermédio do sítio de policlonagem, além
de uma enzima B-galactosidase funcional, a qual, ainda que alterada, é produzida.
as posições dos genes I ao X.
124 T. A. Bnowlr
(a) O sítio de policlonagem
AATTC CCCGG ATC C GTC G AC CTG C AG GTC G AC G G ATC C G G G G
+EcoRl
GGGGC CTAG G C AG CT G G AC
Sall
G TC C AG CTG
Sall
C
+
CTAG G C C C CTTAA
EcoRl
Accl Accl
Hincll Hincll Figura 6.8
(b) Construção de Ml3mp7 Sítios de Construção de
restricão M13mp7: (a) o sítio
de policlonagem e
EcoRl, (b) sua inserção no
ligação
sítio de EcoRl de
M13mp2. Note que
rL/rv os sítios de restrição
M13mp2 M13mp7 para Sa/l são tam-
Sítio de
policlonagem bém reconhecidos
por Acd e Hircll.
Figura 6.9
Clonagem com
ffil3Ínp7 (ver o texto
para detalhes).
Quando o M13mp7 é digerido taÍlto com EcoRI, BamHI ou SaII, uma parte ou todo o sí-
tio de policlonagem é excisado (Figura 6.9a). Na ligação, na presença de um DNA novo, um
de três eventos pode ocorrer (Figura 6.9b). mídeo pUC8 (t
sua capacida&
(1) DNA novo é inserido. Uma segun
(2) O sítio de policlonagem é reinserido. possui o mestr
(3) O vetor se religa, sem inserção. clonado em M
M13mp9, estar
A inserção de um DNA novo quase que invariavelmente impede a produção de B-galacto- ciamento de D
sidase, de forma que as placas recombinantes são claras em meio ágar com X-gal (Figuá extremidade ú
6.9c). Alternativamente, se o sítio de policlonagem é reinserido, e o M13mp7 original é nova- 6.11d). Somen
mente formado, então ocorrerá a formação de placas azuis. Porém, o que acontecerá se o ve- ciamento; se o
tor se religar, nem com um DNA novo e nem com o sítio de policlonagem inserido? Mais urna será seqüencia
vez, o projeto do sítio de policlonagem entra em ação. Não importa qual o sítio de restrição ção no vetor gi
utilizado, a auto-ligação resulta em um gene lacZ'funcional (Figura 6.9c), originando placas mitirá que a se
azuis. A seleção é, portanto, inequívoca: somente fagos Ml3mpT recombinantes darão origem Outros pan
aplacas claras. semelhantes ac
Uma grande vantagem de M13mp7, com seus sítios de clonagem simétricos, é que o DNA de restrição dil
inserido tanto no sítio de BamHI, SalI ou PsrI pode ser excisado da molécula recombinante
utilizando-se EcoRI (Figura 6.10). Pouquíssimos vetores permitem que um DNA clonado se- Vetores híbl
ja tão facilmente recuperado. Embora os vetr
nes clonados, r
6.2.3 Vetores Ml3 mais complexos to de DNA qur
Os vetores Ml3 mais sofisticados possuem sítios de policlonagem mais complexos inseridos mo o tamanho
no gene lacZ'.lJmexemplo é o Ml3mp8 (Figura 6.11a), o qual é o correspondente do plas- dos. Para soluc
---------15
CLoruncev GÊNrcA E AnÁuse oe DNA 125
(a) Clivagem de Ml3mpz

Ïodo ou parte do sítio de policlonagem
Sítio de policlonagem
EcoRl,
ou Sa/l
/\/ã..
(b) Religação com novos
produtos de DNA passíveis (c) Coloração das placas em meio
Figura 6.8
Construção de 1 Novos insertos de DNA: /'l ágar com X-gal
M13mp7: (a) o sítio \

de policlonagem e tabZ'lnterrompido *Sem p-gal *Placa clara
(b) sua inserção no
sítio de EcoRl de
M13mp2. Note que 2 Sítio de policlonagem reinserido:
os sítios de restrição
para SaÍ são tam- lacz. rcslaurade * B_gal -*Placa azul
bém reconhecidos
por Accl e Hirrcll.
3 Sítio de policlonagem reinserido:

Figura 6.9 *p-gal *placa
lacZ'reslaurado azul
Clonagem com
1[ltl3rnp7 (ver o texto
para detalhes).
SalI, uma parte ou todo o sí-
de um DNA novo, um
mídeo pUCS (p. 119). Assim como no vetor plasmidial, uma vantagem do M13mp8 está na
sua capacidade. de receber fragmentos de DNA com duas extremidades coesivas diferentes.
Uma segunda característica é fornecida pelo vetor gêmeo M13mp9 (Figura 6.1 1b), o qual
possui o mesmo sítio de policlonagem, mas na orientação inversa. Um fragmento de DNA
clonado em M13mp8, se excisado por meio de uma restrição dupla, e, então, inserido em
Ml3mp9, estará, agora, na sua orientação inversa (Figura 6.11c). Isso é importante no seqüen-
a produção de p-galacto- ciamento de DNA (p. 211), durante o qual a seqüência de nucleotídeos é lida a partir de uma
meio ágar com X-gal (Figura extremidade do sítio de policlonagem para o interior do fragmento de DNA inserido (Figura
e o M13mp7 original é nova- 6.11d). Somente cerca de 600 nucleotídeos podem ser lidos em um experimento de seqüen-
ím, o que acontecerá se o ve- ciamento; se o DNA inserido é mais longo que isso, uma das extremidades do fragmento não
iclonasem inserido? Mais uma será seqüenciada. Uma alternativa é virar o fragmento ao contriírio, por sua excisão e reinser-
qual o sítio de restrição ção no vetor gêmeo. Um experimento de seqüenciamento de DNA com esse novo clone per-
6.9c), originando placas mitirá que a seqüência de nucleotídeos da outra extremidade do fragmento seja determinada.
'7
recombinantes darão origem Outros pares de vetores M13 também estão disponíveis. Ml3mp10/l 1 e M13mp18/19 são
semelhantes ao M13mp8/9, mas possuem sítios de policlonagem diferentes e, portanto, sítios
simétricos,équeoDNA de restrição diferentes.
da molécula recombinante
que um DNA clonado se- Vetores híbridos plasmídeo-M1 3
Embora os vetores M13 sejam muito úteis para a produção de versões de fita simples dos ge-
nes clonados, eles têm uma desvantagem. Existe uma limitação prÌra o tamanho do fragmen-
to de DNA que pode ser clonado em um vetor M13, com 1.500 pb, em geral, sendo tido co-
mais complexos inseridos mo o tamanho máximo, embora fragmentos de até 3 kb tenham sido ocasionalmente clona-
é o correspondente do plas- dos. Para solucionar esse problema, inúmeros vetores novos (fagomídeos, do inglês phage-
126 T.A.Bnowru
,^"-ü^
Extremidades de
Sau3A (GATC)
Clivagem com BamHl
(extremidades GATC)
Ligação, 1 Sítios de BamHl não

clonagem são restaurados
t/,,4t\, \
2 M13 possui muitos
\ sítios oara SauSA
/ Fragmento de \
i Satt3A \
/ \ a,,u"n"m com EcoRt
I \<*í
3 Portanto, recuperação
do fragmento por clivagem /\
com EcoRl
Figura 6.10
Recuperação de um DNA
Extremidades clonado a partir de uma
9\ clivagem oo u",o.
coesivas
de EcoRl
molécula de M13mp7 re-
combinante por meio da
,/ \ clivagem dos sítios mais
externos do sítio de poli-
clonagem.
mids) forandesenvolvidos pela combinação de uma paÍe do genoma de M13 com o DNA do
plasmídeo.
Um exemplo é fornecido pelo pEMBL8 (Figura 6.12a), construído pela transferência pa-
ra pUCS de um fragmento de 1.300 pb do genoma de Ml3. Esse pedaço de DNA de Ml3 con-
tém a seqüência-sinal reconhecida pelas enzimas que convertem a molécula de Ml3 de fita
dupla normal em DNA de fita simples, antes da secreção de novas partículas de fago. Essa se-
qüência-sinal ainda é funcional, mesmo que separada do restante do genoma de Ml3, de for-
ma que moléculas de pEMBLS são também convertidas em DNA de fita simples e secretadas
como partículas de fago defectivas (Figura 6.12b). É necessário qïe as células de E coli lti- Figura 6.11
lizadas como hospedeiras em um experimento de clonagem co{rì pEMBL8 sejam subseqüen- ll13mp8 e M13mpg.
temente infectadas com um M13 normal para atuar como um fago auxiliar (do inglês helper
phage), fornecendo as enzimas replicativas necessárias e as proteínas do capsídeo do fago. O
pEMBL8, sendo derivado de pUC8, possui os sítios de policlonagem no interior do gene
lacZ' , de forma que placas recombinantes podem ser identificadas da maneira padrão em meio
ágar contendo X-gal. Com pEMBLS, versões de fita simples dos fragmentos de DNA clona-
dos de até 10 kb de tamanho podem ser obtidas, aumentando significativamente a amplitude
do sistema de clonagem de M13.
ì-
Li
L.
Crorueeera GÊrurcr e ANÁLtsE oe DNA 127
(a) O sítio de policlonagem de M13mp8/9
AAT TCCCGGGGATCCGTCGACCTGCAGCC A
cGGòôóò in òccÀôc ieoÀcôióèe i rcon
I
EcoRl Smal Sa/l Hindlll

Xmal Accl
Hincll
(b) A orientação do sítio de policlonagem
aHindlll Hindl
,_ff<.''"t
EcoRl . EcoRl
-
-y_,rÈ
(c)TransÍerência de DNA de M13mp8 para M13mpg
EcoRl Hind|,t Hindtlt

Hindlll
I
d
n
N
R
h1
Figura 6.10 Clivagem t{ Ligação
n
Recuperação de um DNA P
I
clonado a partir de uma EcoRl

molécula de M13mp7 re-
combinante por meio da
(d) Seqüenciamento de DNA utilizando M13mp8 e Ml3mp9
clivagem dos sítios mais
eÍernos do sítio de poli-
clonagem.
de Ml3 com o DNA do

,/
Fsl
M13mpB \
*-.-/,r'
recombinante
Sequência de DNA
,R recombinante
ído pela transferência pa-

de DNA de Ml3 con-
a molécula de M13 de fita
partículas de fago. Essa se-
do genoma de M13, de for-
de fita simples e secretadas
que as células de E coliuti-
pEMBLS sejam subseqüen-
auxiliar (do inglês helper
do capsídeo do fago. O
m no interior do gene
da maneira padrão em meio
fragmentos de DNA clona-
ificativamente a amplitude
128 T. A. Bnowlr
6.3 Vetores d
Dois proble
(a) pEMBLS
pudessem s
Fragmento de DNA
de M13
(1) Amol
preseÍ
maior
3.997 pb partícr
ampR um fn
Agrupamento de sítios gura 6
(ver Figura 6.4a)
(2) O gen
mento
lizada
de um
(b) Conversão de pEMBLB em DNA de Íita simples
muito
Região de Ml3 zz>, Proheína de rePlicação
6.13U
@ aeïtns
A proteína de M13
replica pEMBLS em
DNA de fita simples
pEMBLS de fita dupla
Figura 6.11
,Í!s dois problemas qu
/\
tt llreram que ser resoM
\./ üs antes que os veto
\__./ rcs de clonagem de,
/ ^ \/ \
Fdessem ser desen
rolvidos. (a) A limita
\. / \_/ ção do tamanho esta
Moléculas de pEMBLS bebdda pelo genom
de fita simples ,üL, devido à necessi
dade de empacotá-l
Figura 6.12 m interior da cabeç
pEMBLS: um vetor hí- üÍago. (b) O DNAd
brido plasmídeo-M13 L possui múltiplos si
Partículas de "fago"
de pEMBLB
que pode ser convertF de reconhecimentt
do em DNA de Íita paÍa quase todas a
simples. de res
trição
F
ì
CrorunGeu GÊrurcn e ANÁLtsE oe DNA 129
Vetores de clonagem baseados no bacterióÍago À
Dois problemas tiveram de ser solucionados antes que os vetores de clonagem baseados em l,
pudessem se desenvolver:
(1) A molócula de DNA de l, pode ser aumentada em tamanho em somente cerca de 5vo,rc-
presentando a adição de apenas 3 kb de DNA novo. Se o tamanho total da molécula for
maior que 52 kb, ela não poderá ser empacotada dentro da estrutura da cabeça de l, e
partículas de fago infectivas não serão formadas. Isso limita severamente o tamanho de
um fragmento de DNA que pode ser inserido em um vetor l, que não foi modificado (Fi-
gura 6.13a).
(2) o genoma de l, é tão grande que ele possui mais do que uma seqüência de reconheci-
mento para virtualmente cada endonuclease de restrição. A restrição não poderia ser uti-
lizadapara clivar a molécula de l" normal em uma forma que ela iria permitir a inserção
de um DNA novo, pois a molécula seria clivada em vários pedaços pequenos, os quais,
muito improvavelmente, iriam restaurar um genoma de l, viável após religação (Figura
6.1 3b).
(a) A limitação de tamanho
Genoma normal de l" Possível recombinante

49 kb >52kb
\
t\
I Novo DNA > 3 kb
I +
X
Figura 6.13 Muito grande para
ser empacotado
dois problemas que
que ser resolvi- ?
Empacotamento
antes que os veto-
ms de clonagem de l,
pdessem ser desen-
(b) Múltiplos sítios de restrição
rolvidos. (a) A limita-
@ do tamanho esta-
Hecida pelo genoma , 1 ,2,3,4,5,6, EcoRl
1" devido à necessi-
dade de empacotá-lo
Figura 6.12
pEMBLS: um vetor hÊ
brido plasmídeo-M13
nn interior da cabeça
bfago. (b) O DNA de
fl, possui múltiplos sÊ
k*,
que pode ser converti-
de reconhecimento ' PU g Retisação Mistura complexa
do em DNA de Íita para quase todas as
simples. Cl É! de moléculas
de res- tgt
trição.
F
uul(-lalttçs, rur )urPtççlluçlltç quç ur[41 allllPla valt h,m
clonagem de l, se desenvolvesse, com sua utilização principal sendo a clonagem de grandes suíam <
pedaços de DNA, desde 5 a25kb, muito extensos pÍÌra manipulação em vetores plasmidiais
ção de
ou Ml3. DNA d
poucas
6.3.1 Segmentos do genoma de )', podem ser deletados sem preiuízos a tios par
sua viabilidade eventua
ra EcoI
A maneira que impulsionou o desenvolvimento dos vetores de clonagem de l, foi fornecida
pela descoberta de que um grande segmento na região central da molécula de DNA de l, po-
de ser removido sem prejudicar a capacidade do fago de infectar células de E. coli. A remo-
ô3.3 Vetorer
ção de toda ou de parte dessa região não-essencial, entre as posições 20 e35 do mapa mostra- Uma ve
do na Figura 2.9, diminui o tamanho da molécula de l, resultante para até cerca de 15 kb. Is- plos síti
so significa que até 18 kb de um DNA novo podem agora ser adicionados, antes que o ponto diferent
de clivagem para o empacotamento seja alcançado (Figura 6.14). a serem
A região "não-essencial" de fato contém a maioria dos genes envolvidos na integração e
excisão do profago de l, do cromossomo de E. coli. Um genoma de l, deletado é, portanto"
não-lisogênico e pode seguir somente o ciclo lítico de infecção. Isso é, por si só, desejável pa.
ra um vetor de clonagem, uma vez que a indução não é necessária antes que as placas sejern
formadas (p. 58).
E.
o.EO.Eó
:O2EE
oooc$ ì(ú
H,B g
O r(ú È
fi g€
rrú
Figura 6.14
Componentes
docapsídeo b2
gE
E6i E .E Et @ Í.
E
O mapa genético de 1", mostrando a po-
sição da região não-essencial que pode
= ser deletada sem prejuízos à capacida&
do Íago de seguir o ciclo lítico de infec-
ção.
6.3.2 A seleção natural pode ser utilizada para o isolamento de l,

modiÍicados que não possuem determinados sítios de restrição
Mesmo um genoma de À deletado, com a sua região não-essencial removida, possui múlt
sítios de reconhecimento para a maioria das endonucleases de restrição. Trata-se de um
blema freqüentemente encontrado quando um vetor novo está sendo desenvolvido. Se
te um ou dois sítios necessitam ser removidos, então atécniea de mutagênese in vitro (p.
pode ser utilizada. Por exemplo, um sítio para EcoRI, GAATTC, poderia ser modificado Figura 6.15
ra GGAITC, que não é reconhecido pela enzima. No entanto, a mutagênese invitro estaya iülzando-se a se-
sua infância quando os primeiros vetores de l, se desenvolveram, e, mesmo nos dias de llftão natural para
ela não seria uma maneira eficiente para a modificação de mais que uns poucos sítios em to de fa-
única molécula. l" que não pos-
sítios de res-
ütiiPo Para EcoRl.
Cloruncev GÊrurcn e AnÁuse oe DNA 131
variedade de vetores dc Em vez disso, a seleção natural foi utilizada paÍa fornecer linhagens de l" que não pos-
sendo a clonagem de grandes suíam os sítios indesejados. A seleção natural pode ser posta em funcionamento pela unliza-
em vetores plasmidiais
ção de uma linhagem hospedeira de E. coli que produz EcoRI. A maioria das moléculas de
DNA de À que invadem a célula é destruída por essa endonuclease de restrição, mas umas
poucas irão resistir e produzirão placas. Esses serão fagos mutantes, nos quais um ou mais sí-
sem preiuízos a tiospara EcoRI foram espontaneamente perdidos (Figura 6.15). Viírios ciclos de infecção irão,
eventualmente, resultar em moléculas de À que não possuem todos ou a maioria dos sítios pa-
clonagem de À foi fornecida ra EcoRI.
molécula de DNA de À po-

células de E. coli. A remo-
83,3 Vetores de inserção e substituição
20 e35 do mapa mostra- Uma vez que os problemas apresentados pela dificuldade de empacotamento e pelos múlti-
paraaté cerca de 15 kb. Is- plos sítios de restrição foram resolvidos, o caminho estava aberto para o desenvolvimento de
antes que o ponto diferentes tipos de vetores de clonagem baseados em 1,. As primeiras duas classes de vetores
a serem produzidas foram os vetores de l, de inserção e de substituição (ou troca).
envolvidos na integração e
de À deletado é, poÍanto,
lsso é, por si só, desejável pa-
ia antes que as placas sejam
5 sítios para EcoRl
,..-t '4ll\DNA de l, normat

I ttlll
Ç
r
\
\
de 1,, mostrando a po- infecção de células de E.coli
produtoras de EcoRl
ião não-essencial que pode
sem prejuízos à capacidade Placa formada
seguir o ciclo lítico de inÍec- Por fago mutante Somente 3 sítios
"..-JÏ:T'
de ?u Muito poucas placas
sítios de restrição
removida, possui múltiplos Repetição da inÍecção
com o fago mutante
e restrição. Trata-se de um pro-
sendo desenvolvido. Se somen-
de mutagênese invitro (p.244)
Sem sítios
, poderia ser modificado pa- Figura 6.15 oara Eco9l
a mutagênese invitro estava na llliNizando-se a se-
rt' t
, e, mesmo nos dias de hoje, leção natural para Segupda linhagem

Mais algumas
que uns poucos sítios em uma oisolamento de fa- de fago mutante
placas
gm l, que não pos-
sram sítios de res-
t--
üião para EcoRl.
I
132 ï A. Bnowlr
Vetores de inserção dess:

Em um vetor de inserção (Figura 6.16a), um fragmento grande da região não-essencial foi re- fer, d
movido e os dois braços ligados um ao outro. Um vetor de inserção possui ao menos um úni- dem
co sítio de restrição, dentro do qual um DNA novo pode ser inserido. O tamanho do fragmen- nho.
to de DNA que um vetor individualmente pode carrear dependerá, é claro, da extensão da de- . l,GE
leção de sua região não-essencial. Dois vetores de inserção populares são: kb (p
liclor
l,gt10 (Figura 6.16b), que pode caffear até cerca de 8 kb de um DNA novo, inserido em most
um único sítio de EcoRI, localizado no interior do gene cI. A inativação por inserção mais
desse gene resulta em recombinantes que são distinguidos como placas claras, emvez NNh
de placas turvas (p. 109). menl
LZ^PI (Figura 6.16c), com o qual inserções de até 10 kb de DNA no interior de qual- tanto
quer um dos seis sítios de restrição dentro do sítio de policlonagem irão inativar o gene que (
lacZ'presente no vetor. Os recombinantes originam placas claras, em vez de placas po st
azuis, em meio ágar com X-gal.
6.3.4 Experime
Vetores de substituição ou substi
Um vetor de ì, de substituição possui dois sítios de reconhecimento para a endonuclease de
Um experi
restrição utilizada para a clonagem. Tais sítios flanqueiam um segmento de DNA que é subs-
um vetor F
tituído pelo DNA a ser clonado (Figura 6.I7a). Freqüentemente, o fragmento substituível (ou
ligada e as
fragmento stuffer, no jargão de clonagem) carrega sítios de restrição adicionais que podem
ser utilizados para clivá-lo em pedaços pequenos, de forma que a sua própria reinserção du-
rante um experimento de clonagem é bastante improvável. Os vetores de substituição são, em
geral, projetados para carïear pedaços de DNA maiores do que os que os vetores de inserção
podem suportar. A seleção dos recombinantes é, freqüentemente, com base no tamanho, uma
vez que os vetores não-recombinantes são muito pequenos pÍÌra serem empacotados nas cabe-
ças do fago (p. 109).
Dois velores de substituição populares são:
ÀEMBL4 (Figura 6.17b), que pode carrear até20kb de DNA inserido pela substituição
de um segmento flanqueado por pÍÌres dos sítios de EcoRI, BamHIe SalI (qualquer uma
(a) Construção de um vetor de l, de inserção
clivagem'
DNA de À normat (49 kb) rigação yï1,.',::rà"
Figura 6.17
- |* (35-40kb) tlfrfiores de À de
Região nôstituição. (a)
não-essencial
lDbnagem com
um vetor de l,
ü zubstituição.
Figura 6.16 {b) Clonagem
(b) l.sr10 (c) rzAPil Vetores de l, de inser- oom i.EMBL4.
ção. P = sítio de poli- (c) A estrutura
clonagem no gene de },GEM11,
LTrj-+oxo ' 7à '-\ '41 kb

lacZ'de l.ZAPll, con-
tendo sítios de restri-
mmnslrando a or-
ffirn dos sítios
Deleção lacZ' ção únicos para Sad, ürestrição nos
Deleção dcÍs sítios de
Notl, Xbal, Spel, Eco
Rle Xhol. policlonagem.
b
b
t
i
===: È-r
Cr-oueerv GÊNtcA E ANÁLlsE oe DNA 133
dessas três endonucleases de restrição pode ser utilizadapararemover o fragmento stuf-

po-
não-essencial foi re-
fer, deforma que fragmentos de DNA com uma vaÍiedade de extremidades coesivas
dem ser clonados). A seleção dos recombinantes de ì"EMBL4 pode basear-se no tama-
possui ao menos um úni-
nho, ou pode utilizar o genótipo Spi (p. 109).
O tamanho do fragmen-
2,,GEM11 e ?r,GEM12 (Figura 6.1'7c), cada um dos quais possui uma capacidade de 23
É claro, da extensão da de-
kb (próxima ao máximo teórico), com o fragmento stuffer flanqueado por sítios de po-
sao:
liclonagem que contêm sete sítios de restrição diferentes. Os sítios de policlonagem
mostram-Se levemente diferenteS nesses dois vetores, mas' em ambos os casos, os sítios
DNA novo, inserido em
mais externos são para a enzima de restrição S7ïI, a qual reconhece a seqüência GGCC-
{ inativação Por inserção
NNNNNGGCC. Essa seqüência é muito rara e improvável de estar presente no frag-
placas claras, em vez
mento de DNA que foi clonado. A restrição do vetor recombinante com SfI pode, por-
rcLìüno
tanto, ser utilizada para excisar o fragmento clonado, com uma grande probabilidade de
DNA no interior de qual- que o fragmento seja recuperado intacto. Como com }"EMBL4, o tamanho ou o fenóti-
irão inativar o gene
po Spi podem ser utilizados para a seleção dos recombìnantes'
claras, emYez de Placas
n3.4 Experimentos de clonagem com vetores de ?r, de inserção
ou substituição
para a endonuclease de Um experimento de clonagem com um vetor de l" pode seguir as mesmas etapas como com
de DNA que é subs- um vetãr plasrnidial - as moléculas de ì" são clivadas, o DNA novo é adicionado, a mistura é
o fngmento substituível (ou ligada e as moléculas resultantes utilizadas para transfectar uma linhagem de E. coli hospe-
!ão adicionais que Podem
a sua própria reinserção du-
de substituição são, em
os que os vetores de inserção
com base no tamanho. uma
(a) Clonagem com um vetor de I de substituição
empacotados nas cabe- Clivagem,

ligação
t------T-------rJ I v77V77' I
inserido pela substituição

BamHIe SalI (qualquer uma
(b) ).EMBL4
L--Y,J
Fragmento
stuffer z \
DNA novo
EcoRl, BamHl,
Sa/l ou uma
r ffi___)
combinação \\
RBS SBR DNA novo,
Figura 6.17
R = EcoRl de até 23 kb
ffiores de ), de
urbstituição. (a) B= BamHl
0onagem com S = Sail
un vetor de l. (c) }"GEMI1
üsubstituição.
Figura 6.16 {b) Clonagem
Vetores de l, de inser- oom ÀEMBL4.
Ção. P = sítio de Poli-
[p) A estrutura
clonagem no gene de ÀGEM11,
Í
IacZ'de l,ZAPll, con- nmtrando a or- SfiI - Sacl - Xhol - Bam\l - Avrll- EcoRl
lb tendo sítios de restri- ffin dos sítios "rr\
restrição nos - - Avrl Bamïl - Xhol Sacl- Sfll
ção únicos Para Sac{, Xbal Eco?l
bçao Notl, Xbal, Spel, Eco dois sítios de
policlonagem.
Rle Xhol.
b
I %:
.:
134 T. A. Bnowr.r
deira competente (Figura 6.18a). Esse tipo de experimento necessita que o vetor esteja na sua 6.3.5 Fragmentc
forma circular, com os sítios cos ligados entre si por meio de pontes de hidrogênio. utilizande
Embora bastante satisfatório para muitos propósitos, um procedimento baseado em trans-
O último e o
fecção não é particularmente eficiente. Um número mais elevado de recombinantes será obti-
entre uma Ín
do se um ou dois refinamentos forem introduzidos. O primeiro é auttlização da forma linear
trada no fato
do vetor. Quando a forma linear do vetor é digerida com a endonuclease de restrição apropria-
da, os braços direito e esquerdo são liberados como fragmentos separados. Uma molécula re-
protéico do f
ootamento ra
combinante pode ser construída misturando-se o DNA a ser clonado com os braços do vetor
(Figura 6. 1 Sb). A ligação resulta em vários rearranjos moleculares, incluindo catenanos cons- lécula que cr
Um cosu
tituídos de braço esquerdo-DNA-braço direito, repetidos muitas vezes (Figura 6.18b). Se o
também nect
DNA inserido possui o tamanho correto, então os sítios cos, que separam essas estruturas, es-
tarão a uma distância correta um do outro para o empacotamenÍo in vitro (p. 101). Os fagos
recombinantes são, portanto, produzidos em um tubo de ensaio e podem ser utilizados para
infectar uma cultura de E. coli. Essa estratégia, em especial a utilização do empacotamento ln
vitro, restlta em um grande número de placas recombinantes.
(a) Clonagem com um DNA de I circular
( );* (
./---\
/\
\cos'
\__-/
/
."o*, U
\cos
À_-_-
'Fr*"
,.---.---',:!coat
/
DNA
Vetor de l. de inserção - / Molécula recombinante

forma circular Transfecção de E. coti
(b) Clonagem com um DNA de l" linear

Ligação cos Figura 6.18
e*t^tÊ"*" '..--%_q DiÍerentes estraté-
,orflEcoeì gias de clonagem
i^\
d" N
com um vetor de 1".
Braços
ô^ \, (a) Utilizando-se a
@.."nF{\
Íorma circular de l.
,ra'%," como um plasmÊ
DNA
novo deo. (b) Utilizando-
a se os braços es-
? ? ?-------
recombinantes ll=
J querdo e direito do
genoma de 1,, além Figura 6.19
,/ //L I do empacotamento ülm cosmídeo típico
./ Mistura do empacotamenlo in vitro in vitro, para a ob-
tenção de um nú-
ea maneira como
lnfecção de E. coli dts é utilizado para
mero maior de pla- ndonagem de Írag-
cas recombinantes. rmttos de DNA lon-
gos.
t
Ï
Ct-ouoeu GÊrurcn e ANÁLtsE oe DNA 135
que o vetor esteja na sua 53.5 Fragmentos muito grandes de DNA podem ser clonados
de hidrogênio. utilizando-se um cosmídeo
imento baseado em trans-
recombinantes será obti- O último e o mais sofisticado tipo de vetor baseado em l" é o cosmídeo, o qual é um híbrido
a utilizaçfie da forma linear entre uma molécula de DNA de fago e uma de plasmídeo bacteriano, com sua estratégia cen-
de restrição apropria- trada no fato de que enzimas que empacotam a molécula de DNA de l, dentro do capsídeo
Uma molécula re- protéico do fago necessitam somente dos sítios cos parafuncionar (p. 3a).4 reação de empa-
com os braços do vetor Gotamento in vitro funciona não somente com genomas de 1,, mas também com qualquer mo-
incluindo catenanos cons- lécula que cilïegue sítios cos separados por um DNA de 37 a 52kb.
vezes (Figura 6.18b). Se o Um cosmídeo é basicamente um plasmídeo que caÍrega um sítio cos (Figura 6.19a). Ele
essas estruturas, es- também necessita de uma marca de seleção, tal como o gene que confere resistência à ampi-
in vitro (p. 101). Os fagos
e podem ser utilizados para
do empacotamento in
(a) Um cosmídeo típico
BamHl
(b) Clonagem com pJBB

BamHl
Clivagem BamHl BamHl

I a
com BamHl
cos ampH
-=l
lo-t
la-l
pJBB linear
pJBB circular -
/ Bam*r BamHr
Figura 6.18
DiÍerentes estraté-
u:rn, /--=-
gias de clonagem DNA novo
com um vetor de 1". (r^"
(a) Utilizando-se a "r,
Íorma circular de l"
como um plasmÊ Empacotamento / "*-
deo. (b) Utilizando-
se os braços es-
querdo e direito do
genoma de À, além
invitro
3:l#:.ï15 ç??
,2" 'h-%
do empacotamento
Figura 6.19
lllin cosmídeo típico
Partícuraso"'\
in vitro, para a ob- e a maneira como ::J:i::;$:ïJs3[:lïil;:.,",
tenção de um nú- de é utilizado para
lnfecção de E. coli -t--__
/ I
mero maior de pla- sdonagem de Írag- U ,
cas recombinantes. fiEíìtos de DNA lon- Meio com ampicilina

gos.
:==1.*iryrr
136 T. A. Bnowrrr
cilina, além de uma origem de replicação plasmidial, rmayezque os cosmídeos não &zironrÍn
todos os genes de À e, portanto, não produzem placas. Ao contriírio, colônias são &procuraú
meio seletivo, exatamente como com um vetor plasmidial. [ma soh
um experimento de clonagem com um cosmídeo é realizado como segue (Figura 6.1 insertos de I
O cosmídeo ó aberto em seu único sítio de restrição e novos fragmentos de DNA são in dos nos cror
dos. Tais fragmentos são normalmente produzidos pela digestão parcìa7 com uma endonucl* somes), os q
se de restrição, uma vez que a digestão total quase que invariavelmente resulta em fragmen- lativamente
tos que são muito pequenos para serem clonados em um cosmídeo. A ligação érealizadade plasmidiais
forma que os catenanos são formados. Com a condição de que o inserto de DNA possua o ta- reduzindo o
manho correto, o empacotamenÍo in vitro cliva os sítios cos e coloca os cosmídeos recombi- tros vetores
nantes dentro das partículas de fago maduras. Esses fagos À são, então, utilizados para infec- vantagem. e
tar uma cultura de E. coli, apesar, é claro, de que placas não serão formadas. Em vez disso, as de capsídeo
células infectadas são plaqueadas em um meio seletivo e colônias resistentes ao antibiótico clonar fragr
irão aparecer. Todas as colônias serão recombinantes, já que cosmídeos lineares não-recom- nam as cara
binantes são muito pequenos para serem empacotados dentro das cabeças de À. dos de Pl (
dade de até
6.4 Àe outros vetores de alta capacidade permitem que

bibliotecas genômicas sejam construídas 6.5 Vetores p
O principal uso de todos os vetores baseados em À é a clonagem de fragmentos de DNA mui- Vetores de r
to grandes piìra serem suportados por vetores plasmidiais ou M13. Um vetor de substituição, incluindo S
tal como ÀEMBL4, pode carrear até20kb de DNA novo, enquanto alguns cosmídeos podem plasmídeos
sustentar fragmentos de até 40 kb. Isso confronta com o tamanho máximo do inserto de cerca pla faixa dr
de 8 kb para a maioria dos plasmídeos e menor do que 3 kb para os vetores Ml3. Uns poucos
A capacidade para clonar fragmentos de DNA tão extensos significa que bibliotecas ge- ses vetores r
nômicas podem ser produzidas. Uma biblioteca genômica é um conjunto de clones recombi- lizações.
nantes que contém todo o DNA presente em um organismo individual. Uma biblioteca genô-
mica de E. coli, por exemplo, contém todos os genes de E. coli, de forma que qualquer gene
desejado pode ser retirado da biblioteca e estudado. Bibliotecas genômicas podem ser manti-
das por muitos anos, além de multiplicadas, de maneira que cópias podem ser enviadas de um Tabela 6.1
grupo de pesquisa para outro. organismos
A grande questão é quantos clones são necessários para uma biblioteca genômica? A res-
posta pode ser calculada com a fórmula:
ln(l- p)
r"ír-9ì Espécies
\ b)
E. coli
na qual Né
o número de clones que são necessários, P é a probabilidade de um gene qualquer
Saccharom,
estarpresente, a é o tamanho médio dos fragmentos deDNA inseridos no vetor, ebéotama-
nho total do genoma. A Tabela 6.1 mostra o número de clones necessário para bibliotecas ge- Drosophila
nômicas em uma variedade de organismos, construídas utilizandtr um vetor de substituição de Anoz
l" ou um cosmídeo. Homem
Não é, de forma alguma, impossível obterem-se várias centenas de milhares de clones, e
Sapo
os métodos utilizados para identificar um clone carregando um gene desejado (Capítulo 8) po-
dem ser adaptados para lidar com números tão grandes, de maneira que bibliotecas genômi- " Calculado p
cas çom esses tamanhos não são, em absoluto, impraticáveis. No entanto, maneiras para se re- 'Fragmenros
'Fragmentos
t
l
CLoruneev GÊucn e ANÁLrsE oe DNA 137
os cosmídeos não possuem duzir o número de clones necessário para uma biblioteca genômica estão continuamente sen-
colônias são formadas em do procuradas.
Uma solução está no desenvolvimento de novos vetores de clonagem, capazes de suportar
como segue (Figura 6.19b). insertos de DNA longos. Durante os últimos anos, os progressos nessa área foram centraliza-
de DNA são inseridos nos cromossomos artificiais bacterianos (BACs, do inglês bacterial artificial chromo-
ial com uma endonuclea- somes), os quais são vetores modernos baseados no plasmídeo F (p. 29). O plasmídeo F é re-
resulta em fragmen- lativamente grande e os vetores dele derivados têm uma capacidade maior do que os vetores
. A ligação é realizada de plasmidiais normais. Os BACs podem sustentar insertos de DNA de até 300 kb de tamanho,
inserto de DNA possua o ta- reduzindo o tamanho de uma biblioteca genômica humana para somente 30.000 clones. Ou-
os cosmídeos recombi- tros vetores de alta capacidade foram construídos a partir do bacteriófago Pl, o qual possui a
então, utilizados para infec- vantagem, em relação a À, de ser capaz de comprimir 110 kb de DNA dentro da sua estrutura
formadas. Em vez disso, as de capsídeo. Vetores do tipo cosmídeos, baseados em P1, foram projetados e utilizados para
ias resistentes ao antibiótico clonar fragmentos de DNA variando em tamanho desde 15 até I00 kb. Os vetores que combi-
ídeos lineares não-recom- nam as características de vetores de Pl e BACs, chamados cromossomos artificiais deriva-
cabeças de 1". dos de Pl (PACs, do inglês PI-derived artificial chromosomes), também possuem a capaci-
dade de até 300 kb.
6.5 Vetores para outras bactérias

Vetores de clonagem também foram desenvolvidos para várias outras espécies de bactérias,
fragmentos de DNA mui-
. {Jm vetor de substituição, incluindo Streptomyces, Bacillus e Pseudomonas. Alguns desses vetore\ são baseados em
alguns cosmídeos podem plasmídeos específicos para o organismo hospedeiro, enquanto outros são iriasmídeos de am-
máximo do inserto de cerca pla faixa de hospedeiro, capazes de replicar em uma variedade de hospedeiros bacterianos.
os vetores Ml3. Uns poucos são derivados de bacteriófagos específicos para esses organismos. A maioria des-
ignifica que bibliotecas ge. ses vetores é muito semelhante aos vetores de E. coli em termos de objetivos gerais e de uti-
conjunto de clones recombi- lizações.

idual. Uma biblioteca genG
d,e forma que qualquer gene
genômicas podem ser manti-
podem ser enviadas de um Tabela 6.L Número de clones necessário para bibliotecas genômicas em uma variedade de
organismos
biblioteca genômica? A res-
Número de clones'
Tamanho do Fragmentos Fragmentos

Espécies genoma (pb) de 17 kbà de 3-5 kb'
E. coli 4,6 x IO6 820 4to

idade de um gene qualquer
S accharomy c e s ce rev isiae 1,8 x 107 3.225 1.500
idos no vetor, e b é o Íama-
ssário para bibliotecas ge- Dros ophila me lanogaster 1,2x 108 21.500 10.000
um vetor de substituição de Arroz 5,7x 108 100.000 49.000
Homem 3,2x l}e 564.000 274.000
de milhares de clones, e x
Sapo 2,3 l01o 4.053.000 1.969.000
desejado (Capítulo 8 I po-
a que bibliotecas genômi- " Calculado para uma probabilidade (P) de 957o de que um gene qualquer estará presente na biblioteca.
entanto, maneiras paÍa se re- 'Fragmentos adequados paÍa um vetor de substituição, tal como }"EMBL4.
'Fragmentos adequados para um cosmídeo.
t
CLoruneev GÊucn e ANÁLrsE oe DNA 137
os cosmídeos não possuem duzir o número de clones necessário para uma biblioteca genômica estão continuamente sen-
colônias são formadas em do procuradas.
Uma solução está no desenvolvimento de novos vetores de clonagem, capazes de suportar
como segue (Figura 6.19b). insertos de DNA longos. Durante os últimos anos, os progressos nessa área foram centraliza-
de DNA são inseridos nos cromossomos artificiais bacterianos (BACs, do inglês bacterial artificial chromo-
ial com uma endonuclea- somes), os quais são vetores modernos baseados no plasmídeo F (p. 29). O plasmídeo F é re-
resulta em fragmen- lativamente grande e os vetores dele derivados têm uma capacidade maior do que os vetores
. A ligação é realizada de plasmidiais normais. Os BACs podem sustentar insertos de DNA de até 300 kb de tamanho,
inserto de DNA possua o ta- reduzindo o tamanho de uma biblioteca genômica humana para somente 30.000 clones. Ou-
os cosmídeos recombi- tros vetores de alta capacidade foram construídos a partir do bacteriófago Pl, o qual possui a
então, utilizados para infec- vantagem, em relação a À, de ser capaz de comprimir 110 kb de DNA dentro da sua estrutura
formadas. Em vez disso, as de capsídeo. Vetores do tipo cosmídeos, baseados em P1, foram projetados e utilizados para
ias resistentes ao antibiótico clonar fragmentos de DNA variando em tamanho desde 15 até I00 kb. Os vetores que combi-
ídeos lineares não-recom- nam as características de vetores de Pl e BACs, chamados cromossomos artificiais deriva-
cabeças de 1". dos de Pl (PACs, do inglês PI-derived artificial chromosomes), também possuem a capaci-
dade de até 300 kb.
6.5 Vetores para outras bactérias

Vetores de clonagem também foram desenvolvidos para várias outras espécies de bactérias,
fragmentos de DNA mui-
. {Jm vetor de substituição, incluindo Streptomyces, Bacillus e Pseudomonas. Alguns desses vetore\ são baseados em
alguns cosmídeos podem plasmídeos específicos para o organismo hospedeiro, enquanto outros são iriasmídeos de am-
máximo do inserto de cerca pla faixa de hospedeiro, capazes de replicar em uma variedade de hospedeiros bacterianos.
os vetores Ml3. Uns poucos são derivados de bacteriófagos específicos para esses organismos. A maioria des-
ignifica que bibliotecas ge. ses vetores é muito semelhante aos vetores de E. coli em termos de objetivos gerais e de uti-
conjunto de clones recombi- lizações.

idual. Uma biblioteca genG
d,e forma que qualquer gene
genômicas podem ser manti-
podem ser enviadas de um Tabela 6.L Número de clones necessário para bibliotecas genômicas em uma variedade de
organismos
biblioteca genômica? A res-
Número de clones'
Tamanho do Fragmentos Fragmentos

Espécies genoma (pb) de 17 kbà de 3-5 kb'
E. coli 4,6 x IO6 820 4to

idade de um gene qualquer
S accharomy c e s ce rev isiae 1,8 x 107 3.225 1.500
idos no vetor, e b é o Íama-
ssário para bibliotecas ge- Dros ophila me lanogaster 1,2x 108 21.500 10.000
um vetor de substituição de Arroz 5,7x 108 100.000 49.000
Homem 3,2x l}e 564.000 274.000
de milhares de clones, e x
Sapo 2,3 l01o 4.053.000 1.969.000
desejado (Capítulo 8 I po-
a que bibliotecas genômi- " Calculado para uma probabilidade (P) de 957o de que um gene qualquer estará presente na biblioteca.
entanto, maneiras paÍa se re- 'Fragmentos adequados paÍa um vetor de substituição, tal como }"EMBL4.
'Fragmentos adequados para um cosmídeo.
t
a Cnpíruto 7
ion of new cloning vectors. IL
is packageable in vitro in
Vetores de Clonagem para Eucariotos
75.4242-6.
plasmids. Nucleic Acids
vectors carrying polylinker
propagation of large human
t 1984) Efïtctent in vitro

ning a bacteriophage SP6
clonado em um plasmídeo do
in single-stranded
-78. [Vetores Ml3.]
300 kilobase-pair fragments of
the National Academy of Sc
and recoveru of DNA

Sciences of the USA, 87,103-7-
Yectors and host strains: Vetores para leveduras e outros Íìngos, I 39 Vetores defuríagem para animais, 157
Vetores de clonagem para pìantas superiores, 148
A maioria dos experimentos de clonagem é realizada tendo como organismo hospedeiro E

coli, e a maior variedade dos vetores de clonagem que está disponível é para esse organismo.
A E. coli é particularmente popular quando o objetivo do experimento de clonagem é estudar
as caracteísticas básicas da biologia molecular, tais como a estrutura e a função do gene. No
entanto, sob certas circunstâncias, pode se tornar desejável autilização de um hospedeiro di-
ferente para um experimento de clonagem. Isso é especialmente verdadeiro em biotecnologia
(Capítulo 13), na qual o objetivo pode não ser o estudo de um gene, mas a utilização da clo-
nagem para controlar ou melhorar a síntese de um produto metabólico importante (por exem-
plo, um hormônio, tal como a insulina) ou para modificar as propriedades de um organismo
(por exemplo, introduzir a resistência a herbicida em uma planta cultivável). Devemos, por-
tanto, considerar os vetores de clonagem para organismos diferentes de E. coli.
Vetores para leveduras e outros fungos

A levedura Saccharomyces cerevisiaeé um dos organismos mais importantes na biotecnologia.
Assim como seu papel na fabricação de cerveja e na produção de pão, a levedura tem sido utili-
zada como hospedeiro para a produção de importantes compostos farmacêuticos, a partir de ge-
nes clonados (p.29I). O desenvolvimento de vetores de clonagem para levedura foi grandemen-
te estimulado pela descoberta de um plasmídeo presente na maioria das linhagens de S. cerevi-
siae (Figrxa 7.1). O plasmídeo de 2 ytn, como ele é chamado, constitui-se em um dentre uma
quantidade bastante limitada de plasmídeos encontrados em células eucarióticas.
14O T.A. Bnown
FLP
Figura 7.1
O plasmídeo de 2 pm de levedura. REP| e REP2 esttu
envolvidos na replicação do plasmídeo, e FLPcodifica
uma proteína que pode converter a Íorma A do plasmÊ
deo (mostrada aqui) para a Íorma B, na qual a ordem
dos genes Íoi reorganizada pela recombinação intrarno-
lecular. A Íunção de D não é exatamente conhecida.
7.1.1 Marcas de seleção para o plasmídeo de 2 Frm

72
O plasmídeo de 2 pm é, de fato, uma excelente base para um vetor de clonagem. Ele o
kb de tamanho, o que é ideal para um vetor, e existe na céluÌa de levedura em número de [.8.t2
pias entre 70 e 200. A replicação utriliza a origem de replicação do plasmíÇéó, ìárias enzir l[Iìa
fornecidas pela célula hospedeira, além das proteínas codificadas pelos g6nes REPl e Rl @se
presentes no plasmídeo ü!m
No entanto, tudo não é perfeitamente direto na utilização do plasmídeo de 2 pm como
vetor de clonagem. Primeiro, existe a questão da marca de seleção. Alguns vetores de
gem para levedura contêm genes que conferem resistência a inibidores, tais como me
to e cobre, mas a maioria dos vetores populares faz uso de um tipo radicalmente diferente
sistema de seleção. Na prática, um gene de levedura normal é utilizado, geralmente um
que codifica uma enzima envolvida na biossíntese de aminoácidos. um exemplo é o
LEU2, que codifica B-isopropil-malato-desidrogenase, uma das enzimas envolvidas na
versão de ácido piúvico a leucina.
A fim de úllizar LEU2 como marca de seleção, um tipo especial de organismo
ro é necessário. o hospedeiro deve ser um mutante auxotrófico, que possui um gene
não-funcional. Tal levedura leu2- é incapaz de sintetizar leucina e pode sobreviver some
esse aminoácido for fornecido como um nutriente no meio de crescimento (Figura 7.2a). A
leção é possível porque os transformantes contêm um plasmídeo que carrega uma c
gene LEU2, e, assim, são capazes de crescimento na ausência do aminoácido. Em um
mento de clonagem, as células são espalhadas em meio mínimo (ao qual não foi adici
qualquer aminoácido). Somente células transformadas são capazes de sobreviver e formar
lônias (Figura7.2bt. epissômico
7.'|..2 Vetores baseados no plasmídeo de 2 pm: plasmídeos

epissôm icos para levedura
os vetores derivados do plasmídeo de 2 pm são chamados de plasmídeos epissômicos OYEpl3 apr
levedura (YEps, do inglês yeast episomal plasmids).Alguns yEps contêm o plasmídeo Prim€irc. ele é u
pm inteiro, outros incluem somente a sua origem de replicação. um exemplo desse últi tde replicação de
po é YEpl3 tFigura 7.3;. ra de pBR322. e I
Crorunçev GÊNrcA E ANÁLrsE oE DNA 141
(a) Levedura leu2-
+
REP| e REP2 estão
e.FLP codiÍica
atorm{A do plasmÊ
B, na Qgal a ordem O meio deve conter
Cromossomos - ausência leucina
recombina]ão intrame
do gene LEU2
(b) Utilizando LEU2 como uma marca de seleção
TransÍormar levedura
Frgiura7.2
de clonagem. Ele possú o ^\ -\
lel'edura em número de gle LEU2 Somente células transformadas
podem sobreviver
plasmídeo, viírias enzi r@mo Uma
pelosgenes REP| e de se- Vetor - carrega
em um o gene LEU2 correlo
de 2 pm como
Meio mínimo - sem leucina
. Alguns vetores de
radicalmente diferente
izado, geralmente um
. Um exemplo é o
imas envolvidas na
que possul um gene

I DNAdepBR322
@e sobreviver somente 10,7 kb ori DNA de 2 pLm
imento (Figura 7 .2a). A
que cilïega uma cópia
- t/'
zz DNA do cromossomo
ninoácido. Em um exor de levedura
(ao qual não foi adic
de sobreviver e formar Figura 7.3
epissômico de levedu-
ra, YEp13.
OYEp13 apresenta várias caracteísticas gerais dos vetores de clonagem para levedura.
contêm o plasmídeo dc Primeiro, ele é um vetor de transferência (do inglês shuttle vector). Assim como a origem
exemplo desse último de replicação de 2 pm e o gene de seleção LEU2, o YEp13 também possui a seqüência intei-
ra de pBR322, e pode, portanto, replicar e ser selecionado tanto em levedura qtanto em E. co-
)
142 T. A. Bnowlr
a definição
Ii,1g1átvârias linhas de raciocínio subjacentes à utilização de vetores de transferência. Uma
d
dessas é que pode ser difícil recuperar a molécula de DNA recombinante de uma colônia de
vetor como r
no DNA cror
levedura transformada. Isso não é um grande problema com YEps, os quais estão presentes
em células de levedura primeiramente como plasmídeos, mas com outros vetores para leve- entre o gene
do plasmído
dura, que podem integrar-se em um dos cromossomos da levedura (p. 1a3), a purificação po-
permanecer ì
de ser impossível. Isso é uma desvantagem porque, em muitos experimentos de clonagem, a
ja excisado r
purificação do DNA recombinante é essencial para identificação da construção correta por in-
termédio, por exemplo, do seqüenciamento do DNA.
O procedimento-padrão para clonagem em levedura é, portanto, realizar o experimento de
7.1.4 Outros tiP
clonagem inicial com E coli e selecionar recombinantes nesse organismo. Os plasmídeos re- Além dosY
combinantes podem, então, ser purificados, caracterizados, e a molécula correta introduzida destacando-t
na levedura (Figura 7.4).
(1) Plasm
7.1.9 UmYEp pode se inserir no DNA cromossômico da levedura sãoba
éYIp5
A palavra "epissômico" indica que umYEp pode replicar como um plasmídeo independentq orotidi
mas também implica que a integração em um dos cromossomos da levedura podqocorrer (ver
sintétir
)
mente
já que
breviv
Moléculas de YEpl3 recombinantes
ção oc
(2) Plasm
O recombinante são ca
desejado \
seqüêr
origen
cluind
7.6b) t
TRPl
Vetor religado
Meio com ampicilina
Extrair o DNA de vários clones,

identiÍicar a molécula correta
Transformar levedura
Í
Meio mínimo - ltrcombinação entre
Levedura recombinante sern leucina LEU2plasmidial e d
sorno pode integrar
!D{A cromossômico t
ra Após a integraF
duas cópias do ç
m$malmente uma é Ít
Figura 7.4 a outE
Clonagem com um vetor de transÍerência E colr-levedura, tal comoYEpl3'
I
Ëi
t
Cr-orunceu GÊlrcr e ANÁLtsE oe DNA 143
llores de transferência. U a definição de "epissomo" na página 27). Aintegração ocorre porque o gene carregado pelo
inbinante de uma colônia vetor como marca de seleção é extremamente homólogo à versão mutante do gene presente
fos, os quais estão no DNA cromossômico da levedura. ComYEpl3, por exemplo, a recombinação pode ocoffer
Fm outros vetores para lt entre o gene LEU2 do plasmídeo e o gene LEU2 mutante da levedura, resultando na inserção
1., tp. t+S), a purificação do plasmídeo inteiro em um dos cromossomos da levedura (Figura 7.5). O plasmídeo pode
de clonagem, permanecer integrado, ou um evento de recombinação mais tardio pode fazer com que ele se-
construção correta por i ja excisado novamente.
reahzar o experimento Outros tipos de vetores de clonagem para levedura

Os plasmídeos Além dos YEps, há vários outros tipos de vetores de clonagem utilizados com S. cerevisae,
ula correta i destacando-se os segunites :
(1) Plasmídeos integrativos para levedura (YIps, do inglês yeast integrcttive plasmids)
levedura são basicamente plasmídeos bacterianos que contêm um gene de levedura. Um exemplo
plasmídeo i é YIp5, que é pBR322 com um gene URA3 inserido (Figura 7.6a). Esse gene codifica
levedura pode ocorrer ( orotidina-5'-fosfato-decarboxilase (uma enzima que cataÌisp um dos passos da rota bios-
sintética para nucleotídeos de pirimidina) e é utllizadolúmo marca de seleção exata-
mente da mesma maneira como LEU2. UmYIp não pode replicar como um plasmídeo,
já que ele não possui qualquer pedaço do plasmídeo de 2 pm, e, em vez disso, a sua so-
brevivência depende da sua integração no DNA cromossômico da levedura. A integra-
ção ocorre exatamente conforme descrito para umYEP (Figura 7.5).
(2) Plasmídeos replicativos para levedura (YRps, do inglês yeast replicative plasmids)
são capazes de multiplicarem-se como plasmídeos independentes, pois possuem uma
seqüência de DNA cromossômico que inclui uma origem de replicação. Sabe-se que as
origens de replicação estão localizadas muito próximas a vários genes de levedura, in-
cluindo um ou dois que podem ser utilizados como marcas de seleção. YRpT (Figura
L6b) é um exemplo de um plasmídeo replicativo, composto de pBR322, além do gene
TRPI de levedura. Esse gene, que está envolvido na biossíntese do triptofano, localiza-
Meio com ampicilina

YEpl3
\r-euz
f,
\ LEU2 muÌado da levedura
Figura 7.5 I
entre os genes I Recombinação
plasmidial e do cromos- I
wno pode integrar YEp13 no LEU2 LEU2
cromossômico da levedu-
RApós a integração existem --u'>>t& t--J
úlas cópias do gene LEUZ DNA plasmidial
uma é funcional e
a outra, mutada.
144 T.A. Bnowu
clonado, j
do produt,
(a)Ylp5
Então,
URAs combinan
cromosso
binantes c
quando as
YEp apre:
plasmíder
últimos ar
ge que as
em cultur
7,1.5 Cromost
) de longc
(b)YRp7
O último
cial de le
TRPl
nova piÌrÍ
básica so
nentes fu
(1) Oc
dos
(2) Doi
sári
Figura 7.6 cro:
UmYlp e umYRP. (3) As
caç
Uma
seadjacenteàorigemdereplicaçãodocromossomo.ofragmentodeDNAdelevedura
de que o:
presente emYRpT contém tanto TRP| quanto a origem'
combina
de vetor para levedura é o
Três fatores devem ser considerados na decisão de qual tipo artificial.
mais adequado para um determinado experimento de clonagem. o primeiro desses é a fre' várias ce
de transformantes passíveis de serern tihcial,
qüência áe transformação, uma medidã do número a
de transformação elevada é
obtidos por micrograma de DNA plasmidial. uma freqüência
imprescindível, ou se existe pouco
necessária se um número grande àe recombinantes é
mais elevada, fornecendo entre
DNA inicial. YEps possueÃ a freqüência de transformação
também são bastante produtivos'
10.000 e 100.000 células transformadas por pg. YRps
rende menos que 1'000
dando entre 1.000 e 10.000 transformantes por pg, mas umYIp
que procedimentos especiais se-
transformantes por pg, quase que somente 1 a 10, a menos
YIp reflete o fato da necessida-
jam utilizador. À Uuiiu ireqtiência de transformação de um
vetor possa ser retido em uma cé-
de da ocorrência do raro evénto de integração, antes que o
lula de levedura.
cópias: 2O a50 e 5 a lOQ
Ademais, YEps e YRps também apresentam o maio. número de
urt., um YÌp está usualmente presente com apenas uma cópia por
respectivamente. Em
"ont a partir do gene
célula. Tais números são important*t i" o objetivo é a obtenção da proteína
Ct-onneeu GÊr.ircn e AnÁusE oe DNA 145
clonado, já que com um maior número de cópias do gene, maior será o rendimento esperado
do produto protéico.
Então, por que alguém haveria de desejar utilizar um YIp? Porque os YIps produzem re-
combinantes muito estáveis, uma vez que a perda de um YIp que tenha se integrado em um
cromossomo ocolTe somente em uma freqüência extremamente baixa. Por outro lado, recom-
binantes de YRp são muito instáveis, com os plasmídeos tendendo a reunir-se na célula-mãe
quando as células-filha brotam, de forma que estas são não-recombinantes; recombinantes de
YEp apresentam os mesmos problemas, embora um melhor entendimento sobre a biologia do
plasmídeo de 2 trtm tenha permitido que YEps mais estáveis tenham sido desenvolvidos nos
últimos anos. Apesar disso, umYlp é o vetor de escolha se a necessidade do experimento exi-
ge que as células recombinantes de levedura devam reter o gene clonado por longos períodos
em cultura.
7.1,5 Gromossomos artificiais podem serruüilizados para a clonagem

de longos pedaços de DNA em leveòúra
O último tipo de vetor de clonagem para levedura a ser considerado é o cromossomo artiÍi-
cial de levedura (YAC, do ingTês yeast artificíal chromosome), uma abordagem totalmente
nova pÍÌra a clonagem gênica. O desenvolvimento dos YACs foi um subproduto da pesquisa
básica sobre a estrutura dos cromossomos eucarióticos, trabalho que identificou os compo-
nentes fundamentais de um cromossomo como sendo (Figura 7.7):
(1) O centrômero, o qual é necessário para os cromossomos serem corretamente distribuí-

dos para as células-filhas durante a divisão celular.
(2) Dois telômeros, as estruturas nas extremidades de um cromossomo, as quais são neces-
sárias para as extremidades serem replicadas corretamente, além de impedirem que o
cromossomo seja degradado por exonucleases.
(3) As origens de replicação, que são posições ao longo do cromossomo, nas quais a repli-
cação do DNA inicia. similares à origem de replicação de um plamídeo.
to de DNA de levedure Uma vez que a estrutura do cromossomo tenha sido assim definida, surgiu a possibilidade
de que os componentes individuais pudessem ser isolados por meio de técnicas de DNA re-
combinante e, depois, reunidos novamente em um tubo de ensaio, criando um cromossomo
de vetor para levedura é o
artificial. Como as moléculas de DNA presentes nos cromossomos naturais de levedura têm
0 primeiro desses é a fre' várias centenas de quilobases de comprimento, tornou-se possível, com um cromossomo ar-
tes passíveis de serem
tificial, a clonagem de pedaços de DNA bastante extensos.
de transformação elevada é
ildível, ou se existe pouco
elevada, fornecendo entre
são bastante produtivos, Telômero
rende menos que 1.0fi!
procedimentos especiais se-
reflete o fato da necessida-
possa ser retido em uma cé-
Posições das
origens de replicação
de cópias: 2O a5O e 5 a 108
com apenas uma cópia pm Telômero
Figura7.7
da proteína a partir do genc
Estrutura do cromossomo.
146 T. A. Bnowlr
A estrutura e a utilização de um vetorYAC dem ser con

mencionada
Vários vetores YAC foram desenvolvidos, mas cada um construído seguindo as mesmas linhas,
com pYAC3 constituindo-se em um exemplo típico (Figura 7.8a). À primeira vista, pYAC3 não o experimer
se paÍece muito com um cromossomo artificial, mas, com uma avaliação mais cuidadosa, suas A estrat(
características únicas tomam-se aparcntes. O pYAC3 é essencialmente um plasmídeo pBR322. mente cliva
no qual uma certa quantidade de genes de levedura foi inserida. Dois desses genes, URÁ3 e mentos. O fi
TRPl,iá,haviam sido descobertos como marcas de seleção paraYIp5 eYRp7, respectivamen- qüência ZEI
te. Como emYRpT, o fragmento de DNA que contém TRPI também contém uma origem de des cegas (5
replicação, mas, em pYAC3, esse fragmento foi prolongado ainda mais para incluir a seqüên- TACGTA), r
cia chamada CEN4, a qual contém o DNA da região do centrômero do cromossomo 4. O frag- ção de proto
mento ZrRPl-oigem-CEN4, portanto, contém dois dos três componentes do cromossomo arti- de S. cerevi
hcial. ura3,queé
O terceiro componente, os telômeros, é fornecido pelas duas seqüências chama$as IÃ'L. Os transfom
Essas não são por si próprias seqüências teloméricas completas, mas, uma vez no inQrior do nimo, no qu
riúcleo da levedura, atuam como seqüências de disseminação, sobre as quais os telômdos po- são capazes
to, contendo
) crescer em n
to de DNA r
qual é realiz
(a) pYAC3 lônias vermr
Aplicaçõc
SUP4
O estímulo i
levedura, os
mento dos c
11,4 kb
meiose. Tais
te a propaga
utilizados cc
mento em ul
que 100 kb d
BamP'l muito além r
(p. 136), ma
(b) A estratégia de clonagem com pYAC3 abriram um I
anteriorment
Clivaoem com nante. Uma I
Bamúl + SnaBl de que, sob i
\ ros, permitit
e--w-J I r r mente é encr
Braço esquerdo Braço direito Os cromr
BamHl BamHl Ligação com um inserto nômicas. k
de DNA com extre- ra os vetorer
midades cegas uma bibliote
TEL TRPlori-CEN UBAS TEL
|-WZ - I r_D Figura 7.8 lizados para
UmvetorYACeamaneia até 1.400 kb
DNA inserido
como ele é utilizado para a humana pari
clonagem de pedaços de mas de instal
DNA extensos. dos pela recc
Ct-ouneeu GÈrurce e ANÁLtsE oE DNA 147
dem ser construídos. Isso tudo deixa somente uma outra parte de pYAC3 que não foi ainda
r:eguindo as mesmas linhas" mencionada: SUP4, que é a marca de seleção, dentro da qual o DNA novo é inserido durante
\ primeira vista, pYAC3 não o experimento de clonagem.
iação mais cuidadosa, suas A estratégia de clonagem com pYAC3 é como se segue (Figura 7.8b). O vetor é primeira-
mente clivado com uma combinação de BamHI e SnaBI, cortando a molécula em três frag- l,
te um plasmídeo pBR32f
Dois desses genes, URÁ3 e mentos. O fragmento de BamHI é removido, deixando dois braços, cada um ligado a uma sè-
il1p5 e YRp7, respectivamen- qüência TEL e a um sítio de SnaBI. O DNA a ser clonado, o qual deverá possuir extremida- rl
contém uma origem de des cegas (SnaBI é uma enzima que produz extremidades cegas, reconhecendo a seqüência l
mais para incluir a seqüên- TACGTA), é ligado entre os dois braços, produzindo o cromossomo artificial. A transforma- 1
do cromossomo 4. O frag- ção de protoplastos (p. 110) é, então, utilizada para introduzir o cromossomo artificial dentro
do cromossomo art! de S. cerevisiae. Alinhagem de levedura utilizada é um duplo mutante auxoÍróïrco, trpl
ura3- , que é convertido a trpl' ura' pelas duas marcas de seleção do cromossomo artificial.
seqüências chamadas ZEL Os transformantes são, portanto, selecionados por intermédio do plaqueamento em meio mí-
mÍÌs, uma vez no interior do nimo, no qual sdt1e19 as células contendo o cromossomo artificial corretamente construído
as quais o1:elôrneros po- são capazes de crescer. Qualquer célula transformada com um cromossomo artificial incorre-
to, contendo dois braços esquerdos ou dois direitos, emyez de um de cada, não será capaz de
crescer em meio mínimo, pois uma das marcas de seleção estará ausente. A presença do inser-
to de DNA no vetor pode ser conferida pelo teste para a inativação por inserção de SUP4, o
qual é realizado por um simples teste de coloração: colônias brancas são recombinantes, co-
lônias vermelhas não o são.
Aplicações para os vetoresYAC

O estímulo inicial para o desenvolvimento de cromossomos artificiais veio de geneticistas de
levedura, os quais desejavam utilizá-los para estudar vários aspectos da estrutura e comporta-
mento dos cromossomos, por exemplo, examinar a segregação dos cromossomos durante a
meiose. Tais experimentos determiniÌram que os cromossomos artificiais são estáveis duran-
te a propagação em células de levedura e sugeriram a possibilidade de que eles poderiam ser
utilizados como vetorgs para genes muito extensos paÍa serem clonados como um único frag-
mento em um vetor para E. coli. Diversos genes importantes de mamíferos são maiores do
que 100 kb de comprimento (por exemplo, o gene para fibrose cística humano possui 250 kb),
muito além da capacidade de todos e dos mais sofisticados sistemas de clonagem em E. coli
(p. 136), mas bem dentro do alcance de um vetorYAC. Os cromossomos artificiais, portanto,
abriram um caminho para os estudos das funções e maneiras de expressão de genes,que eram,
anteriormente, considerados impossíveis de analisar por meio de técnicas de DNA recombi-
nante. Uma nova dimensão desses experimentos foi recentemente fornecida pela descoberta
de que, sob algumas circunstâncias, os YACs podem ser propagados em células de mamífe-
ros, permitindo que a análise funcional seja realizada no organismo no qual o gene normal-
mente é encontrado.
Os cromossomos artificiais são igualmente importantes na produção de bibliotecas ge-
nômicas. Lembre-se de que, com fragmentos de 300 kb, o tamanho máximo do inserto pa-
ra os vetores de E. coli de maior capacidade, cerca de 30.000 clones são necessários para
uma biblioteca genômica humana (p. 1 37). No entanto, vetores YAC são rotineiramente uti-
Figura 7.8 lizados para clonar fragmentos de 600 kb, e tipos especiais são capazes de suportar DNA de
Um vetorYAC e a até 1.400 kb de extensão, estes últimos diminuindo o tamanho de uma biblioteca genômica
como ele é utilizado para humana para somente 6.500 clones. Infelizmente, esses "mega-YACs" apresentam proble-
clonagem de pedaços de mas de instabilidade do inserto, pois os DNA clonados algumas vezes tornam-se rearranja-
DNA extensos. dos pela recombinação intramolecular. Entretanto, YACs têm sido de enorme valor pelo for-
148 T. A. Bnowlr
necimento de extensos pedaços de DNA clonado, que são utilizados, em larga escala, em
projetos de seqüenciamento de DNA.
7.1.6 Vetores para outras leveduras e fungos

Vetores de clonagem para outras espécies de levedura e fungos são necessários pÍÌra estudos
básicos da biologia molecular desses organismos e para estender as possíveis utilizações de
leveduras e fungos na biotecnologia. Plasmídeos epissômicos baseados no plasmídeo de 2 pm
de S. cerevisiae sáo capazes de replicar em alguns poucos outros tipos de leveduras, mas a ex-
tensão não é ampla o suficiente pÍÌra os vetores de 2 pm serem de utilidade geral. Em qualquer
caso, as necessidades da biotecnologia são mais bem satisfeitas pelos plasmídeos integrativoq
equivalentes aosYlps, uma vez que eles fornecem recombinantes estáveis que podem ser mul-
tiplicados por períodos longos em biorreatores (p.277). Vetores integrativos eficientes estão
agora disponíveis para um certo núrpero de espécies, incluindo leveduras, tais como Pichia
pastoris e Kluveromyces lqctis, alén{ dgs fungos filamentosos Aspergillus nidulans e Neuros-
pora crassa.
7.2 Vetores de clonagem para plantas superiores

Os vetores de clonagem para plantas superiores foram desenvolvidos na década de 1980 e a
sua utilização originou as culturas geneticamente modificadas (GM, do inglês geneticallt
modified crops), que estão em evidência atualmente. As modificações genéticas das plantas
cultiváveis e de outras plantas serão examinadas no Capítulo 15. Aqui serão vistos os vetores Figura 7.9
de clonagem e como são utilizados. A doença do tumor
Três tipos de sistemas de vetores têm sido empregados, com uma graduação variada de su- de galha.
cesso, com plantas superiores:
(1) Vetores baseados nos plasmídeos que o'correm naturalmente em Agrobacterium. linhagem. Ele t
(2) Transferência gênica direta utilizando diversos tipos de DNA plasmidial. lhas como parü
(3) Vetores baseados nos vírus de plantas. plasmídeo Th é
tal, além de sel
Tais genes taml
7.2.1 Agrobacterium tumefaciens: o menor engenheiro genético
bactérias utiliz:
da natureza te programa as
Embora nenhum plasmídeo de ocorrência natural seja conhecido em plantas superiores, um
Utilizando o
plasmídeo bacteriano, o plasmídeo Ti de Agrobacterium tumefaciens, é de grande importân-
cia.
célula vegd
O A. tumefaciens é w microrganismo do solo, que caÌrsa a doença do tumor de galhe Muito rapidarn
(crown gall disease) em muitas espécies de plantas dicotiledôneas. A doença do tumor de ga- vos genes no in
lha ocorre quando um ferimento no caule permite às bacterias A. tumefaciens invadirem a nes dentro do l
planta. Após a infecção, as bactérias induzem uma proliferação cancerosa do tecido do caule cromossômico
na região do tumor (Figura 7.9). porque o grand
A capacidade para induzir a doença do tumor de galha está associada com a presença do O principal
plasmídeo Ti (indutor de tumor, do inglês tumor inducing) dentro das células bacterianas. Es- de em um plasr
se é um plasmídeo grande (com mais de 200 kb) que contém numerosos genes envolvidos no a inserção de u
processo infectivo (Figura 7.10a). Uma característica extraordiniíria do plasmídeo Ti ó que,
após a indução, parte da molécula é integrada no DNA cromossômico da planta (Figurrr (1) A estraté
7.10b). Esse segmento, chamado T-DNA, possui entre 15 e 30 kb de tamanho, dependendo da DNA não
Cloneoev GÊrurcn e ANÁLrsE oe DNA 149
zados, em larga escala, em
Planta saudável
são necessários para estudofi

r as possíveis utilizações dc
no plasmídeo de 2 pm
ripos de leveduras, mas a ex-
utilidade geral. Em qualquer Bactéria invade Agrobactéria
pelos plasmídeos integrativoc, o Íerimento
esúveis que podem ser mul- Divisões celulares
integrativos efi cientes estão rápidas-tumor de galha
leveduras, tais como
nidulans e Ne
de galha
vidos na década de 1980 e
(GM, do inglês
genéticas das
. Aqui serão vistos os ve Figura 7.9
ftdoença do tumor
uma graduação variada de de galha.
em Agrobacterium. linhagem. Ele é mantido de uma forma estável na célula da planta e transmitido às células-fi-
.A plasmidial. lhas como paÍe integrante dos cromossomos. Porém, a característica mais extraordinária do
plasmídeo Ti é que o T-DNA contém oito ou mais genes que são expressados na célula vege-
tal, além de serem responsáveis pelas propriedades cancerígenas das células transformadas.
Tais genes também comandam a síntese de compostos incomuns, chamados de opinas, que as
genético bactérias utilizam como nutrientes (Figura 7.10c). Em resumo, o A. tumefaciens geneticamen-
te programa as células da planta pila seu próprio benefício.
em plantas superiores,
Utilizando o plasmídeoTi para introduzir novos genes em uma
, é de grande i
célula vegetal
a doença do tumor de Muito rapidamente foi percebido que o.plasmídeo Ti poderia ser utilizado para introduzir no-
A doença do tumor de vos genes no interior de células vegetais. Tudo que seria necessário seria inserir os novos ge-
A. tumefocierzs invadirem nes dentro do T-DNA e, então, abaciériarealizaria o trabalho árduo de integrá-los no DNA
cancerosa do tecido do cromossômico da planta. Na prática, isso demonstrou ser uma proposta enganosa, sobretudo
porque o grande tamanho do plasmídeo Ti dificulta a manipulação da molécula.
associada com a presença O principal problema é, obviamente, que um sítio de restrição único é uma impossibilida-
das células bacterianas. de em um plasmídeo de 200 kb de tamanho. Estratégias modernas foram desenvolvidas para
genes envolvidor a inserção de um DNA novo dentro do plasmídeo Ti. Duas são, em geral, utilizadas:
do plasmídeo Ti é
ico da planta ( (1) A estratégia dos vetores binários (Figura 7.1 l) está baseada na observação de que o T-
de tamanho, depende DNA não necessita estar fisicamente ligado ao restante do plasmídeo. Um sistema de
150 T.A. Bnown
(a) Um plasmídeoTi
T-DNA (oncogenes)
Região de
virulência
Figura 7.11
A estratégia
sentes na rÍ
Região de especificidade ao hospedeiro rido para o I
-/l no plasmíde
(b) lntegração doT-DNA no genoma da planta dois p

do pla
getais
suem
Recombinação DNA cromossômico
bastar
da planta
f
r-oÍí-------r nicas-
ï-DNA integrado
(2) A estr
basear
na por
que, s
de intr
tanto,
duziú
combi
(c) Expressão dos genes doT-DNA ta lev:
ÍnOSS(
T-DNA
- DNA da planta Produçãr

Se bactéria
\
\ uma planta
Rápida divisão Síntese de opinas lulas do tur
celular mente, de p
vo gene em
Existem
Figura 7.10 tura de célu
O plasmídeo Ti e sua integração no DNA cromossômico da planta, após a infecção com Á. getais e pro
tumefaciens. ma maneira
Croruncev GÊNrcA E ANÁLrsÊ oe DNA 151
Sítio de restrição
único
Região de
virulência
Região de
especificidade
ao hospedeiro
Plasmídeo A
-170 kb
O Plasmídeo B
-20 kb
Figura 7.11
A estratégia do vetor binário. Os plasmídeos A e B complementam um ao outro quando pre-
sentes na mesma célula de A. tumeíaciens. O T-DNA carregado pelo plasmídeo B é transfe-
ao hospedeiro
rido para o DNA cromossômico da planta p,ç!as proteínas codiÍicadas pelos genes presentes
no plasmídeo A. / '',
dois plasmídeos, com o T-DNA em uma molécula relativamente pequena, e o restante

do plasmídeo na forma normal, é da mesma forma eficiente para transformar células ve-
getais. De fato, algumas linhagens de A. tumefaciens, e agrobactérias relacionadas, pos-
suem sistemas naturais de plasmídeos binários. O plasmídeo do T-DNA é pequeno o
cromossomrco
bastante para possuir um sítio de restrição único e ser manipulado utilizando-se de téc-
nicas-padrão.
(2) A estratégia da co-integração (Figura 7.12) ttrliza um plasmídeo inteiramente novo,

baseado no pBR322 ou um vetor pma E. coli semelhante, porém contendo uma peque-
na porção do T-DNA. A homologia entre a nova molécula e o plasmídeo Ti pressupõe
que, se ambos estão presentes na mesma célula de A. tumefaciens, a recombinação po-
de integrar o plasmídeo pBR dentro da região do T-DNA. O gene a ser clonado é, por-
tanto, inserido dentro de um sítio de restrição único do pequeno plasmídeo pBR, intro-
duzido em células de A. tumefaciens qtte contêm um plasmídeo Ti, e o processo de re-
combinação natural permite a integração do novo gene no T-DNA. A infecção da plan-
ta leva à inserção do novo gene, juntamente com o restante do T-DNA, dentro dos cro-
mossomos da célula vegetal.
da planta Produção de plantas transÍormadas com o plasmídeoTi

Se bactérias A. tumefacien.ç que contêm um plasmídeo Ti modificado são introduzidas em
uma planta pela maneira natural, por infecção de um ferimento no caule, então somente as cé-
lulas do tumor de galha resultante irão possuir o gene clonado (Figura 7.13a).Isso é, obvia-
mente, de pouco valor para o biotecnologista. Ao contriírio, uma maneira de introduzir o no-
vo gene em cada uma das células da planta é necessária.
Existem várias soluções, a mais simples sendo infectar não a planta madura, mas uma cul-
Ì tura de células vegetais ou protoplastos (p. I l0) em meio líquido (Figura 7.13b). Células ve-
F, após a infecção com Á. getais e protoplastos, cujas paredes celulares foram reconstruídas, podem ser tratados da mes-
: ma maneira que microrganismos: por exemplo, eles podem ser plaqueados em um meio sele-
I
i
152 T.A.Bnowru
tivo, a fim de isolarem-se transformantes. Uma planta madura, regenerada a partir de

transformadas, irá conter o gene clonado em todas as células e irá passar o gene clonado
a sua descendência.
No entanto, a regeneração de uma planta transformada pode ocorrer somente se o vetor
foi "desarmado", de forma que as células transformadas não apresentam as propriedades
cerígenas. O desarmamento é possível porque os genes cancerígenos, todos os quais se si
no T-DNA, não são necessários para o processo infeccioso; a infectividade é controlada,
cipalmente, pela região de virulência do plasmídeo Ti. De fato, a única parte do plasmídeo
que está envolvida na infecção são duas seqüências repetidas, de 25 pb, encontradas nas
midades esquerda e direita da região integrada no DNA da planta. Qualquer DNA
tre essas duas seqüências repetidas será úatado como "T:DNA" e transferido para a planta.
na-se, portanto, possível remover todos os genes cancerígenos de um T-DNA normal e
tuí-los com um conjunto inteiramente novo de genes, sem prejuízos ao processo infeccioso-
Numerosos vetores de clonagem com Ti desarmados estão disponíveis atualmente,
exemplo típico sendo o vetor binário pBIN19 (Figura 7.14). As et{gmidades esquerda e
reita do T-DNA presentes nesse vetor flanqueiarrruma cópia do {enè\lacZ', contendo
rosos sítios de clonagem, e um gene para resistência à canamicina, que funciona após a
Íigua7"13
(b
poÍ
Plasmídeo pequeno
tipo pBR
Íê
(a) ln-
& um íeri-
Especificidade ao \regÊ
Fragmento hospedeiro
do T-DNA
s(>
(
t
ürnor de
'1/=3 'frblTransncr-
I una su$
'-\
Gene a ser
-zl Plasmídeo lanbdas
Recombinação
clonado Ti normal dadaÍÌta
á fans-
5ÍÍnadas-
Virulência
Gene novo _*
Figura7.12
Plasmídeo Ti recombinante A estratégia tiÉrbdeï
co-integração çpaonbre red
Cr-oruncev GÊNtcA E AruÁusE oE DNA
re_qenerada a paÍir de células

pÍìssar o gene clonado para
(a) A inÍecção de um Íerimento por Á. tumeíaciens Íecombinante
ocorrer somente se o vetor Ti

tam as propriedades can-.
todos os quais se situem
ividade é controlada, prin- )]=- )
a única parte do plasmídeo fi Aplicação da bactéria Gene clonado somente está
5 pb, encontradas nas extre- fecombinante presente no tumor de galha
Qualquer DNA colocado en- (b) TransÍoÍmação de células vegetais em cultura

transferido para a planta. Tor-
lnoculação com
um T-DNA normal e substi A. tumefacìens
ao processo infeccioso. recombinante o Bactéria
disponíveis atualmente, nn
extremidades esquerda e di-
+
@'
Célula
gene lacZ', contendo nume-
vegetal
Plaqueamento
que funciona após a inte-
Células vegetais em meio sólido
em suspensão
Calos transÍormados
Figura 7.13
TransÍormação de
vegetais por
A-tumeíaciensre- TransÍerência para
rwnbinante. (a) ln- Formação de galhos meio com equilíbrio
de hormônios de
@ão de um Íeri-
crescimento diÍerentes
células vege-
llds transÍormadas
,un," no *,o
presentes so-
iilrEnte no tumor de
gúta. (b) TransÍor-
de uma sus- q
celular: todas
cáulas da planta NZ
77777-7
são trans- Planta transformada
Íormadas.
Sítios de restrição
Repetição
esquerda
Figura7.12 Figura7.14 Repetição direita

A estratégia da iÍluetor binário de Ti, pBlN19 . l1s11q = eêrlê
co-integração. que conÍere resistência à canamicina.
<-''.-1
154 T. A. Bnowr.r
gração das seqüências do vetor dentro do cromossomo da planta. Como com o vetor de trans- que ele é diÍ
ferência de levedura (p. 1a0), as manipulações iniciais, que resultam na inserção do gene a ser há necessidar
clonado em pBIN19, são realizadas em E coli, amolécula de pBIN19 recombinante correta De fato, a int
é, então, transferida para A. tumefaciens e, depois, para a planta. As células vegetais transfor- mossomo da
madas são selecionadas por plaqueamento em meio ágar contendo canamicina. A transfer
mente um pla
O plasmídeo Ri leção apropri
Durante os anos, surgiu também o interesse no desenvolvimento de vetores de clonagem pa- clonado forar
ra plantas baseados no plasmídeo Ri de Agrobacterium rhízogenes. Os plasmídeos Ri e Ti plasmidial pa
têm muitas semelhanças, a diferença principal sendo que a transferência do T-DNA de um podem ser reg
plasmídeo Ri para a planta não resulta em um tumor de galha, mas na doença daraiz cabelu- sivelmente m
da, caractenzada por uma proliferação massiva de um sistem?radicular altamente ramifica- Um métor
do. A possibilidade de crescimento de raízes transformadas e\r uma densidade elevada em leno-glicol, cr
cultura líquida tem sido explorada pelos biotecnologistas como uma potencial maneira de ob' DNA sobre a
terem-se quantidades elevadas de proteínas, a partir de genes clonados em plantas (p.296). 7.16a). Ospn
ra 7.16b) ou c
Limitações de clonagem com os plasmídeos de Agrobacterium tas com DNA
As plantas superiores são divididas em duas amplas categorias, as monocotiledôneas e as Após o tn
dicotiledôneas. Vários fatores foram combinados para facilitar a clonagem de genes em di- que estimula
cotiledôneas, tais como o tomate, o tabaco, abatata, a ervilha e o feijão, porém muito mais meio seletivo
complicada é a obtenção dos mesmos resultados com as monocotiledôneas. Isso tem sido quais plantas
frustrante, pois estas incluem o centeio, a cevada, o artoz e o milho, as quais são as plantas Agrobacteriui
cultiváveis mais importantes e, portanto, o alvo mais desejado para projetos de engenharia
genéÍica.
A principal dificuldade resulta do fato de que, na natuteza, A. tumefaciens e A. rhizoge-
nes infectam somente plantas dicotiledôneas; as monocotiledôneas estão excluídas da faixa
de hospedeiros naturais. Durante algum tempo acreditou-se que essa barreira natural era in-
superável e que as monocotiledôneas eram totalmente resistentes à transformação com veto-
res Ti e Ri, mas, finalmente, técnicas artificiais pararcahzar a transferência do T-DNA foram
desenvolvidas. Isso, porém, não é o final da história. A transformação com um vetor de Agru>
bacterium normalmente envolve a regeneração de uma planta intacta, a partir de culturas de
protoplastos, células ou calos transformados. A facilidade com a qual uma planta pode ser
regenerada depende bastante da espécie em particular envolvida e, mais uma vez, as plantas
mais difíceis são as monocotiledôneas. Tentativas para solucionar esse problema têm centra-
lizado a utilização da biobalística - o bombardeamento com microprojéteis (p. 111) - para
introduzir o DNA plasmidial diretamente no interior de embriões vegetais. Embora esse se-
ja um processo de transformação bastante violento, ele não aparenta ser tão danoso pÍìra os
embriões, os quais ainda continuam seu programa de desenvolvimento normal para produzir
plantas adultas. A estratégia tem sido bem-sucedida com o milho e diversas outras monoco-
tiledôneas importantes.
7.2.2 Clonagem gênica em plantas pela transÍerência direta de genes

A biobalística mascara a necessidade de utlTizar Agrobacterium como maneira de transferir o
DNA para dentro das células vegetais. A transferência gênica direta entra no processo urn
passo à frente e dispensa, em geral, o plasmídeo Ti.
A transferência gênica direta está baseada na observação, primeiramente realizada em
1984, de que um plasmídeo bacteriano supertorcido, embora incapaz de replicar em uma cé-
lula vegetal por si próprio, pode tomar-se integrado, por meio de recombinação, em um cro
mossomo da planta. O evento de recombinação é pouco entendido, mas é praticamente certo Figura Z.
fursÍerência gênica dire
Cloneorv GÊNtcA E Ar'rÁlrse oe DNA 155
Como com o vetor de que ele é diferente da integração de um vetor de levedura no cromossomo (p. 143), pois não
m na inserção do gene a há necessidade de uma região de homologia entre o plasmídeo bacteriano e o DNA da planta.
pBINl9 recombinante De fato, a integração parece ocolïer aleatoriamente em qualquer posição em qualquer cro-
As células vegetais mossomo da planta (Figura 7.15).
A transferência gênica direta, portanto, faz uso de DNA plasmidial supertorcido, possivel-
mente um plasmídeo bacteriano simples, tal como pBR322, dentro do qual uma marca de se-
leção apropriada (por exemplo, o gene que confere resistência à canamicina) e o gene a ser
de vetores de clonagem clonado foram inseridos. A biobalística é freqüentemente utilizada para introduzir o DNA
. Os plasmídeos Ri e plasmidial para dentro de embriões vegetais, mas, se as espécies que estão sendo modificadas
flerência do T-DNA de podem ser regeneradas a partir de protoplastos ou células únicas, então outras estratégias, pos-
mas na doença daraiz sivelmente mais eficientes que a biobalística, são possíveis.
radicular altamente rami Um método envolve a ressd,qpensão dos protoplastos em uma solução viscosa de polieti-
uma densidade elevada leno-glicol, composto polimérico)-negativamente carregado, que é utilizado para precipitar o
uma potencial maneira de DNA sobre as superfícies dos protoplastos e para induzir a entrada por endocitose (Figura
emplantas (p.296)- 7 .l6a). Os protoplastos também podem ser fusionados com lipossomos contendo DNA (Figu-
Agrobacterium ra7 .l6b) ou células intactas podem ser vigorosamente agitadas com agulhas de sílica cober-
tas com DNA, as quais perfuram a parede celular e transferem o DNA para o interior.
as monocotiledôneas e
Após o tratamento, os protoplastos são deixados durante alguns dias em uma solução
a clonagem de genes em que estimula a regeneração das paredes celulares. As células, então, são espalhadas sobre
e o feijão, porém muito
meio seletivo para identificar transformantes e para fornecer culturas de calos, a partir das
iledôneas. Isso tem si quais plantas intactas podem desenvolver-se (exatamente como descrito para o sistema com
ilho,as quais são as pl
A g ro b act e rium, Figlur a 7. 1 3b).
para projetos de en
A. tume.faciens e A. rhi
estão excluídas da
essa barreira natural era i
à transformação com
com um vetor deÁg

Transformação de
tacta, a partir de culturas protoplastos vegetais
a qual uma planta pode
e. mais uma vez, as pla -.-*
esse problema têm ce o$ts-
roprojéteis (p. 111) - pBR322 \
vegetais. Embora esse supertorcido
nta ser tão danoso para
\ Recombinação
imento normal para produzi não-homóloga
e diversas outras
direta de genes
como maneira de transferir
direta entra no processo urn
primeiramente realizada en
apaz de replicar em uma cé-
recombinação, em um cr<>
Gene novo inserido
mas é praticamente certo Figura 7.15 no DNA da planla
'lfiansÍerência gênica reta.
di
156 T. A. Bnowrl
do DNA viral sobre I

(a) Precipitação de DNA
ria os vírus por toda
. O potencial dos'
Protoplastos vãgetais rios anos, mas sem !
DNA vírus de plantas pos
)
) como possíveis vetc
)
J mais difíceis de real
riores são conhecidi
condições ideais par
Caulimovírus cr
Embora um dos pri-r
ano de 1984, tenhau
nabo, duas dificuldar
(b) Fusão com lipossomos contendo DNA
A primeira foi ç
la necessidade de en
Protoplasto vegetal regiões não-essencia
fìca muito limitada- I
blema por meio da u
K,
gomídeos (p. 125). Ìt
da couve-flor (CaM
o senciais, o que sienil
---/
ìo/
DNA o
prio, comandar a inft
genoma de CaÌvfV n
tor de clonagem seja
\/ Essa abordagem
Lipossomos é a extremamente lin
) tos de clonagem a so
,ãa polhos e couves-flori

tica como fontes de;
são utilizados para a
ízJ \J plasmídeo Ti ou pela
K Figura 7.16
DNA transferido
para o núcleo TransÍerência gênica di- Geminivírus cor
reta por meio de (a) pre-
E sobre os geminivíl
cipitação de DNA na su-
perfície dos protoplastos, cluem plantas, tais o
Lipossomo Íusionado e (b) Íusão de protoplas- para essas e outras n
tes com lipossomos con- tos de dificuldades. r
tendo DNA. alguns geminivírus

adicional que tenha
quisas nos últimos e
ençontrar aplicações
7-2-3 Tentativas para utilizar vírus de plantas como vetores cente, previsto para
de clonagem
Versões modificadas dos bacteriófagos l, e
coli (Capítrilo 6). Considerando que
Mi3 são vetores de clonagem importantes para E. [3 Vetores de clol
maioria das planras está sujeitã à infeição viral, pode-
a
riam, dessa forma, os vírus ser utilizados para clonar genes em plantas? Em caso positivo, Esforços considerár
eles
poderiam ser muito mais convenientes para utilização do que outros tipos de vetãres, porque,
clonagem gênica en
com muitos vírus, seria possível a transformação ser obtida simplesmente por meio Oa ffcçao síntese de proteína
Crounorv GÊrurcn e ANÁLtsE oe DNA 157
t:
do DNA viral sobre a superfície de uma folha. O processo de infecção natural, então, espalha-
ria os vírus por toda a planta.
O potencial dos vírus de plantas como vetores de clonagem vem sendo explorado há vá-
rios anos, mas sem grande sucesso até o momento. Um problema é que a grande maioria dos
vírus de plantas possui genomas não de DNA, mas de RNA. Vírus de RNA não são tão úteis
como possíveis vetores de clonagem, pois as manipulações com RNA são particularmente
mais difíceis de realizar. Somente duas classes de vírus de DNA que infectam plantas supe-
riores são conhecidas, os caulimovírus e os geminivírus, mas nenhuma dessas apresenta
condições ideais para a clonagem gênica.
Caulimovírus como vetores

Embora um dos primeiros experimentos bem-sucedidos de modificação genética de plantas, no
ano de 1984, tenha utilizado um vetor de caulimovírus para clonar um novo gene em plantas de
nabo, duas dificuldades gerais com esses vírus limitaram sua utilidade.
A primeira foi que o tamanho total do genoma de um caulimovírus é, como À, controlado pe-
la necessidade de empacotá-lo no interior de seu capsídeo protéico. Mesmo após a deleção de
regiões não-essenciais do genoma do vírus, a capacidade para cÍÌrïegaÍ um DNA inserido ainda
fica muito limitada. Pesquisas recentes têm mostrado que pode ser possível solucionar esse pro-
blema por meio da utilização da estratégia do vírus auxiliar, semelhante às utilizadas com os fa-
gomídeos (p. 125). Nessa estratégia, o vetor de clonagem é o genoma de um vírus do mosaico
da couve-flor (CaMV, do inglês cauliflower mosaic virus) que não possui vários dos genes es-
senciais, o que significa que ele pode carregar um gene longo inserido, mas não pode, ele pró-
prio, comandar a infecção. As plantas são inoculadas com o DNA do vetor, juntamente com um
genoma de CaMV normal. O genoma viral normal forrece os genes necessários para que o ve-
tor de clonagem seja empacotado pelas proteínas virais e espalhado por toda a planta.
Essa abordagem tem um potencial considerável, mas não resolve o segundo problema, que
é a extremamente limitada faixa de hospedeiros dos caulimovírus. Isso restringe os experimen-
tos de clonagem a somente umas poucas plantas, principalmente brássicas, tais como nabos, re-
polhos e couves-flores. Os caulimovírus têm, entretanto, sido importantes na engenharia gené-
tica como fontes de promotores extremamente ativos que funcionam em todas as plantas e que
são utilizados para a obtenção da expressão de genes introduzidos por meio da clonagem com o
plasmídeo Ti ou pela transferência gênica direta.
Figura 7.16
Transferência gênica di- Geminivírus como vetores
reta por meio de (a) pre-
E sobre os geminivírus? São eles interessantes sobretudo porque seus hospedeiros naturais in-
cipitação de DNA na sw
perf ície dos protoplastos" cluem plantas, tais como o milho e o centeio, e eles poderiam, portanto, ser vetores potenciais
e (b) Íusão de protoplas- para essas e outras monocotiledôneas. Mas os geminivírus apresentam seus próprios conjun-
tos com lipossomos corr tos de dificuldades, sendo um dos problemas que, durante o ciclo de infecção, os genomas de
tendo DNA. alguns geminivírus sofrem rearranjos e deleções, os quais iriam embaralhar qualquer DNA
adicional que tenha sido inserido, uma desvantagem óbvia para um vetor de clonagem. Pes-
quisas nos últimos anos têm focalizado tais problemas e os geminivírus estão começando a
encontrar aplicações especializadas na clonagem em plantas, com um papel importante e cres-
cente, previsto para o futuro.
vetores
rclonagem importantes para Vetores de clonagem para animais

sujeita à infecção viral,
lantas? Em caso positivo, Esforços consideráveis foram aplicados no desenvolvimento de sistemas de vetores para a
.tros tipos de vetores, clonagem gênica em células animais. Esses vetores são necessários na biotecnologia para a
lesmente por meio da f síntese de proteínas recombinantes a partir de genes que não são expressos corretamente
!
i
:
158 ï A. Bnowr
quando clonados emE. coli ou levedura (Capítulo l3), além de métodos para clonagem
em
humanos, que estão sendo procurados por biologistas moleculares clínicos, na tentativa de de-
senvolver técnicas para a terapia gênica (p. 31a), na qual uma doença étratadapor meio
dr
introdução de um gene clonado dentro do paciente.
O aspecto clínico sugere que a maior atenção tem sido direcionada aos sistemas de clona-
gem para mamíferos, mas progressos importantes também foram obtidos com insetos. A clo.
nagem em insetos é interessante, pois utiliza um tipo de vetor completamente novo, o qrrrl
ainda não havia sido encontrado. Iremos, portanto, examinar os vetores para insetos, antes de
frnalizat o capítulo com uma visão geral dos métodos de clonagem utilizados com mamíferm"
7.3.1 Vetores de clonagem para insetos

A mosca-das-frutas, Drosophila melanogaster, foi, e ainda é, um dos mais importantes org&
nismos-modelo usados pelos biólogos. Seu potencial foi primeiramente reconhecido pelo fa-
moso geneticista Thomas Hunt Morgan, que, em 1910, começou arealizar cruzamentos ge-
néticos entre moscas-das-frutas com colorações de olhos diferentes e outras características he-
reditárias. Tais experimentos conduziram a técnicas, ainda utilizadas atualmente, para o ma-
peamento de insetos e outros animais.
Mais recentemente, a descoberta de que os genes de seleção homeótica de Drosophila
os genes que determinam a identidade das estruturas corporais da mosca são intimamentc
-
-
relacionados aos genes equivalentes em mamíferos fez com que a D. melanogasterfosse uti-
lizada como um modelo para o estudo dos processos de desenvolvimento humano. A impor-
tância da mosca-das-frutas na biologia moderna torna imperativo que vetores para a clonagenr
gênica nesse organismo estejam disponíveis.
Elementos P como vetores de clonagem para Drosophita

O desenvolvimento de vetores de clonagem p ara Drosophila tem seguido um caminho diferen-
utilizado com bactérias, levedura, plantas e mamíferos. Nenhum plasmídeo é coúe-
te daquele
cido em Drosophila e, embora a mosca-das-frutas seja, como todos os organismos, suscetível
à infecção por vírus, esses não têm sido empregados como base paÍa vetores de clonagem.
Ao
contrário, a clonagem em Drosophila uttlizaum transposon, chamado de elemento p.
Transposons são comuns em todos os tipos de organismos. Eles são pedaços curtos de
DNA (usualmente menores que l0 kb de comprimento), que podem se movir dsuma posição
para outra no cromossomo de uma célula. Os elementos P, os quais são um de viírios
tipos de
transposons de Drosophila, possuem 2,9 kb de comprimento e contêm três genes flanqueados
por seqüências curtas, invertidas e repetidas em ambos os lados do elemento (Figura7.l7a)-
Os genes codificam a transposase, a enzima qu e realizao processo de transposiçãã, e
as repe-
tições invertidas formam as seqüências de reconhecimento, que permitem que a enzima iden-
Figura7.17
Clonagem em I
tihque as duas extremidades do transposon inserido.
Transposição *
Assim como se movem de um sítio para outro dentro de um único cromossomo, os ele-
trutura de um vt
mentos P também podem saltar entre cromossomos, ou entre um plasmídeo que caÍïega de clonagem (R
um
elemento P e um dos cromossomos da mosca (Figura 7.|7b).Esse último evento é a chave pa- um gene da trar
ra a utllização dos elementos P como vetores de clonagem. O vetor é um plasmídeo que "asas cortadas'
cop
tém dois elementos P, um dos quais contém o sítio de inserção para o DNA que irá ser
clona-
do. A inserção de um DNA novo dentro desse elemento P resulta na intemrpçao
de seu gene
da transposase, de maneira que tal elemento torna-se inativo. O segundo elernento
R presen- sim, a transposa
te no plasmídeo, é, portanto, aquele que possui a versão intacta do gene da transposas".
A clonado foi inset
"on-
dição ideal é que esse elemento P não deva ser transferido para os cromossomo s de Drosophi-
frutas. A transpo
la, de forma que ele tem suas "asas coÍadas": suas repetições invertidas são removidas; as-
elemento P mod
ocorfe dentro do
Crouacev GÊnrcr e AruÁuse oe DNA 159
métodos para clonagem

clínicos, na tentativa de
é tratada por meio (a) A estrutura de um elemento P
aos sistemas de
obtidos com insetos. A Genes
pletamente novo, o / \ ---ì
f"":--Ì---'-7-'1 F.r:------] r-:
-
para insetos, antes
utilizados com mami
r Repetições terminais invertidas
dos mais importantes (b) A transposição de um elemento P

reconhecido pelo
arealizar cruzamentos
e outras caracteísticas ïransposição
atualmente, para o
homeótica de Drosophila
mosca - são inti \
/-\
/ --'t
a -.,'
Elemento P inserido em
um cromossomo da mosca
D. melanoga,r/er fosse \ --/
imento humano. A i Elemento P carregado
vetores para a c pelo plasmídeo
um caminho (c) A estrutura de um vetor de clonagem de elemento p

-F'Íenhum plas mídeo é conlrc-
os organismos, suscetível
vetores de clonagem. Ao ElemenÌo com "asas cortadas"
de elemento P. R/
Eles são pedaços curtos de -----_|r-l---'-]l---------'.]-
'' -'.
se mover de uma posição ,,\/ì ^ |
são um de viírios tipos de ' Repetições invertidas DNA pìasmidial
três genes flanqueadul
do elemento (Figura l.lla).
de transposição, e as repe=
Figura7.17
que a enzima iden-
Clonagem em Drosophila com um vetor de elemento P. (a) Estrutura de um elemento p. (b)
Transposição de um elemento P de um.plasmídeo para um cromossomo da mosca. (c) Es-
uruco cromossomo, os ele_ trutura de um vetor de clonagem de elemento P. O elemento P à esquerda contém um sítio
rplasmídeo que caÍrega um de clonagem (R) que interrompe seu gene da transposase. O elemento p à direita possui
último evento é a chave pa- um gene da transposase intacto, mas não pode transpor a si mesmo, porque ele tem suas
é um plasmídeo que con- "asas cortadas" - ele não possui suas repetições terminais invertidas.
o DNA que irá ser clona-
na rntem;pção de seu gene
elemento P, presen- sim, a transposase não o reconhece como um elemento P legítimo. lJma vez que o gene a ser
gene da transposase. A con-
clonado foi inserido no vetor, o DNA plasmidial é microinjetado em embriões da mosca-das-
cÌomossomo s de D ro s ophi- frutas. A transposase fornecida pelo elemento P de asas cortadas comanda a transferência do
das são removidas; as- elemento P modificado para o interior de um dos cromossomos da mosca-das-frutas. Se isso
ocorre dentro do núcleo de uma linhagem germinativa, então a mosca adulta, que se desenvol-
160 ï. A. Bnowlr
verá a partir do embrião, irá conter cópias do gene clonado em todas as suas células. A c
gem com o elemento P foi primeiramente desenvolvida na década de 1980 e tem fornec
inúmeras contribuições importantes para a genéticade Drosophila.
Vetores de clonagem baseados em vírus de insetos

Embora os vetores virais não tenham sido desenvolvidos para a clonagem gênica em
phila,umtipo de vírus, o baculovírus, tem desempenhado um papel importante na c
gênica com outros insetos. A principal utilização dos vetores de baculovírus está na prod
de proteína recombinante, assunto ao qual iremos retornar quando considerarmos esse
no Capítulo 13.
7.3.2 Clonagem em mamíferos

Até o momento, a clonagem gênica em mamíferos é realizada devido a uma dentre as três
zões seguintes:
(1) Para a obtenção de um gene-nocaute, que é uma técnicrúrnportante, utilizada para

xiliar na determinação da função de um gene não-ider{tificado (p. 268). Esses exp
mentos são normalmente realizados com roedores, comò o camundongo, por exeml
(2) Para a produção de proteína recombinante em uma cultura de células de mamífero,
mo em uma técnica relacionada de cultivo (pharmíng), a qual envolve a modific
genética de um animal defazenda, de forma que ele sintetize uma proteína Figun
como um produto farmacêutico, freqüentemente em seu leite (p.29D. S/40 e um exemplo c
(3) Na terapia gênica, na qual células humanas são modificadas a fim de tratar uma uüização como um ve
ça (p. 315). únagem. Para clonar
m da p-globina de coe
Vetores de clonagem para mamíÍeros fragmento de restriç
Durante muitos anos, imaginou-se que os vírus provariam ser a chave para a clonagem tfidlll a BamHlfoidel
mamíferos. Essa expectativa foi apenas parcialmente concretizada. O primeiro experi (resultando em SVG
de clonagem envolvendo células de mamíferos foi realizado em 1919, com um vetor substituído com o ge
no vírus 40 do macaco (SV40, do inglês simian virus 40). Esse vírus é capaz de infectar c{
rias espécies de mamíferos, realizando um ciclo lítico em alguns hospedeiros e um ciclo

gênico em outros. O genoma possui 5,2 kb de tamanho (Figura 7.18a), contendo dois
tos de genes, os genes "iniciais", expressados bem no início do ciclo de infecção e que bovinos (BP
ficam proteínas envolvidas na replicação do DNA viral, e os "tardios", que codificam as ciclo de infer
teínas do capsídeo viral. SV40 apresenta os mesmos problemas que ì" e os caulimovírus multicópia cr
plantas, que é o limite restrito de empacotamento de uma quantidade de DNA novo que lula de camu
ser inserida no genoma. A clonagem com SV40 envolve, portanto, a substituição de um lular. Vetores
mais dos genes existentes pelo DNA a ser clonado. No experimento original, um segmento plicação tantr
região gênica tardia foi substituído (Figura 7.18b), mas a substituição de um gene inicial dução de pro
bém é uma opção. Até o mor
Com os anos, desde 1919, inímeros outros tipos de vírus foram utilizados para clonar de genes em r
nes em mamíferos. Os adenovírus permitem que fragmentos mais extensos de DNA sej à qual se reto
clonados, dos que são possíveis com um vetor SV40, embora eles sejam mais difíceis de
nipular, devido aos genomas serem maiores. Os papilomaúrus, os quais também apresen Clonagem
uma capacidade relativamente alta para o DNA a ser inserido, apresentam a vantagem i Uma das raze
tante de permitir que uma linhagem celular estável seja obtida. em células de
Muitos vírus de mamíferos destroem suas células hospedeiras logo após a infecção, era a maneira
forma que truques especiais são necessários, caso esses vírus sejam utilizados para qu Embora se tre
finalidade que não sejam experimentos de transformação de curta duração. Os papi rianos, ou có1
L
Croraeeu GÊNrcA E AruÁuse oe DNA 161
todas as suas células. A c

ada de 1980 e tem f
(a) O genoma de SV40
íla.
Híndll
a clonagem gênica em
Genes tardios
papel importante na (proteínas do capsídeo)
baculovírus está na
considerarmos esse
Genes iniciais
devido a uma dentre as três (replicação viral)
importante, utilizada para

(b) SVGT-sçqm o gene da B-globina de coetho inserido
(p. 268). Esses
o camundongo, por e I Gene da B-globina de coelho
de células de mamífero.
a qual envolve a modi
ize uma proteína i
Figura 7.18
leite (p. 294) e um exemplo de sua
a fim de tratar uma como um vetor de
. Para clonar o ge-
da p-globina de coelho, o
ftagmento de restrição de
a chave para a clonagem a BamHl foideletado
O primeiro experi {resultando em SVGT-5) e
1919, com um vetor sóstituído com o gene do
r írus é capaz de inflectar coelho.
hospedeiros e um ciclo li
7. l8a), contendo dois coni
ciclo de infecção e que bovinos (BPV), que causam verrugas no gado, são particularmente atraentes, devido ao seu
ios", que codificam as ciclo de infecção incomum em células de camundongo, adquirindo a fôrma de um plasmídeo
que l, e os caulimovírus multicópia com cerca de 100 moléculas presentes por célula. Ele não provoca a morte da cé-
idade de DNA novo que lula de camundongo, sendo moléculas de BPV passadas para as células-filhas na divisão ce-
to, a substituição de um lular. Vetores de transferência consistindo em seqüências de BPV e pBR322, e capazes de re-
original, um segmento plicação tanto em células de camundongo quanto bacterianas, têm sido utilizados paÍa a pro-
ição de um gene inicial dução de proteínas recombinantes em linhagens celulares de camundongo.
Até o momento, os retrovírus são os vetores mais comumente utilizados para a clonagem
utilizados para clonar de genes em células de mamíferos. Suas aplicações mais importantes estão na terapia gênica,
mais extensos de DNA sei à qual se retornará quando esse tópico for discutido (p. 315).
eles sejam mais difíceis de
f
b. os quais também apresel Clonagem gênica sem um vetor
b
apresentam a vantagem imp Uma das razões pelas quais os vetores virais não têm se tornado comuns na clonagem gênica
h- em células de mamíferos foi a descoberta, no início da década de 1990, de que a microinjeção
[ileirus togo após a infecção, era a maneira mais eficiente de transferir genes novos para o interior de células de mamíferos.
I sejam utilizados para qualq Embora se trate de um procedimento difícil de realizar, a microinjeção de plasmídeos bacte-
hrta duração. Os papiloma rianos, ou cópias de DNA lineares de genes, dentro do núcleo de células de mamíferos resul-
h
162 T.A.BRowN
ta na inserção do DNA nos cromossomos, possivelmente como cópias múltiplas em

um arran" leituras adicio
é geralmente visto co-
jo seqüencial, da cabeça para a cauda (Figura 7.19). Tal procedimento
pois evita possibilidade de que o
mo mais satisfatório Ao que a utilização de um vetor viral,
a Anderson, C. (19!
outro' da utilização
DNA viral infecte as células e provoque defeitos de um tipo ou de Bevan, M. (1984)
nocauteaã o 269),que possua cópias de um gene clonado em todas as
Um camundongo @' Brisson, N., Pasd
suas células, pode ser gerado por microinjeção de um
óvulo fertilizado, o qual é, subseqüente- gene in plant
implantado em uma mãe ado'
mente, cultivado invitropo, u.ál.iu, divisões celulares e, depois, caulimovírur
tiva. Alternativamente, uÀa célula-tronco embriogênica (ES, do inglê's embryonic stem celll Broach, J.R. (198
pode ser utilizada. Essas são obtidas a partir de um embrião

inicial e, ao contrário da maioria Burke, D.T., Carl
tificial chron
que seus modelos de desenvolvimen-
das células de mamíferos, são totipotentes, significando Chilton, M.D. (l!
mesmas podem formar muitas er
to não foram predeterminados e as células descendentes das mídeo Ti.l
a célula F'S é devolvida paÍa um
truturas distintas no camundongo adulto. Após a microinjeção, Evans, M.J., Cn
resultante é uma quirnera" 370-'74.Írc,
embrião, o qual é implantado .Ã umu -aeãOodva. O camundongo
porque o embrião qrr Grúam, F.L. (19
compreendendo uma mistura de células modificadas e não-modificadas, Hamer, D.H. & I
normais' que contribuem'
recebe a célula ES também contém uma certa quantidade (?éìulas 281, 35-40.
juntamente com a célula ES, para formar o camundongo a\utto' Hansen, G. &Wt
cos, que contêm o gene clonaão em todas as suas células,
""-""filï,1,1"^:lt:^tÏ;
são obtidos após permitir que a qú- Monaco, A.P. &
de óvulos com o gelrB
mera se reproduza, uma vez que alguns descendentes irão originar-se
Biotechnolo,
Nadolska-Orc21'l
clonado. technique &
Parent, S.A. eta
Yeast,l,8!
!
Paszkowski, J..
Múltiplas cóPias do DNA clonado
((l\\
Rubin, G.M. & S
ce, 218,348
Timmermans, M
nml Reviett
Viaplana, R., Tu
virus replac
estratégia d
Figura 7'19 -r^,.râ incarir{a como um arranlo sequ"rencial em uma mG
^ranaâac inseridas
uúniptas cópias de moléculas clonadas
lécula de DNA cromossômico.
i
CnpÍrulo 8
Como Obter um Clone
de um Gene Específico
\e
O problema da seleção, I 65 ldentificação de um clone a partir de uma biblioteca
Seleção dìreta. 167 genôrnica. 169
Métodos para identificação do clone. 1 74
Nos capítulos anteriores foi examinada a metodologia básica utilizadapara clonar genes e fo-
ram avaliados os vários tipos de vetores que são usados com bactérias, leveduras, plantas e
animais. Agora, deve-se observar os métodos disponíveis para obtenção de um clone de um
gene individual e específico. Esse é o ponto cítico de um experimento de clonagem gênica;
o sucesso ou o fracasso geralmente dependem do fato de a estratégia aplicada permitir ou não
que clones do gene desejado possam ser selecionados diretamente ou, de modo alternativo, di-
ferenciados de outros recombinantes. Uma vez que tal problema tenha sido resolvido e que
um clone tenha sido obtido, o biólogo molecular está capacitado afazer uso de uma ampla va-
riedade de diferentes técnicas que extrairão informações sobre s gene. As técnicas mais im-
portantes serão descritas nos Capítulos l0 e 1 l.
O problema da seleção
O problema enfrentado pelo biólogo inolecular que deseja obter um clone de um gene único
e específico foi ilustrado na Figura 1.4. Mesmo os organismos mais simples, como E. colí,
contêm milhares de genes e a clivagem do DNA celular total produz não apenas o fragmento
que contém o gene desejado, mas, também, muitos outros fragmentos, que são portadores de
todos os outros genes (Figura 8.la). Durante a reação de ligação não há seleção de um frag-
mento individual: inúmeras moléculas diferentes de DNA recombinante são produzidas, to-
das contendo diferentes porções de DNA (Figura 8.1b). Conseqüentemente, uma variedade de
clones recombinantes é obtida após a transformação e o plaqueamento (Figura 8.lc). De al-
gum modo, o clone correto deve ser identifìcado.
166 T. A. Bnowlr
(a) Clivagem de uma molécula de DNA extensa
-_-* _ìr
EcoRl
{ a-
Muitos
Hnfi,ï'"'
a
?.--- --
O gene a ser
clonado
lnserção no vetor
(b) As moléculas de DNA recombinantes
resultantês
(c) Todas produzirão colônias
Figura 8.1 ts estratégias btfu

O problema da se- rndas para obter u
leção. üaleção direta. (b)
nante desejado i
8.1.1 Existem duas estratégias básicas para a obtenção do

clone desejado !.2 Seleçãt
Embora existam muitos procedimentos diferentes, pelos quais o clone desejado pode ser ob
tido, todos correspondem a variações de dois temas básicos. Para poc
com ága
(1) Seleção direta do gene desejado (Figura 8.2a), o que significa que o experimento de
cas colô
clonagem é projetado de tal modo que os únicos clones obtidos são clones do gene pre
la de DIt
curado. Quase invariavelmente, a seleção ocoÍre na etapa de plaqueamento.
Oex
(2) Identificação do clone a partir de uma biblioteca genômica (Figura 8.2b), o que re- tência a
quer um experimento de clonagem inicial, que servirá como "ferramenta", fornecendo
que conl
uma biblioteca de clones que representam todos os genes presentes na célula, ou a maiu
D€S Qu€ i
ria deles, seguida da análise dos clones individuais para identificar qual o clone coÍreto-
e suHon
mentos (
Em termos gerais, a seleção direta é o método preferido, uma vez que é rápida e em geral
PaÍa
não-ambígua. Entretanto, deve-se notar que ela não é aplicável a todos os genes. As técnicas
de um vr
para a identificação dos clones são, assim, muito importantes, especialmente porque bibliote-
tes molé
cas genômicas completas de diversos organismos estão agora disponíveis.
tência à
CrorureEu GÊrurcn e ANÁLrsE oe DNA 167
(a) Seleção direta
>_
P
t-
OO
\ \
X I
Apenas o recombinante
a correto Pode sobreviver
i (b) ldentiÍicação do clone

i
!
.aaaa
aaaaaaa
a.aaaaa
Uma biblioteca
aaaaaaa de clones
Figura 8.2 a ìa a a a
Figura 8.1 ffs estratégias básicas que podem ser utili-
O problema da para obter um determinado clone. (a)
leção. direta. (b) ldentiÍicação do recombi-
nante desejado a partir de uma biblioteca Clone corÍeto
de clones.
Seleção direta
desejado pode ser
Para poder selecionar um gene clonado é necessário plaquear os transformantes em um meio
com ágar onde apenas os recombinantes desejados, e nenhum outro, possam crescer. As úni-
que o experimento
cas colônias obtidas serão, portanto, aquelas formadas pelas as células que contêm a molécu-
são clones do gene
la de DNA recombinante desejada.
ueamento.
O exemplo mais simples de seleção direta ocorre quando o gene desejado especifica resis-
(Figura 8.2b), o que
tência a um antibiótico. Como exemplo, consideraremos um experimento para clonar o gene
"ferramenta", fl
que confere resistência à canamicina, a partir do plasmídeo R6-5. Esse plasmídeo contém ge-
na célula, ou a
nes que conferem resistência a quatro antibióticos: canamicina, cloranfenicol, estreptomicina
car qual o clone
e sulfonamida. O gene que confere resistência à canamicina localiza-se em um dos 13 frag-
mentos de EcoRI (Figura 8.3a).
1"., qrr" é rápida e em
Para clonar esse gene, os fragmentos EcoRI do R6-5 devem ser inseridos no sítio de EcoRI
Jtoaos os genes. As té<
piahente de um vetor como pBR322. A mistura de ligação compreenderá muitas cópias das 13 diferen-
porque bit
tes moléculas de DNA recombinantes, um grupo das quais portando o gene que confere resis-
fu,oníveis.
tência à canamicina (Figura 8.3b).
168 T. A. Bnowlr
A inativação por inserção não pode ser usada para selecionar recombinantes quando o sí- &2.1 A recuperação
tio de EcoRI do pBR322 é utilizado. Isso se deve ao fato de esse sítio não estar localizado noa
De fato, a seleção d
genes que conferem resistência tanto à ampicilina quanto à tetraciclina desse plasmídeo (Fi-
nes que conferem n
gura 6.1). Porém, tal fato é insignificante para a clonagem do gene que confere resistênciaà
se uso de linhagens
canamicina, pois, nesse caso, o gene clonado pode ser usado como uma marca de seleção. Os
Como exemplo.
transformantes são plaqueados em meio ágar com canamicina, no qual as úniças células ca-
gene codifica a enz
pazes de sobreviver e produzir colônias são aquelas recombinantes que contêm o gene que
essencial triptofanc
confere resistência à canamicina clonado (Figura 8.3c).
nal, é chamada de r
de crescimento. E
i
Essa E coli mu
total é primeiramer
ria. O processamen
(a) Plasmídeo R6-5
/l produz numerosÍìs l
kant\ uma cópia intacta c

obtido a partir da li
Í---.--.1T]
LJ -\ A mistura de li
Sítios -t EcoRl í'1 rrLJ\ trpA- (Figtra8.4b)
de= -..+
uns poucos terão. Í
EcoRl \
t---'-
-a
--- 13 Íragmentos
diÍerentes
binantes são não-ar
- \ é capaz de comandr
realizada pelo plaq
suplemento adicior
Ligação no sítio de tróficos não podem
(b) A ligação origina 13 moléculas de EcoRl do pBR322
binantes que contêr
DNA recombinantes diÍerentes
o
O emprego e as
Embora a recup€ra
nes, duas limitaçõe
(1)
o
Uma linhager
(2) Um meio on<
A técnica de rs
ticas, pois os clone
descitaparao trpÁ
TransÍormação de linhagens auxotróf
E coÍ, plaqueamento cuperação do marc
\ Ademais, muta
XX seleção de alguns g
(c) Mas apenas uma possibilita o crescimento tre enzimas equila
em meio ágar com canamicina exógena funcione t
deiro para o tipo s€
Meio contendo Apenas o recombinante que ldentificação l

50 pg/ml de canamicina contém o gene kanR pode sobreviver biblioteca geÍ
Embora a recupera
Figura 8.3 utilizada e existem
Seleção direta para o gene que confere resistência à canamicina clonado de R6-5 (kana).
do. Diversos mutar
Clonacev GÊnrca e ANÁLrsE oe DNA 169
recombinantes quando o
A recuperação do marcador ampria o emprego da seleção direta
sítio não estar localizado
iclina desse plasmídeo De fato, a seleção direta seria muito limitada se somente pudesse ser utilizada para clonar ge-
gene que confere resistênci nes que conferem resistência a antibióticos. Felizmente, aiécnicapode ser ampliada
fazendo-
uma marca de seleção. se uso de linhagens mutantes de E. coti como hospedeiras para a transformação.
no qual as únicas células Como exemplo, consideraremos um experimento para clonar o gene trpA de E. coli.Esse
tes que contêm o gene gene codifica a enzima triptofano sintase, a qual está envolvida na biossíntese do aminoácido
essencial triptofano. Uma linhagem mutante de E. coli, que possui um gene trpAnáo-fincio-
nal, é chamada de trpA- e é capaz de sobreviver apenas se o triptofano for adicionado ao meio
de crescimento. E. coli trpA- é,portanto, outro exemplo de auxotrofia (p. 140).
Essa -E coli mrÍante pode ser utilizada para clonar a versão correta do gene r4pÁ. O DNA
total é primeiramente purificado a partir de uma linhagem normal (tipo selvagem) da bacté-
ria. O processamento com uma endonuclease de restrição, seguido pela ligação em um vetor,
produz nu}Érosas moléculas de DNA recombinantes, uma das quais pode, com sorte, conter
uma cópia intacta do gene trpA (Figura 8.4a). Trata-se, é claro, do gene funcional, já que foi
obtido a partir da linhagem de tipo selvagem.
.J A mistura de ligação é, então, usada para transformar as células auxotróficas de E. coli
trpA (Figura 8'4b). A grande maioria dos transformantes que resulta será auxotrófìca, mas
t-) uns poucos terão, agora, a cópia correta do gene trpA, onginada do plasmídeo. Tais recom-
lsfragmentos
binantes são não-auxotróficos - eles não necessitam mais do triptofano, pois o gene clonado
é capaz de comandar a produção da triptofano sintase (Figura 8.4c). A seleção direta é, assim,
realizada pelo plaqueamento dos transformantes em meio mínimo, o qual carece de qualquer
suplemento adicional e, particularmente, não possui triptofano (Figura 8.4d). Mutantes auxo-
tróficos não podem crescer em meio mínimo, logo, as únicas colônias a aparecer serào recom-
binantes que contêm o gene trpAclonado.
o emprego e as limitações da técnica de recuperação do marcador

Embora a recuperação de um marcador possa ser usada para obtermos clones de muitos ge-
nes, duas limitações são impostas a essa técnica.
(1) uma linhagem mutante deve estar disponível para o gene em questão.
(2) um meio onde apenas o tipo selvagem possa sobreviver é necessário.
A técnica de recuperação é aplicável à maioria dos genes que codifica enzimas biossinté-
ticas, pois os clones desses genes podem ser selecionados em meios mínimos da maneira já
descrita para o trpA. Entretanto, a técnica não está limitada a E. coli,nem somente a bactérias;
ïransformação de Ìinhagens auxotróficas de leveduras e fungos filamentosos estão também disponíveis, e
a re-
E colr, plaqueamento cuperação do marcador tem sido usada para selecionar genes clonados em tais organismos.
Ademais, mutantes auxotróficos de E. coli podem ser utilizados como hospedeiros para a
seleção de alguns genes de outros organismos. Com freqüência, há similaridade
suficiente en-
tre enzimas equivalentes de diferentes bactérias, ou mesmo de leveduras, para que
a enzima
exógena funcione em E' coli, de modo que o gene clonado sejacapazde transformar
o hospe-
deiro para o tipo selvagem.
ldentiÍicação de um clone a partir de uma

biblioteca genômica
Embora a recuperação do marcador seja uma técnica poderosa, não é sempre que ela pode
ser
clonado de R6-S (kanR1. utilizada e existem muitos genes importantes que não podem ser selecionados por esie méto-
do. Diversos mutantes bacterianos não são auxotróficos, de modo que as Ìinhagens mutantes
17O T. A. Bnowrl
(a) Construção do pBR322 recombinante
ooü
trpA
ligação
(b)TransÍormação de E coti trpA- a/

"trDA- / trpA-
Não-
rêcombinante
t
I
Recombinantes
--=-
trpA+
Õ
@
(c) O gene do plasmídeo
é expressado
\
ptoleína trpA
or"nu"recombinantes
(d) Plaqueamento em / Figura 8.4
meio mínimo trpe* podem sobreviver
I ..< Figura 8.5
Seleção direta para o Freparação de uma bi-
gene trpA clonado em
Uioteca genômica em
uma linhagem trpA- de um vetor cosmidial.
E. coli.
some), um cro
e de tipo selvagem não podem ser distinguidas pelo plaqueamento em meio mínimo ou em ou um vetor P
qualquer outro meio especial. Além disso, nem a recuperação do marcador, nem qualquer ou- Para bacté
tro método de seleção direta é de muita utilidade no fornecimento de bactérias complementa- nômicacompl
das por clones contendo genes de organismos mais desenvolvidos (isto é, animais e plantas), mais, entretân
pois, nesses casos, as diferenças são geralmente tão grandes que as enzimas exógenas não clone desejaú
funcionariam na célula bacteriana. blioteca, espu
Uma estratégia alternativa deve, portanto, ser considerada. Isso ocorre quando um grandÊ maisl uliliílaÍl
número de clones diferentes é obtido e aquele que se deseja é, de alguma forma, identificado-
E.3.2 Nem todos
8.3.1 Bibliotecas genômicas
Uma caracterí
Antes de se observarem os métodos utilizados para identihcar clones individuais, deve ser con- viduais. Um g
siderada a biblioteca propriiÌmente dita. Uma biblioteca genômica (p.136) é uma coleção de clo- celulares - céI
nes em número apaÍentemente suflciente para conter cada gene presente em um determinado or-
de genes, mas
ganismo. Bibliotecas genômicas são preparadas pela purificação do DNA total da célula, ao qual outros são sile
se segue um processo parcial de restrição, resultando em fragmentos que podem ser clonados O fato de
em um vetor adequado (Figura 8.5), geralmente um vetor de l" de substituição, um cosmídeo oq qualquer pode
possivelmente, um cromossomo artificial de levedura (YAC, do inglês yeasr artificial chromo- o DNA. mas c
Cuorunceu GÊrurcr e ANÁLtsE oe DNA 171
DNA celular total
,4usde -35"not
kb
í-Í--1-------rr
Ligação no cosmídio
I
I Empacotamenlo in vitro,
I infecção de E. colí
i
,/-1--\
/'-' . - >a,/, colônias
/:..'...'x
.'
Í....,'.'l
Figura 8.4 Figura 8.5
\.'....:'l
\ ..'. ./
Seleção direta para o de uma bi-
gene trpA clonado em + outras ptacas
genômica em de Petri = biblioteca genômica
uma linhagem trpA'&
un vetor cosmidial.
E. coli.
some),um cromossomo artificial bacteriano (BAC, do inglês bacterial artificial chromosome)

em melo mlnlmo ou ou um vetor Pl.
marcador, nem qualquer Para bactérias, leveduras e fungos, o número de clones necessários para uma biblioteca ge-
de bactérias comp nômica completa não é tão grande que não possa ser manejado (Tabela 6.1). Para plantas e ani-
(isto é, animais e p mais, enffetanto, uma biblioteca completa possuiria tantos clones diferentes, que identificar o
as enzimas exógenas clone desejado provar-se-ia uma tarefa gigantesca. Para tais organismos, um segundo tipo de bi-
blioteca, específica não para todo o organismo, mas para um determinado tipo celular, seria de
ocorre quando um maior utilidade.
alguma forma, identifi
Nem todos os genes são expressados no mesmo momento
Uma característica da maioria dos organismos multicelulares é a especialização de células indi-
individuais, deve ser viduais. Um ser humano, por exemplo, é constituído por um grande número de diferentes úpos
(p. 136) é uma coleção de
celulares - células cerebrais, sangüíneas, hepáticas, etc. Cada célula contém o mesmo conteúdo
te emum determinado de genes, mas, nos diferentes tipos celulares, grupos distintos de genes são ativados, enquanto
DNA total da célula. ao outros são silenciados (Figura 8.6).
que podem ser clona O fato de que, relativamente, apenas poucos genes são manifestados em um tipo celular
4i
I
ituição, um cosmídeo qualquer pode ser utilizado na preparação de uma biblioteca, se o material a ser clonado não for
yeast artificial o DNA, mas o RNA mensageiro (mRNA). Apenas aqueles genes que estiverem sendo expres-
I
Cr-orunceu GÊNrcA E ANÁLrsE oe DNA 173
cialmente degradado, por tratamento com a ribonuclease H (RNase) (Figura 8.7b). Os frag-
mentos remanescentes de RNA servem, então, como iniciadores (p. 68) para a DNA-polime-
rase I, a qual sintetiza a segunda fita de cDNA (Figura 8.7c), resultando em um fragmento de
DNA de fita dupla que pode ser ligado a um vetor e clonado (Figura 8.7d).
(a) Sínteqe$ primeira Íita

)
cú AAAAA
mRNA Cauda de Anelamento de um lT

lnlclaclor
\
Poli(A) oligo(dï) iniciador
\I
-
Transcriptasereversa
/
./
RNA /
T-n-l-t-,rT-n-T-Tl iH
(b) Degradação do RNA DNA
,/RNase H
,/
/
Fragmentos de RNA
n n n r-Ì1.]-r
(c) Síntese da
segunda Íita
/ DNA-poll
Fragmentos I
de RNA atuam
como iniciadores DNA
8.6
diÍerentes são expres-
em tipos celulares dÌb
\
T-T-I-TÍ-T-FTT-Ì-TTTT AAAÁA
cDNA de fita dupla ÌrÍrr
União das extremidades

(d) Ligação em um vetor coesivas, ligação
material iniciadot os
de genes da célula.
útil se o gene desej
Por exemplo, o gene da .- cDNA
no trigo, é expressado em
-olvimento. Em tais
se pudéssemos clonar o
lones específicos para g
(e) TransÍormação
Figura 8.7 Clones de

cDNA
llüm esquema pos-
de clonagem. Entretanto, úrd para a clona-
(cDNA, do j do cDNA (ver
detalhes).
(p 68), que sintetiza uma = poliadeno- = Clones da
olip(dT) = oli- gliadina
(Figura 8.7a). Uma
la híbrida pode ser
midina.
172 T. A. Bnowr'r
cialmente r
Célula do tipo A
mentos ren
rase I, a qu
DNA de fit
\ u"n"..ir.o"Joo.
mRNA -- proÌeína
Célula do tipo B
Genes silenciados
.--------* mRNA -_ proteína
Figura 8.6
\ mRNA proteína Genes diÍerentes são exprs
sados em tipos celulares dib'
rentes.
sados são transcritos em mRNA. Logo, se o mRNA for usado como material iniciador, os
nes resultantes compreenderão apenas uma seleção do número total de genes da célula.
Um método de clonagem que utilize mRNA seria particularmente útil se o gene desej
fosse expressado em altos níveis em um tipo celular individual. Por exemplo, o gene da
dina, uma das proteínas nutricionais mais importantes presentes no trigo, é expressado em
nível muito elevado nas células das sementes de trigo em desenvolvimento. Em tais cél
mais de 307o do mRNA total especificam gliadina. Obviamente, se pudéssemos clonar o
NA das sementes de trigo, iríamos obter um grande número de clones específicos para
na.
8.3.3 O mRNA pode ser clonado como DNA complementar Frgura &7
pc.
O RNA mensageiro não pode, ele próprio, ser ligado a um vetor de clonagem. peraa dona-
mRNA pode ser convertido em DNA pela síntese do DNA complementar (cDNA, do i cDl.lA (ver
complementary DNA). d€fralhes)"
A chave para esse método é a enzima transcriptase reversa (p. 68), que sintetiza uma =pdiadenc
polinucleotídica de DNA complementar a uma fita de RNA existente (Figura 8.7a). Uma = oli-
que a fita de cDNA tenha sido sintetizada, o membro RNA da molécula híbrida pode ser
Crouoev GÊNrcA E ANÁLrsE DE DNA 173
cialmente degradado, por tratamento com a ribonuclease H (RNase) (Figura 8.7b). Os frag-
mentos remarescentes de RNA servem, então, como iniciadores (p. 68) para a DNA-polime-
rase I, a qual sintetiza a segunda fita de cDNA (Figura 8.7c), resultando em um fragmento de
DNA de fita dupla que pode ser ligado a um vetor e clonado (Figura 8.7d).
(a) Síntese da primeira fita
5' 3'
mRNA Cauda de n*r"r*r,tio" rr .## \ \
lnlclador
Poli(A) oligo(dT) iniciador
I
Transcriptasereversa
/I
i RNA /
l--t--l--t--l--lm AAAAA
u...J....J....J....l.-.4]-TfTI
I
(b) Degradação do RNA DNA
,/
/ ,/
t RNase H
i
Fragmentos de RNA
t .T ..'l n r-rì-rr
t
Í (c) Síntese da
t segunda Íita ,/ DNA-pol I
l
lr
Ij
Fragmentos /
de RNA atuam
como iniciadores DNA
L.",.
pres diÍerentes são exprr
fdos em tipos celulares d
\
T-fT-'l-T-l-T-fT-fTTT"l- AAAAA
dupla rrrrr
Fn"r cDNA de Íita
I
I União das extremidades
material iniciador, os, (d) Ligação em um vetor coesivas, ligação
!rc
pl de genes da célula.
pnte útil se o gene desej
por exemplo. o gene da g CDNA
fo trigo. é expressado em -.
loluimento. Em tais célu
[se pudéssemos clonar o r
fones específicos para gÌii
l
(e) Transformação
F
I
Figura 8.7 Clones de
frentar esquema pos-
cDNA
bde clonagem. ufuel para a clona-
pmentar (cDNA, do do cDNA (ver
para detalhes).
b. 68), que sinteriza uma = poliadeno-
bnte (Figura 8.7a). Uma oligo(dT) = oli-
nlécula híbrida pode ser godesoxitimidina.
b
174 T. A. Bnowlr
Os clones de cDNA resultantes são representativos do mRNA presente na preparação

ginal. No caso do mRNA preparado a paÍir das sementes de trigo, a biblioteca de cDNA
suiria uma grande proporção de clones representando o mRNA da gliadina (Figura 8.7e).
tros clones também estarão presentes, mas localizar o cDNA da gliadina clonado é um
cesso muito mais fácil do que identificar o gene equivalente a partir da biblioteca
completa do trigo.
8.4 Métodos para identiÍicação do clone

Uma vez que uma biblioteca adequada tenha sido preparada, viírios procedimentos podem
empregados na tentativa de identificar o clone desejado. Embora uns poucos desses
mentos sejam baseados na detecção do produto de tradução do gene clonado, é, via de
mais fácil identificar diretamente a molécula de DNA recombinante correta, o que pode
realizado por meio da importante técnica de sondagem por hibridização. Frú
nfsn:dização ì
8.4.1 Fitas complementares de ácido nucléico hibridizam-se entre si ilirilllnléico. (a) Un
o,e híbrida insl
Quaisquer duas moléculas de ácido nucléico de fita única têm o potencial de formar pares de nmnda entre dua
base uma com a outra. Para a maioria dos pares de moléculas, as estruturas híbridas resultan MÌ{A não-homol
tes são instáveis. pois somente um pequeno número de ligações individuais entre as fitas é for- tlm híbrido es
mado (Figura 8.8a). Entretanto, se os polinucleotídeos forem complementares, um extenso mado entre d
pareamento de bases pode ocorrer para formar uma molécula de fita dupla estável (Figura @Íplementars
8.8b). Isso pode ocorrer não apenas entre moléculas de DNA de fìta simples para formar unre híbrido DNA-
hélice dupla de DNA, mas também entre moléculas de RNA de fita simples e entre combina- @mo o que
ftrrnado entre
ções de fitas de DNA e de RNA (Figura 8.8c).
A hibridização de ácidos nucléicos pode ser utilizada para identificar um determinado
eseuü
clone recombinante se uma sonda de DNA ou RNA, complementar ao gene desejado, estiver
disponível. A natureza exata da sonda será discutida posteriormente neste capítulo. Primeiro"
deve ser considerada a técnica propriamente dita.
ra 8.9
8.4.2 Sondagem por hibridização para colônias e placas mole
gadas
A sondagem por hibridização pode ser usada para identificar moléculas de DNA recombinan- ï
tes tanto em colônias de bactérias quanto em placas de bacteriófagos. Graças às técnicas ino- lation
vadoras, desenvolvidas no final da década de 1970, não é necessário purifïcar cada molécrrh
ção a
recombinante. Um método de sondagem in situ, ao contriírio, é utilizado. atir"id
Primeiro, as colônias ou placas são transferidas para uma membrana de nitrocelulose m ligad.
náilon (Figura 8.9a) e, então, são tratadas para remover todo o material contaminante, deixan- por ar
do apenas o DNA (Figura 8.9b). Geralmente, esse tratamento também resulta na o
das moléculas de DNA, de modo que as pontes de hidrogênio entre as htas individuais na hÉ te &r
lice dupla são quebradas. Tais moléculas de fita simples podem, então, ser firmemente li Ír0 acl
à membrana por um curto período a 80'C, se uma membrana de nitrocelulose estiver Ilutrci
utilizada, ou pela radiação ultravioleta, se for usada a membrana de náilon. As moléculas guais
nam-se aderidas à membrana por meio de suas estruturas açúcar-fosfato, de modo que as b* o
ses ficam livres para parear com as molécuÌas de ácido nucléico complementares. reaçã
A sonda deve agora ser marcada, desnaturada por aquecimento e aplicada à membrana cham
uma solução de reagentes químicos que promovam a hibridização dos ácidos nucléicos (Fi sgr&
Cr-oruaoeur GÊrurcn e ANÁLrsE oe DNA 175
Iesente na preparação oú
rbiblioteca de cDNA pos-
(a) Um híbrido instável
fliadina (Figura 8.7e). Ou-
fiadina clonado é um pro"
lir da biblioteca genômica
rprocedimentos podem
ns poucos desses procedii
E clonado, é, via de regra,
(b) Um híbrido estável
le correta, o que pode sc
lzação. Figura 8.8
Hibridização de ácido
nm-se entre si nrcléico. (a) Uma molé-
qlla híbrida instável for-
Pequenas regiões não-complementares
kncial de formar pares & flmnda entre duas Íitas de não afetam a estabilidade geral
Itruturas híbridas resultan- [D].lA não-homólogas. (b)
iyiduais entre as fitas é fa- Um híbrido estável Íor-
lplementares, um exteNo mado entre duas Íitas (c) Um híbrido DNA-RNA
.fita dupla estável (Fi ournplementares. (c) Um
lsimples para formar híbrido DNA-RNA, tal
lsimples e entre combinr como o que pode ser
rbrmado entre um gene
e seu transcrito.
bntificar um dete
iao gene desejado,
D neste capítulo. Pri
ra 8.9c). Após um peíodo para permitir que a hibridização aconteça, o filtro é lavado para re-
mover as sondas que não se ligaram, é seco e então são detectadas as posições das sondas li-
ls gadas (Figura 8.9d).
rlas de DNA recombinan- Tradicionalmente, a sonda é marcada com um nucleotídeo radioativo, tanto por nick trans-
!s. Graças às técnicas ino- lation quanto por preenchimento das extremidades (p. 81), ou, alternativamente, por inicia-
b purificar çsds mql{çula ção aleatória (random priming) (Figtra 8.10), uma técnica que resulta em uma sonda com
hado. atividade bem mais elevada e, portanto, capaz de detectar quantidades bem menores de DNA
brana de nitrocelulose ut ligadas à membrana. Com esses métodos, a posição do sinal de hibridização é determinada
[ial contaminante, deixan- por auto-radiografia.
im resulta na desnatura@ Os métodos de marcação radioativa, porém, estão começando a entrar em desuso, em par-
*as fitas individuais na h6
te devido aos riscos qÌre trazem ao pesquisador e em parte devido aos problemas associados
b, ser firmemente ligadro ao acondicionamento dos resíduos radioativos. A sonda de hibridização pode, portanto, ser
ilrocelulose estiver sendo, marcada de uma maneira não-radioativa. Diversos métodos tôm sido desenvolvidos, dois dos
rnáilon. As moléculas tg'- quais são ilustrados na Figura 8.1 l.
cf,ato, de modo que as ba- O primeiro faz uso de nucleotídeos desoxiuri.dina trifosfato (dUTP) modificados pela
mplementares. reação com a biotina, uma molécula orgânica que possui alta afinidade por uma proteína
; aplicada à membrana em chamada avidina. Após a hibridização, as posições das sondas biotinizadas e ligadas podem
m ácidos nucléicos (Figu- ser determinadas pela lavagem com avidina, associada a um marcador fluorescente (Figura
176 T.A.Bnowru
(a)TransÍerência das colônias paÍa nitÍocelulose ou náilon
Membrana de
nitrocelulose/náilon
--!'--
I \/\/
"---l--------l_-!ì
lÌ---:-:::Jl Bactérias aderidas
à membrana
(b) Degradação das células'e puriÍicação do DNA
Bactérias DNA
/ \ Árcari+ J \-
Protease
\ sooc
Bases \ Pot z ou inadiação
não-Pareadas noras ultravioleta
/I\ )
}*tY;rr
DNA e ligado
pela estrutura DNA ligado Figura 8.10
à membrana
açúcar-Íosfato Marcação do DNA Por
iniciação ale alória ( ran-
Filme de raio X
(c) Sonda com o DNA marcado &m priming). A mistura
*^*ã â.?-lá. lavaoem
\ @ hexâmeros randomi-
.ffi
,/ ')Çl,,w,Y\ " -'%r,,,v-Ìf ffi dos (oligonucleotídeos
\ / APlicação do Íilme lfiptaméricos de seqüên-
Ligação não- Ligação de raio X cla randomizada) é suÍi-
específica esPecíÍica cientemente complexa
para incluir, pelo menos,
(d) A auto-radiograÍia Íesultante
@umas moléculas que
possam parear com a
dNTP = 2'-desoxi-
nmrrieotídeo 5'{rifosÍato.
Figura 8.9
Hibridização positiva A hibridização em
colônias com uma
sonda marcada ra- Exemplos do uso;
dioativamente.
obviamente, o sucesso (
determinado clone recot
possa ser usada como so
8.11a). Esse método é tão sensível quanto a sondagemradioativae está se tornando
cada
cia do gene clonado. Se
mais popular. menteéocasoseoobjr
O mãsmo também é verdadeiro para o segundo método de hibridização com sonda
não-ra
ser utilizado como sond
dioativa, no qual a sonda de DNA é complexada com a enzima peroxidase de rábano sil
Na prática, a nature,
tre (horserudish x peroxi.dase) e é detecÍada pela habilidade enzimática em degradar lum
gene desejado. Serão co
com a emissão de quimioluminescência (Figura 8.11b). O sinal pode ser registrado em
fi
fotográfico normal de maneira análoga à auto-radiografia' (1) Aquela na qual o 1
tir do qual uma bil
b
Cr-onneeu GÈrutcn e Ar.tÁrtse oe DNA 1TI
Sonda de DNA
de fita dupla
Desnatu ração pelo aquecimento
DNA de fita simples
Adição de hexâmeros randomizados

de oligonucleotídeos
.P
rs formam
Alguns; hexâmeros
h
LJJ pares de bases
Figura 8.10
Marcação do DNA Por
üriciação alealória (ran- \ Adição da polimerase de
Mn priming). A mistura Klenow + dNTPs,
ú hexâmeros randomi- \ um dos quais está marcado
dos (oligonucleotídeos
Itsaméricos de seqüên- \
cã randomizada) é suÍi-
cientemente complexa
pra incluir, pelo menos,
rlgumas moléculas que
possam parear com a
dNTP = 2'-desoxi- DNA marcado
nnrcleotídeo 5'-triÍosÍato.
Figura 8.9
A hibridização em
colônias com uma
sonda marcada ra- Exemplos do uso prático da sondagem por hibridização
dioativamente.
Obviamente, o sucesso da hibridização em colônia ou placa como meio para identificar-se um
determinado clone recombinante depende da disponibilidade de uma molécula de DNA que
va e está se tornando cada possa ser usada como sonda. Essa sonda deve compartilhar, pelo menos, uma parte da seqüên-
cia do gene clonado. Se o gene propriamente dito não estiver disponível (o que presumivel-
hibridização com sonda não-ra mente é o caso se o objetivo do experimento for fornecer um clone dele), então, o que pode
peroxidase de rábano silve ser utilizado como sonda?
imática em degradar lumino( Na prática, a natuÍeza da sonda é determinada pela informação disponível a respeito do
pode ser registrado em filrrr gene desejado. Serão consideradas três possibilidades.
(1) Aquela na qual o gene desejado é expressado em altos níveis em um tipo celular, a par-
tir do qual uma biblioteca de clones de cDNA tenha sido preparada.
178 ï A. Bnowlr
l'
Sondagem por
(a) Marcação com um nucleotídeo biotinizado
Conforme descrito
ra a obtenção de un
Sondade DNA /
./ durP-biotina
I determinado tipo ce
em desenvolvimenú
{\( gene da gliadina (Fï
Nick \ -\=-
transtation, \ A identificação r
preenchimento das nados clones de cDl

---\
extremidades ou
teca (Figura 8.12). L
iniciação aleatória
te é purificada, nuìÍ(
\ Hibridização
diferentes clones us
\ da biblioteca seja d
gliadina e analisado
,%
l{><-> lamento do produto
Sondas de oligr
BBBB
+-{-r! .-
-/
,/r*xïï** a um marcador
fluorescente
tenham sido ca
Freqüentemente, o Í
,r>ü detalhamento. Em p
7-7-7rr-7-7-7-77-2-777-7
^t<r>
(b) Marcação com a peroxidase de rábano silvestre
Peroxidase de rábano silvestre

+ glutaraldeído
__.t\_\
HP ./
HP -/
H>--'-'' \ Hibridizaeão
\
\
HP HP
À<,r{r\ .O}<"À
777-7777-777-7'7-7-
,.'/
Adição de luminol
-,-
Figura 8.11
Dois métodos para a m€ìÍ-
cação não-radioativa das
sondas de DNA.
i1
(2) Aquela na qual a seqüência de aminoácidos da proteína codificada pelo gene é

ú Figu
I ta ou parcialmente conhecida. Sondagem em uma bibliotec
(3) Aquela na qual o gene é membro de uma família de genes relacionados. identiÍicar um clone ahtr
I
t
I
t
i
F
Clotnçenr GÊNtcA E ANÁLtsE oe DNA 179
Sondagem por abundância para analisar uma biblioteca de cDNA

Conforme descrito neste capítulo, uma biblioteca de cDNA é, com freqüência, preparada pa-
ra a obtenção de up clone de um gene expressado em um nível relativamente elevado em um
determinado tipo
\elular. No exemplo da biblioteca de cDNA, a partir das sementes de trigo
em desenvolvimentb/uma grande proporção dos clones é cópia dos transcritos de mRNA do
gene da gliadina (Figura 8.7e).
A identificação dos clones da gliadina é simplesmente um caso de utilização de determi-
nados clones de cDNA, a partir da biblioteca, para sondar todos os demais membros da biblio-
teca (Figura 8.12). Um clone é selecionado aleatoriamente e a molécula de DNA recombinan-
te é purificada, marcada e utilizada para sondar os clones remanescentes. Isso é repetido com
diferentes clones usados como sondas até que um que hibridize com uma grande proporção
da biblioteca seja obtido. Esse cDNA abundante é considerado como um possível clone da
gliadina e analisado mais detalhadamente (por exemplo, por seqüenciamento do DNA e iso
lamento do produto de tradução), a fim de confirmar a identihcação.
Sondas de oligonucleotídeos para genes cuios produtos de tradução

tenham sido caracterizados
Freqüentemente, o gene a ser clonado codifica uma proteína que já foi estudada com algum
detalhamento. Em particular, a seqüência de aminoácidos da proteína deve ter sido determi-
Biblioteca
B de clones
sonda A Á,0,,0,'"nr\ sonda B

/ em colônia \
/\
Figura 8.Í 1
Dois métodos para a mar-
cação não-radioativa das
sondas de DNA.
Auto-radiografias
Sonda A = Sonda B =
ada pelo gene é Figura 8.12 Clone pouco Clone muito
Sondagem em uma biblioteca para abundante abundante
relacionados. identiÍicar um clone abundante.
180 T. A. Bnowlr
nada utilizando técnicas de seqüenciamento disponíveis há mais de 40 anos. Se a seqüência

de aminoácidos é conhecida, então é pospÍvel utilizar o código genético para deduzir a se-
qüência nucleotídica do gene relevante. é sempre aproximada, pois somente
Qssl dedução
metionina e triptofano podem ser associados de maneira não-ambígua às trincas de códons;
todos os outros aminoácidos são codificados por, pelo menos, dois códons cada. Contudo, na
maioria dos casos, os diferentes códons paÍa um aminoácido individual são relacionados. Ala-
nina, por exemplo, é codificada por GCA, GCT, GCG e GCC, logo, dois dos três nucleotídeos
da trinca que codifica a alanina podem ser deduzidos com certeza.
Como um exemplo para esclÍÌrecer como tais deduções são feitas, considere a citocromo
c,.uma proteína que desempenha um papel importante na cadeia respiratória de todos os or-
ganismos aeróbicos. A proteína citocromo c de levedura foi seqüenciada em 1963, com o re-
sultado mostrado na Figura 8. 13. Essa seqüência contém um segmento, iniciando no aminoá-
cido 59, com a seqüência Trp-AspGlu-Asn-Asn-Met. O código genético determina que es-
se hexapeptídeo é codificado por TGG-GAë-GAâ-AAë-AAë-ATG. Embora isso represen-
te um total de 16 seqüências diferentes possíveis, 14 dos 18 nucleotídeos podem ser deduzi-
dos com certeza.
Oligonucleotídeos com cerca de 50 nucleotídeos de extensão podem ser facilmente sinte-
tizados em laboratório (Figura 8.14). Assim, uma sonda de oligonucleotídeos poderia ser
construída de acordo com a seqüência nucleotídica deduzida e tal sonda sei.acapaz de iden-
tificar o gene que codifica a proteína em questão. No exemplo da citocromo c de levedura, mi
16 oligonucleotídeos possíveis, que podem codificar Trp-Asp-Glu-Asn-Asn-Meq seriam
sintetizados, separados ou em conjunto, e então utilizados para sondar uma biblioteca genô-
mica ou de cDNA de levedura (Figura 8.15). Um dos oligonucleotídeos da sonda terá a se-
qüência correta para essa região do gene da citocromo c e o seu sinal de hibridização indica-
rá quais clones são poÍadores desse gene.
O resultado pode ser verificado por meio de uma segunda sondagem com uma mistura Figura I
üün esquema sin
de oligonucleotídeos cujas seqüências são deduzidas a partir de um segmento diferente de
proteína citocromo c (Figura 8.15). Entretanto, o segmento da proteína empregado para de-
lib da síntesr
olgonucleotíú
dtzir a seqüência de nucleotídeos deve ser escolhido com cuidado: o hexapeptídeo Osgrupama
Ser-Glu-Tyr-Leu-Thr-Asn, que segue imediatamente o primeiro hexapeptídeo escolhido. ligade
poderia ser codificado por milhares de seqüências diferentes de l8 nucleotídeos, claramen- rüerridades 3
te uma opção inadequada para uma sonda sintética. pevinem reaç
ünüemononude
Sondas heterólogas permitem que genes relacionados ôos indivirJu
seiam identiÍicados Corn um cont
Geralmente, uma considerável similaridade entre nucleotídeos é vista quando dois genes mrÈ{adOSO çlg I
iuilltgtb Íìo qua

mesma proteína, mas de organismos diferentes, são comparados, o que reflete a
da estrutura dos genes durante a evolução. Com freqüência, dois genes de organismos rel são rer
ufrüas, @em
;dkinadc nrc
mmrffiotídeos, ut
úctlipnud€
15
GLY_SER-ALA_LYS- LYS-GLY.ALA_THR_ LEU_ PHE_ LYS_THR_ARG-CYS_GLU -
Figura 8.13 crcsoÍne
30
LEU- CYS- HIS-THR.VAL-GLU- LYS_ GLY _GLY_ PRO_ HIS- LYS _VAL_GLY_ PBO-
45 A seqüência de aminoácidos da
ASN_LEU_HIS_GLY_ PHE-GLY-ARG-HIS -SER-GLY_GLN-ALA-GLN *GLY-
ILE _
60 citocromo c de levedura. O hexa-
TYH - SER -TYR -THR_ASP-ALA_ASN _ ILÊ _ LYS_ LYS_ ASN - VAL_LEU.TRP_ASP_
75 peptídeo que está destacado em narlos:
GLU ASN ASN_T,4ET_SER-GLU.TYR-LEU-THR-ASN-PRO-LYS_LYS_TYR_ILE-
90 vermelho é utilizado para ilustrar Ìrm gÊt
PRO- GLY_THR _ LYS - IVET-ALA-PHE *GLY.GLY _LEU _ LYS_ LYS. GLU - LYS-ASP-
ARG.ASN -ASP- LEU _ ILÉ _ÌHR -ÍYR _LEU - LYS _LYS_ALA_CYS _GLU
103 como uma seqüência nucleotídicar imint
pode ser deduzida, a partir de estrutu
uma seqüência de aminoácidos.
Ct-onnoev GÊrurcn e ANÁLrsE oe DNA 181
ris de 40 anos. Se a seq

p genético para deduzir a se- 3' /'--\ 5'
pre aproximada. pois so I -t-j-| Ç61$sPs 5'Protesido
prbígua às trincas de cr
-.- -
Suporte \ / tigaçaodoprimeiro
lilois códons cada. Contudo,
de sílica { nucleotídeo ao suporte
ilividualsão relacionados.
bgo, dois dos três
Y.a.
r{} ïflïr*!v:':eil"Ï:n""'
bfeitas, considere a citocro
I 1
lia respiratória de todos os
fiíienciada em 1963, com o '
J ^
,lRemocãoda
-/lõË::
-fr;o*o
I--,4\ v;\.
hrnento. iniciando no amin da proteção 3
fgo genético determina que
r
lerc. Embora isso repres \!-,/
aat---/
Lcleotídeos podem ser dedr
\,/ Cond.ensação
podem ser faciÌmente s
\
poderia
sonda seria capaz de i
citocromo c de levedura- f@Ot '*n*Jnucreotídeo
Asn-Asn-MeL seri
da I
/-\ 3' 5'

.Jlproteção5' o\1/'
sondar uma biblioteca genô. ,l Remocão
deos da sonda terá a se-
sinal de hibridização i I /r
A\o Remoção da
sondagem com uma mi Figura 8.14 ", Proteção3'
-Ã*""; _t)-o
um segmento diferente ü[n esquema simpli-
lfuado da síntese de
ína empregado para
olgonucleotídeos.
cuidado: o hexapept
Os grupamentos
iro hexapeptídeo escolhi
r@
ligados às
I8 nucleotídeos, claram úemidades 3'e 5'
i prwinem reações
I runbe mononucleotÊ
pnados deos individuais.
Com um controle Continua até o
Nucteotídeo
lé vista quando dois genes widadoso do mo- O comprimento
desejado - então,
ps. o que reflete a cons Ínento no qual as
! g.n.r de organismos
sao remo-
vÍ1as, podem ser
T Suporte de sílica
é clivado do suporte
dcionados mono- o Grupamento protetor 5', por exemplo, dimetoxi-tritil

m:.rdeotídeos, um a o Grupamento protetor 3', por exemplo, dimetilJosforamidita
ao oligonucleotÊ
Fa 8.13
em crescimento.
lçüência de aminoácidos da
Íomo c de levedura. O hexa-
Heo que está destacado em nados são suficientemente similares paÍa que uma sonda de fita simples, preparada a partir de
Hho é utilizado para ilustrar um gene, forme um híbrido estável com o segundo gene. Embora as duas moléculas não se-
I uma seqüência nucleotídica jam inteiramente complementares, pares de bases suficientes são formados para produzir uma
Iser deduzida, a partir de estrutura estável (Figura 8.16a).
seqüência de aminoácidos.
i
t
P
182 T. A. Bnowlr
bndizarán2
Oligonucleotídeos sintéticos, nes (Figura
marcados nas extremidades
'[tr udues ^ de nucleotí
complexo
;:;
g
lia multigê
B,,rf:ïff""J,ï,*."
\
\ ,/
..t --6.h
Sondagem
\..:.:'./
por -:- '-z
bros poden
8.4.4 Métodos r
hibridização em colônia tradução

\ /
\\\ -- 3J'3"JJ:ï::::ïï il3:fl'ffl As sondas r
ffiz terminado r
com as mo
10.000 recr
Auto-radiograÍia investigada
uma sonda
\ nam impos
\ Provável clone da
citocromo c
tégia difere
Sinal não-específico?
Nova sondagem com um segundo
oligonucleotídeo deduzido
Figura 8.15
O uso de um oligo-
nucleotídeo sintéti-
ldentiÍicação definitiva do co, marcado na ex-
clone da citocromo c
tremidade, para
identiÍicação de um
clone do gene da
citocromo c de le-
vedura.
As sondas heterólogas fazem uso da hibridização entre seqüências relacionadas para e

identificação dos clones. Por exemplo, o gene da citocromo c de levedura, identifïcado na se-
ção anterior por sondas de oligonucleotídeos, poderia ser utilizado como sonda de hibridiza-
ção para identificar genes de citocromo c em bibliotecas de clones de outros organismos. Ume
sonda preparada a partir do gene de levedura não seria inteiramente complementar ao gene dc
Neurospora crassa, mas um pareamento de bases suficiente deveria ocorrer para que um hí-
brido fosse formado e detectado por auto-radiografia (Figura 8.16b). As condições experi-
mentais seriam modificadas de modo que a estrutura heteróloga não fosse desestabilizada c
perdida antes da auto-radiografia.
As sondas heterólogas também podem identificar genes relacionados no mesmo organis-
mo. Se o clone de cDNA da gliadina do trigo, identihcado anteriormente no capítulo por meio
Figura 8-16
da sondagem por abundância, for utilizado na sondagem de uma biblioteca genômica, ele hi- ;Mas heterólogas.
CLoruncev GÊrurcn e ANÁLrsE oe DNA 1&l
bidizará não somente com seu próprio gene, mas também com uma variedade de outros ge-
nes (Figura 8.16c). Todos eles relacionam-se ao cDNA da gliadina, mas possuem seqüências
de nucleotídeos levemente diferentes. Isso ocorre porque as gliadinas do trigo formam um
complexo grupo de proteínas relacionadas que são codificadas pelos membros de uma famí-
lia multigênica. Uma vez que um gene da famflia tenha sido clonado, todos os demais mem-
bros podem ser isolados pela sondagem heteróloga.
Métodos de identificação baseados na detecção do produto de

tradução do gene clonado
As sondas de hibridização são, geralmente, o método preferido para a identificação de um de-
terminado recombinante a partir de uma biblioteca de clones. A técnica é de fácil execução e,
com as modificações introduzidas nos últimos anos, pode ser usada para analisar mais de
10.000 recombinantes por experimento, permitindo que grandes bibliotecas genômicas sejam
investigadas em um tempo razoavelmente curto. Entretanto, as necessidades para obtenção de
uma sonda que seja, no mínimo, parcialmente complementar ao gene desejado às vezes tor-
nam impossível utilizar a hibridização para identificar os clones. Nessas ocasiões, uma estra-
tégia diferente torna-se necessária.
(a) Um híbrido entre duas Íitas de DNA relacionadas
Pareamento de bases suÍiciente

para Íormar uma estrutura estável
Figura 8.15
O uso de um oligo-
nucleotídeo sintéli" (b) Sondas heterólogas entre espécies
co, marcado na ex-
Gene da citocromo c
tremidade, para de levedura marcado
identiÍicação de (
clone do gene da "\hÍ.
citocromo c de le' Provável clone
vedura. da ciÌocromo c
de Neurospora
Biblioteca genômica
seqüências relacionadas para do DNA de Neurospora
c de levedura, identificado na
ilizado como sonda de hibri (c) Sondas heterólogas dentro de uma mesma espécie
clones de outros organismos. cDNA da gliadina
complementar ao gene marcado
zíõ-ì\ ) ("
:.'j'.ì "(
deveria ocoffer paÍa que um /a . .\ xì.J
8.16b). As condições ex
não fosse desestabilizada
f
l3
:-1 . o r I Membros da
tt7 '
Íamília multigênica
\.t."1. da gliadina
relacionados rto mesmo \i__2,
nte no capítulo por Biblioteca genômica do trigo
Figura 8.16
uma biblioteca genômica, ele heterólogas.
I
184 T. A. Bnowlr
A principal alternativa à hibridização com sondas é a sondagem imunológica (screening Utilizaçã

immunological). A diferença está no fato de que, enquanto por meio das sondas de hibridiza- colônias
ção o próprio fragmento de DNA clonado é diretamente identificado, um método imunológi- Existem vá
co detecta a proteína codificada pelo gene clonado. Logo, as técnicas imunológicas pressu-
dução diret
põem que o gene clonado esteja sendo expressado para que a proteína esteja sendo sintetiza-
feridas a ut
da e que a mesma proteína não esteja normalmente presente nas células hospedeiras.
tendo o ant
Os anticorpos são necessários para os métodos imunológicos brana pode
de detecção teína bacte
(Figura 8.1
Se uma amostra purificada de uma proteína for injetada na corrente sangüínea de um coelho"
tadas por z
o sistema imune do animal responde por meio da síntese de anticorpos que se ligam e ajudam nescente P
a degradar a molécula estranha (Figura 8.17a). Essa é uma versão do mecanismo de defesa na-
tural que os animais utilizam para lidar com invasões bacterianas, virais e de outros agentes
infecciosos.
Uma vez que a proteína é injetada no coelho, os níveis de anticorpos presentes em sua cor-
rente sangüínea perÍnanecem suficientemente elevados pelos próximos dias para que quanti-
dades substanciais sejam purifìcadas. Não é necessiírio matar o coelho, pois apenas 10 nú dc
sangue fornecem uma quantidade razoável de anticorpos (Figura 8.17b). Esse anticorpo puri-
ficado liga-se somente à proteína que fora originalmente injetada no animal.
(a) Anticorpos ligam-se às moléculas exógenas
)
o,\ J Molécula exógena,
Por exemolo, Proteína
pí
-? F-'-=- Anticorpos
I
Figura 8.1t
llüülização de um an
(b) PuriÍicação dos anticorpos Figura 8.17 tborpo purificaü
Anticorpos. (a) Os an- pra detectar Proteí
ticorpos na corrente ffils em colônias re
Remoção de sangüínea ligam-se a combinantes. En
10 ml de sangue moléculas exógenas e wda proteína mat
ajudam a degradá-las- cada A, o PróPú
ï-l (b) Anticorpos purifi- mticorpo pode se
Coelho inletado com ï-

v cados podem ser obti-
dos de um pequeno
volume de sangue re-
rnarcado ou, alter
mrdiì/amente, um s€
gundo anticorP
a proteína exógena Sangue tirado de um coelho rmrcado que se I
AnÌicorpo
puriÍicado injetado com a proteÊ glrn esPeciÍicament
na exógena. @ primeiro anticol
p pode ser usaü
( Cloruncera GÊNrcA E ANÁLrsE DE DNA 185
m imunológica,(scret Utilização de um anticorpo puriÍicado para detectar proteínas em

io das sondas de hibri colôn ias recombinantes
um método im
Existem várias versões da sondagem imunológica, mas o método mais utilizado é uma repro-
imunológicas
dução direta da sondagem por hibridização em colônias. As colônias recombinantes são trans-
esteja sendo si
feridas a uma membrana de polivinil, as células são lisadas e é adicionada uma solução con-
células hospedeiras.
tendo o anticorpo específico (Figura 8.18a). O próprio anticorpo pode ser marcado ou a mem-
imunológicos brana pode ser subseqüentemente lavada com uma solução de proteína A marcada, uma pro-
teína bacteriana que se liga especificamente às imunoglobulinas que constituem os anticorpos
(Figura 8.1 8b). A marcação pode ser radioativa, caso no qual as colônias marcadas são detec-
sangüínea de um
tadas por auto-radiografia, ou não-radioativa, quando um sinal fluorescente ou quimiolumi-
que se ligam e aj
nescente pode ser utilizado.
do mecanismo de defesa
virais e de outros
presentes em sua
mos dias para que (a) Sondagem imunológica
coelho, pois apenas 10 ml

8.17b). Esse anticorpo Colônias
no animal. Lise das células
/\ (cloroÍórmio)
Tt>>_7 ZHz'
Membrana
\noiçao de anticoÍpos
/ específicos
,/
,
Anticorpos ligam-se às células Iisadas
proteína clonada
( contendo a
llr.[
z-+H--z
Proteína A liga-se
ao anticorpo ,,/ aatçao da proteína A
,/ marcada com 1125
I
?il?
Figura 8.18 zffi
de um an-
Figura 8.17 ümrpo puriÍicado
Anticorpos. (a) Os detectar proteÊ
ticorpos na corrente ern colônias re-
(b) A auto-radiograÍia resultante
sangüínea ligam-sea cornbinantes. Em
moléculas da proteína mar-
ajudam a cada A, o próprio
(b) Anticorpos puriF rrüicorpo pode ser
cados podem ser nmarcado ou, alter-
Srnal positivo = recombinante
dos de um pequeno sintetiza a proteína clonada
volume de sangue re gundo anticorpo
tirado de um coelho mnnrcado que se li-
injetado com a especificamente
na exógena. primeiro anticor-
p pode ser usado.
186 T. A. Bnowr.r
O problema da expressão gênica

A sondagem imunológica depende do fato de o gene clonado estar sendo expressado, de mo-
do que o produto protéico traduzido esteja presente nas células recombinantes. Entretanto, co-
mo será discutido em maiores detalhes no Capítulo 13, um gene de um determinado organis-
mo geralmente não é expressado em um organismo diferente. Em particular, é bastante impro-
vável que um gene clonado de um animal ou planta (com exceção dos genes dos cloroplastos)
seja expressado em células de E. coli. Esse problema pode ser contornado empregando-se um
tipo especial de vetor, chamado de vetor de expressão (p.279), destinado especificamente a
promover a expressão do gene clonado em um hospedeiro bacteriano. A sondagem imunolô
gica de colônias de E. coli recombinantes, contendo genes animais clonados em vetores de ex-
pressão, tem, de fato, sido muito útil para a obtenção de genes de viírios hormônios importan-
tes.
Leituras adicionais
Benton, W.D. & Davis, R.W. (1977) Screening ì,gt recombinant clones by hybridization to single plaques in sinr-
Science, 196, I 80-82.
Dyson, N.J. & Brown, T.A. (2001) Immobilization of riucleic acids and hybridization analysis. ln'. Essential Moleculs
A reação em
Biology: A Practical Approach, Yol.2 (ed. T.A. Brown), 2nd edn. In press.IRL Press at Oxford University Press.
187
Oxford.
PCR em deta
Feinberg, A.P. & Vogelstein, B. (1983) A technique for labelling DNA restriction fragments to high specific activity.
Analytical Biochemistry, 132,6-13. [Marcação com iniciadores aleatórios (random priming).f
Grunstein, M. & Hogness, D.S. (1975) Colony hybridization: a method for the isolation of c'loned cDNAs that co*'
tain a specihc gene. Proceedings of the National Academy of sciences of the usA, 72, 3961-5. Como resu
Gubler, U. & Hoffman, B.J. (1983) A simple and very efficient method for generating cDNA libraries. Ganc"
básicos da
2s,263-9-
Thorpe, G.H.G., Kricka, L.J., Moseley, S.B. & Whitehead, T.P (1985) Phenols as enhancers of the chemiluminesceil como a an
horseradish peroxidase-luminol-hydrogen peroxide reaction: application in luminescence-monitored enzym DNA_DN
immunoassays. Ctinical Chemistry,3l, 1335-41. [Descreve o princípio do método de marcação não-radioatirt-l da princip:
Young, R.A. & Davis, R.W. (1983) Efficient isolation of genes by using antibody probes. Proceedings of the Nati* glès polym
nalAcademy ofSciences ofthe USA,80, ll94-8.
que uma cl
tas vezes p
mas que p(
Este ca
se entenda
vante, segl
volvidos p
A reação
A reação e
umamolá
desde que
extremidar
cleotídeos
dupla (Fig
síntese de
Via de
ticus. Con
sendo expressado, de
Cnpírulo 9
recombinantes. Entretanto,
de um determinado
particular, é bastante i
A Reação em Cadeia da Polimerase
dos genes dos clorop
contornado empregando- se
)- destinado especifica
iano. A sondagem i
clonados em vetores de
vários hormônios im
to single plaques in
analysis. ln: Es s ential

IRL Press at Oxford University A reação em cadeia da polimerase em linhas gerais, Problemas com a freqüência de erro da DNA-
187 polimerase de Taq,200
fragments to high specific PCR em deLalhes, 190
r random priming).1
i:olation of cloned cDNAs that
usA.72.396t-s.
generating cDNA libraries, Como resultado dos últimos sete capítulos, tornaram-se familiares não apenas os princípios
básicos da clonagem de genes, mas, também, as técnicas fundamentais da biologia molecular,
a-s enhancers of the chemi como a análise por restrição, a eletroforese em gel, a marcação do DNA e a hibridização
in luminescence-monitored
DNA-DNA. Para completar o estudo básico de análise do DNA, é retomada, agora, a segun-
metodo de marcação não-
probes. P roc e edin g s of the da principal técnica para o estudo dos genes, a reação em cadeia da polimerase (PCR, do in-
glès polymerase chaín reaction). A PCR é uma técnica muito simples: tudo o que acontece é
que uma curta região de uma molécula de DNA, um único gene, por exemplo, é copiada mui-
tas vezes por uma enzima DNA-polimerase (Figura 1.2). Esse parece ser um exercício trivial,
mas que possui múltiplas aplicações em pesquisas genéticas e em amplas áreas da biologia.
Este capítulo inicia com uma visão geral sobre a reação em cadeia da polimerase, para que
se entenda exatamente qual o seu alcance. Posteriormente, será abordada a metodologia rele-
vante, seguindo os passos envolvidos na PCR e os métodos especiais que vêm sendo desen-
volvidos para o estudo dos fragmentos de DNA amplificados que são obtidos.
1 A reação em cadeia da polimerase em Iinhas gerais

A reação em cadeia da polimerase resulta na amplificação seletiva de uma região escolhida de
uma molécula de DNA. Qualquer região de qualquer molécula de DNA pode ser selecionada,
desde que as seqüências nas extremidades dessa região sejam conhecidas. As seqüências das
extremidades devem ser conhecidas porque, pararealizar uma PCR, dois pequenos oligonu-
cleotídeos devem hibridizar com a molécula de DNA, um com cada uma das htas da hélice
dupla (Figura 9.1). Esses oligonucleotídeos, que atuam como iniciadores para as reações de
síntese de DNA, delimitam a região que será amplificada.
Via de regra, a amplificação érealizadapela enzima DNA-polimerase I de Thermus aqua-
ticus. Conforme mencionado na página 68, esse organismo vive em ambientes quentes e mui-
188 T.A. Bnown
3' 5'
5'
5',
3',
Adição dos oligonucleotídeos

iniciadores
3'
5' 3' Figura 9.1

Hibridização dos oligo-
Região a ser ampliÍicada nucleotídeos i
com o DNA-molde no
início de uma PCR.
tas das suas enzimas, incluindo a polimerase de Taq, são termoestáveis, o que significa
tência à desnaturação pelo calor. Como se tornará evidente a seguir, a termoestabilidade
polimerase de Taq é essencial para a metodologia da PCR.
Para iniciar uma amplificação por PCR, a enzima é adicionada ao DNA-molde
aos iniciadores e incubada, para que sintetize as novas fitas complementares (Figura 9.2a
mistura é então aquecida a94"C, para que as fitas recém-sintetizadas separem-se do Figura 92
(Figura 9.2b) e, posteriormente resfriadas, permitam que mais iniciadores hibridizem ffi,mea@o em ca-
suas respectivas posições, incluindo aquelas das novas fitas sintetizadas. A polimerase de dhiada polimera-
que, diferentemente da maioria dos tipos de DNA-polimerases, não é inativada pelo úlTPs =2'4e-
agorarealiza uma segunda rodada de síntese de DNA (Figura 9.2c). O ciclo
bridização-síntese é repetido, geralmente 25 a3o vezes, resultando, ao final, na síntese de ffiosÍiatos.
tenas de milhões de cópias do fragmenro de DNA amplificado (Figura 9.2d).
Ao término de uma PCR, uma amostra da mistura de reação é geralmente anâiisada
eletroforese em gel de agarose; DNA suficiente foi produzido para que o fragmento amplifica
cado seja visível como uma banda discreta após a coloração com brometo de etídio de bacter
9.2e). A própria análise pode fornecer informações úteis a respeito da região de DNA que mo o seqì
I
CLoruncev GÊrurcn e ANÁLrsE oe DNA 189
3' 5'
ffi
r
5' 3',
,5'
@
5',
\ 3' (a) Adição da DNA-potimerase
\ de lag+dNTPs
ffi
t--,--,-.,--,--,--,--,--,.-,--,--,--,a
Síntese da Íita nova
É:rrrrrrrr -rFl?|ll,,
/
/
I
(b) Desnaturação
I
|
I
(c) Segundo ciclo de síntese
@
Figura 9.1
Hibridização dos oligo
nucleotídeos inici
com o DNA-molde no
início de uma PCR.
(d) Demais ciclos (e) Visualização do produto
is, o que signifìca Produto da PCR : :

seguir, a termoestabilidade
ao DNA-molde
(Figura 9
separem-se do Figura 9.2 ACÚMULO EXPONENCIAL
,/\
iniciadores hibridizem A reação em ca- DE FRAGMENÏOS AMPLIFICADOS Marcadores Gel de agarose
de tamanho
A polimerase de ia da polimera-
APOS 30 CICLOS:
não é inativada pelo ôlTPs =2'-de-
228 = 268.435.456 FRAGMENTOS
9.2c). O ciclo desnatu
ao final, na síntese de trifosÍatos.
(Figura 9.2d).
é geralmente analisada
para que o fragmento amplificada ou, alternativamente, o produto da PCR pode ser ligado a um vetor plasmidial ou
com brometo de etídio ( de bacteriófago, clonado pelo método normal e examinado por meio de técnicas-padrão, co-
ito da região de DNA que mo o seqüenciamento de DNA.
190 T.A. BRowN
9.2 PCR em detalhes

Embora experimentos com PCR sejam de muito fácil execução, é necessário um planej:
to cuidadoso, caso espere-se que os resultados tenham algum valor. As seqüências dos i
dores são críticas para o sucesso do experimento, assim como a precisão das te
lizadas nos estágios de aquecimento e resfriamento do ciclo da reaçáo. Há também a i
tante questão sobre o que pode ser feito com as moléculas de DNA amplificadas, uma vez
tidas.
9.2.1 Determinação dos oligonucleotídeos iniciadores para uma pcR

os iniciadores são a chave do sucesso ou da falha de um experimento de pcR. Se forem
jetados corretamente, o experimento resulta na amplificação de um único fragmento de
correspondente à região-alvo da molécula-molde. Se os iniciadores forem projetados de Figura 9,
do incorreto, o experimento fracassará, possivelmente porque a amplificação não de in'lciadon
possivelmente porque um fragmento errado, ou mais de um fragmento, será amplificado para ampli
gura 9.3). Obviamente, grande parte do planejamento deve ser destinada à determinação da u"glot
iniciadores. ftfi.nrano. Os éxot
Desenvolver as seqüências apropriadas para os iniciadores não é um problema: elas sao mostraú
fecfi
corresponder às seqüências das extremidades da região-alvo da molécula-molde. Cada ini
dor deve ser complementar (mas não idêntico) à sua fita-molde para que a hibridização üm, cíntrons, con
melârpulos aberto
..
ocoffer, e as extremidades 3' dos iniciadores que hibridizaram devem apontar uma em dire
(Figura 9.4r. o fragmento de DNA a ser amplificado não devó ter mais do que ct
i à outra
de 3 kb de extensão e, idealmente, é inferior a 1 kb. Fragmentos de mais de l0 kb podem
I amplificad
ciente é a a
ficação de
especiais-
O ptin
Marcadores pequenos-
de tamanho indesejadr
um experi
dos, na ter
rios fragm
esses inici
tios possír
Isso signil
único e es
O que
9.4, fosser
acada4t'-
Figura 9.3 genoma h
Os resultados das PCRs com iniciadores bem e pobremente planejados. A linha 1 mostra sítio de hi
um único fragmento amplificado do tamanho esperado, resultante de um experimento bem ria, portar
realizado. Na linha 2, não há produto de ampliÍicação, sugerindo que um ou ambos os inicia- Por qu
dores Íoram incapazes de hibridizar com o DNA-molde. As linhas 3 e 4 mostram, respectiva o compú
mente, um produto de amplificação de tamanho incorreto e uma mistura de produtos (o pro iniciadort
duto certo mais dois produtos errados);ambos os resultados devem-se à hibridização'de urn
mero de n
ou dos dois iniciadores em sítios que não os alvos da molécula de DNA-molde.
CLonnceu GÊNrcA E AruÁuse oe DNA 191
Gene da o1-globina humano
é necessário um
. As seqüências dos ini T
roo nn
isão das temperaturas \
reação. Há também a i \
amplificadas, uma vez \
...G TG TC ÏGA GTC TC TCT TGGG TGG..
@
para uma PCR 5', J
5' ...C A C A G A C T C A G A G A G A A C C C A C C...

de PCR. Se forem
único fragmento de
forem projetados de
-
Figura 9.4
amplificação não ocorrená, par de iniciadores
nto, será amplificado para amplifi-
inada à determinação o gene da a,-globi- ...A TGGGGGCACCAGAA AC T TA T T T... 5'
mB humano. Os éxons 3',
é um problema: elas
écula-molde. Cada inici
são mostrados
rmn retângulos fecha-
..,T
@
ACCC CC GTGG TC T T TGAA TA 4A...3,
üs, os íntrons, como
Fra que a hibridização retângulos abertos.
apontar uma em di
deve ter mais do que
de mais de l0 kb podem
amplihcados por técnicas-padrão de PCR, porém, quanto mais longo o fragmento, menos efi-
ciente é a amplificação e mais difícil torna-se a obtenção de resultados consistentes. A ampli-
ficação de fragmentos muito extensos - com cerca de 40 kb - é possível, mas requer métodos
especiais.
O primeiro ponto importante a ser definido é o tamanho dos iniciadores. Se forem muito
pequenos, podem hibridizar com sítios que não os alvos e originar produtos de amplificação
indesejados. Para ilustrar essa questão, imagine que o DNA humano total seja utilizado em
um experimento de PCR com um par de iniciadores de 8 nucleotídeos de extensão (chama-
dos, na terminologia do PCR, de "8-mers"). O resultado provável seria a amplificação de vá-
rios fragmentos diferentes. Isso acontece porque se espera que ocorram sítios de ligação para
esses iniciadores, em média, a cada 48 = 65.536 pb, originando, aproximadamente, 46.000 sí-
tios possíveis na seqüência de nucleotídéos de 3.000.000 kb que constitui o genoma humano.
Isso signiÍìca que seria muito incomum que um par de iniciadores de S-mers originasse um
único e específico produto de amplificação para o DNA humano (Figura 9.5a).
O que aconteceria se os iniciadores de 17 nucleotídeos de extensão, mostrados na Figura
9.4, fossem utilizados? A freqüência esperada para uma seqüência de 17 nucleotídeos é de I
a cada 411 = 17 .179.869 .184 pb. Esse tamanho é cerca de cinco vezes maior que a extensão do
genoma humano, logo se esperaria que um iniciador de 17 nucleotídeos tivesse somente um
lnejados. A linha 1 mostra sítio de hibridização no DNA humano total. Um par de iniciadores de l7 nucleotídeos deve-
lüe de um experimento bem ria, portanto, originar um produto de amplificação único e específico (Figura 9.5b).
b que um ou ambos os inicia. Por que simplesmente não se desenvolvem iniciadores tão longos quanto possível? Porque
ls 3 e 4 mostram, respectirra o comprimento do iniciador influencia o ritmo no qual ele se hibridiza com o DNA-molde;
i mistura de produtos (o pro I
iniciadores longos hibridizam em um ritmo mais lento. A eficiência da PCR, medida pelo nú-
híem-se à hibridização de mero de moléculas amplificadas produzidas durante o experimento, é, conseqüentemente, re-
de DNA-molde. il
:
192 T. A. Bnowlr
(a) PCR de DNA humano com iniciadoÍes de 8

nucleotídeos de extensão
Sítios de hibridização
/l \
3'- J ,/ l\
r_ \ 5'
1 kb vanos pares 0e rntcladores podem

originar produtos de ampliÍicação
(b) PCR de DNA humano com iniciadores de 17

nucleotídeos de extensão
3', 5'
Figura 9.5 Figun

Apenas o Íragmento desejado O comprimento dos iniciadores é lültmperfil de temPen
é ampliÍicado crítico para a especiÍicidade da típico para uma t
PCR.
xa, híbridor
duzida se os iniciadores forem muito longos, pois a hibridização completa com as moléculm dos - são e
do molde não pode ocorrer no tempo permitido durante o ciclo da reação. Na prática, inicia. mento apn
dores de mais de 30 nucleotídeos de extensão são raramente utilizados. dos perfeit,
g.2.2 Estabelecimento das temperaturas corretas a serem utilizadas reamento f
aumenta si
Durante cada ciclo de uma PCR, a mistura de reação é submetida a três temperaturas (Figura não os alvt
e.6): A temp
entre o inir
(1) A temperatura de desnaturação, geralmente 94'c, a qual quebra os pares de bases e lidos incom
bera as fitas únicas de DNA para atuarem como moldes na próxima rodada da síntese de peratura (
DNA. de.AZ.é
(2) A temperatura de hibridização ou de anelamento, na qual os iniciadores aderem-se ao,s se ("derret
moldes. mitir que r
(3) A temperatura de extensão, na qual ocorre a síntese do DNA. É comumente determina- brido com
da em74"C,logo abaixo da temperatura ótima para a DNA-polimerase de Taq. rém, mais
A temperatura de anelamento é a mais importante, pois pode afetar a especificidade da T^ = (4x

reação. A hibridização DNA-DNA é um fenômeno dependente da temperatura. Se a tempe-
ratura for muito elevada, nenhuma hibridização ocorrerá e, ao contrário, os iniciado.", o, na qual [G
moldes permanecerão dissociados (Figura 9.7a).Entretanto, se a temperatura for muito "bai- mero de nr
CLorunceu GÊNrcA E Ar.rÁr-rse oE DNA 193
Desnaturação
(1 min)
()
(ú I Extensão
l
670 I (2 min)
o
o-
E
.(l)
F
9-5 Figura 9.tr

dos iniciadores é üllm perfil de temperatura
para a especiÍicidade da típico para uma PCR.
xa, híbridos incorÍetos - aqueles em que nem todos os pares de bases são corretamente forma-
completa com as
dos - são estáveis (Figura 9.7b). Caso isso aconteça, os ciilculos prévios a respeito do compri-
da reação. Na prática, in
mento apropriado dos iniciadores tornam-se irrelevantes, pois presumia-se que apenas híbri-
dos perfeitos entre iniciadores e moldes fossem çapazes de ser formados. Se os erros de pa-
reamento forem tolerados, o número de potenciais sítios de hibridização para cada iniciador
serem utilizadas aumenta significativamente e há maior tendência de que a amplificâção ocorra em sítios que
a três temperaturas (Fi não os alvos da molécula-molde.
A temperatura ideal de anelamento deve ser baixa o suficiente para permitir a hibridização
entre o iniciador e o molde, mas alta também o suficiente para prevenir a formação de híbri-
quebra os paÍes de bases e dos incorretos (Figura 9.7c). Essa temperatura pode ser estimada pela determinação da tem-
próxima rodada da síntese peratura de fusão ou T-(do inglês melting temperature) do híbrido entre o iniciador e o mol-
de. A Z- é a temperatura na qual os híbridos com as bases corretamente pareadas dissociam-
os iniciadores aderem-se se ("derretem"): uma temperatura
!3ïC abaixo dessa deve ser baixa o suficiente para per-
mitir que os híbridos corretos formem-se, porém igualmente muito elevada para que um hí-
A. E comumente dete brido com um único erro seja estável. A Z. pode ser determinada de forma experimental, po-
-polimerase de Taq. rém, maiícomumente, é calçulada a partii ãa fórmula simples (Figura 9.8):
afetar a especificidade T^ = (4x [G + C\ + (2x [Á + fl)"C,

da temperatura. Se a
contriírio, os iniciadores e naqual[G+QéonúmerodenucleotídeosGeCnaseqüênciadoiniciadorelA+Tféonú-
a temperatura for muito bai- mero de nucleotídeos A e T.
194 T.A.Bnown
Portail
(a)Temperatura de anelamento muito elevada cálculo da
da. Note-s
lniciadores e moldes tenham I-
permanecem dissociados iniciador p
Á4
a ) Após a P
^-attt
A reação e
perimento
recer irtfor
tudos dess
(b)Temperatura de anelamento muito baixa nagem gêr
variedade
técnicas v
aít----"-'''fr
B (1) Eletr
(2) Clor
(3) Seqi
-R...--,'" Hibridização incorreta -
nem todos os pares As dut
\ de bases corretos
tulo 10, qr
\ foram Íormados
__ FTl'Tlì EletroÍo
Conforme
rif,rcados I
(c) Temperatura de anelamento coÍÍeta Umabanc
dé etídio r
hibridizaç
,-----(tt-"'ta nais estivt
B Figura 9.7
A temperatura exer@
Emall
um importante eÍeito se um exl
A iniciação ocorre
apenas nos sítios- sobre a hibridização Por exeml
alvo desejados dos iniciadores com o determina
DNA-molde. restrição,
análise d,
restrictiot
nômicos (
Alterr
Seqüência do iniciador: 5' AGACTCAGAGAGAACCC 3' se o DNA
4Gs 5Cs 7As 1T gura 9.9).
profiling',
Em al
I,=(4x9) +(2xB)
diagróstir
= 36 + 16
identifica
Realizar I
= 52oC Figura 9-8 rém uma
Cálculo da I,de um iniciador. muitasF(
zida pela
Crouecev GÊrurcn e ANÁLtsE oe DNA 195
Portanto, a temperatura de anelamento para um experimento de PCR é determinada pelo

cálculo daT^para cada iniciador, utilizando-se uma temperatura I a2"C inferior à encontra-
da. Note-se que isso significa que os dois iniciadores devem ser determinados de modo que
tenham Çs idênticas. Se não for esse o caso, a temperatura de anelamento apropriada para um
iniciador pode ser muito elevada ou muito baixa para o outro membro do par.
Após a PCR: estudo dos produtos da PGR

A reação em cadeia da polimerase geralmente é o ponto de partida para longas séries de ex-
peripentos, nas quais o produto de amplificação é estudado de várias maneiras, a fim de ofe-
recer informação a respeito da molécula de DNA que atuou como molde original. Muitos es-
tudos desse tipo encontram-se nas partes 2 e 3, quando são examinadas as aplicações da clo-
nagem gênica e das análises de DNA nas pesquisas e na biotecnologia. Embora uma ampla
variedade de procedimentos tenha sido desenvolvida para o estudo dos produtos da PCR, três
técnicas são particularmente importantes.
*\
(1) Eletroforese em gel dos produtos da PCR. I
(2) Çlonagem dos produtos da PCR. ì
(3) Seqüenciamento dos produtos da PCR.
)
As duas primeiras técnicas são descritas neste capítulo. A terceira será adiada aÍé o Capí-
tulo 10, quando serão abordados todos os aspectos do seqüenciamento de DNA.
EletroÍorese em gel dos produtos da PCR
Conforme indicado na Figura 9.2, os resultados da maioria dos experimentos de PCR são ve-
rificados fazendo-se migrar uma porção da mistura de reação amplificada em gel de agarose.
Uma banda representativa do DNA amplificado deve ser visível após coloração com brometo
dé etídio ou, se a produção de DNA for baixa, o produto pode ser detectado pelo método de
hibridização de Southern (p. 201). Se a banda esperada estiver ausente ou se bandas adicio-
Figura 9.7 nais estiverem presentes, algum erro ocorreu e o experimento deve ser repetido.
A temperatura Em alguns casos, a eletroforese em gel de agarose é utilizada não apenas para determinar
um importante efeib se um experimento de PCR funcionou, mas também para oferecer informações adicionais.
sobre a hibridização Por exemplo, a presença de sítios de restrição na região amplificada do DNA-molde pode ser
dos iniciadores com determinada por intermédio do processamento do produto da PCR com uma endonuclease de
DNA-molde. restrição, antes de fazer a amostra migrar no gel de agarose (Figura 9.9). Fsse é um tipo de
análise de polimorfismos de comprimento de fragmentos de restrição (RFLP, do inglês
restriction fragment length polymorphism) e é importante tanto na construção de mapas ge-
nômicos (p.262) quanto no estudo de doenças genéticas (p. 311).
Alternativamente, o tamanho exato do produto da PCR pode ser utilizado para estabelecer
se o DNA-molde contém alguma mutação de inserção ou deleção na região amplificada (Fi-
gura 9.9). As mutações de comprimento desse tipo formam a base do perfïl do DNA (DNÁ
proftling), uma técnica central na ciência forense (Capítulo 16).
Em alguns experimentos, a simples presença ou ausência do produto da PCR tem caráter
diagnóstico: por exemplo, quando a PCR é utllizada como um procedimento de seleção para
identificar um gene desejado em uma biblioteca genômica ou de DNA complementar (cDNA).
Realizar PCRs com cada clone em uma biblioteça genômica parece ser uma tarefa tediosa, po-
b rém uma das vantagens da PCR é que experimentos individuais são rapidamente montados e
h 7-de um iniciador. muitas PCRs podem ser executadas paralelamente. A carga de trabalho também pode ser redu-
zidapela sondagem combinatória, um exemplo da qual é mostrado na Figura 9.10.
196 ï A. Bnowlr
.L-
O-\-
t, Figura 9.9
A eletroÍorese err
\
PCR '+\
- \
PCR
--.
.L- gel do produto da

PCR pode
informações sobru
/ a molécula de
\
Clivagem
DNA-molde. As F
nhasle2mos-
tram, respectiva-
t- f- mente, um
de PCR não-clirra
Marcadores de tamanho do e um prodúo
clivado com urìa
enzima que cliva
no sítio R. A
mostra o
obtido quando o
DNA-molde corr
tém uma inser@
na região ampliÊ
cada.
Clonagem dos produtos da PCR

Algumas aplicações necessitam que, após a PCR, os produtos resultantes sejam ligados a
vetor e examinados por qualquer um dos métodos-padrão utilizados nos estudos de c
do DNA. Isso pode parecer fácil, entretanto há complicações.
O primeiro problema diz respeito às extremidades dos produtos da PCR. Ao se exarni
a Figura 9.2, é possível pensar que os fragmentos amplificados por PCR possuam
des cegas. Se assim fosse, eles poderiam ser inseridos em um vetor de clonagem por li
cega entre as extremidades ou, de modo alternativo, os produtos da PCR poderiam receber
tremidades coesivas pela união com moléculas de ligação ou adaptadores (p. 88). Infelì
te, a situação não é tão simples. A DNA-polimerase de Thq tende a acrescentar um
deo adicional, em geral uma adenosina, à extremidade de cada fita que ela sintetiza. Isso
nifica que um produto de PCR de fita dupla não possui extremidades cegas e, ao contrári
maioria das terminações 3'possui um único nucleotídeo sobressalente (Figura 9.11). Os
cleotídeos sobressalentes poderiam ser removidos pelo tratamento com uma enzima
Figura 9-10
clease, resultando produtos de PCR com extremidades cegas verdadeiras, porém essa A sondagem cr
uma conduta popúlar, pois é difícil de impedir que a exonuclease se torne hiperativa e nes é sondada
outros danos às extremidades das moléculas. nações de don
Uma solução é utilizar um vetor de clonagem especial, que contenha timidinas (T) positivo(s) seia
salentes e que, conseqüentemente, possa ser ligado ao produto da PCR (Figura 9. 1 2). En plaa2, na linh
ral, tais vetores são preparados segundo a restrição de um vetor-padrão em um sítio de deduzir que exi
nação cego e depois tratado com a DNA-polimerase de Taq, somente na presença de 2' ção não é arrü
xitimidina 5'trifosfato (dTTP). Nenhum iniciador está presente, de modo que tudo que a resultados pci
sárias se existir
limerase pode fazer é adicionar um nucleotídeo T às extremidades 3' da molécula cega do
Brown, T. A. (1Í
Ë, .--
&
tt
I
Clorunceu GÊNrcA E ANÁLrsE oe DNA 197
Mistura,
-?.-i.*-*-*-*-#.F,F*? PCR
Figura 9.9 ,",/ ,Á ,-t':-,'" ,:";: :':-:r -,t ,,'" :i,r:t /
A eletroÍorese em 7 ,,*t 1,,"-;t.r,^ ;"r- ,-;.* {+;''' t* .t
gel do produto da {*er*} ,$1 {}}. *t9.ige.6 ï:;w;;.n'l -1' "' ,//
PCR pode : ; ::. w. :. /Ú
inÍormações sobre
a molécula de
DNA-molde. As lF
nhasle2mos- Repetida para todas as linhas em
tram, respectiva' todas as 10 placas = 80 PCRs
mente, um
de PCR
do e um produb
clivado com ufiÌar
enzima que cliva
no sítio R. A
mostra o
obtido quando o
DNA-molde corr'
tém uma inser@
na região amplifr.
cada. Repetida para todas as colunas em
Mistura, PCR
todas as 10 placas = 120 PCRS
Mistura com cavidades A1 de todas as outras I placas, PCR
resultantes sejam ligados a

nos estudos de
da PCR. Ao se e
por PCR possuÍìm
vetor de clonagem por
da PCR poderiam
adaptadores (p. 88). Repetida para todas as cavidades
lende a acrescentar um nuc = 96 PCRs
fita que ela sintetiza. Isso
Total de PCRS = 296
s cegas e, ao
ente (Figura 9.11). Os
com uma enzlma Figura 9.10
verdadeiras, porém essa A sondagem combinatória de clones em placas de microtitulação. Uma biblioteca de 960 clo-
se torne hiperativa e nes é sondada por uma série de PCRs, cada uma com uma combinação de clones. As combi-
nações de clones com resultados positivos permitem que a(s) cavidade(s) contendo clone(s)
contenha timidinas (T) positivo(s) seja(m) identiÍicada(s). Por exemplo, se PCRs positivas são obtidas na linha A da
da PCR (Figura 9.12). Em placa 2, na linha D da placa 6, na coluna 7 da placa 2 e na coluna 9 da placa 6, então se pode
-padrão em um sítio de deduzir que existam clones positivos nas cavidades A7 da placa 2 e D9 da placa 6. Essa dedu-
somente na presença de 2' ção não é ambígua e pode ser feita sem que se realizem as PCRs nas cavidades (que teriam
resultados positivos para as cavidades A7 e D9). As PCRs das cavidades somente são neces-
de modo que tudo que a
sárias se existirem dois clones positivos na mesma placa. (Reproduzida com permissão de
3' da molécula cega do
Brown, T. A. (1999) Genomes. BIOS Scientific Publishers, OxÍord.)
198 T. A. Bnowrl
eficientemente
5', 3' é limitada àqut
Figura 9.11
AGAC TC AGA..............,,.......,...AAC T T A TT T A sentes no DNI
ttttttltt lllllllll Polinucleotídeos sintetizados pela
A TC TGAG TC T........,.,......,.........T TGA A T A AA tensão da extn
q,'
DNA-polimerase de laq geralmente
possuem uma adenosina extra nas zar com a mol
suas terminações 3'. PCR que poss,
Produto da PCR
Vetor com
a cauda de T
Figura 9.13
Obtenção de um
produto de PCR
@ín uma extremida-
de coesiva Pelo uso
ú um iniciador cuia
seqüência inclui um
sítio de restrição.
Figura 9.12
Utilização de um vetor especial com uma
cauda de T para clonar um produto de
PCR.
tor, resultando em um vetor com uma cauda de I na qual os produtos da PCR podem ser in-
seridos. Fi
Um iniciador de PCF
Uma segunda solução é desenvolver iniciadores que possuam sítios de restrição. Depois
de restrição Present
da PCR, os produtos são tratados com uma endonuclease de restrição que, ao clivar cada mo-
extensão na extrel
lécula na seqüência iniciadora, gera fragmentos com extremidades coesivas, que podem ser
Cloruneeu GÊNrcA E ANÁLrsE DE DNA 199
eficientemente ligados em um vetor de clonagem padrão (Figura 9.13). Essa abordagem não
é limitada àquelas circunstâncias nas quais os iniciadores transpõem os sítios de restrição pre-
sentes no DNA-molde. Pelo contrário, o sítio de restrição pode ser incluído em uma curta ex-
sintetizados pela
de ïag geralmente tensão da extremidade 5'de cada iniciador (Figura 9.14). Essas extensões não podem hibridi-
adenosina extra nas zar com a molécula-molde, porém são copiadas durante a PCR, resultando em produtos de
PCR que possuem os sítios de restrição terminais.
Seqüência do iniciador
5', 3',
CTCTGGATCCAGATATG
Produto resultante da PCR
C TCT G G ATC
I tt trr
CAGAT
r r r rl ll
A T G.....
I I I I
AGAGAC C TA G GT CT A T A C.,,..
A extra
Figura 9.13
(Dtenção de um
produto de PCR GATCCAGATATG,..,
llllllll
extremida- GTCTATAC,,,.
iva pelo uso
iniciador cuja Extremidade
ia inclui um
. coesiva
sïb de restrição.
um vetor especial com

clonar um produto de DNA-molde
3' ...GTG TC TGAG TC TC TCT TGGGTGG..
IrìrïililìÌtÌllïÌ
da PCR podem
Figura 9.14 lniciador
sítios de restrição. lúiador de PCR com sítio

nestrição presente em uma 5'
ição que, ao clivar cade
,r#nsão na extremidade 5'
s coesivas, que podeu
a-
200 T. A. BRowN
9.3 Problemas com a Íreqüência de erro da DNA-

polimerase de fag
Todas as DNA-polimerases cometem erros durante a síntese do DNA, ocasionalmente
rindo um nucleotídeo incorreto na fita de DNA em crescimento. A maioria das poli
entretanto, é capaz de corrigir tais erros, retornando a eles e ressintetizando a seqüência
reta. Essa propriedade é conhecida como uma função de " leitura de revisão" e está na
dência da polimerase possuir uma atividade de exonuclease no sentido 3'para 5' (p. 6a).
A DNA-polimerase de Taqparece não possuir a atividade de leitura de revisão e, como Íê-
sultado, é incapaz de corrigir seus eÍros. Isso significa que o DNA sintetizado pela DNA
limerase de Taq nem sempre é uma cópia acurada do DNA-molde. O índice de erro tem
estimado em I para cada 9.000 nucleotídeos de DNA sintetizados, o que pode paÍecer q
insignificante, mas que se traduz em 1 erro a cada 300 pb para os produtos da PCR
após 30 ciclos. Isso porque a PCR envolve cópias feitas de cópias das cópias, de modo que
erros induzidos pela polimerase gradualmente se acumulam e os fragmentos produzidos ao
nal de uma PCR contêm cópias dos erros iniciais, além de quaisquer outros novos erros i
duzidos durante a rodada final de síntese.
Para muitas aplicações, esse alto índice de erro não representa um problema. Em parti
lar, o seqüenciamento direto de um produto de PCR (p.216) providencia a seqüência
do molde, mesmo que os produtos da PCR contenham os erros introduzidos pela DNA-
merase deTaq.Isso ocorre porque os eÍros são distribuídos aleatoriamente, logo, para
molécula que possua um eÍro em um nucleotídeo em uma determinada posição, haverá
tas moléculas com a seqüência correta. Nesse contexto, a freqüência de erro é, de fato, insi
nificante.
lsso não acontece se os produtos da PCR forem clonados. Cada clone resultante
múltiplas cópias de um único fragmento amplihcado, logo o DNA clonado não possui,
sariamente, a mesma seqüência da molécula-molde original utilizada na PCR (Figura 9.1
Figura 9.15
Tal possibilidade gera uma incerteza para todos experimentos realizados com produtos AÍreqüência eleva-
PCR clonados e determina que, sempre que possível, o DNA amplificado deva ser da de erro da DNA-
diretamente em vez de ser clonado. polimerase de Taq
lffina-se importante
,qpiando os produtos
rlas PCRs são clo-
nados.
Leituras adicio
Marchuk, D., Dn
for direct clc
Rychlik, W., Spe
invitro. Nuc
Saiki, R.K., Gelf
table DNA p
CLorunceu GÊrurcn e AtÁuse oe DNA
NA.
Produtos de fita dupla
da PCR
DNA, ocasionalmente -"------*t-rigação
A maioria das em ( \
um vetor \
'/ -*.-
rintetizando a seqüência /
de revisão" e está na de
'f-->'- \ /
I \---"
hentido 3' paras' (p. 6a). --j"- 1</(\
ileirura de revisão e. comorE
[A 5intetizado pela DNA-p Errosemposições /
p. \ \ i
O índice de erro rem siü aleatórias/\\/
fos. que pode parecer qrnr
fos
o
produtos da PCR obriü \\---l I \---l
fs das cópias. de modo quec Motécutas de DNA
Fagmentos produzidos ao fi recombinantes
!
fiuer outros novos erros intu ,*"/
I
t
lra um
problema. Em particil
pvidencia a seqüência corrct
pnroduzidos pela DNA-poü
ptoriamente. Iogo, para cail
pinada posição. haverá mli
pcia Ae eno é. de fato. insQ O--a\
i
I
Fada clone resultante cont

fAclonado não possui. nec
lizada na PCR (Figura 9.1
I realizados com produtos Figura 9.15
A Íreqüência eleva-
OÕ Um clone único contém
múltiplas cópias da mesma
foplificado deva ser estud:
Ì
I da de erro da DNA- molécula -
I todas com os mesmos erros
polimerase de Taq
I
: bna-se importante
çrando os produtos
das PCRs são clo-
nados.
ras adicionais
Marchuk, D., Drumm, M., Saulino, A. & Collins, F.S. (1991) Construction of T:vectors, a rapid and general system
for direct cloning of unmodihed PCR products. Nucleic Acids Research, lg, I t 54.
Rychlik, W, Spencer, WJ. & Rhoads, R.E. (1990) Optimization of the annealing temperature for DNA amplification
in vitro. Nucleic Acids Research, 18, 6409- 12.
Saiki' R.K., Gelfand, D.H., Stoffel, S. er ai. (1988) Primer-diÍected enzymatic amplification of DNA with a thermos-
table DNA polymerase. Science, 239,487-91. [A primeira descrição de PCR utilizando polim erase de Taq.]
J
PARTE2
APLTCAçOES DA CLONAGEM
GÊNICA E DA ANALISE DE DNA
NA PESQUISA
l,
r!
Cnpírulo 10
Estudando a Localizaçáo e a
Estrutura do Gene
Como estudar a localização de um gene, 205 Seqüenciamento de DNA: revelando a estruturâ de

um gene, 2l I
A Parte I deste livro mostrou como um experimento de clonagem habilmente realizado ou

uma reação em cadeia da polimerase (PCR) podem fornecer uma amostra pura de um gene in-
dividual, ou qualquer outra seqüência de DNA, separada dos demais genes e seqüências de
DNA da célula. Agora, a atenção volta-se para as maneiras como a clonagem, a PCR e outras
técnicas de análise do DNA são utilizadas para estudar os genes. Serão considerados três as-
pectos da pesquisa na biologia molecular:
(1) As técnicas utilizadas para estudar a localização e a estrutura de um gene (este Capí-
tulo).
(2) os métodos utilizados para estudar a expressão e função de um gene (capítulo l l).
(3) As várias técnicas coletivamente chamadas de genômicas e pós-genômicas (capítu-
lo 12).
1 Como estudar a localização de um gene

Várias técnicas estão disponíveis para determinar alocalização de um gene em uma molécu-
la de DNA. A natureza precisa do procedimento utilizado depende do tamanho da molécula
de DNA envolvida, com as técnicas aplicáveis para moléculas pequenas, tais como versões
normais e recombinantes de plasmídeos e cromossomos de fagos, sendo diferentes daquelas
utilizadas para alocalização de um gene em moléculas de DNA extensas, pertencentes aos
cromossomos eucarióticos.
I
l
I
ilt
--u
206 T. A. Bnowlr
10.1.1 Localizando a posição de um gene em uma molécula

de DNA pequena
Considere novamente o exemplo da seleção direta utilizado no Capítulo 8, o qual resultou m
gene que confere resistência à canamicina, originado de R6-5, sendo clonado como um frag-
mento de EcoRI portado pelo pBR322 (p. 167). Agora que o clone está disponível, seria bas-
tante útil determinar-se em qual, dentre os 13 fragmentos de EcoRI de R6-5, o gene está lo"
calizado, uma vez que essa informação permitiria que o gene fosse colocado no mapa de rer
trição de R6-5 e posicionado em relação aos outros genes desse plasmídeo.
Primeiramente, uma clivagem de restrição de R6-5 com EcoRI deve ser separada pm
uma eletroforese em gel de agarose, de forma que os fragmentos individuais possam s€ü
identificados (Figura 10.1a). Um desses fragmentos é o mesmo que aquele inserido na nx)-
lécula de pBR322 recombinante, a qual contém o gene que confere resistência à canamÈ
cina. O propósito é, portanto, marcar a molécula recombinante e utilizá-la como sonda ut
reação de clivagem, o que pode ser obtido enquanto os fragmentos de restrição ainda exr-
tão contidos no gel da eletroforese, mas os resultados não são normalmente muito bomi,
uma vez que a matriz do gel produz uma quantidade grande de sinais de hibridização da
fundo inespecíficos, que mascaram o sinal de hibridização específico. Ao contrário, es
bandas de DNA do gel de agarose são transferidas para uma membrana de náilon ou nito-
celulose, fornecendo um ambiente muito mais "limpo" para o experimento de hibridizer-
ção.
A transferência das bandas de DNA de um gel de agarose para uma membrana utiliza
técnica aperfeiçoada eml975 por E. M. Southern e referida como transferência de
(ott Southern-blot). A membrana é colocada sobre o gel e um tampão é forçado a passar
vés dele, carregando o DNA do gel para a membrana, na qual o DNA é ligado. Aparelhos
fisticados podem ser adquiridos para auxiliar esse processo, mas muitos biologistas
lares preferem um dispositivo caseiro, que inclui uma grande quantidade de papéis-toalhe
habilidades de equilíbrio consideráveis (Figura 10.1b). O mesmo método pode também
utilizado para a transferência de moléculas de RNA (transferência de "northern") ou
teínas (transferência de "western' '). Até o momento, ninguém sugeriu uma transferência
"eastern" .
A transferência de Southern resulta em uma membrana que contém uma réplica das
das de DNA do gel de agaÍose. Se a sonda marcada é então aplicada, a hibridização ocorre
uma auto-radiografia (ou um sistema de detecção equivalente para uma sonda não-radioati
revela qual fragmento de restrição contém o gene clonado (Figura l0.lc). Assim é poss
posicionar-se o gene que confere resistência à canamicina no mapa de restrição de R6-5
gura 10.1d).
A transferência de Southern e a hibridização podem ser utilizadas paralocalizar a
ção de um gene clonado, ou um isolado por meio de PCR, dentro de uma molécula de
qualquer, da qual um mapa de restrição foi obtido. Note que essa molécula de DNA
Figura 10.1
ria ser, ela mesma, um plasmídeo ou fago recombinante, com a hibridização de Sou
A hibridização de
utilizada para determinar a posição exata de um gene no fragmento clonado. Isso é i Southern.
tante, pois, com freqüência, o fragmento de DNA clonado é relativamente extenso
exemplo, 40 kb para um vetor cosmidial), enquanto o gene de interesse, presente em
ma parte do fragmento clonado, pode possuir menos que 1 kb de tamanho. Também o 1.2 Localizando
mento clonado pode caÍregar inúmeros genes, além daquele em estudo. As estratégias
de DNA exte
critas no Capítulo 8 para a identificação de um clone a partir de uma biblioteca genômi
podem, pois, ser seguidas por uma análise de Southern da molécula de DNA recomb A hibridização d
para localizar a posição exata, dentro do fragmento clonado, do gene que está sendo do para a molécu
rado (Figura 10.2). a maioria dos plr
I
Cr-oruaceu GÊnrcn r ANÁLrsE oe DNA 2O7
Dlécula
(a) EletroÍorese do DNA de R6-5 clivado com EcoRl
bítulo 8, o qual resu

pdo clonado como um
e está disponível, seria
R.I de R6-5, o gene está
E colocado no mapa de
plasmídeo.
taRI deve ser separada
los individuais possam
lpe aquele inserido na
úere resistência à (b) TransÍerência de Southern
,e utilizála como sonda
htos de restrição ainda

normalmente muito Papéis-toalha
c sinais de hibridização ---1--:--- j Membrana de náilon
pecífico. Ao contrário, --- ou nitrocelulose
inbrana de náilon ou ni
=E-El-f-t,E=
í-';e"t
experimento de hi
furna membrana utiliza Suporte

hansferência de
pãoéforçadoapassar (c) Resultado da sondagem por hibridização
h*a e UgaOo. Aparelhos
huitos biologistas
htiaaAe de papéis
bmétodo pode também
m
r lll llll
|l lll
fude"northern") ou
igeriu uma <sitivo-Írasmento6
htém uma réplica das (d) Posicionamento do Íragmento no mapa de restrição de R6-5
Ha a hibridização
FragmenÌo 6 = posição
luma sonda
h l0.lc). Assim é
a- o"ï;"" n".-
p de restrição de R6-5
Sítios de EcoRl
---
ladas para localizar a
ldr u-u molécula de
h molécula de DNA
Figura 10.1
lhibridização de
A hibridização de
hto clonado. Isso é i
Southern.
blativamente extenso
Lteresse, presente em
ltamanho. Também o
bstudo. As estratégias
1.2 Localizando a posição de um gene em uma molécula
I uma biblioteca de DNA extensa
nrla de DNA recombi A hibridização de Southern é possível somente se um mapa de restrição pode ser determina-
Bene que está sendo do para a molécula de DNA em estudo. Isso significa que o procedimento é apropriado para
a maioria dos plasmídeos, bacteriófagos e vírus, mas não pode ser utilizado paralocalTzar
I
208 T. A. Bnowlr
rede de poros
Molécula de DNA recombinante tamanho podr
- onde está o gene? gressivamenú
que 50 kb nã
As limitar
mais complic
é mais bem il
glès orthogor
longo do con
res de eletrod
Hibridização ra 10.4a). O r
de Southern reção continu
Uma vez r
VETOR léculas de Dì
nos reta (Figr
DNA deve se
pois uma mol
Fragmento de restriÇão mitindo que r
contendo o gene
mensão adicir
Figura 10.2
A hibridização de Southern
ser utilizada para localizar a po.
sição de um gene clonado em
uma molécula de DNA recomt*.
nante.
genes em moléculas de DNA extensas. o mapeamento de restrição torna-se muito

do com moléculas com mais de 250 kb de tamanho, conforÍne pode ser notado se for
a Figura 4.18. Esse exemplo de mapeamento de restrição é bastante direto, uma vez quË
molécula de l, não é muito extensa. Imagine o quanto a análise seria mais complexa se
tisse uma quantidade de sítios de restrição cinco vezes maior. Outras técnicas devem,
to, ser utilizadas para localizar as posições de genes eucarióticos nas moléculas de DNA
mossômico.
Separando cromossomos por meio da eletroÍorese em gel

A primeira questão a formular é: qual cromossomo contém o gene de interesse? para
organismos isso pode ser respondido segundo um tipo especial de hibridização de Sou
envolvendo, em vez de fragmentos de restrição, moléculas de DNA cromossômico i
separadas por um tipo inovador de eletroforese em gel.
Figura 10.3
Na eletroforese em gel convencional, conforme descrita na página 78, o campo elétrico
em gel
tá orientado junto com o comprimento do gel e as moléculas de DNA migram em um linha agarose conven-
ta em direção ao pólo positivo (Figura 10.3a). Moléculas com tamanhos diferentes podem e suas limita-
separadas devido às suas velocidades diferentes, com as quais elas são capazes de migrar ções.
CLouceu GÊNrcA E Ar.rÁr-rse oe DNA 209
rede de poros que compõe o gel. No entanto, somente moléculas dentro de uma certa faixa de
tamanho podem ser assim separadas, pois a diferença na velocidade de migração torna-se pro-
gressivamente menor para moléculas maiores (Figura 10.3b). Na prática, moléculas maiores do
que 50 kb não podem ser eficientemente resolvidas por eletroforese em gel padrão.
As limitações da eletroforese em gel-padrão podem ser resolvidas se um cÍìmpo elétrico
mais complicado é utilizado. Viírios sistemas diferentes foram desenvolvidos, mas o princípio
é mais bem ilustrado pela eletroferese em gel de campo pulsado ortogonal (OFAGE, do in-
glèn orthogonalfield alternation gel electrophoresls). Em vez de ser aplicado diretamente ao
longo do comprimento do gel, o campo elétrico, nesse experimento, alterna-se entre dois pa-
res de eletrodos, cada um ajustado em um ângulo de 45" em relação à extensão do gel (Figu-
ra10.4a). O resultado é um campo pulsado, com as moléculas de DNA no gel trocando de di-
reção continuamente, de acordo com os pulsos.
Uma vez que os dois campos alternam de uma maneira regular, o movimento final das mo-
léculas de DNA no gel ainda é de uma extremidade para a outra, em uma linha mais ou me-
nos reta (Figura 10.4a). No entanto, em cada troca na direção do campo, cada molécula de
DNA deve ser realinhada por 90', antes que a sua migração continue. Esse é o ponto-chave,
pois uma molécula pequena pode realinhar-se de forma mais rápida do que uma extensa, per-
mitindo que a molécula curta progrida em direção à base do gel mais rapidamente. Essa di-
mensão adicional aumenta o poder de resolução do gel um tanto drasticamente, de forma que
(a) Eletroforesê em gel de agarose convencional

Jura 1O.2
fbridização de Southern
e
[úilizada para localizar a
po de um gene clonado em [-,-
p molécula de DNA
Fe
//
//
mroracao Il
M
foão torna-se muito
-----E--
lpode ser notado se for
(b) A inÍluência do comprimento do DNA
lstante direto, uma vez na velocidade de migração
p seria mais complexa se
hrtras técnicas devem,

Ds nas moléculas de DNA
(ú Baixa resolução das

!^ moléculas de DNA acima
$e em gel o< de um determrnado tamanho
CZ
oô
pne de interesse? Para .Eo
lde hibridização de F:
O:i
Resolução adequada das
DNA cromossômico j.c) moléculas de DNA nessa
otõ faixa de tamânho
Figura 10.3 oE
kgina 78, o campo elé em gel
DNA migram em um linha agarose conven- Distância migrada em x horas
panhos diferentes podem e suas limita-
fas são capazes de migrar çoes.
L
21O T.A.Bnowru
moléculas com mais de vários milhares de quilobases de comprimento podem ser separadas- A hibridizaç
Essa amplitude de tamanho inclui moléculas cromossômicas de muitos eucariotos, incluindo cromossom
levedura, viírios fungos filamentosos importantes e protozoários, tal como o parasita da mú[- As técnicas de r
na plasmodiumfalciparum. Géis mostrando os cromossomos desses organismos podem, pa- limitadas aos er
tanto, ser obtidos (Figura 10.4b). culas muito ma
A eletroforese em gel de campo pulsado ortogonal e técnicas relacionadas, tais como on de alguma fom
campos elétricos homogêneos de contornos grampeados (CHEF, do inglês contour clam' moléculas de D
pediomogeneous electric fields) e a eletroforese em gel de campo invertido (FIGE' do in- sui a vantagem
glê,sfietd irwersion gel electrophoresis), são importantes por inúmeras razões' Por exemplo'o do, mas tambér
bNa. a" cromossomos individuais pode ser purificado do gel, possibilitando que conjuntos & A hibridiza
bibliotecas genômicas cromossômicas sejam preparadas. Cada uma dessas bibliotecas, colD' servar cromoss
tendo os genes de somente um único cromossomo, é substancialmente menor e mais fácil & tos organismos
manipular do que uma biblioteca genômica completa. Além disso' moléculas de DNA cÍo" pelo padrão de
mossômicas podem ser imobilizadas em uma membrana de nitrocelulose ou náilon pela tram. fornece uma lo
ferência de Southern e serem submetidas à análise por hibridização. Assim, o c tica de um croÍ
que possuir um gene clonado ou um gene isolado pela PCR pode ser identificado. As células r
com ribonucle
DNA. O parea
mossomos des
'mt
enclausurados
;i_ \
(a) OFAGE da e aplicada à
mossômica hor
ção dessa manr
ca difícil, a hib
meros genes ni
Como uma
\l-' -/
sonda e a hibri
óptico. Se fluc
\1 mesmo tempo
tas de suas flu
inglês fluoresc
jas localizaçõt
estudo de célu
cromossômica
(b) Separação dos cromossomos de identificados r
levedura por meio da OFAGE nicas de colon
tV
XV
Xlll. XVI
-: xtv íiO.2 Seqüencii
---VII,
--tl de um ger
-xl
Provavelmentr
ciamento de f
Figura 10.4 ser determina<
Número do cromossomo
EletroÍorese em gel de camPo Pul* do e eficiente
do ortogonal (OFAGE).
l-
Croxneev GÊrurcn e ANÁLrsE oe DNA 211
podem ser A hibridização in siÍu para visualizar a posição de um gene em um

muitos eucariotos, inc
cromossomo eucariótico
tal como o parasita da
organismos podem, As técnicas de eletroforese em gel não-convencionais, incluindo OFAGE, são, até o momento,
limitadas aos eucariotos inferiores, cujos cromossomos são relativamente pequenos. As molé-
relacionadas. tais culas muito maiores (> 50.000 kb) dos mamíferos e outros eucariotos superiores estão ainda,
, do inglês contour
de alguma forma, além da capacidade da tecnologia atual. A localização de um gene nessas
invertido (FIGE, doi moléculas de DNA extensas pode, no entanto, ser obtida pela hibridização in siÍa, a qual pos-
razões. Por e sui a vantagem adicional de não apenas identificar em qual cromossomo o gene está localiza-
bilitando que do, mas também fomecer informação a respeito da posição do gene no seu cromossomo.
uma dessas bibliotecas- A hibridização in situ deriva das técnicas de microscopia óptica padrão, utilizadas para ob-
menor e mals servar cromossomos em células que estão em processo de divisão (Figura 10.5a). Com mui-
sso, moléculas de DNA tos organismos, cromossomos individuais podem ser reconhecidos por meio de suas formas e
ulose ou náilon pela pelo padrão de bandeamento produzido por vários tipos de corantes. A hibridização in situ
fornece uma localização visual direta de um gene clonado sobre a imagem de microscopia óp-
;ão. Assim, o cr
ser identificado. tica de um cromossomo.
As células são tratadas com um fixador, ligadas a uma lâmina de vidro e, então, incubadas
com ribonuclease e hidróxido de sódio para degradar o RNA e desnaturar as moléculas de
DNA. O pareamento de bases entre as fitas polinucleotídicas individuais é desfeito, e os cro-
mossomos desempacotam-se em um certo nível, expondo segmentos de DNA normalmente
enclausurados dentro da sua estrutura (Figura 10.5b). Uma amostra de gene é, então, maÍca-
da e aplicada à preparação cromossômica. A hibridização ocorre entre o gene e sua cópia cro-
mossômica homóloga, resultando em uma mancha escura em uma auto-radiografia. A posi-
ção dessa mancha indica a localização do gene em seu cromossomo. Embora seja uma técni-
ca difícil, a hibridização in situ com sondas radioativas tem sido úilizadapnaposicionar inú-
meros genes no mapa citogenético humano.
Como uma alternativa à marcação radioativa, um marcador fluorescente pode ser ligado à
sonda e a hibridização observada diretamente, utilizando-se um tipo especial de microscópio
óptico. Se fluorocromos diferentes são utilizados, dois ou mais genes podem ser sondados ao
mesmo tempo, com os diferentes sinais de hibridização sendo distinguidos pelas cores dístiÀ-
tas de suas fluorescências. Essa técnica, hibridização in sítu com fluorescência (FISH, do
inglês fluorescence in sitn hibridization), é também freqüentemente utilizada com sondas, cu-
jas localizações cromossômicas normais já são conhecidas. Isso é particularmente útil para o
estudo de células que sofreram rearranjos cromossômicos. Rearranjo.s, tais como duplicações
cromossômicas, ou a translocação de um segmento de um cromossomo para outro, podem ser
identificados relativamente rápido pela FISH, bem mais rapidamente do que por meio das téc-
nicas de coloração convencionais.
Seqüenciamento de DNA: revelando a estrutura

de um gene
Provavelmente, a técnica mais importante disponível para o biologista molecular é o seqüen-
ciamento de DNA, pelo qual a ordem exata dos nucleotídeos em um segmento de DNA pode
110.4 ser determinada. Somente a partir do final da década de 1970 o seqüenciamento de DNA rápi-
h"r" er gel de campo do e eficiente tornou-se possível.
lgonal(OFAGE).
I
I
I
!
T
È
Ê
I
I
ra'-'
212 T.A.BRowN
10.2.1 O método de I
(a) Cromossomos humanos na metálase
de cadeia
Padrão de
bandeamento O método de termir
t/.r,ts reconhecível a ser seqüenciada t
*4 *Ço,Í*l ,, flï= to por terminação r
Nrly.;:5,,ía
' rnlrV
plementar a um m(
I ^r,t O iniciador
ffi O primeiro Pasn e
-.--------**') / romossomo lamento de um olil

10 pm nante (Figura 10-ú
fita comPlementar,
(b) Hibridização in situ ma relacionada" tal
cada peloSãcïéã6
dupla, a Partir da q
+
/) 3::ffi::i::"'
sição adjacente ao
Síntese da Íita
A reação de síntes
cada um dos quan
f f .Apricação da sonda,
midina 5'-trifosfat
auto-radiografia
fosfato [dCTP]).1
Lâmina de vidro
com as células ra de reação. Esse
\
fixadas rado na cadeia Pc
cleotídeo normal,
cleotídeo não Pos
Esse grupo é nect
deia ocorre, poru
la enzima.
Se didesoxi-l
opostas às timina
Manchas mostram / -'t
meira T, uma vez
a localizaçáo
cromossômica =-qj,/
didesoxinucleoú
de um gene clonado -/o ,4' Figura 10.5
i i ,[/
|,/ -/ \
Cromossomos e
hibridização rn sr
ser polimerizada
ja incorporada- O
I
diferentes, mas c
tu.
Quatro reaçõ
Íitas terminat
A reação de síntr
Duas tecnologias diferentes foram desenvolvidas quase que simultaneamente - o método' com didesoxi-Al
de terminação de cadeia por F. Sanger e A. R. Coulson, no Reino Unido, e o método de degra- soxi-CTP. O resr
dação química por A. Maxam e W. Gilbert, nos Estados Unidos. As duas técnicas são radical- uma famflia cent
mente diferentes, mas igualmente valiosas. Ambas permitem que seqüências de DNA de vrí- do em didesoxi-1
rios quilobases de tamanho sejam determinadas em um tempo mínimo. A seqüência do DNA O próximo p
é, no momento, a primeira e o tipo mais básico de informação a ser obtido, em relação a um tos de cada fita 1
gene clonado. gel, embora as cr
Croruecev GÊrurca e ANÁLtsE oe DNA 213
O método de Sanger-Coulson: nucleotídeos terminadores

de cadeia
O método de terminação de cadeia necessita de um DNA de fita simples e, assim, a molécula
a ser seqüenciada é normalmente clonada em um vetor M13. Isso é porque o seqüenciamen-
to por terminação de cadeia envolve a síntese enzimática de uma segunda fita de DNA, com-
plementar a um molde existente.
O iniciador
O primeiro passo em um experimento de seqüenciamento por terminação de cadeia é o ane-
lamento de um oligonucleotídeo iniciador pequeno Qtrimer) na molécula de M13 recombi-
nante (Figura 10.6a). Esse iniciador atua como o ponto de partida paru arcação de síntese da
fita complementar, realizada pelo fragmento de Klenow da DNA-polimerase I, ou uma enzi-
ma relacionada, tal como a "Sequenase", uma versão modihcada da DNA-polimerase codifi-
cadapeloE@'Lembre.sedequeessasenzimasnecessitamdeumaregiãodefita
dupla, a partir da q'ual iniciam a síntese da fita (p. 68). O iniciador anela no vetor em uma po-
sição adjacente ao sítio de clonagem.
Síntese da Íita complementar

A reação de sínteseda fita complementar é iniciada pela adição da enzima, juntamente com
cada um dos quatro desoxinucleotídeos (2'-desoxiadenosina 5'-trifosfato [dATP], 2'-desoxiti-
midina 5'-trifosfato IdTTP], 2'-desoxiguanosina 5'-trifosfato tdGTPl, 2'-desoxicitidina 5'-tri-
fosfato tdCTPl). Além disso, um único nucleotídeo modificado é também incluído na mistu-
ra de reação. Esse é um didesoxinucleotídeo (p. ex., didesoxi-AlP), o qual pode ser incorpo-
rado na cadeia polinucleotídica em crescimento da mesma maneira eficiente como um nu-
cleotídeo normal, mas que bloqueia o avanço da síntese da fita. Isso é porque o didesoxinu-
cleotídeo não possui o grupo hidroxila na posição 3' da molécula de açúcar (Figura 10.6b).
Esse grupo é necessiírio para que o próximo nucleotídeo seja adicionado; a terminação da ca-
deia ocorre, portanto, em todo o momento em que um didesoxinucleotídeo é incorporado pe-
laenzima.
Se didesoxi-AlP é adicionado na mistura de reação, a terminação ocoffe nas posições
opostas às timinas no molde (Figura 10.6c). Porém, a terminação nem sempre ocorre na pri-
meira I uma vez que dATP normal também está presente e pode ser incorporado, em vez do
didesoxinucleotídeo. Arazão de dATP para didesoxi-ATP é tal que uma fita individual pode
Figura 10.5
ser polimerizada por uma extensão considerável, antes que uma molécuia de didesoxi-AlP se-
Cromossomcü
hibridização in
ja incorporada. O resultado é que uma famflia de fitas novas é obtida, todas de comprimentos
tu. diferentes, mas cada uma terminando em um didesoxi-ATP.
Quatro reações separadas resultam em quatro Íamílias de

Íitas terminadas
úmultaneamente A reação de síntese da fita é realizadaem quatro reações simultâneas. Assim como a reação
- o
com didesoxi-ATP, existe uma com didesoxi-TTP, uma com didesoxi-GTP e uma com dide-
Unido,eométodode
soxi-CTP. O resultado são quatro famflias distintas de polinucleotídeos recém-sintetizados,
Às duas técnicas são radi
uma família contendo fitas em que todas terminam em didesoxi-ATP, uma de fitas terminan-
e seqüências de DNA de
do em didesoxi-TTP, etc.
ínimo. A seqüência do
O próximo passo é separar os componentes de cada família, de forma que os comprimen-
ser obtido, em relação a
tos de cada fita possam ser determinados. Isso pode ser obtido por meio da eletroforese em
gel, embora as condições devam ser cuidadosamente controladas, pois é necessário separar as
214 T. A. Bnowr.r
fitas que diferem em extensão por apenas um nucleotídeo. Na prática, a eletroforese éreaha- ção é introduzida. r
da em géis de poliacrilamida muito hnos (com menos de 0,5 mm de espessura). Os géis cm- tivo (p. e*., "P- on
têm uréia, a qual desnatura o DNA, de forma que as fitas recém-sintetizadas dissociam-se dan experimento.
fitas-molde. Ademais, a eletroforese érealizada em uma voltagem elevada, de maneira queo'
gel é aquecido até 60oC ou mais, garantindo que as fitas não se irão reassociar de forma algu-
Lendo a seqüi
ma. A leitura da seqüê
Cada banda no gel contém somente uma pequena quantidade de DNA, de forma que urn mais, é localizada-
auto-radiografia deve ser utilizada para a visualização do resultado (Figura 10.6d). A marw vido à incorporaçã
essa banda aparec(
qüência é, portantr
A próxima bar
(a) Anelamento do iniciador cleotídeo mais lon
Figura 10.7); o sq
Gene inserido em O processo coi
um vetor M13
M13 nam-se tão aglorn
partir de uma auto
lniciador
b) Didesoxi-ATP
NHr 10.2.2 O método de
I
/-"-"-\" Existem somente r

DNA-polimerase
dATP dTTP 'G-
ï-O-P-?-O-P-o-
P
? cH2
"ó\!l
'l-".-"2"" l-
Sanger-Coulson e
DNA de fita dupla
dGTP dCTP lt ilill ^
didesoxi-ATP ô ô ô !,r"-.-l
Cu pC cial. Tampouco ur
n'ficrc iJ é a síntese de umi
tt
HH reagentes químict
.Posição onde o -OH
(c) Síntese das Íitas de um dNTP foi substituído
por -H
__ qtrltr-r- ___
Novasfitas, -ôiiri
--òii i iii
iii I rr
todasterminamem Jjl r
um didesoxi-ATP --a'r
::_i i ii Didesoxi-ATp
i i
\
\
lniciador
(d) Auto-radiograÍia resultante

-ô
I
lnterpretação da auto-radi
duzida em um experimento
ciamento por terminaçãc
Cada canaleta contém os
Fragmentos menorês
produzidos pelas sínteses
presença de um dos quatro
cleotídeos trifosÍatos (dide
Figura 10.6 A seqüência é lida pela iden
Seqüencia- canaleta em que cada Írag
mento de rece, iniciando-sê com aqr
DNA por ter- grou para mais longe d
minação de gradualmente avançando i
cadeia. autG
CLoNAcEM GÊrutcn e ANÁLtsE oe DNA 215
radioa-
eletroforese é
a ção é introduzida, nas fitas recém-sintetizadas, pela inclusão de um deoxinucleotídeo
t'S-dATP; mistura etapa de síntese das fitas no início do
de espessura). Os géis tivo (p. ex.,"P- ou na de reação na
intetizadas dissociam-se experimento.
elevada, de maneira
irão reassociar de forma
Lendo a seqüência de DNA a partir da auto'radiograÍia
A leitura da seqüência é muito fácil (Figura 10.7). A primeira banda, ou seja, a que migrou
de DNA, de forma que mais, é localizada, a qual representa o menor segmento de DNA, a fita que foi terminada de-
(Figura 10.6d). A vido à incorporação do didesoxinucleotídeo na primeira posição do molde. A canaleta na qual
essa banda apareceu é anotada. Digamos que foi na canaleta A; o primeiro nucleotídeo da se-
qüência é, Portanto, A.
A próxima banda com maior mobilidade corresponde à molécula de DNA que é um nu-
cleotídeo mais longa do que a primeira. A canaleta é registrada (T no exemplo mostrado na
Figura 10.7); o segundo nucleotídeo é, portanto, I e a seqüência, aÍé o momento, é AI-
O processo continua ao longo de toda auto-radiografia até que as bandas individuais tor-
nam-se tão aglomeradas que não podem mais ser separadas umas das outras. Geralmente, a
partir de uma auto-radiografia, é possível ler-se uma seqüência de cerca de 400 nucleotídeos.
NHp 10.2.2 o método de Maxam-Gilbert: degradação química de DNA

I
Existem somente umas poucas sirnilaridades entre os métodos de seqüenciamento de DNA de

"-"\"
ltl Sanger-Coulson e Maxam-Gilbert. O método de Maxam-Gilbert necessita de fragmentos de
-*?t* DNA de fita dupla, de forma que a clonagem em um vetor M13 não é um passo inicial essen-
cial. Tampouco um iniciador é adicionado, pois o princípio da técnica de Maxam-Gilbert não
é a síntese de uma fita nova, mas a clivagem de uma molécula de DNA existente, utilizando
reagentes químicos que atuam especificamente em um determinado nucleotídeo.
Didesoxi-NTP
ATTGCGATTCG ddc
ATTGCGATTCddc
ATTGCGATTddc
Figura 10.7 ATTGCGATddT
Interpretação da auto-radiograÍia pro- ATTGCGAddT
ATTGCG ddA
ürzida em um experimento de seqüen- ATTGCddc
ciamento por terminação de cadeia. ATTG ddC
Cada canaleta contém os Íragmentos ATTddc

produzidos pelas sínteses das Íitas na AÏddT
de um dos quatro didesoxinu-
AddT
deotídeos triÍosÍatos (didesoxi-NTPs).
Figura seqüência é lida pela identiÍicação da ddA
canaleta em que cada Íragmento apa-
mento de rece, iniciando-se com aquele que mi- Direção da
DNA por grou para mais longe da origem, e eletroforese
minação gradualmente avançando ao longo da
cadeia. auto-radiograÍia.
r_-
216 T.A.BRowN
Existem diversas variações do método de Maxam-Gilbert, diferindo em detalhes,

tais co-
mo a maneira pela qual o DNA marcado é obtido e anaturezaexata dos reagentes
de clivagem
que são utilizados. A maioria desses reagentes é muito tóxica produtos químicos
- que clivam
moléculas de DNA em um tubo de ensaio irão fazer o mesmo no organismo,
devendo ser to-
mado um cuidado muito grande quando estes são utilizados.
A descrição seguinte é uma versão popular da técnica de Maxam-Gilbert. Um fragmento
de DNA de fita dupla que irá ser seqüenciado é, primeiramente, marcado pela
ligação de um
grupo fosfato radioativo na extremidade 5'de cada fita (Figura 10.8a). limãtilsutióxido
(DM-
SO) é, eàtão, adicionado e a amostra de DNA marcada é aluecida a 90"C. Isso resulta
na que-
bra do pareamento de bases e dissociação da molécula de DNA em suas duas fitas componen-
tes, as quais são separadas uma da outra pela eletroforese em gel (Figura lg.Sb),
com base no
fato de que uma das fitas provavelmente contenha uma maior quantidade de nucleotídeos
pu-
ínicos do que a outra, e irá, portanto, ser levemente mais pesada, movendo-se mais lentamen-
te durante a eletroforese. Uma fita é purificada do gel e dividida em quatro amostras,
cada
uma delas tratada com um dos reagentes de clivagem. De fato, o primeiro conjunto de reagen-
tes a ser adicionado provoca uma modificação química nos nucleotídeos para os quais
eles são
específicos, tornando a fita suscetível à clivagem naquele nucleotídeo, quando um produto
químico adicional - piperidina - for adicionado (Figura 10.8c). A modificãção e as reações
de
clivagem são realizadas sob condições que resultam em apenas uma quebra por fita.
Alguns dos fragmentos clivados retêm a marcação com "P nas suas extremidades 5'. Após
a eletroforese, utilizando-se as mesmas condições especiais como paÍa
o seqüenciamento por
terminação de cadeia, as bandas são visualizadas pela auto-radiãgrafia qúe representa
tais
fragmentos marcados. A seqüência de nucleotídeos pode, então, ser lida da auto-radiograha
exatamente como para o experimento de terminação de cadeia (Figura lO.gd).
10.2.3 Seqüenciamento de produtos de pCR

Conforme descrito na página 195, alguns experimentos de PCR são projetados de forma
que
a informação desejada a respeito do gene, ou outra seqüência de DNA que
está sendo estuãa-
{u' noA" ser obtida simplesmente pela análise dos produtos por meio da eletroforese em gel.
Freqüentemente, no entanto, é necessário determinar a seqüãncia do fragmento
de DNA am-
plificado, o que pode ser obtido pela clonagem do produto da pcR (p. 1 96) e pela
utilização
de um método de seqüenciamento padrão com terminadores de cadeà
ou degradação quími-
ca, conforme foi descrito. Figura 10.8
Um problema com essa abordagem é que as seqüências dos clones individuais podem Uma versão do s+.
não
representar fielmente a seqüência da molécula de DNA-molde originat, em qüenciamento de DNA
decorrência dos er-
ros ocasionalmente introduzidos pela DNA-polimerase de Taq durante o processo pelo método de degra-
de amplifi-
cação (p. 200). Métodos que seqüenciam diretamente um produto de PCR, dação química.
sem a necessidade
de clonagem, são, portanto, necessários.
Seqüenciamento direto dos produtos da pCR

O método de seqüenciamento direto está baseado na técnica de Sanger-Coulson
e, portanto, paração da fiti
requer DNA de fita simples como material inicial. O produto da PCR
é, obviamente, de fita za um iniciadr
dupla, de forma que maneiras de purificar fitas simplãs são necessiírias. Há
viírias possibili- na, uma protel
dades, a melhor delas é realizar-se a PCR inicial com um iniciador
normal e um modificado, Uma vez c
o iniciador modificado de tal maneira que as fìtas de DNA sintetizadas
a partir dele sejam fa- tes são semell
cilmente purificadas. Um modo brilhante de se realizar isso é pela ligação
de pequenãs esfe- culas com cad
ras magnéticas em um dos iniciadores. Após a PCR, o DNA de fita
sìmples e òutioo pela se- Sequenase. A
Cr-orueeeu GÊNrcA E ANÁLrsE oe DNA 217
diferindo em detalhes, tais

dos reagentes de cli (a) Marcação e dissociação das Íitas
produtos químicos que
no organismo, devendo ser Polinucieotídeo- .---.I
qurnase
Um *#:ËilÉ ÍÍÍrrflÍtÍÍÍr
-ãú@ ;PdATP* @'.,
/
marcado pela ligação de 5:1'ff[:; Marcação das
10.8a). Dimetilsulfóxido
DMSO /
90'C extremidades 5'
ida a 90'C. Isso resulta na /
em suas duas fitas com ,--"-O---l
o-- ,---t--o
(Figura 10.8b), com base
idade de nucleotídeos .-/ Fitas simples
movendo-se mais --"t- marcadas
(b) Separação das Íitas leve
em quatro amostras, e pesada
o primeiro conjunto de
deos para os quais eles
quando um
A modificação e as
uma quebra por fita.
nas suas extremidades 5'. Reações de clivagem
para o seqüenciamento
que representa ._A .-T
.-A .- T_ etc.
, ser lida da auto-radi a o-1 T
(Figura 10.8d). a--------::4
')----------- a-
.-A .)-T
(d) A auto-radiograÍia resultante
são projetados de forma

DNA que está sendo
meio da eletroforese em
ia do fragmento de DNA
PCR (p. 196) e pela uti
cadeia ou degradação
Figura 10.8
clones individuais podem Uma versão do se-
qiirenciamento de DNA
iginal, em decorrência dos
pelo método de degra-
durante o processo de
dação química.
de PCR, sem a necess
Sanger-Coulson e, paração da fita "magnética" da fita normal (Figura 10.9). Uma metodologia semelhante utili-
da PCR é. obviamente, de za um iniciador marcado com biotina, com as fitas simples separadas pela ligação com avidi-
ssárias. Há várias na, uma proteína que possui uma elevada afinidade por biotina (p. 175).
normal e um modifi Uma vez que o DNA de fita simples tenha sido purificado, os procedimentos subseqüen-
a partir dele sejam tes são semelhantes àqueles do método-padrão de Sanger-Coulson, no qual famílias de molé-
pela ligação de pequenas culas com cadeias terminadas são sintetizadas pela ação de uma DNA-polimerase, tal como a
fita simples é obtido pela Sequenase. A única complicaçáo diz respeito ao iniciador utilizado no seqüenciamento, como
I
t
i
2'18 T. A. Bnowrrr
lnlclar as reaço€
lniciadores da fita purificadas e, Pl
I
I superior com biotina.
I
II
lniciadores da Seqüenciam
fita inferior Sempre é neces
posta é não, Pot
DNA-molde *-) 'Esferas
ção, resultando
No seqüenc
magnéticas
te a uma mistur
iniciador é adic
da PCR não Por
fita do DNA-m,
reação é cicladi
duz as cópias é
A segunda r
ÇflÍrÍ.rrÍIt' que a Primeira r
I tídeo diferente
I
to, cadeias tern
II Desnaturação
a corrida dos PI
I
ì mo para um ex
---- -------l' 10,2.4 Seqüenciat

:. Na metodologi
-' -Y deias terminad,
DNA é lida de
pode ser utiliz:
------ -
--------.to
< (p. 211), a mar
----------t' I Separação das fitas centes, abrindc
Á marcadas com as esferas Marcadoret
/\ maonéticas cada molécula
//\ -\ __________r- gura 10.11a). I
/ - -------: Figura 10.9
NTPs, cujavar
-------: Uma das maneiras de purificar
tro reações em
to com todos o
l_- DNA de fita simples, a partir de um rentes podem s
produto de PCR de fita dupla. Um
Como os si
dos iniciadores é marcado com
cessiário, um ti
uma esfera magnética. Após a
vez de confiar
PCR, os produtos de fita dupla são
desnaturados e as fitas magnéticao uma única can
separadas das Íitas não-marcadas- co tubo de um
(Figura 10.1 1t
dados para o c
ponto de partida para as reações de síntese das fitas. No procedimento de seqüenciamento-pÈ seqüência pod
drão, esse iniciador anela em um sítio do vetor Ml3, adjacente ao sítio de clonagem, dentm te paÍa um arq
do qual o DNA a ser seqüenciado foi clonado (Figura 10.6). Esse iniciador "universal" nfu 96 seqüências
pode ser utilizado com produtos de PCR, uma vez que esses não possuem as seqüências fu dos muito mai
M13 apropriadas. Ao invés dele, um dos iniciadores da PCR inicial é também utilizado pme
Cronnceu GÊNrcA E ANÁLrsE oe DNA 219
iniciar as reações de seqüenciamento. Esse iniciador deverá ser complementar às fitas simples
purificadas e, portanto, será o iniciador que não foi marcado com as esferas magnéticas ou
com biotina.
Seqüenciamento em ciclos térmicos

Sempre é necessiírio purificar fitas simples a fim de seqüenciar um produto de PCR? A res-
posta é não, porque é possível combinar PCR e seqüenciamento de DNA em uma única rea-
ção, resultando na técnica chamada seqüenciamento em ciclos térmicos.
No seqüenciamento em ciclos térmicos, a mistura de reação que é preparada é semelhan-
te a uma mistura de PCR, mas com duas exceções importantes. A primeira é que somente um
iniciador é adicionado à reação, o que significa que o processo de amplihcação caracteístico
da PCR não poderá ocorrer, e, em.vez disso, tudo o que acontecerá será a reprodução de uma
fita do DNA-molde. No entanto, esse processo de reprodução é repetido muitas vezes, pois a
reação é ciclada de forma térmica, exatamente como em uma PCR real, e a enzima que pro-
duz as cópias é termoestável, tal como a DNA-polimerase de Taq.
A segunda diferença entre a reação de seqüenciamento em ciclos térmicos e uma PCR é
que a primeiraérealizada em quatro reações simultâneas, cada uma com um didesoxinucleo-
tídeo diferente incluído na reação. As novas moléculas que são sintetizadas possuem, portan-
to, cadeias terminadas (Figura 10.10), podendo a seqüência da molécula-molde ser lida após
a corrida dos produtos das quatro reações em um gel de poliacrilamida, da mesma maneira co-
mo para um experimento padrão de Sanger-Coulson.
10.2.4 Seqüenciamento automático de DNA

Na metodologia tradicional de seqüenciamento de Sanger-Coulson, as moléculas com as ca-
deias terminadas que são sintetizadas mostram-se radioativamente marcadas e a seqüência de
DNA é lida de uma auto-radiografia. Essa não é a única estratégia de marcação e detecção que
pode ser utilizada com a metodologia de terminação de cadeias. Como na hlbidização in situ
(p.211), a marcação radioativa vem sendo substituída pela utilização de marcadores fluores-
centes, abrindo novos horizontes pam o seqüenciamento do DNA.
Marcadores fluorescentes são normalmente ligados aos didesoxinucleotídeos, de forma que
cada molécula com a cadeia terminada contém uma única marcação na sua extremidade 3' (Fi-
gura l0.1la). Um fluorocromo diferente pode ser utilizado para cada um dos quatro didesoxi-
NTPs, cuja vantagem principal está no fato de que não se faz mais necessário realizar-se as qua-
tro reações em tubos separados. Assim, é possível executar uma única reação de seqüenciamen-
das maneiras de purificar
to com todos os quatro didesoxi-NTPs, pois as moléculas terminadas com didesoxi-NTPs dife-
de Íita simples, a partir de um
rentes podem ser identificadas por meio de seus sinais fluorescentes distintos.
de PCR de Íita dupla. Um
iniciadores é marcado com Como os sinais fluorescentes são detectados? Um tipo especial de sistema de imagem é ne-
. esÍera magnética. Após a cessário, um tipo que envolve a utilização de um computador para ler a seqüência de DNA, em
, os produtos de Íita dupla são vez de confiar nos olhos de um biologista molecular. Os produtos da reação são aplicados em
e as fitas magnética uma única canaleta de um gel de poliacrilamida ou, na tecnologia mais moderna, em um úni-
das Íitas não-marcadas. co tubo de um sistema de e-letrofgrese capilar e, então, passados pelo detector de fluorescência
(Figura 10.11b). O detector identifica o sinal fluorescente emitido pelas bandas e transmite os
dados para o computador, o qual converte a informação na seqüência de DNA apropriada. A
mento de seqüenciamento-p*- seqüência pode ser impressa para anillise pelo operador (Figura 10.1Ic) ou enviada diretamen-
te ao sítio de clonagem, denuu te para um arquivo de dados para análises futuras. Seqüenciadores automáticos podem ler até
Esse iniciador "universal" não 96 seqüências diferentes em um período de duas horas e, por conseguinte, podem adquirir da-
não possuem as seqüências do dos muito mais rapidamente do que é possível ao longo do seqüenciamento manual.
inicial é também utilizado pre
22O T.A.Bnowru
PCR com um
iniciador e
didesoxi-ATP
Figura 10.11
Seqüenciamento
automático dê
DNA. (a) Para o
rrrrrrrrttttttìtttttttì seqüenciamento
automático, ca-
da didesoxi-NTP
é marcado com
um marcador
fluorescente. (b)
Cada didesoxi-
NTP é marcado
com um Íluoro-
Figura 10.10 cÍomo diÍerente,
Após quatro ciclos de Íorma que os
O princípio do seqüencia-
polinucleotídeos
mento em ciclos térmicos.
Uma PCR é realizada com cadeias ter-
minadas são dis-
L com somente um dos ini-
ddA tinguidos à me-
ciadores e um dos dide-
L dida que Pas-
ddA soxi-NTPs. Uma das Íitas
do molde é copiada, origi- sam Pelo detec-
Fooa nando uma Íamília de po-
tor. (c) Um
linucleotídeos com ca- exemplo de uma
L ddA
deias terminadas. ddA = seqüência im-
pressa.
didesoxi-AïP.
podem ser local

a seqüência pú
10.2.5 Montando uma seqüência de DNA extensa sequence) é gra
Um único experimento de terminação de cadeia realizado pelos procedimentos manuais for- Existem vál
nece cerca de 400 nucleotídeos da seqüência, assim como uma única corrida em um seqüen- molécula de Dì
ciador automático resulta em cerca de 750 nucelotídeos. Porém, a maioria dos genes é muito zindo um conju
mais longa do que isso. como uma seqüência de viírios quilobases pode ser obtida? um métü
se era
A resposta é: realizando experimentos de seqüenciamento de DNA com um conjunto de tagem de que ot
fragmentos clonados ou produtos de PCR diferentes, todos derivados a partir de uma única e tos individuais I
extensa molécula de DNA (Figura l}.l2). Esses fragmentos deverão sobrepor-se, de forma quatro ou cinco
que as seqüências de DNA individuais irão, elas mesmas, apresentar sobreposições, as quais chimento de lat
Croruncev GÊNrcA E ANÁLrsE oe DNA 221
(a) Um polinucleotídeo com cadeia terminada, marcado com Íluorescência
ddA :-:_ fluorescência
(b) Detecção de polinucleotídeos com cadeias terminadas
Figura 10.11
Seqüenciamento lwçt- ,r:,,
automático de ffig- ddT ,* Sistema
DNA. (a) Para o B a- ddC . Ã{" de imagem
seqüenciamento ffi- ddG .::: úé'
automático, ca- tu
Detêctor
da didesoxi-NTP ww_ ddG
t é marcado com I
I I
um marcador +
I
fluorescente. (b) Polinucleotídeos passam
I Gada didesoxi- pelo detector
I
NTP é marcado
II com um Íluoro-
cromo diÍerente, (c) A impressão de um seqüenciamento automático
lFisura 10.10
O princípio do seqüencia de forma que os
f
polinucleotídeos
|mento em ciclos térmicc.
com cadeias ter-
[Uma PCR é realizada rninadas são dis- TT C TTiìC GTT 'GCTTGG
]mm somente um dos inF ünguidos à me-
lciadores e um dos dide.
dida que pas-
lsoxi-NTPs. Uma das Íitas
sam pelo detec-
[Oo motOe é copiada, orii tor. (c) Um
fnando uma Íamília de f
exemplo de uma
hnucleotídeos com ca-
ldeias terminadas. ddA = seqüência im-
]didesoxi-ATp pressa.
t
I
I
I podem ser localizadas, tanto pela inspeção visual quanto pela utilização de um computador, e
I a seqüência principal ou conüg (uma abreviação de seqüência contínua, do inglês contiguous
I s e quenc e) é gradualmente construída.
hrcedimentos manuais fr- Existem viírias formas de produzir fragmentos sobrepostos. Previamente à clonagem, a
molécula de DNA deveria ser clivada com duas endonucleases de restrição diferentes, produ-
Sa conida em um seqüen-
zindo um conjunto de fragmentos com, digamos, Saa3A e outro comAlul (Figura 10.13). Es-
lmaioria dos genes é muito
b pode ser obtida? se era um método popular de produção de seqüências sobrepostas, mas apresentava a desvan-
bNA com um coniunto dc tagem de que os síúos de restrição poderiam estar inconvenientemente distribuídos e fragmen-
bs a partir de uma únicac tos individuais poderiam ser muito extensos para seqüenciamento completo. Freqüentemente
Ho sobrepor-se. de forme quatro ou cinco endonucleases de restrição diferentes tinham que ser utilizadas para o preen-
far sobreposições, as qu*i* chimento de lacunas na seqüência principal.
-"l
222 T. A. Bnowr.r
Uma alterna
de uma forma r
resultantes irão
da. Os fragmen
Molécula de DNA extensa
sobressalentes. r
to com enzimas
Clivagem em
fragmentos sobrepostos
10.2.6 As realizaE
A primeira mol
7-77 cleotídeos do h
4 o-- seqüências do r
vamente, o seqi
_ç- , tnserçao em um seqüência do gr
vetor M13
/ em 1982. Atualr
/ de pesquisa ten
/ Os projetos
:K
do a obtenção d
/ â--'
o
primeira seqüêr
â/--\ s:; ) foi publicada er

ra seqüências g
melanogaster. <
\-, nar as mais de I
micos serão ex:
/ s"q,i"n"i"rento de cada
traomento
\ Leituras adicior
\
Carle, G.E. & Olso
Seqüências individuais
Scìences of the
sobrepostas
Figura 10.12 Heiskanen, M., Pel
m Permitem que aseqüência Montando uma seqüência de DNA 3'.79-82.
extensa sela montada Maxam, A. & Gilbt
extensa, a partir de um conjunto
ces of the USA
de seqüências sobrepostas curtas.
Oliver, S.G., van de
mosome ITI- -ìii
Prober, J.M., Train
minating dider
Sanger, F., Nicklen
Molécula de DNA the National Ar
mostrando os sítios de Southern, E.M. (l!
SaUOA (S) e Alut (A)
Journal of Mol
The ArabìdopsisG
Seqüências de diferentes liana. Narure,,
Íragmentos de A/ul
Seqüências de diÍerentes
r-+ Íragmentos de Sarr3A
Figura 10.13
g---
Montando uma seqüência de
Fragmentos individuais DNA extensa por meio da de-
LJ podem ser muito extensos para
pb
200 seqüenciamento completo
terminação das seqüências
de Íragmentos de restrição
sobrepostos.
ft
Ct-orueceu GÊucn e ANÁLrsE oe DNA 223
Uma alternativa é quebrar a molécula de DNA por meio de sonicação, a qual cliva o DNA
de uma forma mais aleatóna e, assim; fornece possibilidades maiores de que os fragmentos
resultantes irão apresentar sobreposição e de que uma seqüência principal contínua será obti-
da. Os fragmentos resultantes da sonicação possuem uma variedade de extremidades 3' e 5'
sobressalentes, mas essas podem ser convertidas em extremidades cegas seguindo o tratamen-
to com enzimas apropriadas, antes da clonagem pelos métodos convencionais.
10.2.6 As realizações do seqüenciamento de DNA

A primeira molécula de DNA a ser completamente seqüenciada foi o genoma de 5.386 nu-
cleotídeos do bacteríofago QX174, completada em 1975. Essa foi rapidamente seguida pelas
seqüências do vírus SV40 (5.243 pb), em 19'77, e do pBR322 (a.363 pb), em 1978. Gradati-
vamente, o seqüenciamento foi aplicado a moléculas maiores. O grupo de Sanger publicou a
seqüência do genoma mitocondrial humano (16,6 kb) em 1981 e a do bacteriófago À (49 kb)
em 1982. Atualmente, seqüências de 100 a 200 kb são rotineiras e a maioria dos laboratórios
de pesquisa tem a experiência necessária para gerar tal quantidade de informação.
Os projetos pioneiros de hoje são as massivas iniciativas genômicas, cada uma objeüvan-
do a obtenção da seqüência nucleotídica do genoma inteiro de um determinado organismo. A
primeira seqüência cromossômica, do cromossomo III da levedura Saccharomyces cerevisiae,
foi publicada em 1992, e a do genoma completo da levedura ocoffeu em 1996. Existem ago-
ra seqüências genômicas completas do verme Caenorhabditis elegans, da mosca Drosophila
melanogaster, da planta Arabidopsis thaliana e do humano Homo sapiens, paÍa não mencio-
nar as mais de 100 diferentes espécies microbianas. Esses projetos de seqüenciamentos genô-
micos serão examinados com maiores detalhes no Capítulo 12.
Leituras adicionais
Carle, G.E. & Olson, M.V. (1985) An electrophoretic karyotype for yeast. Proceedings of the National Academy of
Sciences of the USA,82,3156-60. [Uma aplicação de OFAGE.]
10.12 Heiskanen, M., Peltonen, L. & Palotie, A. (1996) Visual mapping by high resolutionFISH. Trends in Genetics, 12,
uma seqüência de Dì|fl 379-82.
Maxam,A.&GilbeÍ,W.(1977)Anewmethodof sequencingDNA. ProceedingsoftheNationalAcademyofScien-
a partir de um conjunto
ces of the USA,74, 560-64.
ias sobrepostas
Oliver, S.G., van der Hart, O.J.M., Agostine Carbone, M.T. et aL (1992)The complete DNA sequence of yeast chro-
mosome lll. Nature, 357 ,38-46.
Prober, J.M., Trainoq G.L., Dam, R.J. et al. (1987) A system for rapid DNA sequencing with fluorescent chain-ter-
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The Arabidopsis Genome Initiative (2000) Analysis of the genome sequence of the flowering plant Árabidopsis tha-
liana. Nature. 408. 796-8 I 5.
10.13
uma seqüência de
eldensa por meio da de-
das seqüências
Íragmentos de restrição
i
Cnpírulo 11
Estudando a Expressão
e a Função dos Genes
Estudando o transcrito de um gene clonado,226 ldentificando e estudando o produto de tradução de

Estudando a regulação da expressão gênica, 233 um gene clonado, 242
Todos os genes devem ser expressados para que tenham funcionalidade. O primeiro passo na
expressão é a transcrição do gene em uma fita de RNA complementar (Figura I I . I a). Para al-
guns genes - por exemplo, aqueles que codificam moléculas de RNA transportador (IRNA) e
de RNA ribossômico (rRNA) - o próprio transcrito é a molécula funcionalmente impoÍante.
Para outros, o transcrito é traduzido em uma molécula de proteína.
Para entender como é a expressão de um gene, o RNA transcrito deve ser estudado. Em es-
!
I pecial, o biologista molecular irá querer saber se o transcrito é uma cópia fiel do gene, ou se
t
segmentos do gene não estão presentes no transcrito (Figura I I .1b). Tais pedaços que faltam
' são chamados de íntrons e um interesse considerável está centralizado em suas estruturas e
ii
possíveis funções. Além dos íntrons, as localizações exatas dos pontos inicial e final do trans-
crito são importantes. A maioria dos transcritos é cópia, não apenas do próprio gene, mas tam-
bém de ambos os lados de suas regiões nucleotídicas (Figura 11.1c). Os sinais que determi-
nam o início e o término do processo de transcrição são apenas parcialmente entendidos, em-
boram devam ser localizados, caso a expressão de um gene esteja para ser estudada.
Neste capítulo, serão examinados os métodos utilizados para a análise dos transcritos.
Tais métodos podem ser utilizados para determinar se um gene contém íntrons e para mapear
as posições dos pontos inicial e final de transcrição. Depois, serão consideradas brevemente
algumas das numerosas técnicas desenvolvidas nos últimos anos para examinar como a ex-
pressão de um gene é regulada. Essas técnicas são importantes, pois aberrações na regulação
gênica constituem a base para muitos problemas clínicos. Finalmente, será tratado o difícil
problema de como identificar o produto da tradução de um gene.
226 T. A. Bnowr.r
(a) Os genes são expressados por

11.1.1 A microscopii
transcrição e tradução A microscopia ele
Gene desde que os Polin
Í---77-,--7--------- Molécula de DNA nem seus diâmeuc
I
Transcrição sualizar.
I Normalmente,
RNA + TRNA, IRNA
mo c, a qual se lig
rraoueao do mRNA léculas encobertas
I denso para aumen
Proteína
,W tanto espetacularq
No passado, a
zação entre moléc
(b) Alguns genes contêm íntrons
progressivamente
íntrons
,/\ ra determinar se u
/\ ta de DNA, contel
Ç7-'---------'-7T.--'- da fita de DNA nã
Molécula de DNA
I
lizar um pareamel
I Transcrição tura característica
Primário do RNA
:l:T:::l:
ainda contém íntrons
e as Posições dessi
ne. Informações a
,/l pela procura das I
-r--r,.-.-
- -.t I Processamento
cDNA possui a su
------\__+__-------_F _ mRNA maduro _ não compÍÌrada com a
contém íntrons
II rraouçao
.'tr
è ë' Proteína
(c) O RNA transcrito inclui regiões

de ambos os lados do gene
Gene
.-. Figura 11.1
Alguns princípios da expres.
são gênica.
Sinal de iniciação mRNA = RNA mensageiro,
para a transcrição Sinal de terminação
IRNA = RNA transportadoç
rRNA = RNA ribossômico.
11.1 Estudando o transcrito de um gene clonado

A maioria dos métodos de análise dos transcritos está baseada na hibridização entre o transcri-
to de RNA e um fragmento de DNA contendo o gene de interesse. A hibridização dos ácidos
F
nucléicos ocorre exatamente da mesma maneira entre fitas complementares de RNA e DNA
Preparando uma moláx
como entre moléculas de DNA de fitas simples. O híbrido DNA-RNA resultante pode ser ana-
para a observação com o n
lisado por meio de microscopia eletrônica ou com nucleases específicas para fitas simples.
t
Ct-oruneeu GÊr'rrcr e ANÁLrsE op DNA 227
11 .1.1 A microscopia eletrônica das moléculas de ácidos nucléicos

A microscopia eletrônica pode ser utilizada para visualizar moléculas de ácidos nucléicos,
desde que os polinucleotídeos sejam primeiramente tratados com produtos químicos que tor-
nem seus diâmetros visíveis. Moléculas não-tratadas são simplesmente muito finas para vi-
suaìizar.
Normalmente, as moléculas de DNA são misfuradas com uma proteína, tal como citocro-
mo c, a qual se liga aos polinucleotídeos, cobrindo as fitas com uma camada espessa. As mo-
léculas encobertas podem ser coradas com acetato de uranil ou algum outro material eletro-
denso para aumentar a capacidade de visualização da preparação (Figura 11.2). Visões um
tanto espetaculares das moléculas de ácidos nucléicos podem ser obtidas.
No passado, a microscopia eletrônica foi primeiramente utilizada para analisar a hibridi-
zação entre moléculas de DNA diferentes, mas, em anos recentes , a técnica tem-se tornado
progressivamente importante no estudo dos híbridos DNA-RNA. Ela é especialmente útil pa-
ra determinar se um gene contém íntrons. Considere a aparência de um híbrido entre uma fi-
ta de DNA, contendo um gene, e seu RNA transcrito. Se o gene contém íntrons, essas regiões
da fita de DNA não possuirão similaridade com o RNA transcrito e, assim, não poderão rea-
lizar um pareamento de bases. Ao contriírio, elas formarão uma "alça", originando uma estru-
tura característica, quando observadas com a microscopia eletrônica (Figura 11.3). O número
e as posições dessas alças correspondem diretamente ao número e posições dos íntrons no ge-
ne. Informações adicionais podem, então, ser obtidas por meio do seqüenciamento do gene e
pela procura das marcas características que delimitam os limites dos íntrons. Se um clone de
cDNA possui a sua seqüência disponível, a qual, obviamente, não possui íntrons, ela pode ser
comparada com a seqüência gênica paralocalizar os íntrons com precisão.
Figura 11.1
Alguns princípios da
são gênica.
mRNA = RNA mensaç;drqç
IRNA = RNA transportadq,
rFìNA = RNA ribossômirn
hado
I
lhibridização entre o
ts€. A hibridização dos áci Figura 11.2
fplementares de RNA e Preparando uma molécula de DNA o
|RNA resultante pode serr para a observação com o microscópio eletrônico
[ecíficas para fitas simples. eletrônico.
h
228 T. A. Bnowlt
Infelizmente, ar
lntrons tamanhos dos fragl
mas o procedimenl
das. No entanto, m(
Figura 11.3 cial e final do transr
A visualização por microscopia ele- seqüência de DNA.
trônica de um híbrido DNA-RNA, No exemplo mo
formado entre um gene contendo codificadora, juntar
um íntron e seu transcrito proces- um vetorMl3 e ob
sado. é adicionada e pern
do, de fita simples,
O restante, com ex(
11.1.2 A análise dos híbridos DNA-RNA por meio do tratamento dado com rálcali, re
com nuclease
O segundo método para o estudo de um híbrido DNA-RNA envolve uma nuclease específica
para fita simples, tal como a S1 (p. 65). Essa enzima digere DNA de fita simples ou polinu-
cleotídeos de RNA, inclusive regiões de fita simples na extremidade de moléculas predomi-
nantemente de fitas duplas, mas não possui qualquer efeito em DNA de fita duplaou sobre hí-
bridos DNA-RNA. Se uma molécula de DNA contendo um gene é hibridizada com seu RNA
transcrito, e, então, tratada com a nuclease Sl, as regiões de DNA de fita simples não-hibridi-
zadas em cada extremidade do híbrido são digeridas, juntamente com qualquer alça de íntron
(Figura 11.4). O resultado é um híbrido completamente de fita dupla. Os fragmentos de DNA
de fita simples protegidos da digestão pela nuclease Sl podem ser recuperados se a fita de
RNA for degradada em um tratamento com álcali.
HíbridoDNArìNA
,@
\*''
,rW Regiões de DNA de Íita simples

são digeridas
Alcali para
degradar o RNA
__-,/ -_--_--- Fragmentos de DNA de Íita simples Figura 11.5

que Íoram protegidos pelo RNA Localizando um ponto
Figura 11.4 de iniciação de transcri-
O efeito da nuclease 51 so- ção pelo mapeamento
bre um híbrido DNA-RNA. com a nuclease 51.
Cr-oruneeu GÊrurcn e ANÁLrsE oe DNA 229
Infelizmente, as manipulações mostradas na Figura 11.4 não são muito informativas. Os

tamanhos dos fragmentos de DNA protegidos poderiam ser medidos por eletroforese em gel,
mas o procedimento não permite que as suas ordens ou posições relativas sejam determina-
das. No entanto, modificações pequenas e sutis na técnica permitem determinar os pontos ini-
cial e final do transcrito, bem como qualquer íntron que ele contenha pode ser posicionado na
b por microscopia ele- seqüência de DNA.
h híbrido DNA-RNA, No exemplo mostrado na Figura 11.5, um fragmento de Sau3{contendo 100 pb da região
b um gene contendo codificadora, juntamente com 300 pb da seqüêncialíder que precede o gene, foi clonado em
hr transcrito proces- um vetor Ml3 e obtido como uma molécula de fita simples. Uma amostra do RNA transcrito
é adicionada e permitida anelar à molécula de DNA. A molécula de DNA ainda é, antes de tu-
I
do, de fita simples, mas agora ela possui uma pequena região protegida pelo RNA transcrito.
O restante, com exceção dessa região protegida, é digerido pela nuclease S1 e o RNA é degra-
t
dado com iílcali, restando um pequeno segmento de DNA de fita simples. Se tais procedimen-
fatamento
t
l* u-u nuclease específice

ide nta simples ou polin-
$ de moléculas predoni- _t
Gene
7--?7--?--?--?-
h Oe nta dupla ou sobre F
lhiUriOizada com seu RML Fragmento de 400 pb \ lnserção do
E fita simples não-hibriÕ de SatÉA \ Íragmento de
fom qualquer alça de

p- os fragmentos de
XêmM13
\
P recuperados se a fita
/ìs"3A
[--l"*^
DNA de Íita simples
t./ Anelamento do mBNA
rt
\L
\r._-___-__çfl-...-.-
Região de fita duPla
DNA ,, / _-./
ffi
-/ Nuclease 51
l'**o
RNA Ábdi
\
\ r DNA
\ Tamanho por eletroÍorese,

\ porexemplo, 150pb
\
150 pb
Figura 11.5 a
Localizando um ponto
\
Hgura 11.4 de iniciação de transcri- Ponto de iniciação
D efeito da nuclease 51 ção pelo mapeamento de transcrição
le um híbrido DNA-RÌ.|^, com a nuclease 51.
23O T. A. Bnowlr
tos são examinados detalhadamente se tornará claro que o tamanho desse fragmento
de fita
simples corresponde à distância entre o ponto de iniciação de transcrição o rítio de
Sau3A
" por eletrofore-
do lado direito. O tamanho do fragmento de fita simples é, então, determinado
se em gel e essa informação é utllizada para localizar o ponto de iniciação
deìranscrição na
seqüência de DNA. Exatamente a mesma estratégia poderia localizar o ponto de terminação
da transcrição e os pontos dejunção entre íntrons e éxons. A única diferença seria posição
a
do sítio de restrição escolhido para delimitar uma extremidade do fragmento de DNA
de frta
simples protegido.
11.1.3 A análise dos transcritos por extensão de iniciador

(primer extension)
A análise com a nuclease S I é uma técnica poderosa que permite que ambas as extremidades
5'e 3' de um transcrito, bem como as posições dos limites íntron-éxon, sejam identihcadas. O
método final da análise dos transcritos que iremos considerar a extensão de iniciador (pn:-
-
mer extension) - é menos adaptável, porque ele somente permite identificar a extremidade 5"
de um RNA. Apesar de tudo, é uma técnica importante que é freqüentemente utilizada para
conhrmar os resultados das análises com S l.
A extensão de iniciador somente pode ser utilizada se uma parte da seqüência do trans-
crito é conhecida. Isso é porque um oligonucleotídeo iniciador pequeno deve ser anelado ao
RNA em uma posição conhecida, idealmente dentro dos 100 a 200 nucleotídeos da extre-
midade 5' do transcrito. Uma vez anelado, o iniciador é estendido pela transcriptase rever-
sa (p. 68)' a qual continua copiando a fita de RNA até que ela alcance a extremidade
5' (Fi-
gura 11.6). A extremidade 3' dessa fita de DNA recém-sintetizada corresponde, portanto,
à
extremidade 5' do transcrito. A localização da posição dessa extremidadè na seqiiência de
DNA é facilmente obtida pela determinação do comprimento da molécula de DNA de fita
simples e correlacionando essa informação com a posição de anelamento do iniciador.
11.1-4 outras técnicas para o estudo dos RNAs transcritos

Figura 11.6
Nos últimos anos, uma grande variedade de técnicas de manipulação de RNA foi desenvolvi- Localizando um
da, cujo emprego resultou em numerosos e importantes avanços no entendimento ponto de inicia-
de como os
transcritos são sintetizados e processados. Essas técnicas incluem: ção de transcri-
@o por meio da
Hibridização de northern e)densão de ini-
Trata-se de uma técnica equivalente de RNA da hibridização de Southern (p. 206). ciador.
um RNA
extraído é submetido à eletroforese em gel de agarose, utilizando-se um tampão de eletrofo-
rese desnaturante (por exemplo, um contendo formaldeído) para garantir qu"
o, RNAs não
formarão pares de bases inter ou intramoleculares, uma vez que o pareÍìmento de bases pode-
ria afetar a velocidade com a qual as moléculas migram através do gel. Após a eletroforese, minar tenha sido
o
RNA do gel é transferido para uma membrana de náilon ou de nitrocelulose e hibridizado dos e o experimr
com
uma sonda marcada (Figura 11.7). se a sonda for um gene clonado, a banda que polimerases tern
aparece na
auto-radiografia é o transcrito daquele gene. O tamanho do transcrito pode ser determinado de DNA (isto é, r
a
partir da sua posição no gel e, se RNA de diferentes tecidos for aplicadà em canaletas se dependente dr
diferen-
tes do gel, então a possibilidade de que esse gene seja diferenciul-"nt" expressado única reação. Os
poderá ser
examinada. fita dupla (cDN1
da molécula de R
PCR com transcrição reversa (RT-PCR)
tuam-se no interi
Essa técnica possibilita que o RNA seja utilizado como molde em uma reação crição reversa é I
de polimeriza-
ção em cadeia (PCR). O primeiro passo em uma RT-PCR é converter a molécula ãe RNA em a presença de un
um cDNA de fita simples com a transcriptase reversa. Uma vez que esse procedimento gene. Uma versãr
preli-
Ct-ouoeu GÊuca r ANÁLtsE oe DNA 231
Fnho desse fragmento de fita

lanscrição e o sítio de Sau3A 5'
p, determinado por eletrofore- RNA transcrito
I iniciaçao de transcrição na
icalizar o ponto de terminação Anelamento do iniciador
fnica
diferença seria a posição
ldo fragmento de DNA de fita
g
- _/
lniciador
Extensão com transcriptase reversa
que ambas as extremidades

sejam identificadas. O
extensão de iniciador (prü-
identificar a extremidade í
Desnaturação do RNA,
üentemente utilizada pan medida do tamanho do DNA -
por exemplo, 239 nucleotídeos
parte da seqüência do trans-
deve ser anelado ao /
200 nucleotídeos da extre-
pela transcriptase reveÍ-
a extremidade 5' (Fr-
corresponde, portanto. à Correlação com a seqüência de DNA
na seqüência dc
da molécula de DNA de fita
amento do iniciador.
------ DNA
de RNA foi desenvolvi-

Figura 11.6
Localizando um # 23epb \
,/\/
ponto de inicia-
no entendimento de como ui
ção de transcri- Ponto de iniciação posição da extremidade 5'
ção por meio da de transcrição do iniciador
extensão de ini-
Southern (p. 206). Um RNA

ciador. -
um tampão de eletrofe
garantir que os RNAs nib
pareamento de bases pode-
do gel. Após a eletroforese, o minar tenha sido realizado, os iniciadores da PCR e a DNA-polimerase de Taq são adiciona-
ulose e hibridizado com dos e o experimento prossegue exatamente como na técnica-padrão (Figura 11.8). Algumas
a banda que aparece rn polimerases termoestáveis são capazes de sintetizar cópias tanto de moléculas de RNA como
ito pode ser determinado e de DNA (isto é, elas possuem ambas as atividades de transcriptase reversa e DNA-polimera-
icado em canaletas diferen- se dependente de DNA) e, assim, podem realizar todos os passos de uma RT-pcR em uma
nte expressado poderá ser única reação. Os produtos de uma RFPCR são muitas moléculas de DNA complementar de
fita dupla (cDNA), cópias do RNA-molde, apesaÍ de essas, provavelmente, não serem cópias
da molécula de RNA completa, pois, normalmente, os sítios de anelamento dos iniciadores si-
tuam-se no interior do transcrito, emvez de estarem nas suas extremidades. A PCR com trans-
uma reação de polimeriza- crição reversa é freqüentemente utilizada para testar RNA extraído de tecidos diferentes para
a molécula de RNA en a presença de um determinado transcrito, a fim de determinar o padrão de expressão de um
que esse procedimento preli- gene. Uma versão modificada, chamada de amplificação rápida de extremidades de cDNA
F.
T. A. Bnowr.r
Gel de RNA
/ffi ffi ffi

ffi ffi ffit
Hibridização
de northern
Arrastes de RNA
Auto-radiograÍia Figura 1'

Banda de A PCR com trans
hibridização
ção reversa (RT-PCI
11.2 Estuda
Figura Í 1.7
A hibridização de northern.Très extrações de RNA de tecidos diÍerentes Íoram submetidas à Poucos g
eletroÍorese em um gel de agarose. As extrações possuem muitas moléculas de RNA de tam+ ativados r
nhos diÍerentes, de forma que cada uma Íornece um arraste de RNA, mas duas bandas distin- de regula
tas são visualizadas, uma para cada um dos RNAs ribossômicos mais abundantes. Os tama- gular a el
nhos desses rRNAs são conhecidos (por exemplo,4.718 e 1.874 nucleotídeos em mamÍÍeros), produtos
de forma que eles podem ser utilizados como marcadores de tamanho internos. O gel é trans- as enzim:
ferido para uma membrana, sondado com um gene clonado e os resultados visualiiados por quantidar
meio de auto-radíografia. Somente na canaleta 1 aparece uma banda, mostrando que o gene
triptofanc
clonado é expressado somente no tecido do qual essa extração de RNA foi obtida.
tose, são I
Nos orga
(RACE, do inglês rapid amplification of cDNA ends), pode ser utilizada para identificar as to maior r
extremidades 5'e 3'das moléculas de RNA. padrões d

to necessi
Seqüenciamento de RNA tes na exl
O seqüenciamento de RNA é normalmente realizado pela análise da seqüência do produto de Muito
uma RT-PCR. Métodos diretos para o seqüenciamento de moléculas de RNA foram desenvol- sica: ager
vidos, mas eles foram ineficientes e - muito importante a molécula de RNA teve de ser puri- te que os
-
ficada antes de ser seqüenciada. É possível obterem-se amostras puras de genomas de RNA de explorar i
vírus e de RNAs celulares muito abundantes, tais como as moléculas de RNA ribossômico, ria dos av
mas a purificação de um único mRNA é muito difícil. No entanto, se os iniciadores para uma os estudo
RFPCR forem projetados corretamente, apenas o único mRNA-alvo será copiado eã análise DNA con
da seqüência do produto da RT-PCR fornecerá a seqüência desse mRNA. sobre os t
Cr-onaceu GÊNrcA E ANÁLrsE oe DNA 233
I
I
i RNA
Ib RNA
\ Transcriptasereversa
\ ,--<rr-r-rT Hí
tnrthern
-t---.---\
ftrto-radiografia Figura 11.8 PCR-padrão

A PCR com transcri-
@o reversa (RT-PCR).
11,2 Estudando a regulação da expressão gênica

Poucos genes são expressados durante todo o tempo. Muitos estão sujeitos à regulação e são
Íoram submetidas à
moléculas de RNA de tanr*. ativados somente quando a célula requisita seus produtos gênicos. Os sistemas mais simples
mas duas bandas dislir de regulação gênica são encontrados em bactórias, como E. coli, por exemplo, a qual pode re-
rnais abundantes. Os tarn+. gular a expressão de genes paÍa os processos biossintéticos e metabólicos, de forma que os
rucleotídeos em mamÍferosft produtos gênicos desnecessiírios não são sintetizados. Por exemplo, os genes que codificam
internos.Ogel étrars. as enzimas envolvidas na biossíntese do triptofano podem ser inativados quando existem
visualizados por quantidades abundantes de triptofano na célula, e ativados novamente quando os níveis de
mostrando que o geÍìe
, triptofano diminuem. De maneira similar, os genes para a utilização de açúcares, como a lac-
RNA Íoi obtida. tose, são ativados apenas quando o açúcar em questão estiver presente para ser metabolizado.
Nos organismos superiores, a regulação gênica é mais complexa, pois existe um número mui-
utilizada para identificar er to maior de genes para controlar. A diferenciação celular envolve mudanças volumosas nos
padrões de expressão gênica, e o processo de desenvolvimento do óvulo fertilizado até o adul-
to necessita da coordenação entre células diferentes, além de mudanças temporais-dependen-
tes na expressão gênica.
da seqüência do produto & Muitos dos problemas na regulação gênica necessitam de uma abordagem genética clás-
de RNA foram desenv* sica: a genética possibilita que os genes que controlam a regulação sejam distinguidos, permi-
de RNA teve de ser purí- te que os sinais bioquímicos que influenciam a expressão gênica sejam identificados e pode
de genomas de RNAdc explorar as interações entre genes e famílias gênicas diferentes. É por essa razáo qlue a maio-
las de RNA ribossômico, ria dos avanços no entendimento do desenvolvimento nos organismos superiores iniciou com
se os iniciadores para nmr os estudos da mosca-das-frutas Drosophila melanogaster. A clonagem gênica e a análise do
serácopiadoeaanálise DNA complementam a genética clássica, pois fornecem informações muito mais detalhadas
mRNA. sobre os eventos moleculares envolvidos na regulação da expressão de um único gene.
234 T.A.BRowN
Agora sabe-se que um gene sujeito à regulação possui uma ou mais seqüências contrç
ladoras na sua região a montante (Figura 11.9) e que o gene é ativado e inativado pela liga-
ção de proteínas reguladoras a tais seqüências. Uma proteína reguladora pode reprimir a ex-
pressão gênica, nesse caso, o gene é inativado quando a proteína está ligada às seqüênciar
controladoras, ou, alternativamente, a proteína pode ter um papel positivo ou reforçador"
ativando ou aumentando a expressão do seu gene-alvo. Nesta seção serão examinados os
métodos paralocalizar seqüências reguladoras e determinar seus papéis na regulação da ex-
pressão gênica.
11.2.1 IdentiÍicando os sítios de ligação de proteínas na

molécula de DNA
Uma seqüência controladora é uma região do DNA onde uma proteína reguladora pode se li-
gar. Deveria ser possível, portanto, identificarem-se seqüências controladoras a montante de Uma proteína ligada d
um gene pela procura da região relacionada ao sítio de ligação da proteína. Existem três ma- dade de um Íragmento
neiras diferentes de se realizar isso. te a eletn
Retardação em gel de complexos DNA-proteína

As proteínas são estruturas um tanto volumosas e uma proteína ligada em uma molécula de
DNA resulta em um aumento considerável da massa molecular total. Se esse aumento pode
ser detectado, um fragmento de DNA contendo um sítio de ligação de proteína será identifi-
cado. Na prâtica, um fragmento de DNA com uma proteína ligada a ele é identificado por
eletroforese em gel, pois possui uma mobilidade menor do que a molécula de DNA não-
complexada (Figura 1 1. 10). O procedimento é referido como retardação em gel (gel retar-
dation).
Em um experimento de retardação em gel (Figura 11.11), a região do DNA a montante do
gene que está sendo estudado é clivada com uma endonuclease de restrição e, então, mistura-
da com a proteína reguladora ou, se a proteína reguladora não foi ainda identificada, com um
extrato protéico nuclear não-fracionado (lembre-se de que a regulação gênica ocorre no nú-
cleo). Os fragmentos de restrição contendo a seqüência controladora formam um complexo
com a proteína reguladora: todos os demais fragmentos permanecem como DNA "descober-
tos". A localizaçáo da seqüência controladora é, enÍão, determinada pelo posicionamento, no
mapa de restrição, do fragmento que foi retardado durante a eletroforese em gel. A precisão
com a qual a seqüência controladora pode ser localizada depende de o quão detalhado é o ma-
pa de restrição e de o quão convenientemente localizados estão os sítios de restrição. Uma
única seqüência controladora pode ser menor do que 10 pb de extensão, de forma que a retar-
dação em gel raramente é capaz de defini-la com exatidão. Técnicas mais precisas são, por-
tanto, necessiírias para delimitar a posição da seqüência controladora dentro do fragmento
identificado pela retardação em gel.
Realizando um experit
Seqüências controladoras
l\ \ Gene
Promotor Footprint
Figura 11.9
Posições possíveis para seqüências O procedim
200 pb
controladoras na região a montante de controlador
um gene. retardação r
Cr-oruneeu GÊrlrcn e AruÁ-rse oe DNA 235
lr ou mais seqüências conüG

iativado e inativado pela lig*
Fguladora pode reprimir a ex-
Éna está ligada às seqüêncier
papel positivo ou reforçada;
h seção serão examinados c
[s papéis na regulação da er-
Gel de agarose
ls na
I
i Canaleta 1: Fragmento de DNA

Canaleta 2: Fragmento de DNA +
Fìoteína reguladora pode se ür Figura 11.10 proteÍna ligada
-Ì
i controladoras a montante Uma proteína ligada diminui a mobili-
rda proteína. Existem três mr. dade de um Íragmento de DNA duran-
te a eletroforese em gel.
b ligada em uma molécula ds

ttotal. Se esse aumento po& 1234-Gene
Oe proteína será identif,- ..........-.................,.- ,t,-,
içao RRRRRRR
a ele é identificado
a molécula de DNA Clivagem com a
em geÌ (gel endonuclease de restrição
do DNA a montante 1
)
Á
restrição e, então, mi í--4 2
4
unda identifrcada, com uE 3
lação gênica ocorïe no ú-
formam um complexo { Mi"tur"do.
como DNA "descober*
"or "
otot"inu reguladora
pelo posicionamento, \
em gel. A
deoquãodetalhadoéon
n-z- 1
4
5
os sítios de restrição. t--]-

nsão, de forma que a reüil-
icas mais precisas são, pc, I
dentro do fragmenü!ì I
I
/
Figura 11.11 Determinação das mobilidades dos fragmentos
Bealizando um experimento de retarda- por meio de eletroforese em gel
ção em gel.
Footprinting com DNase I

O procedimento geralmente denominadofootprinting ("pegada") possibilita que uma região
controladora seja posicionada dentro de um fragmento de restrição que foi identificado pela
retardação em gel. A técnica defootprintitcg funciona com base no fato de que a interação
236 T. A. Bnowr'r
com uma proteína reguladora protege o DNA da região de uma seqüência controladora da
ação degradante de uma endonuclease, tal como a desoxirribonuclease (DNase) I (Figmr
Il'12). Esse fenômeno pode ser utilizado paralocalizar o sítio de ligação da proteína na rno-
lécula de DNA.
O fragmento de DNA em estudo é primeiramente marcado em uma extremidade com utrr
marcador radioativo e, então, complexado com a proteína reguladora (Figura l1.l3a). Entã\
DNase I é adicionada, mas a quantidade utilizada é limitada, de forma que não ocorre a do-
gradação completa do fragmento de DNA. Ao contriírio, o objetivo é clivar cada molécula em
uma única ligação fosfodiéster (Figura 1 1. l3b). Se o fragmento de DNA não possui uma pru
teína ligada a ele, o resultado desse tratamento é uma famflia de fragmentos marcados, dife-
rindo em tamanho em apenas um nucleotídeo cada.
Após a separação em um gel de poliacrilamida, a famflia de fragmentos aparece corm
uma escada de bandas em uma auto-radiografia (Figura 1 I . 13c). No entanto, a proteína ligan.
te evita que determinadas ligações fosfodiéster sejam clivadas pela DNase I. Conseqüento-
mente, nesse caso, a família de fragmentos não estará completa, pois os fragmentos resultan-
tes da clivagem dentro da região da seqüência controladora não estarão presentes. Essa ausên-
cia é notada na auto-radiografia como uma "pegada", claramente visualizada na Figun
I 1.13c. A região da molécula de DNA contendo a seqüência controladora pode, agora, sor
analisada a partir dos tamanhos dos fragmentos em ambos os lados da pegada.
Ensaios de interferência por modiÍicação

As análises por retardação em gel e footprinting possibilitam que as seqüências controladoras
sejam localizadas, mas não fornecem informações em relação às interações entre a proteíne
ligante e a molécula de DNA. A técnica mais precisa dessas duas o footprinting somentc
- -
revela a região do DNA que é protegida pela proteína ligante. As proteínas são relativamentc
grandes, se comparadas com uma hélice dupla de DNA, e podem proteger viírias dezenas dc
pares de bases, quando ligadas a uma seqüência controladora que possua somente uns poucqüs
pares de bases de comprimento (Figura I I .14). O
footprinting, portanto, não delimita a região
controladora propriamente dita, somente a região onde ela está localizada.
Proteína reguladora
Par de base
I Figura 11.13
Footprinting com
DNase l.
Molécula de DNA
\ ol.t"." r
Os nucle
ficados por
fotri:o
r
Figura 11.12 fragmentos r

+ Uma proteína ligada
protege uma região de
eles são trata
plo sendo o r
Fragmento de DNA protegido uma molécula de DNA 11.15). Essa
-o pela proteína ligada
og da sua degradação por
uma nuclease, tal como
nucleotídeo I
extrato protr
a DNase l.
Clonnceu GÊNrcA E ANÁLrsE oe DNA 237
h seqüência controladora dr
lmuclease (DNase) I (Figun
Ëe Ìigação da proteína na mr' '/..-t
'/ ,--
fu uma extremidade com üm
/t, (a) Marcação da extremidade,
bdora (Figura 11.13a). Entfu Moléculas de DNA adição da proteína reguladora
lc forma que não ocoÍre a &' \
Fvo é clivar cada molécula eri \
lde nNe não possui uma Fnr"
fc fragmentos marcados, difu'
2' --a-
-a-
fragmentos aparece cotrrl marcada --t'-r.*ína
Extremidade
No entanto, a proteína ---;- rigada
pela DNase I. C l
I
pois os fragmentos
/ tul Limitada degradação
*::-
presentes. Essa aufu com DNase
visualizada na Fi I
pode, agora,
da pegada.
F {- ru:l:riruHËà::"
protegida pela proteína
"Ëtá"
as seqüências control
a-
\
interações entre a \ (c) EletroÍorese em gel, auto-radiograÍia
- o footprinting - \
proteínas são relati Tamanhos dos Auto-radiograÍia
fragmentos de DNA
proteger viírias dezenm ++
possua somente uns ++ a---------------
+ "e"ouou'
não delimita a ++
zada.
++ .-
+r
)
+
+ --l
- +
t-t
I
.<
-
I
+
-t I
-t
'-J
Canaleta 1: Controle - sem proteína ligada Posições onde

Figura 11.13 Canaleta 2:Teste - DNA + proteína ligada a proteína está ligada
Footprinting com
DNase l.
Os nucleotídeos que realmente formam ligações com a proteína ligante podem ser identi-
ficados por meio do ensaio de inteúerência por modificação. Como no footprinting, os
Figura 11.12 fragmentos de DNA devem ser primeiramente marcados em uma das extremidades. Então,
Uma proteína ligada eles são tratados com um reagente químico que modifica nucleotídeos específicos, um exem-
protege uma regiãoür plo sendo o dimetil-sulfato, que se liga nos grupos metila de nucleotídeos de guanina (Figura
uma molécula de Dl{fi 11.15). Essa modificaçáo ércalizada sob certas condições limitantes, de forma que apenas um
da sua degradação nucleotídeo por fragmento de DNA seja modihcado. Em seguida, o DNA é misturado com o
uma nuclease, tal extrato protéico. O ponto-chave do experimento é que a proteína ligante provavelmente não
a DNase l.
238 T.A.Bnowru
Figura 11.14
Proteína ligante Uma proteína li-
gada pode pro-
teger uma região
de DNA que é
muito mais ex-
tensa do que a
seqüência con-
troladora.
irá se ligar ao DNA se um dos nucleotídeos de guanina dentro da região controladora estiver
modificado, pois a metilação de um nucleotídeo interfere na reação química específica qm
possibilita que ele forme uma ligação com a proteína.
Como a ausência da proteína é monitorada? Se a mistura de DNA e proteína for examina
da por eletroforese em gel de agarose, duas bandas serão visualizadas, uma correspondendo
ao complexo DNA-proteína e, a outra, ao DNA não-ligado à proteína - em essência, essa paÍ-
te do experimento constitui-se em um ensaio de retardação em gel (Figura I 1.15). A bande
correspondente ao DNA não-ligado é purificada do gel e tratada com piperidina, um reager
te químico que cliva moléculas de DNA nos seus nucleotídeos metilados (p.216). Os produ-
tos do tratamento com piperidina são, agora, separados em um gel de poliacrilamida e o resul-
tado é visualizado em auto-radiografia. O tamanho da banda ou das bandas que aparecem na
auto-radiografia indica a posição no fragmento de DNA das guaninas, cujas metilações imp+
Figura 11.15
diram a ligação da proteína. Essas guaninas localizam-se dentro da seqüência controladora 0
Um ensaio de in-
ensaio de modihcação pode, agora, ser repetido com reagentes químicos que possuam corm terferência por
alvos os nucleotídeos A, T ou C para determinar a posição precisa da seqüência controladora modificação.
11.2.2 ldentiÍicando seqüências controladoras por meio de

ensaios de deleção
Os experimentos de retardação em gel,footprinting e interferência por modificação são cap A técni
zes de localizar possíveis seqüências controladoras a montante de um gene, mas não fomecem emumami
informações sobre a função das seqüências individuais. O ensaio de deleção é uma aborda- ra I 1.16). l
gem totalmente diferente, que não só pode localizar seqüências controladoras (embora apena$ veria resul
com a precisão de uma retardação em gel), como, mais importante, pode também indicar e qüências c,
função de cada seqüência. ções result

Clorunoeu GÊNrcA E ANÁLrsE or DNA 239
nl/_ / Fragmentos de restrição com uma extremidade marcada
./ \-- Dimetil-sulfato
\
Figura 11.1t1
Uma proteína Í"
Gs modificadas
?àr
/r do extrato nuclear
gada pode pro. \Oieao
teger uma Proteínas
de DNA que é t'o au"
muito mais ex- è- ){
tensa do que a
seqüência cur Eletroforese em gel -tY < Nenhuma
troladora. de agarose - proteína ligada
(sítio bloqueado)
região controladora
química específica Purificacão do DNA
ìJ
e proteína for
P
uma
)
- em essencla, essa
/ Pipendina
I (Figura I1.15). A ú
piperidina, um
( p. 216). Os
de poliacrilamida e o
bandas que aparecem
Determinação do tamanho
cujas metilações por meio de eletroÍorese em
seqüência Figura 11.15 gel de poliacrilamida
que possuÍìm
llm ensaio de in-
. terferência por
da seqüência
modiÍicação.
de
por modificação são A técnica baseia-se na suposição de que a deleção da seqüência controladora irá resultar
um gene, mas não em uma modificação na maneira pela qual a expressão de um gene clonado é regulada (Figu-
de deleção é uma ra 1 1.16). Por exemplo, a deleção de uma seqüência que reprime a expressão de um gene de-
adoras (embora veria resultar naquele gene sendo expressado em um nível mais elevado. Similarmente, se-
, pode também qüências controladoras tecido-específicas podem ser identificadas, uma vez que as suas dele-
ções resultam na expressão do gene-alvo em tecidos outros que o tecido correto.
24O T.A.Bnowru
Silenciador Promotor
Expressão
\
Expressão menos
Tabela I
\ Figura 11.16 em organ
Expressão mais elevada O princípio subjacente à
análise de deleção Geneo
lacZ
neo
cat
Genes-repórteres dhïr
Antes de realizar-se o ensaio de deleção, uma maneira deve ser encontrada para analisar o aphN
efeito de uma deleção sobre a expressão do gene clonado. Provavelmente, o efeito será ape- lux
nas observado quando o gene for clonado nas espécies de onde ele foi originalmente obtidoç uidA
em nada resultará a análise de um gene vegetal, envolvido na regulação pela luz, se esse gene
" Todos er
for clonado em uma bactéia.
minescen
Existem, atualmente, vetores de clonagem desenvolvidos para a maioria dos organismm
(Capítulo 7), de forma que a clonagem do gene em estudo de volta ao seu hospedeiro não d+
veria constituir-se em um problema. A dificuldade é que, na maioria dos casos, o hospedeiro
já possui uma cópia do gene em seus cromossomos. Como poderão as mudanças no padrão
de expressão de um gene clonado ser distinguidas do padrão normal de expressão exibido pe- Realiz
la cópia cromossômica do gene? A resposta é uttllizar um gene-repórter. Trata-se de um ge-
Umavs
ne-teste, que é fusionado à região a montante do gene clonado (Figura II.l7), substituindo es-
ensaio d
se gene. Quando clonado dentro do organismo hospedeiro, o padrão de expressão do gene-re-
constru(
pórter deverá mimetizar exatamente o do gene original, pois o gene-repórter estará sob a in-
fluência de exatamente as mesmas seqüências controladoras do gene original.
gura ll,
organisr
O gene-repórter deve ser escolhido com cuidado. O primeiro critério é que ele deve codi-
pórter. I
ficar um fenótipo que não é ainda exibido pelo organismo hospedeiro. O fenótipo de um ge-
remoúr
ne-repórter deve ser relativamente fácil de detectar após o gene haver sido clonado no hospe-
na esps
deiro, e, idealmente, deverá ser possível de submetê-lo a um experimento de quantificação fe-
ladora t
notípica. Tais critérios não têm demonstrado dificuldade de serem satisfeitos e uma varieda-
Osr
de de genes-repórteres diferentes é utilizada nos estudos de regulação gênica. Alguns exem-
cuidadc
plos estão listados na Tabela I 1.1.
Clorureer,r GÊNrcA E Ar.rÁlrse oe DNA 241
Seqüências controladoras Promotor
Gene sob investigação
/ sro.titriçao do gene por

um oene-reoórrer
I
Gene-repórter
+-nv?z\-
\ \\,/\ / Promotor
Figura 11.17 Seqüências controladoras
Um gene-repórter.
Tabela LL.l Alguns exemplos de genes-repórteres utilizados no estudo da regulação gênica

figura 11.16 em organismos superiores
D princípio subjacente à
rnálise de deleção Geneo Produto gênico Ensaio
lacZ p-galactosidase Teste histoquímico

neo Neomicina-fosfotransferase Resistência à canamicina
cat Cloranfenicol-acetiltransferase Resistência ao cloranfenicol
dhfr Dihidrofolato-redutase Resistência ao metotrexato
Ìencontrada para anali aphN Aminoglicosídeo-fosfotransferase Resistência à higromicina
petmente, o efeito seú
lux Luciferase Bioluminescência
fe foi originalmente uidA p-glucoronidase Teste histoquímico
paçao pela luz, se esse
o
l Todos esses genes foram obtidos de E. coli, com exceção de lux, que possui três fontes: as bactérias lu-
ja maioria dos organismc minescentes Vibrio harveyii e V. fischeri e o vaga-lume Photinus pyralis.
lao seu hospedeiro não de
iA aos casos, o hospedeiro
fo as mudanças no padrão
fü de expressão exibido pe-
Realizando um ensaio de deleção
fórter. Trata-se de um ge
F I 1. l7), substituindo es- Uma vez que o gene-repórter tenha sido escolhido e feita a construção necessária, realizar um
b de expressão do gene-rc- ensaio de deleção é bastante fácil. As deleções podem ser realizadas na região a montante da
le-repórter estará sob a in- construção, por meio de uma das diversas estratégias. Um exemplo simples é mostrado na Fi-
be original. gura 11.18. O efeito da deleção é, então, analisado pela clonagem da construção deletada no
é que ele deve codi- organismo hospedeiro e pela determinação do padrão e da extensão da expressão do gene-re-
fitério
tiro. fenótipo de um ge-
O pórter. Uma elevação na expressão indicará que uma seqüência repressora ou silenciadora foi
ier sido clonado no hospe- removida, uma diminuição indicará a remoção de um ativador ou reforçador, e uma mudança
quantificação fe- na especificidade do tecido (como mostrado na Figura 11.18) revelará uma seqüência contro-
inento de
isatisfeitos e uma varieda- ladora tecido-específi ca.
gênica. Alguns exem- Os resultados de um projeto de ensaio de deleção devem ser interpretados com bastante
fção
cuidado. Complicações podem surgir se uma única deleção remove duas seqüências contro-
242 T. A. Bnowr.r
nado. Ambas dep

Seqüência controladora teínas em sisteme
específica para a semente preparados a partì
I
t
Gene-repórter
@- coelho (ambas ex
, c , Figura 11.18
R R \---=- Expressáo gênica as demais molécu
Ensaio de deleção. Um gene
semente-especíÍica repórter foi ligado à região a sistema de traduç
montante de um gene espe trados nas proteín
cíÍico para a semente de uma moléculas de mR
planta. A remoção do Írag- a qual pode ser se
mento de restrição, situado da representa um
entre os sítios R, deleta a se- amostra.
Deleção da seqüência qüência controladora, a qud Tanto a HRT
controladora \
ì comanda a expressão gênica diretamente da ar
O gene agora é especíÍica para a semente, bilizado em uma
\ expressado de Íorma que o gene-repórtsr (Figura 11.20). C
em todos os tecidos é, agora, expressado em to-
nece ligado à me
dos os tecidos da planta.
recuperado e tra<
proteína çerlifica
ladoras bastante pÍóximas ou, como é bastante comum, duas seqüências controladoras distin-
tas cooperam para a produção de uma única resposta. A despeito dessas potenciais dificulda-
des, ensaios de deleção, em combinação com estudos dos sítios de ligação de proteínas, fr-
necem informações importantes a respeito de como a expressão de genes individuais é regu
lada, tendo complementado e ampliado as análises genéticas mais gerais sobre a diferencir
ção e o desenvolvimento.
11.3 ldentiÍicando e estudando o produto de tradução

de um gene clonado
Nos últimos anos, a clonagem gênica tem se tornado progressivamente útil no estudo, não ape-
nas dos genes propriamente, mas também das proteínas codihcadas pelos genes clonados. In-
vestigações sobre a estrutura e a função da proteína têm se beneficiado enormemente do desen-
volvimento de técnicas que permitem que mutações sejam introduzidas em pontos específicour
de um gene clonado, resultando em mudanças diretas na estrutura da proteína codificada.
Antes de se considerar tais procedimentos, será, primeiramente, focalizado o problenre
mais real de como isolar a proteína codificada por um gene clonado. Em muitos casos, essr
análise não será necessária, pois a proteínajá foi caracÍeizada muito antes de o experimento
de clonagem gênica ser realizado, e amostras purificadas da proteínajá se encontram dispo-
níveis. Por outro lado, há ocasiões em que o produto de ttadução de um gene clonado não foi
identificado. Um método para o isolamento da proteína é, então, necessário.
11.3.1 HRT e HART podem identificar o produto de tradução

de um gene clonado
Duas técnicas relacionadas, tradução com liberação do híbrido (HRT, do inglês hybrid-re-
lease translation) e tradução com retenção do híbrido (HART, do inglês hybrid-arrest
translation), são utilizadas para identificar o produto de tradução codificado por um gene clo-
I
Tradução lM
Crorunoev GÊNrcA E ANÁLrsÊ oe DNA 243
nado. Ambas dependem da capacidade de um mRNA purificado conduzir a síntese das pro-
teínas em sistemas de tradução livres de células. Esses são extratos celulares, normalmente
preparados a partir de sementes de trigo na fase germinativa ou de células de reticulócitos de
coelho (ambas extremamente ativas na síntese protéica), contendo ribossomos, tRNAs e todas
figura 11.18 as demais moléculas necessárias para a síntese protéica. A amostra de mRNA é adicionada ao
Ensaio de deleção. Um gere
sistema de tradução livre de células, juntamente com uma mistura dos 20 aminoácidos encon-
Fpórter Íoi ligado à região a 3sS-metionina
trados nas proteínas, um dos quais é marcado (freqüentemente é utilizado). As
de um gene espe
para a semente de unrr moléculas de mRNA são traduzidas em uma mistura de proteínas radioativas (Figura 11.19),
. A remoção do Írag- a qual pode ser separada por eletroforese em gel e visualizada por auto-radiografia. Cada ban-
de restrição, situado da representa uma única proteína, codificada por uma das moléculas de mRNA presentes na
os sítios R, deleta a se. amostra.
controladora, a qual Tanto a HRT quanto a HART funcionam melhor quando um clone de cDNA, preparado
a expressão gêni:r diretamente da amostra de mRNA, está disponível. Para a HRT, o cDNA é desnaturado, imo-
para a semente,
bilizado em uma membrana de nitrocelulose ou náilon, e incubado com a amostra de mRNA
Íorma que o gene-rePórt (Figura 11.20). O mRNA específico, correspondente ao cDNA, hibridiza com esse e perma-
agora, expressado em te
nece ligado à membrana. Após a remoção das moléculas não-ligadas, o mRNA hibridizado é
os tecidos da planta.
recuperado e traduzido em um sistema livre de células, o que fornece uma amostra pura da
proteína codificada pelo cDNA.
as controladoras
dessas potenciais di
de ligação de proteínas,
de genes individuais é
is gerais sobre a dife
a\q
\\t ^' *?q*.
.lôï:..
\..\\
\ ?
\\ sistemade
\
purificados \ / '."o+ traduçãolivre
tradução mRNAs o" tu'''"'
/r,or*oo".o,n
\
tut-t"'
I
útil no estudo, não
pelos genes clonado* -{ Proteína marcada
enormemente do \'j=l
em pontos t mRNA
da proteína codificada
/
I
focalizado o
\ Eletroforese em gel,
rnado. Em muitos casos \ auto-radiograÍia
muito antes d" o
"*p"#
já se encontram \
de um gene clonado \
necessário.
tradução Produtos
de tradução Marcadores de
peso molecular
marcados
(HRT, do inglês /t para proteínas
RT, do inglês hybrid
codificado por um Figura 11.19
Tradução livre de células.
244 T. A. Bnowlr
cDNA específico
/\
Membrana
Aplicação da mistura de mRNA
\ Hibridização com o mRNA específico

./\
/\
,#ï;,TFFV,
Remoção do mRNA hibridizado
Tradução livre de células, eletroforese

e auto-radiografia
Proteína
codiÍicada
pelo cDNA Figura 11.21
Figura 11.20
Tradução com re-
Tradução com liberação do
tenção do híbrido.
híbrido.
A tradução com retenção do híbrido grande núme

é ligeiramente diferente, no sentido de que o cDNA
desnaturado é adicionado diretamente à amostra de mRNA (Figura 1I.21).4 hibridização m- ção proveito:
vamente ocorre entre o cDNA e seu mRNA correspondente, mas, nesse caso, o mRNA não- se in vitro, tt
ligado não é descartado. Em vez disso, a amostra inteira é traduzida em um sistema livre específico de
&
células. O mRNA hibridizado éincapazde conduzir a tradução, de modo que todas as proteí DiÍerentes
nas' com exceção daquela codificada pelo gene clonado, são sintetizadas. O produto de tradu-
Uma quase i
ção do gene clonado é, portanto, identificado como a proteína que está ausente na auto-radio
grafia. mutações em
11.3.2 A análise de proteínas por mutagênese in vitro (1) Um fra

(2) Ogene
Embora HRT e HART possam identificar o produto de tradução de um gene clonado, essas ser rem
técnicas pouco informam a respeito da proteína propriamente dita. As principais perguntas,
eogen
questionadas pelo biologista molecular de hoje, estão centralizadas na relação entre a estrutu- (3) Um ol
ra de uma proteína e o seu modo de atividade. A melhor maneira de cuidar desses problemas ll.23c
é induzir uma mutação no gene que codifica a proteína e, então, determinar qual oifeito que
adicior
a alteração na seqüência de aminoácidos tem nas propriedades do produto de tradução (Figu-
hélice.
ta 11.22). No entanto, sob circunstâncias normais, as mutações ocoÍrem aleatoriamente e um
CLorueoeu GÊr.lcr e ANÁLtsE oe DNA 245
Ìïq(
I \ i \\^
., Adição do cDNA
es'ecíÍico
N...ì
preparação de mRNA \
aï\ Ct
ü\s
\\
Hibridização do
cDNAcomo mRNA
correspondente
Tradução livre de células
-9.,./
rQlt
(\_-/)r
I
// EletroÍorese em gel,
mRNA hibridizado auto-radiograf ia
não pode ser
traduzido
Figura 11.21 Produtos de HART Produtos da

lura 11.20
Tradução com re- tradução total
pdução com liberação do
tenção do híbrido.
brido.
]
È
I
t
grande número delas pode ter sido selecionado, antes que um4 que nos desse uma informa-
no sentido de que o
It.2t). A hibridi ção proveitosa, fosse encontrada. Uma solução para o problema é fornecida pela mutagêne-
se in vitro, técnica que possibilita que uma mutação direciónada seja realizada em um local
nesse caso, o mRNA
específico de um gene clonado.
ida em um sistema livre
modo que todas as DiÍerentes tipos de técnicas de mutagênese in vitro
izadas. O produto de
Uma quase ilimitada variedade de manipulações do DNA pode ser utilizada para introduzir
p estií ausente na auto-
mutações em genes clonados, destacando-se, a seguir, as mais simples.
t
(1) Um fragmento de restrição pode ser deletado (Figura ll.23a).

ib
(2) O gene pode ser clivado em um único sítio de restrição, uns poucos nucleotídeos podem
b d" ,r-
gene clonado, ser removidos com uma endonuclease específica para fita dupla, tal como Bal3l (p.&),
Eta.As principais pe e o gene religado (Figura ll.23b).
ps na relação entre a (3) um oligonucleotídeo pequeno pode ser inserido em um sítio de restrição (Figura
I de cuidar desses oroble ll.23c). A seqüência do oligonucleotídeo pode ser tal que a seqüência de aminoácidos
ideterminar qual o efeito adicional, inserida na proteína, produz, por exemplo, uma nova estrutura, tal como uma
Ë;;;;.o"';il;;; hélice-o, ou desestabilize uma estrutura existente.
rcorïem aleatoriamente e
F-
246 T. A. Bnowr.r
Embora potenc
Mutação, p. ex., T + A de restrição na
Gene
7-7777---71
* gonucleotídeo
v--.----a-7-7-71
cal do gene.
Utilizando r
em um gen
Existem inúrnr
# Proteína
\
\
*
Mutação, por
exemplo, ile -) leu
mos considera
forma de fita s
ples é purifica
Um oligonucl
contendo a alü
to, o oligonucl
Figura11.22 da fita compl
\ \t Uma mutação pode alterara 11.24b). Essa r
seqüência de aminoácidos e a molécula n

Propriedades da Gompare Propriedades da de uma proteína, aÍetando,
proteína normal proteína mutante Após a int
possivelmente, suas propri+
- - DNA produz I
dades.
vativa da replir
duzidas terá ar
maneira semel
(a) Deleção de um Íragmento de restrição mutada e metr
queados em m
Alul Alti Alul
Alul conter a molá
Gene r r
v-J-"-l
,,ar,,,,o, ---F- meio de hibrid
ligação Gene
I I' d"l"r"do dições muito t
I As células
I
q$$S ProteÍna Proteína com uma dividir (p. 36)
" normat 4N
deleção importante ras, resultanú
do pode ser p
(b) Remoção de um nucleotídeo de um sítio de restÍição Deleção
pequena efeito de uma
EcoRl
v)r---t Ejtl _ v-., ligação_ 771
/ to, ser avaliad
O potencia
I Bdst ?-
I alï:fiã'"*, A mutagênes
tencial extrac
Por exemplo,
qgsd{;:",lï"ï" Proteína com uma ^t"?g maneira cornt
deleção pequena
sível, por meì
(c) lnserção de um oligonuclêotídeo
cidos que det
lnserÇão zimática. As t
EcoRl
EcoRl_ ú rioâcão , tirem que o p
"-+-
I at/!l alternativo e
A
r
I /l
Oligonucleotíde. Figura 11.23
capacid
ráveis, segun
"sôs' Ur-?
( Diversas téc-
engenharie r
Proteína vimento de nr
Proteína
normal
C d""""- nicas de mu-
( tabitizada tagênese rn
vitro.
Cr-orueceu GÊNrcA E ANÁLrsE DE DNA 247
Embora potencialmente úteis, tais manipulações dependem da ocorrência casual de um sítio

de restrição na área de interesse, dentro do gene clonado. A mutagênese direcionada por oli-
gonucleotídeo é uma tócnica mais versátil, que pode introduzir uma mutação em qualquer lo-
cal do gene.
Utilizando um oligonucleotídeo para introduzir uma mutação pontual

em um gene clonado
Existem inúmeras maneiras diferentes de realizar-se a mutagênese por oligonucleotídeo; ire-
mos considerar o mais simples desses métodos. O gene a ser mutado deve ser obtido em uma
forma de fita simples e, por isso, é em geral clonado em um vetor M13. O DNA de fita sim-
ples é purifìcado e a região a ser mutagenizada é identificada por seqüenciamento do DNA.
Um oligonucleotídeo pequeno é, enÍão, sintetizado, complementar à região relevante, mas
contendo a alteração nucleotídica desejada (Figura ll.24a). A despeito desse malpareamen-
to, o oligonucleotídeo irá anelar ao DNA de fita simples e atuar como iniciador para a síntese
ura11.22 da fita complementar, utilizando o fragmento de Klenow da DNA-polimerase I (Figura
Èna mutação pode alterara Il.24b). Essa reação de síntese defrtaé continuada até que uma nova fita completa seja feita
üência de aminoácidos
e a molécula recombinante fique completamente de fita dupla.
uma proteína, aÍetando,
Após a introdução, via transfecção, em células de E. coli competentes, a replicação do
ivelmente, suas proprbr
DNA produz numerosas cópias da molécula de DNA recombinante. A natureza semiconser-
vativa da replicação do DNA garante que a metade das moléculas de fita dupla que serão pro-
duzidas terá ambas as f,rtas não-mutadas, enquanto metade será mutada em ambas as fitas. De
maneira semelhante, metade da progênie de fagos resultante portará cópias da molécula não-
mutada e metade portará a mutação. Os fagos produzidos pelas células transfectadas são pla-
queados em meio ágar sólido, de forma que placas são produzidas. Metade das placas deverá
conter a molécula recombinante original, e metade a versão mutada, o que é determinado por
L- meio de hibridização em placa, utilizando o oligonucleotídeo como sonda e empregando con-
Fen"
dições muito severas, de forma que somente o híbrido completamente pareado seja estável.
febtado
I
As células infectadas com vetores M13 não são lisadas, mas, ao contriírio, continuam a se
I dividir (p. 36). O gene mutado pode, portanto, ser expressado nas células de E. coli hospedei-
F
ras, resultando na produção da proteína recombinante. A proteína codificada pelo gene muta-
i
do pode ser purificada a partir das células recombinantes e suas propriedades estudadas. O
b
h
Ìr
efeito de uma mutação em um único par de bases sobre a atividade da proteína pode, portan-
to, ser avaliado.
I
O potencial da mutagênese direcionada por oligonucleotídeo
A mutagênese direcionada por oligonucleotídeo e as técnicas relacionadas possuem um po-
tencial extraordinário, tanto para a pesquisa básica quanto para a biotecnologia aplicada.
Por exemplo, o bioquímico pode, agora, formular questões muito específicas a respeito da
maneira como a estrutura da proteína afetaa atividade de uma enzima. No passado, foi pos-
sível, por meio de análises bioquímicas, obter-se alguma noção da identidade dos aminoá-
cidos que determinavam a ligação ao substrato e as funções catalíticas de uma molécula en-
L,çao zimâtica. As técnicas de mutagênese fornecem uma visão muito mais detalhada, por permi-
tirem que o papel de cada aminoácido seja avaliado pela substituição desse por um resíduo
alternativo e determinando-se o efeito que essa substituição causa na atividade enzimática.
A capacidade para manipular enzimas dessa maneira tem resultado em avanços conside-
ráveis, segundo nosso entendimento da catálise biológica, e tem nos levado ao novo campo da
Figura 1
t
Diversas
engenharia de proteínas, na qual as técnicas de mutagênese são utilizadas para o desenvol-
Fína nicas de vimento de novas enzimas com propósitos biotecnológicos. Por exemplo, alterações cuidado-
es-
Eada tagênese ir
vitro.
248 T. A. Bnowr.r
(phage disph,
bilitam que e
(a) Oligonucleotídeo
gly ala asn leu met --------l Apresenta

Seqüência
-------- ccA GCT AAT TTA ATc -------Ì gênica normal Essa técnica,
cói ôóÀ ÁrÀ AAT TAC nas na superl
gly ala tyr leu met
)
otioonucleotioeo clonagem do
\ Malpareamento não-complementar no gene clon
do fago (Figr
(b) Síntese da tita complementar
Gene no vetor M13

Fragmento
de Klenow, (a) Apresentação d
dNTPs
Õ
Oligonucleotídeo
Fila complementar é
totalmente sintetizada
(c) lsolamento dos Íagos contendo a mutação
Fagos contendo
(b) Fusão êntÍê o !
o gene normal / Plagueamento

em ágar
,/ Placas contendo
/ o gene mutado
Placas
Hibridização
em placa,
sondagem com Figura 11.24

o oligonucleotídeo Um métõdo para a
marcado
mutagênese direcb
nada por oligonu- (c) Utilizando ur
cleotídeo.
Placa de mbro
sas na seqüência de aminoácidos da subtilisina, uma enzima utilizada no sabão em pó, resnl. Lr
taram em versões manipuladas com maior resistência aos desgastes térmico e de branqu*
mento (oxidativos) que ocorrem nas máquinas de lavar roupas. L
11.3.3 Estudando as interações proteína-proteína
Nas células vivas, poucas, se é que existem, proteínas funcionam em total isolamento. Ao c*
trário, as proteínas trabalham juntas em rotâs bioquímicas e em complexos multiprotéicos. In-
formações a respeito da função de uma proteína que não tenha sido previamente estudada p Figura 11.25
dem, freqüentemente, ser obtidas por meio da determinação de quais outras proteínas trab* Apresentação por fagr
nante. (b) O gene Íusit
lham juntamente com ela na célula. Duas técnicas importantes, a apresentação por fagl terações entre a Prote
i
I
Clorunoeu GÊrurcr e ANÁLrsÊ oe DNA 249
Qthage display) e o sistema de dois híbridos de levedura $teast two hybrid systen), possi-
bilitam que essas interações proteína-proteína sejam examinadas.
Apresentação por Íago

Essa técnica é chamada de apresentação por fago porque envolve a "apresentação" de proteí-
nas na superfície de um bacteriófago, normalmente M13 (Figura ll.25a).Isso é obtido pela
clonagem do gene que codifica a proteína em um tipo especial de vetor Ml3, um que resulta
no gene clonado tornando-se fusionado com um gene que codifica uma proteína do capsídeo
do fago (Figura ll.2sb).Após a transfecção de E. coli, esse gene fusionado comanda a sínte-
(a) Apresentação da proteína na superÍície de um Íago
Apresentação das proteínas
(b) Fusão entÍe o gene clonado e um gene do capsídeo do Íago
Gene do Íago Gene clonado
Expressao I
dogene \\
\ Â
ffirffi,
j\)v6'ò' .-,,
Apresenraçáo
da proteÍna
Proteína do
Figura 11.24 capsídeo )
Um método panaa do Íago
mutagênese
nada por oligonu (c) Utilizando uma biblioteca de apresentação por íago
cleotídeo.
Biblioteca de
apresentação
por Íago
Placa de microtitulação
t
pada no sabão em pó, \ì ( ì /(

istes térmico e de brar
!
I
*
)
l
ffi Lavagens
Fagos retidos
I
ProteÍna-teste
Fm total isolamento. Ao
firplexos multiprotéicoe.
Figura 11.25
ho previamente esfudade
Apresentação por Íago. (a) Apresentação de proteínas na superÍície de um Íago filamentoso recombi-
lquais outras proteínas mnte. (b) O gene Íusionado é utilizado para apresentar a proteína. (c) Uma maneira de detectar as in-
g, a apresentação por
brações entre a proteína-teste e um Íago de uma biblioteca de apresentação.
F
Ì
F
250 T. A. Bnowlr
se de uma proteína híbrida, parcialmente constituída da proteína do capsídeo e parcialmente

do produto do gene clonado. Com sorte, essa proteína híbrida será inserida dentro do capsí-
deo do fago, de forma que o produto do gene clonado fique localizado na superficie das par-
tículas de fago.
Normalmente, essa técniça é realizada com uma biblioteca de apresentação por fago,
constituída de muitos fagos recombinantes, cada um apresentando uma proteína diferente. Bi-
bliotecas representativas podem ser preparadas por clonagem de uma mistura de cDNAs pre-
parados a partir de um determinado tecido ou, menos facilmente, por clonagem de fragmen-
tos de DNA genômicos. A biblioteca consiste em fagos apresentando uma variedade de pro-
teínas e é uilizada para identificar aqueles que interagem com a proteína a ser testada. Essa
proteína-teste poderá ser uma proteína pura ou uma que, ela própria, seja apresentada em urìit
superfície de fago. A proteína é imobilizada nas canaletas de uma placa de microtitulação ou
sobre partículas que podem ser usadas em uma coluna de cromatografia de afinidade, e, en-
tão, misturada com a biblioteca de apresentação por fago (Figura ll.25c). Os fagos retidos na
Figura 11.26
placa de microtitulação ou dentro da coluna, após uma série de lavagens, serão aqueles que
O sistema de
apresentam proteínas que interagem com a proteína-teste imobilizada. dois híbridos de
levedura. (a) Um
O sistema de dois híbridos de levedura
par de Íatores de
O sistema de dois híbridos de levedura é muito diferente da apresentação por fago. Esse pro- transcrição que
cedimento está baseado na descoberta de que a expressão gênica na levedura Saccharomyces devem interagil
cerevisiae depende de interações entre pares de fatores de transcrição (Figura ll.26a). No sis- a Íim de um gene
tema de dois híbridos, um pÍÌr de fatores de transcrição, responsável pela expressão de um ge- da levedura ser
ne de levedura, é substituído por proteínas fusionadas, cada uma parcialmente composta do expressado. (b) A
fator de transcrição e parcialmente da proteína a ser testada. A capacidade desse par de híbri- substituição do
dos de conduzir a expressão do gene-alvo da levedura é, então, testada. Íator de transcri-
Para utilizar o sistema, dois experimentos de clonagem em levedura devem ser realizados. ção 1 pela proteÊ
na híbrida 1. in-
O primeiro experimento de clonagem envolve o gene cujo produto protéico está sendo estu-
terrompe a ex-
dado. Esse gene é fusionado àquele de um dos pares de fatores de transcrição e a construção pressão do gene,
éligada em um vetor de levedura. As leveduras recombinantes produzidas não são capazes de uma vez que 1*
expressar o gene-alvo, pois esse fator de transcrição modificado não pode interagir com o seu não pode intera-
parceiro (Figura ll.26b). gir com o fator de
No segundo experimento de clonagem, uma versão híbrida do parceiro é construída e in- transcrição 2. (c)
serida nas células de levedura. A restauração da expressão do gene-alvo indica que os dois fa- A substituição do
tores de transcrição híbridos podem interagir. As fusões são projetadas de tal maneira que is- Íator de transcri-
so somente poderá acontecer se as interações oco1Terem entre os componentes das proteínas- ção 2 pela proteí-
teste dos híbridos, e não entre os segmentos dos fatores de transcrição (Figura 11.26c). Pares na híbrida 2* res-
de proteínas-teste que atuam um sobre o outro são, portanto, identificados. O segundo expe-
taura a expres-
são do gene, ca-
rimento de clonagem pode envolver uma biblioteca de recombinantes que representam proteí-
so as partes hÊ
nas diferentes, de forma que uma proteína poderá ser testada contra muitas outras.
bridas de 1* e 2*
sejam capazes
de interagir.
F
Cr-ounceu GÊrurcn e ANÁLrsE oe DNA 251
capsídeo e parcialmente
inserida dentro do capsí- (a) Interações entre Íatores de transcrição
na superficie das par-
(ò ooit fatores de transcrição
apresentação por fago"

proteína diferente. Bi-
mistura de cDNAs pre- /-;(^ tnteração
por clonagem de fragmer \IX
uma variedade de pro
\
ína a ser testada. Essa
seja apresentada em u'na
placa de microtitulação m \
de afinidade, e, *
Expressao
- do gene
1.25c). Os fagos retidosn Figura 11.26 (b) O resultado do primeiro expeÌimento de clonagem
serão aqueles qrc O sistema de
-o
dois híbridos de
levedura. (a) Um @
par de Íatores de
por fago. Esse pu transcrição que
Fator de transcrição
híbrido
levedura Saccharom devem interagir, Ausência de interação
@
(Figura 11.26a). No
pela expressão de um
aÍim de um genê
da levedura ser
o<pressado. (b) A
o \
parcialmente composta
substituição do
idade desse par de
tator de transcri-
ção 1 pela proteÊ Não ocorre a
devem serreali
na híbrida 1* in- expressão do gene
protéico está sendo terrompe a ex- -
pressão do gene, (c) O resultado do segundo experimento de clonagem
idas não são capazes *
uma vez que 1
pode interagir com o
parceiro é construída e
não pode intera-
gir com o fator de
nanscrição 2. (c)
@@
indica que os dois A substituição do
Íator de transcri- lnteração
de tal maneira quei
ção 2 pela proteÊ
@
componentes das
na híbrida 2* res- {
(Figura II.26c).
taura a expres-
ificados. O segundo
são do gene, ca-
que representam
so as partes hÊ
bridas de 1* e 2* Expressão
do gene
sejam capazes
de interagir.
F
I
!' ,
-_:::::j=:::=.=€;i
ì
I
CnpíruLo 12
Á. fnna, in Biotechnology, llL
I vitusspecific RNA: analysis by

Estudando Genomas
le.
interactions. Trends in Gert-
itin
i
chain reaction. Irendr
fotft"tur.
interactions by polyacrylamih
from rare transcripts: ãrF

the National Academy of Scia-
of protein-DNA binding ry-

binding of proteins to specift
system. Nucleic Acith
major groove regions at rh

t2,3129-33. An example offt Genômica: como seqüenciar um genoma, 254 Estudos do transcritoma e do proteoma, 269
Pós-genômica: tentando entender a seqüência de um
selection. Proceedings of b
genoma,265
por oligonucleoídeo.l
mapping by DNA.mRNA\I
of the USA, 74, 437G74-
No início do século XXI, a ênfase da biologia molecular passou do estudo de genes indivi-
in phage and host biologffl.
duais para o estudo de genomas inteiros. Essa mudança foi possível graças ao desenvolvimen-
to, durante adécadade 1990, de métodos para o seqüenciamento de grandes genomas. O se-
qüenciamento de genomas começou antes da década de 1990 - vimos, no Capítulo 10, como
o primeiro genoma, aquele do fago QXl74, foi completado em 1975 -, mas somente 20 anos
depois, em 1995, o primeiro genoma de um organismo de vida livre, o dabacténa Haemophi-
lus influenzae,teve seu seqüenciamento concluído. Os cinco anos seguintes constituíram-se
em um divisor de águas, com as seqüências dos genomas de quase 50 outras bactérias sendo
publicadas, juntamente com as seqüências completas de genomas muito maiores, como o de
levedura, o da mosca-das-frutas, o de Caenorhabditis elegans (um verme nematódeo), o da
Arabidopsis thaliana (uma planta) e o humano. Em 2001, o seqüenciamento de genomas bac-
terianos já havia se tornado uma rotina e a execução de projetos dirigidos a genomas eucarió-
ticos, passado a ser encarada com uma confiança muito maior do que a possível apenas uns
poucos anos antes.
Para o entendimento de um genoma, três tipos distintos de análise devem ser executados:
(1) A genômica é a aquisição dos dados de seqüência. Os dados são adquiridos na forma de
muitas seqüências individuais de 500 a 800 pb, que devem ser montadas na seqüência ge-
nômica contínua. É necessário, portanto, ser elaborada uma estratégia para a montagem
correta das seqüências.
(2) A pós-genômica ou a análise funcional é a análise da seqüência de um genoma para lo-
calizar os genes, as seqüências controladoras e outros elementos interessantes, seguida de
vários experimentos para determinar as funções de quaisquer genes desconhecidos que te-
nham sido descobertos.
I
254 T. A. Bnowlr
(3) A bioinformâtica é o uso de sistemas computadorizados para auxiliar as pesquisas genô.

mica e pós-genômica. A bioinformática inclui a montagem computadorizada de contip
de seqüências, o exame de seqüências para verificação da presença de genes, a previsão Figura 12.1
de função para genes identificados e o armazenamento da vasta quantidade de dados ge A abordagem de
Íábrica para o
rados durante um projeto de seqüenciamento de genoma.
seqüenciamento
de DNA em
grande escala.
12.1 Genômica: como seqüenciar um genoma
Um experimento de seqüenciamento por terminação de cadeia simples executado manual-
mente produz em torno de 400 nucleotídeos de seqüência, enquanto uma única corrida em um
seqüenciador automático gera em torno de 750 pb. Mas o tamanho de um genoma bacteriano
típico é de 4.000.000 pb e o do genoma humano é de 3.200.000.000 pb (Tabela 12.1). Fica óL
vio que um grande número de experimentos de seqüenciamento deve ser executado para de-
E
terminação da seqüência completa de um genoma.
Essa situação, aparentemente desanimadora, pode ser resolvida com o uso de sistemas ro-
botizados para a preparação de DNA para seqüenciamento e para a execução dos experimen-
tos de terminação de cadeia, com as seqüências sendo lidas por seqüenciadores automáticm
Figura12.2
que transferem os dados diretamente para um computador (Figura 12.1). Nos laboratórion (a) A abor-
com estilo de fábrica que executam esses projetos, o principal objetivo é manter os seqüencia- dagem alea-
dores automáticos operando em suas capacidades máximas. Cada seqüenciador é capaz & tória (sf,ot-
executaÍ até 96 experimentos em paralelo, gerando 72.000 pb de seqüência a cada duas horas gun ap-
As maiores iniciativas de seqüenciamento utilizam até 100 seqüenciadores automáticos ope- proach) e
rando 24 horas por dia, o que representa uma produção teórica diária de 50.000.000 pb. Nes- (b) a abor-
se contexto, o seqüenciamento de genomas já não parece ser uma tarefa tão assustadora. dagem de
Na prática, a geração de dados de seqüência suficientes é um dos aspectos mais rotineirm contigs de
de um projeto de seqüenciamento de genoma. O primeiro problema real que surge é a neces- clones para
sidade de montar os milhares, ou, às vezes, milhões, de seqüências individuais de 750 pb em a montagem
da seqüên-
uma seqüência genômica contínua. Duas estratégias diferentes foram desenvolvidas para a
cia de um
montagem de seqüências (Figura 12.2).
genoma.
(1) A aboi
Tabela 12.1 Tamanhos de genomas representativos aleator
busca r
Espécie Tipo de organismo Tamanho do genoma (Mb) (2) A abor
rante a
Mycoplasma genitalium Bactéria 0,58
todel
H ae mop hilu s infl ue nzae Bactéria 1,83
mente
Escherichia coli Bactéria 4,64
a parti
S ac charomy ce s ce iae
rev is Levedura t2,t
C aenorhab ditis e le g ans Verme nematódeo 91
12.1.1 A aborda
D ro s op hil a me lano g a s t e r Inseto 180
Arabidopsis thaliana Planta t25 A exigência
Homo sapiens Mamífero 3.200 breposições
Triticum aestivum Planta (trigo) 17.000 ra que seja t
rado e não 1
b
Cr-oruncev GÊrurca e ANÁLrsE oe DNA 255
nrxiliar as pesquisas
imputadorizad ontip
a de c
genil
t-*"*-" -l F;"^Ã;ã Ë"-Ã;;l
henca de senes. a orevisfu Figura 12.1 I - I
lExeculamlllll
lnurouÁrrcosl I I
p quantidade de dados gs- A abordagem de I or | ------------* | Lêemas I --------------------= | Analisam

I
Íábrica para o I experimentos de I I seqüências I I os dados I
I
t
I I
i.
seqüenciamento
I
i
de DNA em lseqüenciamentol I I
grande escala.
I
hrt"t executado
puma única corrida em Molécula de DNA
Iae um genoma bacteri Quebra em fragmentos

f pb (Tabela l2.l ). Fica aleatórios
Montagem de um
ser executado para conlunto de fragmentos
fzve clonados com sobre-
posições parciais
Frgura12.2
12.1). Nos
(a) A abor-
dagem alea-
seqüenciador é, capaz tória (shoÈ
[iência a cada duas h gun ap-
Montasem da seqüência
iadores automáticos proach) e
a de 50.000.000 pb. (b) a abor- /
efa tão assustadora dagem de
contigs de Seqüência de DNA
aspectos mais rotinei
real que surge é a na dones para
individuais de 750 pb a montagem
da seqüên- (b) A abordagem de contigs
desenvolvidas pmr (a) A abordagem aleatória
cia de um de clones
genoma.
(1) A abordagem aleatória (do inglês shotgun approach), na qual o genoma é quebrado
aleatoriamente em fragmentos curtos. As seqüências resultantes são examinadas em
busca de sobreposições, utilizadas para a montagem da seqüência contínua do genoma.
(2) Aabordagem decontigs declones, queenvolveumafasedepré-seqüenciamento, du-
rante a qual é identificada uma série de clones parcialmente sobrepostos. Cada segmen-
iI o,sS
1,83
to de DNA clonado é, então, seqüenciado e as seqüências são posicionadas adequada-
mente no mapa de contigs, para ordenar e gradualmente montar a seqüência genômica
. 4,64
', l2'r a partir das sobreposições.
,97
' 12.1.1 A abordagem aleatória para o seqüenciamento de genomas
180
r25 A exigência fundamental para a abordagem aleatória é a viabilidade da identificação de so-
I3.200 breposições parciais entre todas as seqüências individuais que forem geradas. Além disso, pa-
.000 ra que seja obtida a seqüência genômica correta, esse processo de identihcação deve ser acu-
rado e não pode ser ambíguo. Um erro na identificação de um par de seqüências sobrepostas
F
256 T. A. Bnowr'r
parcialmente poderia levar à montagem da seqüência genômica em uma ordem incorreta ouà ram executa
perda completa de algumas partes dela. Como a probabilidade de ocorrência desse tipo de er- rejeitadas, p,
ro aumenta para genomas maiores, a abordagem aleatória tem sido utilizada principalmenÍc ram entrada
com os genomas bacterianos menores. conjunto de
genoma de,l
O projeto de seqüenciamento do genomade H. influenzae
Poderia I
A abordagem aleatória foi utilizada com sucesso pela primeira vez com abacténa H. influen- acabassem s
zae,pnmeiro organismo de vida livre que teve seu genoma completamente seqiienciado, com de seqüêncii
os resultados publicados em 1995. A primeira etapa foi quebrar o genoma de 1.830 kb da bac- grande quan
téria em fragmentos curtos, que serviriam de molde para os experimentos de seqüenciamento sem, por aci
(Figura 12.3). Poderia ter sido utilizada uma endonuclease de restrição, mas a sonicação (p- mos de tenrl
223) for escolhida por ser mais aleatória e, portanto, capaz de reduzir a possibilidade de ap lacunas indi
recimento de lacunas na seqüência do genoma. a mais bem-
Foi decidido que o projeto concentrar-se-ia nos fragmentos de 1,6 a 2,0 kb, pois eles po- preparada er
deriam gerar duas seqüências de DNA, uma a partir de cada extremidade, reduzindo a quarF gonucleotíd
tidade de clonagens e de preparações de DNA que seriam necessárias. O DNA sonicado fo( mentos. Em
portanto, fracionado por eletroforese em gel de agarose e os fragmentos de tamanho deseja dicando que
do, purificados a partir do gel. Após a clonagem, 28.643 experimentos de seqüenciamento fe estavam adj
chada pelo r
GENOMA
(1.830 kb)
FRAGMENTOS ALEATORIOS
/ cronaoem
/
Figura í2.4
BIBLIOTECA DE CLONES
LJtilizando hibridiza-
ção com oligonu-
cleotídeos para fe-
/ chamento das lacu-
Seqüenciamento
nas na seqüência do
/a genoma de H. in-
fluenzae. Os oligo-
24.304 SEOÜÊNCtAS
nucleotídeos 2 e 5
hibridizam com o
Figura 12.3 mesmo clone de À,
Montajem de seqüências Uma representa- indicando que os
ção esquemática oütigs I e lll são ad-
das principais eta- jacentes. A lacuna
140 CONTTGS pas do projeto de entre eles pode ser
seqüenciamento Íechada a partir do
do genoma de H. seqüenciamento de
influenzae. parte do clone de 1..
Cr-onecev GÊrutcn e ANÁltse oe DNA 257
çias - 4'339 no total - foram

fpma ordem incorreta ouà ram executados com 1g.687 dos clones. Algumas dessas seqüên
seqüências restantes de-
tsorrência desse tiPo de er- rejeitadas, porque tinham extensões menores que 400 pb. As24.304
os dados' O resultado foi um
to utilizada princiPalmene ram entrada em um computador, que levou 30 horas analisando
a um segmento diferente do
conjunto de 140 seqüêncìas contínuas, cada uma correspondendo
genoma de H. influenzae.
\t"rr"e Poderia ter sido possível continuar o seqüenciamento dos fragmentos
sonicados, para que
individuais' Porém' 11'631'485 pb
lcom a bactéiaH. influet acabassem sendo fechadas as lacunas entre os segmentos
do genoma -, sugerindo que uma
Famente seqüenciado,
con de seqüênciajá haviam sido gerados - seis vezes a extensão
que os fragmentos corretos fos-
1.830 kb dabr- granO" quantldade de trabalho adicional seria necessiíria até
lenoma de eficiente em ter-
de seqüenciamem J"-, poi acaso, seqüenciados. Nesse estágio do projeto, a abordagem mais uma das
de cada
mas a sonicação (r *or.á" tempo foi a utilização de uma estratégia fu.igiOu para o fechamento
para o fechamento das lacunas'
a possibilidade de aP*' lacunas individualment". V,áriu, abordagens foram utilizadas
delas envolvendo ã análise por hibridização de uma biblioteca de clones
a mais bem-sucedida
com uma série de sondas (oli-
1,6 a2,O kb, pois eles 1n- preparada em um vetor 1, (Figura I2.4). Abiblioteca foi triada
de cada um dos 140 seg-
idade, reduzindo a qum gonucteotfOeos), cujas ,"quêï"iut correspondiam às extremidades
com o mesmo clone de l" in-
as. O DNA sonicado fc* mentos. Em alguns casos,ìois oligonuclóotídeos hibridizavam
por aqueles oligonucleoúdeos
de tamanho deseja" dicando que aúxtremidades dos dois segmentos representados
extremidades podia, então' ser fe-
de seqüenciamentofç estavam adjacentes no genoma. A lacuna entre essãs duas
de )"'
chada pelo seqüenciaménto da parte apropriada do clone
(a) Preparação dos oligonucleotídeos a seÍem

utilizados como sondas
Contigl l----------
12
1ã Sondas de
Contigll !-----------: oligonucleotídeos
34
Contiglll
ão
Figura 12.4
(b)Triagem de uma biblioteca genômica
Utilizando hibridiza-
ção com oligonu-
cleotídeos Para Íe- Sonda com o Sonda com o
chamento das lacu- oligonucleotídeo 2 oligonucleotídeo 5
nas na seqüência do
genoma de H. in- ê*&€ô**4*& 6&&&&a****
&&ê*èêeer& ô&&ss&&*64
fluenzae. Os oligo- S9&A&**a6e S*9&8Aea*A
eaa$ê*ô*s* âessg&êaô?
nucleotídeos 2 e 5
**ssss&*&ô 9Sé**s*&ss
hibridizam com o 48sêô*4*S* **a6*?*ç**
Figura 12.3 mesmo clone de ?r,
Uma representa- indicando que os
ção esquemática
antigs I e lll são ad-
das principais eF jacentes. A lacuna Gonclusão:
entre eles Pode ser Oscontgslelll
pas do projeto dê tlll estão adiacentes
seqüenciamento Íechada a Partir do |_--_-.:|-_-_-_-:l no genoma
do genoma de H. seqüenciamento de 1256
influenzae. parte do clone de L.
Ë
258 T. A. Bnowlr
Problemas da clonagem aleatória 139), com,

A estratégia de clonagem aleatória foi exitosa com muitos genomas bacterianos. Isso te curto e c
se del.e
ao fato de tais genomas bacterianos serem pequenos, de modo que as exigências computacio- noma hurn
nais para a identificação de sobreposições de seqüências não são muito grandes. Ademais" ciais (BAC
eles não contêm seqüências de DNA repetidas, que são seqüências de poucos pares de bases emcontigs
até várias quilobases, repetidas em dois ou mais locais em um genoma. Tais seqüências pro- Montage
vocam problemas para a abordagem aleatória pois, quando são montadas, aquelas que se erF (chromo
contram parcial ou inteiramente no interior de um elemento repetido podem ser alinhadas, por
sobreposição acidental, com a seqüência idêntica presente em um elemento de repetição dife- Uma das té
rente (Figura 12.5). Isso pode levar ao posicionamento inconeto ou a perdas de parte ou de to- mossômic
da a seqüência quando da montagem do genoma. Por essa razão, o seqüenciamento aleatório um clone é
é considerado inadequado para genomas eucarióticos, visto que eles possuem muitos elemen-
sonda de hi
tos repetidos. Mais adiante, neste capítulo, será visto como essa limitação pode ser superada nes que ger
pelo uso de um mapa genômico para dirigir a montagem de seqüências obtidas pela aborda- cialmente s
gem aleatória. blioteca. M
posições ac
12.1.2 A abordagem de contigs de clones um procedi
te quando c
A abordagem de contigs de clones não tem as limitações do seqüenciamento aleatório e, por- lativamenú
tanto, é capaz de gerar uma seqüência acurada de um grande genoma com DNA repetitivo, clF entre contil
jo inconveniente é envolver muito mais trabalho, o que a torna mais demorada e cara. O tem-
po e o esforço adicionais são necessários para a construção das séries de fragmentos de DNA Métodos
clonados parcialmente sobrepostos. Depois de isso haver sido feito, cada fragmento clonado O ponto fn
é seqüenciado pelo método aleatório e a seqüência do genoma é montada passo a passo (Fi* truir, apart
gura 12.2). pidas para i
Cada fragmento de DNA clonado deve ser o mais longo possível, de modo a minimizaro objetivo a i,
número total de clones necessário para cobrir todo o genoma. Um vetor de alta capacidade é
por isso utilizado. O primeiro cromossomo eucariótico a ser seqüenciado - o cromossomo IIil
de Saccharomyces cerevisiae - foi inicialmente clonado em um vetor do tipo cosmídeo (p-
Figura 12.5
Seqüências repetidas Um problema da
idênticas abordagem der
( \ tória. Uma so-
Molécula de DNA breposição in-
correta de duas
Seqüência 1 Seqüência 2 seqüências é lei-
ta devido ao Íab
de ambas termÈ
Sobreposição das seqüências 1 e 2 narem em uma
região interna&
um elemenlo r+
2 petido. lsso re.
I
sulta na ausên-
I
I
Montagem da seqüência cia de um segr
Figura 12.6
Y mento da molê
Caminhada cro-
----- cula de DNA na
Seqüência de DNA deduzida mossômica
seqüência morr
(chromosome
tada.
walking).
Croueceu GÊNtcA E AruÁlrsr oe DNA 259
139), com o contig resultante incluindo 29 clones. Contudo, o cromossomo III é relativamen-
bacterianos. Isso se te curto e o tamanho médio dos fragmentos era de apenas 10,8 kb. O seqüenciamento do ge-
noma humano, muito mais longo, exigiu 300.000 clones de cromossomos bacterianos artifi-
as exigências com
muito grandes. ciais (BAC, de bacterial artificial chromosome) (p. lal). A montagem de todos esses clones
em contigs cromossomo-específicos foi uma tarefa gigantesca.
de poucos pares de
Tais seqüências Montagem de contigs de clones por caminhada cromossômica
aquelas que se (chromosome walkingl
podem ser alinhadas.
elemento de repetição
Uma das técnicas que pode ser utilizada para montar um contig de clones é a caminhada cro-
a perdas de parte ou de
mossômica (do inglês chromosome walking). Para iniciar uma caminhada cromossômica,
um clone é selecionado aleatoriamente a partir da biblioteca, marcado e utilizado como uma
o seqüenciamento
sonda de hibridização contra todos os outros clones da biblioteca (Figura 12.6a).Aqueles clo-
possuem muitos
nes que geram sinais de hibridização são os que se sobrepõem à sonda. Um desses clones par-
limitação pode ser
cialmente sobrepostos é, então, marcado e utilizado em uma segunda etapa de triagem da bi-
obtidas pela
blioteca. Mais sinais de hibridização são, então, identificados, alguns deles indicando sobre-
posições adicionais (Figura 12.6b). Assim, o contig de clones é construído gradualmente, em
um procedimento passo a passo. Entretanto, esse processo é laborioso, sendo utilizado somen-
te quando o contig corresponde a um cromossomo curto, de modo a envolver um número re-
to aleatório e, lativamente pequeno de clones, ou quando o objetivo é o fechamento de uma ou mais lacunas
com DNA repetifivo- entre contigs, que foram montados por métodos mais rápidos.
is demorada e cara. O
de fragmentos de Métodos rápidos para a montagem de contigsde clones
ito, cada fragmento c O ponto fraco da caminhada cromossômica é começar em um ponto de partida fixo e cons-
é montada passo a passo truir, a partir dali, o contig de clones em um lento processo passo a passo. As técnicas mais rá-
pidas para a montagem de contigs de clones não utilizam um ponto de partida fixo e têm por
l, de modo a mini objetivo a identificação de pares de clones parcialmente sobrepostos: quando um número su-
vetor de alta
- o cromossomo
vetor do tipo cosmídeo
(a)Triagem da biblioteca com o clone A1
Figura 12.5 ABCDEFGHIJ

Um problema 1 at r: a r, a a è t t
abordagem 2 A1
tória. Uma so 3
4
breposição in- 5 B4
correta de duag 6
seqüências é
ta devido ao
de ambas ternü
narem em utna (b)Triagem da biblioteca com o clone 14
região interna
um elemento re
petido. lsso re ABCDEFGHIJ
sulta na ausàr a6 * & t 6 t * i *
cia de um segr
1
2 ê a ? t a a, * * a A1 F2
Figura 12.6 3 9r;*!&€t4t?
mento da mdê 4 ê 3 $ è I & ar * as
Caminhada cro- ã*4***êgtè B4
cula de DNA m 5 â?*ë4*eô?*
mossômica 6
seqüência mm (chromosome
tada.
walking).
f.
94
Ë
b
260 T. A. Bnowr.r
ficiente desses pares for identificado, o contig é revelado (Figura 12.7). As várias técnicas que
podem ser utilizadas para a identificação das sobreposições são conhecidas coletivamente por
datiloscopia de clones (do inglês cloneftngerprinting).
A datiloscopia de clones é baseada na identificação de características da seqüência que são
compaÍtilhadas por um par de clones. A abordagem mais simples consiste em digerir cada
clone com uma ou mais endonucleases de restrição e buscar pares de clones que comparti-
lham fragmentos do mesmo tamanho, excluindo aqueles derivados do vetor e não do DNA ne-
le inserido. Essa técnica pode parecer de simples execução, mas, na práti ca, ela é bastante de-
morada na parte de análise dos géis de agarose resultantes, em busca dos fragmentos compar-
tilhados. Existe também uma possibilidade relativamente elevada de que dois clones que não
se sobrepõem gerem, por acaso, fragmentos de restrição distintos, mas com tamanhos indis-
tinguíveis por eletroforese em gel de agarose.
Resultados mais acurados podem ser obtidos por PCR de DNA repetitivo, também conhe-
cido como PCR de elemento repetido disperso (IRE-PCR, do inglês interspersed repeat
element PCR). Esse tipo de PCR utiliza iniciadores projetados para anelar com seqüências de
DNA repetitivo e para dirigir a amplificação de DNA entre repetições adjacentes (Figura
12.8). Repetições de um tipo determinado estão distribuídas essencialmente de maneira alea-
tória em genomas eucarióticos, com distâncias variáveis entre elas, de modo que produtos de
diferentes tamanhos são obtidos quando tais iniciadores são utilizados com clones de DNA
eucariótico. Se um par de clones gera produtos de PCR de mesmo tamanho, eles devem con-
ter repetições espaçadas de maneira idêntica, possivelmente porque os fragmentos de DNA
sobrepõem-se parcialmente.
Montagem de contigs de clones pela análise do conteúdo

de sítios-alvo seqüência-específ icos
Uma terceira maneira de montar um contig de clones é a busca sistemática de pares de clo-
nes que contêm uma seqüência de DNA específica, que ocoÍïe em apenas uma posição no
genoma em estudo. Se dois clones diferentes contêm essa característica, então eles clara- Figura 12.8
mente devem sobrepor-se parcialmente (Figura 12.9). Uma seqüência desse tipo é chama- PCR de elemento
da de sítio-alvo seqüência-especíÍico (srs, do inglê,s sequence tagged siÍe). Freqüente- repetido disperso
(interspersed re-
mente, uma STS é um gene que foi seqüenciado em um projeto anterior. Como a seqüência
peat element
é conhecida, pode ser projetado um par de iniciadores de PCR específicos para aquele ge-
PCH) (rRE-PCR).
ne, os quais podem ser utilizados para identificar os membros de uma biblioteca de clones
que o contêm. Entretanto, a STS não tem de ser necessariamente um gene, mas qualquer
F2 t4
: trb tz
H7 Sobreposições identif icadas
por datiloscopia de clones
A1 B4
A1
Figura 12.7
Montagem de Figura 12.9
um contig de A base do ma-
clones pela tec- peamento por
H7 A1 F2
nica de datilos- conteúdo de
Dedução do conÍrg de clones
u 14 G6 copia de clones
(clone finger-
STS.
printingl.
z
b
Ë
t
::
Clorueeeu GÊrurcr e ANÁLtsE oe DNA 261
12.7). As viírias técnicas

hhecidas coletivamente
(a) A base da IRE-PCR
;
fbticas da seqüência que Duas repetições idênticas

I consiste em digerir
(\
hs de clones que
lò vetor e não do DNÀ
b prática,.ela é bastante Anetamento dos iniciadores
fca dos fragmentos coq J
lde que dois clones que
L mas com tamanhos i
lrepetitivo, também
i inglês interspersed rqs
I anelar com seqüências O produto da PCR inclui a região
letições adjacentes (Fi entre repetições adjacentes
fcialmente de maneira
I, de modo que produtos
pados com clones de (b) lnterpretação dos resultados
Itamanho, eles devem cc*
pe os fraementos de Clone I Clone ll
Marcadores Clone lll
ì ì ( ,
ht".ioo
I
$emática de pares de ch"

A banda compartilhada
im apenas uma posição m
sugere que os clones ll
herística, então eles clara- Figura 12.8
e lll sobrepõem-se
lência desse tipo é cham PCR de elemento
parcialmente
p tagged sdÍe). Freqüenlo- repetido disperso
(interspersed re-
interior. Como a seqüêncie peat element
foecíficos para aquele go- PCR) (rRE-PCR).
luma biblioteca de cloner
P um gene, mas qualqrm
I
Coleção de
clones ilt -Éil
o Sítio-alvo
IV V seqúência-específ ico
Figura12.7 -.l
Montagem de Figura 12.9

um contig de A base do ma- IV
clones pela téc- peamento por -- Os clones lV e ll devem se sobrepor
nica de datilos. conteúdo de il
STS. -a
copia de clones
(clone finger-
printingl.
F
262 T. A. Bnowrrr
segmento curto de DNA obtido a partir do genoma, desde que ele não seja oriundo de um
elemento repetitivo.
12.1.3 Utilizando um mapa para auxiliar na montagem

de uma seqüência
Figura 12.10
O mapeamento do conteúdo de sítios-alvo seqüência-específicos é um método particularmen-
Tipificação de um poli-
te importante para a montagem de contigs de clones, pois, muitas vezes, as posições das STSs
morfismo de sítio de
no genoma foram determinadas por mapeamento genético ou mapeamento físico. Isso sig- restrição Por PCR. Na
nifica que as posições das STSs podem ser utilizadas para ancorar um contig de clones em um trilha central, o produ-
mapa genômico, permitindo que a posição do contig no interior de um cromossomo seja de- to da PCR gera duas
terminada. Veremos agora como esses mapas são obtidos. bandas, porque Íoi cli-
vado pelo tÍatamento
Mapas genéticos com a enzima de res-
Um mapa genético é aquele obtido por meio de estudos genéticos, utilizando princípios men- trição. Na trilha direita,
delianos e envolvendo progrÉÌmas de cruzamentos dirigidos, para organismos experimentaiq existe apenas uma
ou análise de pedigrees, para humanos. Na maioria dos casos, os lócus estudados são genes banda, porque o DNA-
molde não possui o sÊ
lt,lt
cujos padrões de herança são acompanhados pelo monitoramento dos fenótipos da progênie
tio de restrição.
produzida após um cruzamento entre pais com características contrastantes (por exemplo,
plantas altas e baixas, piÌra os pés de ervilha estudados por Mendel). Mais recentemente, fo-
ram elaboradas técnicas pÍÌra o mapeamento de seqüências de DNA que não são genes, mas
que apresentam variabilidade na população humana. Dentre esses marcadores genéticos, os
mais importantes são:
(1) Polimorfismos de comprimento de fragmentos de restrição (RFLPs, do inglês res-

triction fragment length polymorphisms) são causados por uma variação na seqüência
que resulta em uma alteração em um sítio de restrição. Quando digeridos com uma en-
donuclease de restrição, a perda do sítio é revelada porque dois fragmentos permanecem
unidos. Originalmente, as RFLPs eram tipificadas por hibridizaçáo de Southern de DNA
genômico clivado por endonucleases de restrição. Tal procedimento, porém, é demora-
do, de modo que, hoje em dia, a presença ou ausência de um sítio de restrição é geral-
mente determinada por PCR (Figura l2.l}). Existem aproximadamente 100.000 RFLPs
no genoma humano.
(2) Repetições curtas em tandem (STRs, do inglês short tandem repeats), também cha-
madas de microssatélites, formadas por seqüências repetitivas curtas, como CACACA
As unidades de repetição têm extensões de 1 a l3 nucleotídeos e estão geralmente repe-
tidas 5 a 20 vezes. O número de repetições em um lócus pode ser determinado a partir
de uma PCR utilizando iniciadores que anelam um em cada lado da STR, seguida da
I t_ á=,-
análise do tamanho dos produtos resultantes por eletroforese em gel de agarose ou pG
|
liacrilamida (Figura l2.ll). Existem pelo menos 650.000 STRs no genoma humano.
Figura 12.11
(3) PolimorÍismo de nucleotídeos individuais (SNPs, do inglês single nucleotide poly
TipiÍicação d
morphisms) são posições em um genoma nas quais qualquer um de dois ou mais nu-
doqueodal
cleotídeos diferentes pode ocorrer (Figura I2.I2). Essas mutações pontuais são tipifica-
unidade CA i
das por análise com sondas oligonucleotídicas curtas, as quais hibridizam com formas
alternativas da SNP. O número de SNPs no genoma humano ainda permanece desconhe-
cido, mas é de pelo menos 1,4 milhão. Mapas Íísi
Um mapa ffs
Todos esses marcadores de DNA são variáveis, existindo, portanto, em duas ou mais formas específicas er
alélicas. A herança de alelos alternativos em um determinado lócus é acompanhada pela anâ cus estudadq
lise do DNA preparado a partir da progênie de cruzamentos genéticos. dores de seq
Clorunoev GÊNrcA E ANÁLrsE oe DNA 263
e não seja otion6s ds rrm

Sítio de restrição
f
II
\
- *-..-_->---- lniciadores
\ daPCR
um método particularmen Figura 12.10
ïpiÍicação de um poli- . PCR, restrição
/,
Yezes, as posições das STSm Marcadores
morfismo de sítio de \l ( PCR, restrição
físico. Isso siç
restrição por PCR. Na {ú ú
um contig de clones em utrt
um cromossomo seja do-
trilha central, o produ- :
to da PCR gera duas
bandas, porque Íoi cli- -:
vado pelo tratamento
com a enzima de res-
utilizando princípios rnen tição. Na trilha direita,
organismos experi mentei** existe apenas uma
lócus estudados são gencr banda, porque o DNA-
dos fenótipos da progênL molde não possui o sÊ
trastantes (por exemplq tio de restrição.
. Mais recent"-"nr". f*]
que não são genes, mecr
marcadores genéticos, m
(RFLPs, do inglês ra-

uma variação na seqüêncie
digeridos com uma el-
is fragmentos peÍmaneoel
de Southem de DÌ{ü,
mento, porém, é demqr
sítio de restrição é gereft.
amente 100.000 RFLh
repeats), também ch*

curtas, como CACAC"Tï.
e estão geralmente reper.
Fode
ser determinado a prrfo
Fda lado da STR, seguida ôr
iro.. gel de agarose ou F
bTRs no genoma humano-
)g)ês single nucleotide pafir Figura 12.11
Tipificação de uma STR por PCR. O produto da PCR na trilha direita é um pouco mais longo
luer um de dois ou mais nr-
do que o da trilha central, porque o DNA-molde, a partir do qual ele Íoi gerado, contém uma
ltações pontuais são tipifi*
unidade CA a mais.
lpais hibridizam com form
n ainda permanece desconho
Mapas Íísicos
Um mapa físico é gerado por métodos que localizam diretamente as posições de seqüências
pto, em duas ou mais form específicas em uma molécula de DNA cromossômico. Como no mapeamento genético, os ló-
i:us é acompanhada pela anir
cus estudados podem ser genes ou marcadores de DNA. Estes últimos podem incluir marca-
Éticos.
dores de seqüências expressadas (ESTs, do inglês expressed sequence /ags), que são se-
264 T.A.Bnowru
A impor
ATAGACCRTGGcAA
É possível
ATAGACTATGGCAA co. Essa p
na256,ep
xflio de ur
[,*, Figura12.12 maior esú
Duas versões de uma SNp. car se als
cias curtas
meios gen
qüências curtas obtidas a partir das extremidades de DNAs complementares (cDNAs)
(p. passa-se a
172). Os marcadores de seqüências expressadas são, pois, seqüências parciais
de genes, que" Mapas
quando utilizadas na construção de um mapa, permitem o rrápido posiiionamento
dos geneu no e tamhx
correspondentes, mesmo que a identidade de cada gene não seja aparente a partir
aa seqtiên- elegans e t
cias dos ESTs. Dois tipos de técnica são utilizados no mapeÍìmento físico:
pas tambér
am a aborc
(1) Exame direto de moléculas de DNA cromossômico, como, por exemplo, pela hibridiza_
cação do s
ção de fluorescência ,/r silu (FISH, do inglôs/a orescence in situ hyuìiaization) (p. 2rr')t
das, o que
Se a FISH é executada simultaneamente com duas sondas de DNA, cada
uma delas mar_ de modo a
cada com um fluorocromo diferente, as posições relevantes de ambos os marcadores
re- dem ser el
presentados pelas sondas podem ser visualizadas no cromossomo. Técnicas
especiai* ma. Essa'
para o trabalho com cromossomos descompactados, cujas moléculas de DNA
são esten_ promisson
didas, em oposição à compactação normal, permitem que os marcadores sejam posicio
nados com um elevado grau de precisão.
(2) Mapeamento físico com um reagente mapeador é uma coleção de fragmentos
parcialmente sobrepostos que cobre o cromossomo ou o genoma em estudo.
de DNA 12.2 Pós-ger
os pares de
marcadores que estão em um mesmo fragmento devem estar próximos um
do outro no
deuml
cromossomo: a distância entre ambos pode ser determinada pela medição
da freqüência
com a qual o par ocorre junto em diferentes fragmentos do reagente mapeador (pigu,a Depois de
12.13). Hfuridos de radiação constituem-se em um dos tipos de reagente calizar tod
mapeadr
que tem sido de importância para o Projeto Genoma Humano. Esses ser trivial,
híbridos de radia-
ção são linhagens celulares de hamster que contêm fragmentos de cromossomos huma- e por técni
nos, preparadas por um tratamento envolvendo irradiação (daí o qüência dr
4ome). o mapeamento
é executado por hibridização de sondas marcadas com um painel contém ce
de linhagens celulares"
cada uma contendo uma parte diferente do genoma humano. base em er
similar à d
ções descc
Apesar
completad
fãos. É ner
tá provand
12.2.1 ldentific
A localizar
nhecida, o
corTespon(
Figura 12.13
qualquer ir
O princípio por trás do uso de um reagente mapeador. Pode-se deduzir que
os marcadores Sob tais cir
1 e 2 estão relativamente próximos, pois aparecem juntos
em quatro Íragmentos de DNA. Ao ja dispoúr
contrário, os marcadores 3 e 4 devem estar relativamente distantes, pois
aparecem juntos
apenas em um fragmento.
Cloruneeu GÊNrcA E ANÁLrsE DE DNA 265
A importância de um mapa na montagem da seqüência

É possível obter-se a seqüência de um genoma sem a utilização de um mapa genético ou físi-
co. Essa possibilidade é ilustrada pelo projeto de H. influenzae, que acompanhamos na pági-
na256, e pelos de muitos outros genomas bacterianos que vêm sendo seqüenciados sem o au-
xflio de um mapa. Entretanto, um mapa passa a ter muita importância quando um genoma
maior está sendo seqüenciado, pois ele se constitui em um guia que se pode usar para verifi-
SNP. car se a seqüência do genoma está sendo montada corretamente a partir das inúmeras seqüên-
cias curtas que emergem do seqüenciador automático. Se um marcador que foi mapeado por
meios genéticos e/ou físicos aparece na seqüência do genoma em uma posição inesperada,
(cDNAs) (p passa-se a suspeitar de um erro na sua montagem.
as parciais de genes, q, Mapas genéticos e/ou fisicos detalhados foram importantes para o Projeto Genoma Huma-
posicionamento dos gro no e também para aqueles de seqüenciamento dos genomas de levedura, mosca-das-frutas, C.
nte a partir da seqÍlb elegans e A. thaliana, todos eles baseados na mesma abordagem de contigs de clones. Os ma-
ffsico: pas também estão sendo utilizados para dirigir a montagem de seqüências em projetos que us-
am a abordagem aleatória. Conforme descrito na página 258, o principal problema para a apli-
exemplo, pela hibridize. cação do seqüenciamento aleatório em um grande genoma é a presença de seqüências repeti-
su hy b ridizati on) (p. 2l lfr- das, o que determina a possibilidade de que a seqüência montada "pule" entre duas repetições,
DNA, cada uma delas mr- de modo a excluir ou posicionar incorretamente parte do genoma (Figura 12.5). Tais eÍïos po-
ambos os marcadoresrn* dem ser evitados se a montagem da seqüência referir-se constantemente a um mapa do geno-
. Técnicas especiefo ma. Essa "abordagem aleatória dirigida" ("directed shotgun approach") parece ser bastante
ulas de DNA são estr- promissora como um método rápido para o seqüenciamento de grandes genomas.
marcadores sej am posicio.
de fragmentos de Dtr{tr 12.2 Pós-genômica: tentando entender a seqüência

em estudo. Os pares&
próximos um do outÍo m
de um genoma
pela medição da freqüêncirr
Íeagente mapeador (Figurr Depois de a seqüência de um genoma haver sido completada, a etapa seguinte consiste em lo-
s de reagente mapeadr calizar todos os genes e determinar todas as suas funções. Trata-se de um processo longe de
Esses híbridos de radie. ser trivial, mesmo prÌra genomas que já foram extensivamente estudados por análise genética
e por técnicas de clonagem gênica antes da conclusão do seqüenciamento. Por exemplo, a se-
de cromossomos humer-
o nome)..O mapeametrb
qüência de S. cerevisiae,vm dos organismos mais bem-estudados, revelou que esse genoma
contém cerca de 6.000 genes. Desses, somente 3.600 tiveram sua função determinada, com
Finel de linhagens celulaer, base em estudos previamente executados ou porque o gene da levedura tinha uma seqüência
b.
t
i
similar à de um já estudado em outro organismo. Restaram, portanto, 2.400 genes com fun-
ções desconhecidas.
Apesar da quantidade massiva de trabalho investida desde que o genoma da levedura foi
I
completado, em 1996, ainda não foram determinadas as funções da vasta maioria desses ór-
ffios. É nessa área que a bioinformáúica, às vezes chamada de biologia molecular in silico, es-
tá provando ser de maior valia, como um complemento aos experimentos convencionais.
12.2.1 ldentificando os genes em uma seqüência genômica

A localização de um gene é fácil se a seqüência de aminoácidos do seu produto protéico é co-
nhecida, o que permite que a sua seqüência nucleotídica seja predita, ou se um cDNA ou EST
correspondente foi previamente seqüenciado. Todavia, para a maioria dos genes, não existe
qualquer informação prévia que permita que a seqüência de DNA correta seja reconhecida.
deduzir que os marcadores Sob tais circunstâncias, a localização de um gene pode ser difícil, mesmo que um mapa este-
ntro Íragmentos de DNA. Ao ja disponível. A maioria dos mapas possui uma precisão limitada e é capaz apenas de delinear
Ies, pois aparecem juntos
t
266 T. A. Bnowlr
a posição aproximada de um gene, possivelmente deixando viírias dezenas ou mesmo

cente- não podem se
nas de quilobases por analisar para que o gene seja encontrado. Além disso, muitos genes
aparecem em mapas, pois a existência dos mesmos ainda não foi evidenciada. Como esses
não de levedura, l
ge- ria "questioná
nes podem ser localizados em uma seqüência genômica?
ria não corres
Buscando fases abertas de leitura No homer
que muitos dr
A seqüência de DNA de um gene é uma fase de leitura aberta (ORF, do inglês open reading
terminadas se
frame), uma série de trincas de nucleotídeos, iniciando com um códon ds inicúção (g"d ral2.l5),íd
mente, mas não sempre, um AUG) e terminado em um códon de terminação (TAA, TAG ou
interior de ínt
TGA, na maioria dos genomas). A análise de uma seqüência genômica em busca de ORFs"
éxons e íntror
manualinente ou, mais comumente, com o auxílio de um computador, é, portanto, o primeiro
passo pa-ra alocalização de um gene. É importante que a aniílise seja feita em todas as seis
fa- Diferencia
ses de leitura, pois os genes podem estar orientados em ambas as direções ao longo da héli-
Alguns genor
ce dupla de DNA (Figura l2.l4a). Em um genoma bacteriano, o resulrado típico deise tipo de
to, o genoma
análise é a identificação de longas oRFs, que quase certamente correspondem a genes, e de
molecular, pc
muitas ORFs mais curtas, parcial ou totalmente contidas nos genes, mas presentes em fases
qüência disú
de leitura diferentes (Figura l2.l4b). Tais seqüências curtas quase certamente são combina-
gene. Mas ca
ções de nucleotídeos que formaram ORFs por acaso, mas não constituem genes. Se uma des- sidade de mét
sas ORFs curtas está inteiramente contida entre dois genes, existe a possibilidade de que
ela Para muit
seja erroneamente identificada como um gene real. Entretanto, na maioria dos genomas bac-
neira útil de <
terianos, existe muito pouco espaço entre os genes, de modo que esse problema não é muito
aminoácidos,
freqüente.
alanina, por t
A localização de genes em eucariotos é muito mais difícil. Os genomas eucarióticos não nomas, nem
são tão densamente compactados como os bacterianos, existindo espaçadores muito mais lon- qüência. O h<
gos entre os genes. Isso significa que a inspeção da seqüência revela muitas ORFs curtas que
tos códons: p
vezes mais fr
raros, então,
apresentado
(a) Cada seqüência de DNA possui seis Íases de leitura 1
de de ela con
A identifi
1 GAC--* Essa busca, e
2 T GA -* Figura 12.14 gênicas pres
3 ATG ---* .Buscando fases
mente com g
5'_A TGACCAA TGACA TGCAA TAA _3' de leitura aber-
ìtttllttttttttltttttt todas as dem
3'_T AC TGGT TAC TG TACGT TA T T _5' tas. (a) Cada se-
--ATT 4
qüência de DNA
--TAT 5
possui seis Íases
--TTA 6
de leitura e qual-
quer uma delas
pode conter um
gene. (b) O re-
sultado típico de
(b) o resultado típico de uma busca por oRFs em um genoma bacteriano
uma busca por
ORFs em um
genoma bacte-
Genes riano. As setas
+++
_- ORFs espúrias indicam as dire-
ções nas quais
os genes e as Figura 12.11
tt
ORFs espúrias As seqüênci
100 pb
estão orienta- vertebrados.
dos. cam as posir
Crorunoeu GÊNrcA E ANÁLrsE oe DNA 267
ou mesmo cente- não podem ser descartadas, pois não se sobrepõem a qualquer gene real. A análise do genoma
disso, muitos genes nfu de levedura, por exemplo, identificou mais de 400 ORFs que foram colocadas nessa catego-
iada. Como esses ge- ria "questionável". Possivelmente, algumas delas são genes reais, mas é provável que a maio-
ria não corresponda a seqüências codificadoras
No homem e em outros eucariotos, a busca de genes é ainda mais complicada pelo fato de
que muitos deles são interrompidos, estando divididos em éxons e íntrons (Figura 11.1). De-
', do inglês open reading terminadas seqüências nucleotídicas sempre ocorrem nos limites entre éxons e íntrons (Figu-
de iniciação (g"d- ra 12.15), mas tais seqüências também são encontradas tanto no interior de éxons quanto no
inação (TAA, TAG ou interior de íntrons. A definição de quais dessas seqüências marcam verdadeiros limites entre
ica em busca de ORFs, éxons e íntrons pode ser bastante difícil.
; é, portanto, o primeiro
feita em todas as seis f+. DiÍerenciando genes reais de ORFs casuais
s ao longo da héli- Alguns genomas apresentam indicadores bastante úteis da presença de um gene. Nesse aspec-
típico desse tipo dc to, o genoma humano e os de outros vertebrados são particularmente acessíveis ao biólogo
a genes, e dc molecular, pois 50 a607o dos seus genes são acompanhados por uma ilha de CpG, uma se-
mas presentes em fases qüência distinta, rica em CG, cuja posição indica aproximadamente o local de início de um
te são combina. gene. Mas características como essa são mais exceção do que regra, o que determina a neces-
m genes. Se uma des- sidade de métodos de uso mais geral para a identificação de genes.
possibilidade de que el;r Para muitos genomas, o viés de códons (do inglês codon bias) constitui-se em uma ma-
ioria dos genomas bac- neira útil de conferir um certo grau de ceÍtezaà identificação de um possível gene. Todos os
problema não é muito aminoácidos, exceto a metionina e o triptofano, são especificados por dois ou mais códons. A
alanina, por exemplo, possui quatro códons - GCA, GCC, GCG e GCT. Na maioria dos ge-
eucarióticos não nomas, nem todos os membros de uma família de códons são utilizados com a mesma fre-
muito mais lon- qüência. O homem é típico em relação a esse aspecto, apresentando um viés distinto para cer-
muìtas ORFs cwtas qw tos códons: por exemplo, para a família de códons da alanina, o homem utiliza GCC quatro
vezes mais freqüentemente do que GCG. Se uma ORF contém uma alta freqüência de códons
raros, então, provavelmente, ela não corresponde a um gene. Considerando o viés de códons
apresentado por uma ORF, pode então ser feita uma avaliação mais confiável da probabilida-
de de ela corresponder ou não a um gene.
A identificação de um provável gene é em geral seguida por uma busca por homologia.
Essa busca, executada por computador, compÍÌra a seqüência do gene com todas as seqüências
Figura 12.14 gênicas presentes nas bases internacionais de dados de DNA. Tal comparação é feita não so-
Buscando Íases mente com genes conhecidos do organismo em estudo, mas também com todos os genes de
de leitura aber-
todas as demais espécies disponíveis. Arazáo disso é que dois genes de diferentes organismos
tas. (a) Cada se.
qüência de DNA
possui seis Íases
de leitura e qual-
quer uma delas Exon íntron Exon
pode conter um 5 3'
gene. (b) O re- LI LI
sultado típico de
uma busca por
/\
,t/ \
ORFs em um /\
genoma bacte-
riano. As setas
AG{GTAAGT PYPYPYPYPYPYNCAGü
hs indicam as dire-
I ções nas quais
I os genes e as Figura Í2.15
i ORFs espúrias As seqüências de consenso para os limites éxon-íntron a montante e a jusante de íntrons de
estão orienta- vertebrados. Py = nucleotídeo pirimidínico (C ou T), N = qualquer nucleotídeo. As setas indi-
dos. cam as posições dos limites.
268 T. A. Bnowlr
que possuem funções similares também apresentam seqüências similares, refletindo suas serão alcançz
tórias evolutivas comuns (Figura 12.16). nas e as suÍÌs
Para a execução de uma busca por homologia, a seqüência nucleotídica de um possível go- mente de exp
ne é geralmente traduzida em uma seqüência de aminoácidos, pois isso torna a busca rnaïs Várias té<
sensível. Isso ocorre porque existem 20 aminoácidos, mas apenas quatro nucleotídeos, o das elas podt
Tç
determina que a chance de duas seqüências de aminoácidos parecerem similares por puro ÍEr- caute gênico
so é menor. são funciona
A análise é executada através da Internet, a partir da conexão com a página (web site) lh ção entre o g
um dos bancos de dados de DNA e da utilização de um programa de busca, como o BLAST resultar na sr
(Basic ktcal Alignment SearchTool, ou ferramenta básica para a busca de alinhamento localil- tipo do orgar
Se a seqüência-teste tiver uma extensão maior que 200 aminoácidos e uma identidade de ïIffi ção do gene.
ou mais com uma seqüência no banco de dados (isto é, em 30 de 100 posições o mesmo aai- - mundongo-l
noácido ocoffe em ambas as seqüências), então as duas são quasé com certeza homólogas ee no estabeleci
ORF estudada pode ser confirmada como um gene real. Uma confirmação adicional, se m- problemas. I
cessária, pode ser obtida com autllização de uma análise de transcrito (p.226), que permin qualquer efe
demonstrar que o gene é transcrito em RNA. fica que, apó
teração fenor
12.2.2 Determinação da função de um gene desconhecido
A busca por homologia serve a dois propósitos. Além de testar a veracidade da identif,rca@
do provável gene, ela também fornece uma indicação a respeito da sua função, presumindo- 12.3 Estudos
se que a função do gene homólogo é conhecida. Quase 2.000 genes do genoma de levedurati-
veram suas funções estabelecidas desse modo. Muitas vezes, contudo, as homologias encon- Até agora, c
tradas nas buscas são com outros genes cujas funções ainda não foram determinadas. Tais ge- de genes ind
nes não-caracterizados são chamados de órfãos e a identificação de suas funções é um dm to de novos I
maiores desafios da ciência pós-genômica. noma como
Em anos futuros, provavelmente será possível utilizar a bioinformática para a obtenção de
pelo menos uma indicação da função de um gene 6rfão. Jâ é possível utilizar-se a seqüêncie
(1) Otrar
teopa
nucleotídica de um gene para prever as posições das hélices c e iolhas na proteína por ele
B
codificada, apesar da precisão limitada, e a informação estrutural resultante daí pode, às ve-
(2) O prot
quími<
zes, ser utilizada para inferências a respeito da função da proteína. Proteínas que se ligam a
membranas podem freqüentemente ser identificadas por possuírem arranjos de hélices a quc
atravessam a membrana, e motivos de ligação a DNA, como dedos de zinco, também podem
ser reconhecidos. Uma abrangência e uma precisão maiores desse aspecto da bioinformáúca
AGGACCAGACCCATATAGGACC Figura 12.16

Seqüência ancestrat Homologia entre
duas seqüências
/\ que compartilham
um ancestral co- Figura 12.17
Nocaute gênico
í\ mum. As duas se
por recombina-
qüências adquiri-
AGGGCCAGACCCATACAGGACC ram mutações du- ção entre uma
cópia cromossô-
\ rante suas histó-
mica de um ge-
rias evolutivas,
AGGACCAGACTCATATAGGACC mas as similarida- àe e uma versão
des entre suas se- deletada presen-
qüências indicam te em um vetor
Duas seqüências modernas de clonagem
que elas são ho-
mólogas. plasmidial.
Clonnceu GÊNrcA E ANÁLrsE oe DNA 269
Lares, refletindo suas his- serão alcançadas quando mais informações a respeito da relação entre a estrutura das proteí-
nas e as suas funções forem obtidas. Até lá, a análise funcional de órftos depende principal-
lúdica de um possível ge. mente de experimentos convencionais.
3 isso torna a busca mafu Viárias técnicas pÍÌra o estudo das funções dos genes foram descritas no Capítulo 11 e to-
latro nucleotídeos, o qtr das elas podem ser aplicadas a órfãos. Uma estratégia não-descrita no Capítulo I I é a do no-
h similares por puro Írc&. caute gênico. Nessa técnica, uma versão deletada do gene é utilizada para "nocauteaÍ" a ver-
são funcional presente nos cromossomos do organismo. Isso é possível porque a recombina-
h a página (web site) lh ção entre o gene deletado, presente em um vetor de clonagem, e a cópia cromossômica pode
bbusca, como o BLAST resultar na substituição desta por aquela (Figura 12.17). O efeito do nocaute gênico no fenó-
ba de alinhamento locall, tipo do organismo é, então, analisado para a obtenção de alguma indicação a respeito da fun-
p uma identidade de ï)fr . ção do gene. O efeito de um nocaute de gene humano é inferido a partir do estudo de um ca-
b posições o mesmo ami- . mundongo-nocaute, portador da versão deletada do gene homólogo. Os nocautes auxiliaram
h."tt"ru homólogas ea no estabelecimento das funções de diversos genes, mas nem sempre tal abordagem é livre de
hmação adicional, se m. problemas. Particularmente problemático é o fato de que alguns nocautes não apresentam
ftto (p.226), que permin qualquer efeito óbvio no fenótipo do organismo, ou porque o gene é dispensável, o que signi-
I fica que, após a sua inativação, outros genes podem compensar a sua ausência, ou porque a al-
Ì teração fenotípica é muito sutil para ser detectada.
lido
facidade da identi fi cação 12.3 Estudos do transcritoma e do proteoma
pra função, presuminb
b genoma de levedura ti-
Até agora, consideramos aqueles aspectos da pesquisa pós-genômica que tratam de estudos
fo, as homologias encoo-
de genes individuais. A mudança de ênfase de genes para genomas levou ao desenvolvimen-
h determinadas. Tais ee-
b suas funções é um dm to de novos tipos de análise, os quais são direcionados para a compreensão da atividade do ge-
noma como um todo. Esse trabalho levou à invenção de dois novos temos:
:
Láti"u p-u a obtenção de

(1) O transcritoma, que é o conteúdo de RNA mensageiro (nRNA) de uma célula e refle-
bI utilizar-se a seqüêncie
te o padrão geral de eípressão gênica daquela célula.
F^ Ê nu proteína por eh (2) O proteoma, que é o conteúdo de proteína de uma célula e reflete a sua capacidade bio-
$rltante daí pode, as re química.
Proteínas que se ligam e
lranjos de hélices a qu
le zinco, também poden
tpecto da bioinformátice
!r
Gene completo
--- -- DNA cromossômico
Figura 12.16
Homologia entre Gene deletado
duas seqüências
que compartilham - I DNA plasmidial
\
um ancestral e Figura 12.17
-
mum. As duas se Nocaute gênico
qüências adquirÈ por recombina-
ram mutações úr ção entre uma Recombinação
rante suas histo- cópia cromossô-
rias evolutivas, mica de um ge-
mas as similarid+ ne e uma versão
deletada presen-
I
des entre suas sÈ
qüências indicam te em um vetor
Nocaute gênico
que elas são ho- de clonagem
mólogas. plasmidial.
27O T. A. Bnowr.r
12.3.1 Estudando o transcritoma do cancer<

ao estado r
As técnicas para o estudo do transcritoma foram inicialmente desenvolvidas como paÍte do Uma a
projeto pós-genômico de levedura. Essencialmente, essas técnicas envolvem um tipo sofistica- lício capa
do de análise por hibridização. Todos os 6.000 genes de levedura foram obtidos como clones sintetizadr
individuais e, a partir deles, produziram-se amostras que foram aplicadas sobre lâminas de vi I milhão 1
dro, em arranjos de 80 x 80 pontos (cada ponto correspondendo à aplicação de uma amostra), cional. A I
o que é chamado de microarranjo. Para a determinação de quais genes estão ativos sob deter- mo os olil
minadas condições de cultivo, mRNA foi extraído das células e convertido em cDNA (p. 112), especiais,
que, depois de marcado, foi hibridizado com os microarranjos (Figura 12.18). Foram utiliza- jas seqüên
dos márcadores fluorescentes, e a hibridi zação foi detectada pelo exame dos microarranjos por
microscopia confocal. Os pontos que geraram um sinal indicaram os genes ativos sob as con- 12.3.2 Estudat
dições que estavam sendo estudadas. Alterações na expressão gênica quando a levedura era
O proteon
transferida para diferentes condições de cultivo (por exemplo, depleção de oxigênio) puderam
informaçõ
ser monitoradas a partir da repetição do experimento com uma segunda preparação de cDNA.
pois um ú
Os microarranjos estão agora sendo utilizados para a monitoração de alterações nos trans-
teína, devi
critomas de muitos organismos. Em alguns casos, a estratégia é a mesma utilizada para a le-
lipeptídeo
vedura, com o microarranjo representando todos os genes do genoma. Mas isso é possível so-
pos quími
mente para aqueles organismos que possuem relativamente poucos genes. Um microarranjo
forilação,
de todos os genes humanos poderia ser executado utilizando-se apenas l0 lâminas de vidro de
nas.
18 x I 8 mm, mas a preparação dos clones para cada um dos 30.000 a 40.000 genes humanos
Para er
seria uma tarefa gigantesca. Felizmente, isso não é necessário. Por exemplo, para estudar as
separado
alterações no transcritoma decorrentes de um câncer, poderia ser preparado um microarranjo I
canaleta d
com uma biblioteca de cDNA de tecido normal. A hibridização com cDNA marcado do teci-
culares. O
dessa vez
sional de
Figura 12.18
Análise por mi-
croarranjo. O mi-
Microarranjo
croarranjo mos-
trado aquiÍoi hi-
bridizado com
/rtoriai. çao.o. \ duas prepara-
( amostras de cDNA ções de cDNA dF
\ Íerentes, cada
uma delas mar-
cada com um
marcador Íluoreg Fl(
cente. Os clones Um chipde DNA. Uì
que hibridizam conteria um núr
Hibridização detectada com os cDNAs maior de oligonucle
por microscopia confocal são identificados que aqueles mostra
por microscopia cada oligonucleotíd
conÍocal. a 30 nucleotídeos de
Ct-oruncev GÊNrcA E ANÁLrsE oe DNA 271
do canceroso então revelaria quais genes têm a transcrição estimulada ou inibida em resposta
ao estado canceroso.
penvolvidas como parte ô Uma alternativa para os microarranjos são os chips de DNA, isto é, pastilhas finas de si-
pvolvem um tipo sofisti*
lício capazes de carregar muitos oligonucleotídeos diferentes (Figura 12.19), os quais são
foram obtidos como clom sintetizados diretamente na superfície do chip e podem ser preparados em uma densidade de
ifuadas sobre lâminas de vt I milhão por cm', substancialmente maior do que a possível com um microarranjo conven-
[rplicaçao de uma amostnfu
cional. A hibridização entre um oligonucleotídeo e a sonda é detectada eletronicamente. Co-
pnes estão ativos sob deE-
mo os oligonucleotídeos são sintetizados de novo, utilizando procedimentos automatizados
i"e.tiao em cDNA (p. 172fr.
especiais, é relativamente simples a preparação deum chip portador de oligonucleotídeos cu-
iura l2.l 8). Foram uriliz* jas seqüências são específicas para cada gene humano.
lrame
dos microarranjos pu
ios genes ativos sob as oÍF 12.3.2 Estudando o proteoma
lica quando a levedura cnr
pao Oe oxigênio) puderur O proteoma é a coleção completa de proteínas de uma célula. Estudos proteômicos fornecem
pda preparação de cDli.L informações adicionais que não podem ser obtidas simplesmente pelo exame do transcritoma,
po de alterações nos trrc pois um único mRNA (e, conseqüentemente, um gene) pode dar origem a mais de uma pro-
b" teína, devido ao processamento pós-tradução (Figura 12.20). Em eucariotos, a maioria dos po-
[mesma utilizada para a
ina.
Mas isso é possível n. lipeptídeos que são sintetizados por tradução é adicionalmente processada pela adição de gru-
!s genes. Um microarranfu pos químicos. As adições específicas feitas determinam a função precisa da proteína. A fos-
pas 10lâminas de ü forilação, por exemplo, é uma modificação importante, utilizada para ativar algumas proteí-
p a 40.000 genes hur nas.
Para estudar o proteoma, todo o conteúdo protéico de uma célula ou tecido é inicialmente
f exemplo, para estudrr
separado por eletroforese bidimensional. Nessa técnica, as proteínas são aplicadas em uma
|reparado um microarrmi
h cDNA marcado do tqi canaleta de um gel de poliacrilamida quadrado e separadas de acordo com seus pesos mole-
culares. O gel quadrado é então girado em 90o e uma segunda eletroforese é levada a efeito,
È
dessa vez separando as proteínas com base em suas cargas. O resultado é um padrão bidimen-
sional de manchas de diferentes tamanhos, formas e intensidades, cada uma delas represen-
Figura 12.18
Análise por mi-
croarranjo. O n*. C CTA
croarranjo mc- G CTC , Oligonucleotídeos
trado aqui Írci t* A A CAG
bridizado com c T GCA
duas prepana- G T AGA
C A A TGA
ções de cDNA G T
Íerentes, cada c T
uma delas nrar- c
cada com um T
marcador Figura 12.19 A
Cente. Os Clorn Um chipde DNA. Um chipreal
+ Pastilha de silício
que hibridizam conteria um número muito
com os cDNÂs maior de oligonucleotídeos do
são identificadc que aqueles mostrados aqui e
por microscoçia cada oligonucleotídeo teria 20
conÍocal. a 30 nucleotídeos de extensão.
272 T. A. Bnowlr
tando uma diferente proteína ou grupo de proteínas relacionadas (Figura lL.2la).As diferen-
ças entre dois proteomas são aparentes a partir de diferenças no padrão de manchas quando
os dois géis são comparados. Para a identificação da proteína em uma determinada mancha,
uma amostra da mesma é purificada a partir do gel e tratada com uma protease que cliva o po
lipeptídeo em uma seqüência de aminoácidos específica (de uma maneira similar à atividade
de uma endonuclease de restrição). Os peptídeos resultantes são então examinados por espec-
trometria de massa (Figura 12.21b). O espectrômetro de massa determina a composição de
aminoácidos {e cada pepídeo. Essa informação é geralmente suficiente para permitir que o
gene que codifica a proteína seja identificado a partir da seqüência genômica.
Um gene
ïranscrição
- Um mRNA
Tradução
Figura 12.20
Um gene individual pode
dar origem a duas proteÊ
a+ Novos grupos químicos adicionados
nas, cada uma com uma Figura122
por processamento pós{radução Íunção distinta, se o produ- Análise prol
to inicial de tradução puder (b) ldentifrc
ser modificado de duas ma- se seguido
neiras diferentes por pro-
cessamento pós-tradução.
CLoNAGEM GÊNtcA E ANÁLlsE DE DNA 273
l2.2la).As difer*
(a) EletroÍorese bidimensional das proteínas
de manchas quando
uma determinada mancht,
protease que cliva o po Amostra de proteínas
ira similar à ativida&
l"
ru______]ru__-__l|___--:r-___--
l, Ë-l
;)tl= ltl
examinados por espsc-
ina a composição &
para permitir qrc o l:1",',, I
Gel de poliacrilamida
1. Separaçáo de acordo com o tamanho
2. Rotação do gel
3. Separação de acordo com a carga
(b) ldentiÍicação de uma Proteína
PuriÍicação da proteína,
tratamento com Protease,
exame por espectrometria de massa
\
I
I
I
coMPosrçoES
oos pepríoeos
Comparação dos
peptídeos com as
seqüências de genes
ldentif icação da proteína
gene individual pode

origem a duas proteÊ
cada uma com ume Figura12.21
distinta, se o produ nútise proteômica. (a) Eletroforese bidimensionaldas proteínas em gel de poliacrilamida.
inicial de tradução puder (b) ldeniiÍicação da proteína contida em uma mancha individual por tratamento com protea-
modiÍicado de duas ne se seguido por espectrometria de massa dos peptídeos resultantes.
diÍerentes por pro
pós-tradu@.
PARTE 3
melanogaster.
das técnicas para

publicada, em língur
APLTCAçOES DA
,282,744-6. CLONAGEM GÊNICA E DA
ofgene expressia
ios no estudo de-um
ANALISE DE DNA NA
263-70. [Descreve a
finções para os genes-l
BIOTECNOLOGIA
and assemblyd
um genoma bacteriam
1
of DNA microarrays il ,t
of the human
t
Cnpírulo 13
Produção de Proteínas a Partir
de Genes Clonados
Vetores especiais para a expressão de genes Produção de proteínas recombinantes por células
exógenos em E. coli,2'79 eucarióticas. 29 I
Problemas gerais para a produção de proteínas
recombinantes em E. coli-288
Agora que foram cobertas as técnicas básicas envolvidas na clonagem gênica e na análise
de DNA e examinada a maneira como essas técnicas são utilizadas na pesquisa científica,
pode-se seguir adiante e considerar como a tecnologia de DNA recombinante está sendo
aplicada na biotecnologia. Esse não é um assunto novo, embora a biotecnologia venha re-
cebendo muito mais atenção agora do que no passado. A biotecnologia pode ser definida
como o uso de processos biológicos na indústria e na tecnologia. De acordo com os arqueo-
logistas, a indústria biotecnológica britânica data de 4.000 anos, no final do período neolí-
tico, quando os processos fermentativos que fazem uso de células vivas de levedura para a
produção de cerveja e hidromel foram inicialmente introduzidos no Reino Unido. Com cer-
teza, a fabricação de bebidas fermentadas, como a cerveja, já estava bem-estabelecida quan-
do da invasão da Grã-Bretanha pelos romanos.
Durante o século XX, a biotecnologia expandiu-se com o desenvolvimento de diversos
usos industriais para os microrganismos. A descoberta por Alexander Fleming, em 1929, de
que o fungo Penicillium sintetiza um potente agente antibacteriano levou à utilização em
grande escala de fungos e bactérias para a produção de antibióticos. Inicialmente, os mi-
crorganismos eram multiplicados em grandes recipientes de cultura, a partir dos quais os
antibióticos eram purificados depois da remoção das células (Figura 13.1a). Mais recente-
mente, contudo, esse método de cultivo estanque (batch culture) foi amplamente suplan-
tado por técnicas de cultivo contínuo, que fazem uso de um fermentador. A partir do culti-
vo em fermentador, amostras do meio podem ser continuamente removidas, suprindo inin-
terruptamente a demanda pelo produto (Figura 13.1b). Esse tipo de processo não está limi-
tado à produção de antibióticos, tendo sido também utilizado para a obtenção de grandes
quantidades de outros compostos produzidos por microrganismos (Tabela 13.1).
Uma das razões pelas quais a biotecnologia vem recebendo tanta atenção desde a últi-
ma década é a clonagem gênica. Embora muitos produtos úteis possam ser obtidos de cul-
278 T. A. Bnowr.r
turas microt
(a) Gultivo estanque (batch culturel
mente sinter
produzidos I
dos dessa m
capacidade,
CentriÍugação - -= L-.., Preparação do um animal c
produto a partir:
|--- tor de clona
l- - --)-- do meio executadas
l- _--- _-l_t
I ,
ou
das células bacteriana. l
í4- É claro c
Recipiente de cultura fechado \\ mo pode pa
Sedimento de células mento satisl
(b) Cutivo contínuo tulo, tratare
minaremos
Entradade +
meio Íresco Saída de meio + células
13.1 Vetores
-il
I
I
Figura Í3.1 exógen(
-- il i
_ tt Dois diÍerentes sis-
il Preparação do produto
--lJt temas para a multi- Se um gene
plicação de micror- clonado em
ganismos: (a) culti-
vo estanque e (b)
cultivo contínuo.
Tabela 13.1 Alguns dos compostos produzidos a partir do cultivo de nucrorgamsmos

em escala indrstrial
Composto Microrganismo
Antibióticos
Penicilinas Penicillium spp.
Cefalosporinas Cephalosporium spp.
Gramicidinas, polimixinas Bacillus spp.
Cloranfenicol, estreptomicina streptomyces spp.
Enzimas
Invertase Saccharomyc e s c e rev isiae
Proteases, amilases Bacillusssp., Aspergillus spp.
Álcool Figura 13.2

S. cerevisiae, Saccharomyce s carlsbergensis
Um possível es-
Glicerol S. cerevisiae
quema para a
Vinagre S. cerevisiae, bactérias acéticas produção de
Dextran Leuconostoc spp. uma protêína
Ácido butírico Bactérias produtoras de ácido butírico animal em uma
Acetona, butanol Clostridium spp. bactéria. mRNA
Ácido cítrico Aspergillus niger = RNA mensa-
geiro.
;.
F
F
Cloruneeu GÊrurcn e ANÁLrsE oe DNA 279
turas microbianas, a lista dos mesmos limitava-se, no passado, àqueles compostos natural-
mente sintetizados por microrganismos. Muitos medicamentos importantes que não são
produzidos por micróbios, mas sim por organismos mais complexos, não podiam ser obti-
dos dessa maneira. Isso mudou a pafrir da aplicação da clonagem gênica à biotecnologia. A
capacidade de clonar genes implica que um gene que codifica uma proteína importante de
um animal ou planta pode agora ser retirado de seu hospedeiro normal, inserido em um ve-
tor de clonagem e introduzido em uma bactéria (Figura 13.2). Se as manipulações forem
executadas corretamente, o gene será expressado e a proteína será sintetizada pela célula
bacteriana. Pode, então, ser possível a obtenção de grandes quantidades da proteína.
É claro que, na prática, a produção de uma proteína recombinante não é tão simples co-
mo pode parecer à primeira vista. Tipos especiais de vetores são necessários e um rendi-
mento satisfatório da produção da proteína é muitas vezes difícil de ser obtido. Neste capí-
tulo, trataremos dos vetores de clonagem para a síntese de proteínas recombinantes e exa-
minaremos alguns dos problemas associados ao uso dos mesmos.
13.1 Vetores espec:ais para a expressão de genes

Figura 13.1 exógenos em E. coli
Dois diÍerentes sis-
temas para a multF Se um gene exógeno (isto é, não-bacteriano) for simplesmente ligado a um vetor comum e
plicação de micror- clonado em E. coli, é bastante improvável que uma quantidade significativa da proteína re-
ganismos: (a) cultF
vo estanque e (b)
cultivo contínuo.
Célula animal
de microrganismos
a9\
Vetor portador
do gene animal
spp
@
Figura 13.2 mRNA
yces carlsbergensis
Um possível es-
quema para a
produção de Bactéria modificada
uma proteína por engenharia
[de aciao burírico animal em uma genética sintetizando
I
Proteína animal
I bactéria. mRNA a proteína animal
t
= RNA mensa-
geiro.
280 T. A. Bnowlr
combinante venha a ser sintetizada. Isso ocoÍre porque a expressão do gene depende de ele Existem ser
paz de liga
estar cercado por uma coleção de sinais que podem ser reconhecidos pela bactéria. Esses si-
nais, que são seqüências curtas de nucleotídeos, informam da presença do gene e fornecem
simplesmer
Uma sol
instruções para os aparatos de transcrição e tradução da célula. Os três sinais mais impor-
do a colocá
tantes para genes de E. coli são os seguintes (Figura 13.3):
possível, o
(1) O promotor, que marca o ponto no qual a transcrição do gene deve iniciar. Em E. co' suprem a fa
/i, o promotor é reconhecido pela subunidade o da enzima RNA-polimerase, respon- combinantt
sável pela transcrição. t
(2) O terminador, que marca o ponto no final do gene onde a transcrição deve parar. Um 13.1.1 O prom<
terminador é geralmente uma seqüência nucleotídic a capaz de parear com ela mesma' O promoto
formando uma estrutura de alça com haste (stem loop)' controla o ;
(3) O sítio de ligação do ribossomo, uma seqüência nucleotídica curta reconhecida pelo se ao DNA
ribossomo como o ponto no qual ele deve ligar-se à molécula de RNA mensageiro de de prote
(pRNA). O códon de iniciação do gene está sempre uns poucos nucleotídeos a jusan- ponibilizad
te desse sítio.
Os genes de organismos superiores também estão cercados por sinais de expressão, mas
as suas seqüências nucleotídicas não são as mesmas das versões de E. coli' Esse aspecto é
ilustrado pela comparação entre promotores de E. coli e de genes humanos (Figura 13'4)'
Sítio de ligação
PÍomotor ribossomo
rtt'-'
llGene+
. do , Terminador
_--t_t--DNA
Òt TranscÍito de RNA
Figura 13.3
\ Ponto no qual o ribossomo Os três sinais mais importantes
liga-se ao mRNA
para a expressão gênica em
E. coli.
(a) E. coli
TTGACA TATMT + cene

box-35 box-10 Figura 13.5
A utilização de um
(b) Animais vetor de expressão
Figura 13.4
para a produção de
sinais Seqüências promotoÍas
vários TATAAAT + Gene
típicas de genes de uma proteína a Par-
box -25 tir de um gene exG
E. coli e de células
geno em E. coli-
animais.
$'
Crorurceu GÊrutcn e ANÁLlsE oe DNA 281
Existem semelhanças, mas seria improvável que uma RNA-polimerase de E' coli fosse
ca-
gene depende de ele E' coli
paz de ligar-se a um promotor humano. Um gene exógeno permanece inativo em
[a bactéria. Esses si-
ldo gene e fornecem iimplesmente porque a bactéria não reconhece os seus sinais de expressão.
úma solução pàru problema seria a inserção do gene exógeno em um vetor de mo-
h sinais mais imPor- "rr"
do a colocá-lo sob o controle de um conjunto de sinais de expressão de E. coli. Se isso for
que
possível, o gene deverá ser transcrito e traduzido (Figura 13.5). Veículos de clonagem
podem usados na produção de proteínas re-
rye iniciar. Em E' co- ,upr"- a falta desses sinais e que, por isso, ser
r-polimerase, respon" combinantes são chamados de vetores de expressão'
rição deve Parar. Um 13.1.1 O promotor é o componente crítico de um vetor de expressão

rear com ela mesmÀ porque ele
O promotor é o componente mais importante de um vetor de expressão' Isso
I
controla o primeiro da expressão gênica (a ligação de uma enzima RNA-polimera-
nrta reconhecida Pelo "itagio Portanto, a quantida-
se ao DNA) e determina a freqüência na qual o mRNA é sintetizado.
.de RNA mensageim do promotor dis-
de de proteína recombinante obtida depende em grande parte da rraívreza
nucleotídeos a jusan' ponibilizado pelo vetor de expressão'
pisde expressão, mali

E coti. Esse asPecto é
tmanos (Figura 13.4f'
Vetor de P = Promotor l
expressão Sinais de expressão

R = Síiio de ligação
de E. coli:
do ribossomo t'
T = Terminador
Sítio de restrição único
lnserção de um gene exógeno

no sítio de restrição único
I
Fis mais importantes
ressão gênica em
_- Gene exógeno
\ ,r"n.rort" çâode E. coti
\
Figura 13.5
A utilização de um
O gene exógeno
vetor de expressão
Figura 13.4 para a produção de
é expressado
Seqüências Promotorõ em E. coli
uma proteína a Par-
lípicas de genes de
tir de um gene exó-
.E.colie de células geno em E. coli.
'animais.
282 T.A.Bnowr
O promotor deve ser escolhido com muito cuidado

As duas seqüências mostradas na Figura 13.4a são seqüências consensuais, médias de to-
das as seqüências de promotores de E. coli conhecidas. Embora a maioria dos promotores
de E. coli não difira muito dessas seqüências consensuais (por exemplo, TTTACA ao invés
de TTGACA), qualquer pequena variação pode ter um efeito importante na eficiência
com
a qual o promotor é capaz de dirigir a transcrição. Promotores fortes são aqueles capÍìzes
de sustentar uma taxa elevada de transcrição; promotores fortes geralmente controlam ge-
nes cujos produtos de tradução são necessários em grandes quantidades na célula (Figura
13.6a). Promotores fracos, ao contrário, são relativamente ineficientes e dirigem u tr-r-
crição de genes cujos produtos são necessários apenas em pequenas quantidãdes (Figura
13.6b). Fica claro que um vetor de expressão deve ser portador de um promotor forte, para
que o gene clonado possa ser transcrito com a maior freqüência possível.
Um segundo fator a ser considerado na construção de um vetor de clonagem é a possi-
bilidade de regular o promotor de alguma maneira. Dois tipos principais de rãgulação gêni-
ca são reconhecidos em E. coli - indução e repressão. Um gene induzível é aquele cuja
transcrição é ativada pela adição de um composto químico ao meio de cultura; muitas vL-
zes, esse composto químico é um dos substratos da enzima codificada pelo gene induzível Figura 1
(Figura 13.7a). Um gene reprimível, ao contriírio, é inativado pela adição de um composto Exemplos dos c
químico regulador (Figura 13.7b). maiores tipos de
A regulação gênica é um processo complexo, que envolve o promotor apenas indireta- gulação gênica <
mente. Contudo, muitas das seqüências importantes para a indução ou a repressão estão ocorrem em ba<
em
regiões adjacentes ao promotor e, portanto, também estão presentes em um vetor de ria: (a) um gene
expres-
são. E, por isso, possível estender a regulação ao vetor de expressão, de modo qo" duzível, e (b) um
o ne reprimÍ
"o--
(a) Um promotor Íorte posto q
bém ca
Gene impoú
,..-F- :._ Transcrição binantr
- -' | _.\ _,- dosamr
\
Promotor
/ -ra /J
.-- -r .t1
,
4 ,,,? seguidr
Íorte
(b) um promotor Íraco

-rn/.nn-
/- t'-
Numerosos
-_=-
transcritos
Tradução rf3
gs
gene cl
te não
te alto
eventü
r
Numerosas
Exem
--1' ^*-
/
\ Transcrição
:i!ïï:ï" Viírios
deder
-=-- í
/ J .--
..-)
tados a
Promotor r ã
Íraco -/
Retativamenre Tradução çí (1) c
poucos transcritos q
Número u",Sno o"
moléculas de proteína Figura 13.6 v
Promotores fortes lz
e fracos.
Íi-
L
Cloucer',1 GÊNtcA E ANÁLlsE oe DNA 283
, médias de to-
(a) Um gene induzível
ioria dos promotores
TTTACA ao invés Composto químico regulador.'
Gene normalmente A
na eficiência com inativo ...ativa o gene
são aqueles capazes
/|/
Gene I
mente controlam ge- I
na célula (Figura Promotor X -\-/"=\---
# Transcritos
tesedirigematrans- Sem transcrição
7-
quantidades (Figura
um promotor forte, para
vel.
(b) Um gene rePrimível
declonageméapossi-
is de regulação gêni-
Composto químico regulador...
induzível é aquele cuja
Gene normalmente
de cultura; muitas ve- ativo ...inativa o gene
pelo gene induzível Figura 13.7
Exemplos dos dois
adição de um composto
maiores tipos de re- I
I
I
i
X
gulação gênica que 4-...*_
apenas indireta- #
ocorrem em bacté-
ou a repressão estão em ria: (a) um gene in-
#
em um vetor de expres- duzível, e (b) um ge-
de modo que o com- ne rePrimível.
promotor é tam-
posto químico que induz ou reprime o gene normalmente controlado pelo
do gene clonado. Isso pode representar uma vantagem
bém câpaz de rãgular a expressão
proteínas recombinantes. Por exemplo, se a proteína recom-
importante para a produçãó de
sobre bactéria, a sua síntese pode ser cuida-
binante a seì produzida iem urnefeito danoso a
acumulaçáo níveis tóxicos: isso pode ser con-
dosamente mãnitorada para impedir a sua até
químico regulador para controlar a expressão do
seguido pelo uso criterioso do composto
geïe ctonaao. A regulação do gene ólonado é desejável mesmo que a proteína recombinan-
ie não seja prejudiõial para a célula hospedeira, pois um nível de transcrição continuamen-
à sua
te alto póde atetar a capacidade de replicação do plasmídeo recombinante, levando
eventual perda na cultura.
Exemplos de promotores utilizados em vetores de expressão

Vários promotores de E. coli combinam as características desejadas de força e de
facilida-
Aqueles mais freqüentemente utilizados em vetores de expressão são lis-
de de rãgulação.
tados a seguir:
gete lacZ,
(1) O promotor tac (Figura 13.8a) é a seqüência que controla a transcrição do
qu; codifica a B-galactosidase (e também a do fragmento gênico lacz' , ptesenÍe nos
vetores pUC e tvtt:mp; p. 119 e 122). O promotor lac é induzido por isopropiltioga-
Figura 13.6
lactosídão (IPTG, p 105), de modo que a adição desse composto químico ao meio
de
Promotores fortes
e Íracos.
È
!
È
G
g.
Ì
E
ê
284 T.A.BRowN
cultura ativa a transcrição de um gene inserido jusante do promotor /ac presente em

um vetor de expressão.
a 13.1.2 Cassetr
(2) o promotor trp (Figura 13.8b) está normalmente a montante do agrupamento de ge- Um vetor r
nes que codificam viírias das enzimas envolvidas na biossíntese bém uma s
do arninoácido tripìo-
fano. o promotor trp érep/.mido pelo triptofano, mas é mais facilmente maioria dc
induzido pe_
lo ácido 3-B-indolacrflico. o gene ex(
(3) o promotor tac (Figwa 13.8c) é um híbrido entre os promotores trp e lac.Ele é mais to de sinair
forte do que qualquer um deles, mas ainda é induzívei por IpTG. tanto, na p
(4) o promotor l,P" (Figura 13.sd) é um dos promotores responsáveis pera transcrição Em alg
da molécula de DNA de 1,. o promotor l.p, é muito forte eiambém sítio de lig
é ieconhecido pe_
la RNA-polimerase de E. coli, que é levadã por À a transcrever o DNA gene de E
do bacteriófa_
go. o promotor é reprimido pelo produto do gene l,cl. vetores de executada
expressão portado-
res do promotor l,P. são utilizados em uma linhagem de E. coli com o seg
hospedeira que sinte_
tiza numa forma termossensível da proteína cI (p. 56). A uma baixaiemperatura produto dr
(me_
nor que 30"c), essa proteína mutante é capazde reprimir o promotor l,pr; deo curto,
em tempe-
raturas elevadas, a proteína é inativada, resultando na transc;ição do gene proteína e;
clonado.
(1) Atra
nÍìs c
cia n
estru
rir ni
(a) O promotor lac lidad
IPTG râme
(2) A pr
molé
-35 -10 Transcrição
não 1
-ll Ácido 3-B-indolacrílico hosp

(b) o promotor trp Trlptofano
trpA \ \ (3) O sq
#-- rranscnçao Semtranscrição da pr
rivad
(c) O pÍomotoÍ tac NCS ú
IPTG
-35 -10 Transcrição
(d) PromotoÌ ÀPL -ll
-10
rr ' 3o"c
- s", transcriçãol > 3o.c
Figura 13.!
Transcrição
Um vetor de cassete
típicoeamaneiraco
mo ele é utilizado
Figura 13.8 P-promotor,R=sí.
tio de ligação do ri
Quatro promotores utilizados Íreqüentemente em vetores de
expressão. os promotores /ac e bossomo, T = termi
Írp são apresentados a montante dos genes que eles
normalmente controlam em E. coli. nador
Ct-orunceu GÊrurca e ANÁLrsE oe DNA 285
lromotor /ac presente em 13.1.2 Cassetes e Íusões gênicas

Um vetor de expressão eficiente não requer apenas um promotor foÍe e regulável, mas tam-
P do agrupamento de ge-
bém uma seqüência de ligação do ribossomo e um terminador reconhecíveis por E. coli.Na
ixe do aminoácido tripto- maioria dos vetores, esses sinais de expressão formam um cassete, assim chamado porque
p facilmente induzido pe-
o gene exógeno é inserido em um sítio de restrição único presente no meio do agrupamen-
to de sinais de expressão (Figura 13.9). A ligação do gene exógeno ao cassete o coloca, por-
|rlÍes trp e lac.Eleé mai$
tanto, na posição ideal em relação aos sinais de expressão.
mG.
Em alguns vetores de cassete, o sítio de clonagem não está imediatamente adjacente ao
onsavers pela transcnçãD
sítio de ligação do ribossomo, sendo, ao invés disso, precedido pelo segmento inicial de um
mUem é reconhecido pe- gene de E. coli (Figura 13.10).A inserção do gene exógeno nesse sítio de restrição deve ser
ter o DNA do bacteriófa-. executada de modo a fundir as duas fases de leitura, produzindo um gene híbrido que inicia
;es de expressão portade com o segmento de E. coli e progride sem interrupção até os códons do gene exógeno. O
pali hospedeira que sinte-
produto da expressão do gene é, portanto, uma proteína híbrida, que consiste em um peptí-
pbaixa temperatura (m-
deo curto, codificado pela fase de leitura de E. coli, fusionado à porção aminoterminal da
promotor l"Pr; em tempc-
proteína exógena. Esse sistema de fusão possui quatro vantagens:
pição do gene clonado-
(1) A tradução eficiente do mRNA produzido a partir do gene clonado não depende ape-
nas da presença do sítio de ligação do ribossomo, sendo também afetada pela seqüên-
cia nucleotídica no início da região codificadora. Isso provavelmente ocorre porque
estruturas secundárias resultantes de pareamentos de bases intracadeia podem interfe-
rir na interação do ribossomo com o seu sítio de ligação (Figura I 3. I 1). Essa possibi-
lidade pode ser descartada se a região pertinente for constituída por seqüências intei-
ramente naturais de E. coli.
(2\ A presença do peptídeo bacteriano no início da proteína de fusão pode estabilizar a
molécula e impedir a sua degradação pela célula hospedeira. Proteínas exógenas que
não possuem o segmento bacteriano, ao contrário, são muitas vezes destruídas pela
hospedeira.
(3) O segmento bacteriano pode ser um peptídeo-sinal, responsável pelo direcionamento
da proteína de E. coli para a sua posição correta na célula. Se o peptídeo-sinal for de-
rivado de uma proteína que é exportada pela célula (por exemplo, os produtos dos ge-
nes ompA e malU), a própria proteína recombinante poderá ser exportada. Essa expor-
Gene exógeno inserido

- > 30"c no cassete
rl Figura 13.9
FcÍição Um vetor de cassete
típicoeamaneiraco-
Sn" "'oo"nornfl
mo ele é utilizado. \ _(
P-promotor,R=sí- )
tio de ligação do ri-
rsão. Os promotores bo bossomo, T = termi- \__,/
pcontrolam em E. coli. nador.
286 T.A.Bnown
ta
ÍtI
lnício de um
gene de E. coll o
Sítio de restrição único
(4) o
\
PFì \ T
ni
L'J vl
s(
Ad
segmetr
lnserção de um
gene exógeno portantr
lo trata
Gene exógeno
polipep
PR exempl
bromet
(FiguÍa
em sítir
\
Fusão correta
tue). É
clivage
......GGA GCT ATA TT4......
E. coli O gene exógeno
será traduzido
Fusão incorreta
......GGA GCATA TT4..,...

Segmento
de E. coli O gene exógeno não
Figura 13.10
,;ï""0"'0" A construção de um
genehíbridoeasínte-
Extremidade C
se de uma proteína de
Íusão.
Pareamento de bases
Figura 13.12
A utilização de
Figura 13.í1 cromatograÍia de
Um problema causado aÍinidade para
O sítio de ligação do
pela Íormação de es- purificar uma
ribossomo fica encoberto
trutura secundária no proteína de Íu-
início de um mRNA. são com a gluta-
tiona-S-transfe-
rase.
F
r
{
É
f
Ê
F
lo
E
Ë
Cr-orueeeu GÊNtcA E ANÁLtsE oe DNA 287
tação poderá ser para o meio de cultura ou para o espaço periplásmico, que fica entre
as membranas interna e externa da célula. A exportação é desejável porque simplifica
o problema da purificação da proteína recombinante a partir da cultura.
(4) O segmento bacteriano também pode auxiliar na purificação, permitindo que a proteí-
na de fusão seja recuperada por cromatografia de afinidade. Por exemplo, fusões en-
volvendo a proteína glutationa-S-transferase de E. coli podem ser purificadas por ad-
sorção a partículas de agarose com glutationa ligada a sua superfície (Figura 13.12).
A desvantagem dos sistemas de fusão decorre das possíveis alterações que a presença do
segmento de E. colipode causar nas propriedades da proteína recombinante. São necessiírios,
portanto, métodos para a remoção do segmento bacteriano. Geralmente isso é conseguido pe-
lo tratamento da proteína de fusão com um composto químico ou enzima que cliva a cadeia
polipeptídica na junção entre os seus dois componentes ou em um sítio próximo a ela. Por
exemplo, se uma metionina está presente na junção, a proteína de fusão pode ser clivada com
brometo de cianogênio, que cliva polipeptídeos especificamente em resíduos de metionina
(Figura 13.13). Alternativamente, podem ser utilizadas enzimas como a trombina (que cliva
em sítios adjacentes a resíduos de arginina) ou o fator Xa (que cliva após a arginina de Gly-
Arg). É importante considerar-se sempre que as seqüências de reconhecimentó do agente áe
clivagem não devem ocoÍrer no interior da proteína recombinante.
Adição da proteína de fusão com

glutationa- S-transÍerase
lura 13.10
pnstrução de um Matriz de ebsee_99f
glutationa-
frefrfOriOoeasínte glutationa
agarose
f
de uma proteína de
po.
Proteína de
fusão pura
lura 13.11
Figura 13.12
A utilização de
cromatografia de
Partícula de
agarose
da matriz
r
'";.: Proteína de fusão ligada à glutationa
lr problema causado afinidade para - pelo seu componente de
fa Íormação de es- glutationa- S{ransferase
purificar uma
iura secundária no proteína de Íu-
---------
bo de um mRNA.
são com a gluta- Moléculas de glutationa
tiona-S-transÍe- ligadas à superfície da partícula
rase.
$-
288 T.A.BRowN
(2) Ost
coli
Pept ídeo de E. coli fa nl
são
Proteína animal ou vegetal
I
\
Tratamento com brometo de cianogênio
\ Figura 13.13
Um dos métodos Para a
\ recuperação de um Po-
lipeptídeo exógeno a
partir de uma Proteína
,, Clivagem esPecif icamente
no resíduo de metionina
de fusão. O resíduo de
/t metionina na junção
dos dois componentes
da fusão deve ser o úni-
co presente em todo o
polipeptídeo: se outros
estiverem presentes, o
brometo de cianogênio
clivará a proteína de Íu-
são em mais de dois
Íragmentos.
19.2 Problemas gerais para a produção de proteínas

recombinantes em E. coli
Apesar do desenvolvimento de vetores de expressão sofisticados, existem numerosas difi-
culdades associadas à produção de proteínas a partir de genes exógenos clonados em E- co-
lj. Esses problemas podem ser agrupados em duas categorias: aqueles devidos à seqüência Figura 13
Três dos problen
do gene ãxógeno, e aqueles devidos às limitações de E. coli como hospedeira para a sínte-
que podem ser,
se de proteínas recombinantes.
contrados quando
nes exógenos são
19.2.1 Problemas resultantes da seqüência do gene exógeno pressados em E r
Existem três maneiras pelas quais a seqüência nucleotídica pode impedir a expressão efi- (a) lntrons não t
ciente de um gene exógeno emE' coli: removidos em E r
(b) Terminação I
(1) O gene exógeno pode conter íntrons. Esse seria um problema importante, pois genes matura da trans
de E. coli não possuem íntrons e, portanto, a bactéria não possui a maquinaria neces- ção. (c) Um proble
sária para a remoção dos mesmos dos transcritos (Figura 13'14a)' de viés de codc
Clonnceu GÊrurcn e ANÁLtsE oe DNA 289
(2) O gene exógeno pode conter seqüências que atuam como sinais de terminação em E
coli (Figuta 13.14b). Essas seqüências são perfeitamente inócuas na célula hospedei-
ra normal, mas, na bactéria, resultam em terminação prematura e na perda da expres-
são gênica.
a
(al E. coli não é capaz de remover íntÍons
I
íntron
Í
/
I
pra 13.13
n dos métodos para a I
I
Transcrição
-r-------- I
pperação de um po
futioeo exógeno a - íntron presente no mBNA
$r de uma proteína
lfusão. O resíduo de \\
iÉionina na junção
rradução \ fà
\ Um polipeptídeo incorreto
b dois componentes /- f \ \ é sintetizado
!fusão deve ser o únF
lpresente em todo o \
heptídeo: se outros (b)Terminação prematura da transcrição
lnerem presentes, o
[neto de cianogênio PR
Lará a proteína de Íu-
b em mais de dois
l
gmentos.
l\l. Seqüência semelhante a um terminador
de E. coli no interior do gene exógeno
r
i: Somente parte do
gene é transcrita
t
t-
Hnas
i
(c) Viés de códons
Gene humano
ì
I ccA ccT ccA CCC

kem numerosas difi-
Lsclonados emE.co- A maioria dos códons de prolina é CCA, CCT ou CCC
idevidos à seqüência Figura 13.14
pedeira para a sínte- Três dos problemas
que podem ser en- Gene de E coll
contrados quando ge-
igeno nes exógenos são ex- CCG CCG CCG
I pressados em E. coli.
[ndir a expressão efi- (a) íntrons não são A maioria dos códons de prolina é CCG
removidos em E. coli.
(b) Terminação pre-
lportante, pors genqs matura da transcri- RESULTADO: E. coli tem diÍiculdades na tradução dos códons
ia maquinariâ neces- ção. (c) Um problema de prolina de um gene humano
D. de viés de códons.
29O T.A.BRowN
(3) O viés de códons do gene pode não ser o ideal para a tradução em E. coli. Como des-
crito na página267, apesar de virtualmente todos os organismos utilizarem o mesmo
código genético, cada um possui um viés associado à tendência de utilizar preferen-
cialmente determinados códons. Esse viés reflete a eficiência com a qual as molécu-
las de RNA de transferência (tRNA) são capazes de reconhecer os diferentes códons
no organismo. Se um gene clonado contém uma proporção elevada de códons desfa-
voráveis, os tRNAs da célula hospedeira podem encontrar dificuldades na tradução do
gene, reduzindo a quantidade de proteína que é sintetizada (Figura 13.14c).
Esses problemas geralmente podem ser solucionados, embora as manipulações necessárias

possam consumir tempo e ser de custo elevado (uma consideração importante em um pro-
jeto industrial). Se um gene contém íntrons, pode ser utilizado como alternativa o seu DNA
complementar (cDNA), preparado a partir do mRNA (p. 172) e, portanto, livre de íntrons-
A mutagênese dirigida por oligonucleotídeos pode então ser empregada para alterar as se-
qüências de possíveis terminadores e para substituir códons desfavoráveis por aqueles pre- Figura
feridos por E. coli. Uma alternativa para genes com extensão inferior a2kb é a produção Corpos de inc
de uma versão artificial. Isso envolve a síntese de um conjunto de oligonucleotídeos par-
cialmente sobrepostos, projetados de modo a garantirem que o gene resultante contém os
códons preferidos por E. coli e não possui terminadores'
nantes tam
13.2.2 Problemas causados por E. coli se caso, uÍ
Algumas das dificuldades encontradas quando da utilização de E. coli como hospedeira pa- rem respol
ra ã síntese de proteínas recombinantes advêm de propriedades inerentes à própria bactéria- a ausência
Por exemplo: utilização
maneira.
(1) E. colí pode não processar a proteína recombinante corretamente. As proteínas da
maioria dos organismos são processadas após a tradução, por modificação química de
aminoácidos presentes no polipeptídeo. Muitas vezes, esses eventos de processamen-
to são essenciais para a atividade biológica coÍreta da proteína. Infelizmente, as pro'
13.3 Produç
teínas de bactérias e de organismos superiores não são processadas de maneira idên- eucarid
tica. Em particular, algumas proteínas animais são glicosiladas, o que significa que
elas possuem grupos de açúcar ligados a elas após a tradução. A glicosilação é extre- Os proble
mamente incomum em bactérias e as proteínas recombinantes sintetizadas em E. coli recombini
nunca são glicosiladas corretamente. temas de t
(2) E. coli pode não enovelar a proteína corretamente e geralmente éincapaz de sintetizar tras bactér
as ligações dissulfeto presentes em muitas proteínas animais. Se a proteína não adota so foi alct
a sua estrutura terciáffia com enovelamento correto, ela geralmente é insolúvel e for- /i são euc
ma corpos de inclusão no interior da bactéria (Figura 13.15). A recuperação da pro- eucarioto
teína apartir de corpos de inclusão não é um problema, mas a sua conversão na forma próximo c
corretamente enovelada é difícil ou impossível in vitro. Obviamente, sob tais circuns- binantes t
tâncias a proteína é inativa. em cultivr
(3) E. coli pode degradar a proteína recombinante. Não se sabe exatamente, entretanto, a partir d€
como E coli é capaz de reconhecer a proteína exógena e fazer dela um alvo preferen- milar àqu
cial para reciclagem.
13.3.1 Proteín
Esses problemas são mais difíceis de serem resolvidos do que os problemas de seqüên- Íungos
cia descritos na seção anterior. A degradação de proteínas recombinantes pode ser reduzida
O potenc
com a utilização, como hospedeira, de uma linhagem de E. coli deficiente em uma ou mais
mente re(
proteases responsáveis por esse processo. O enovelamento correto de proteínas recombi-
versas pr
Ct-ouneev GÊNtcA E ANÁLtsE oe DNA 291
o em E. coli. Como des-

nos utilizarem o mesmo
sia de utilizar preferen- Célula de E coll
I com a qual as molécu-
Corpos de inclusão
cer os diferentes códons
levada de códons desfa-
buldades na tradução do
fgura 13.14c).
anipulações necessárias
I importante em um pro-
n alternativa o seu DNA

Drtanto, livre de íntrons.
Egada para alterar as se-
oráveis por aqueles pre-
Figura 13.í5 Nucleóide
nor a2 kb é a produção
Corpos de inclusão.
I oligonucleotídeos par-
ne resultante contém os
nantes também pode ser promovido pela escolha de uma linhagem hospedeira especial, nes-
pli como se caso' uma que sintetize grandes quantidades de proteínas chaperonas, que se acredita
hospedeira pa- se-
rem responsáveis pelo enovelamento de proteínas na célula. Porém, o principal problema é
Entes à própria bactéria-
a ausência de glicosilação. Até o momento, esse problema não teve solução, o que limita
a
utilização de E. coli à síntese de proteínas animais que não precisam ser modificadas dessa
mente. As proteínas da maneira.
modificação química de
FYentos de processamen-
m. Infelizmente. as pro- 13.3 Produção de proteínas recombinantes por células
Esadas de maneira idên- eucarióticas
das, o que significa que
r A glicosilação é extre- Os problemas associados com a obtenção de um alto rendimento na produção
de proteínas
r sintetizadas em E. coli recombinantes ativas a partir de genes clonados em E. coli levou ao desenvolvimenio
de sis-
temas de expressão para outros organismos. Houve algumas tentativas de utilização
E é incapaz de sintetizar de ou-
tras bactérias como hospedeiras para a síntese de proteínas recombinantes e
.Se a proteína não adota algum progres-
so foi alcançado com Bacillus subtilis, mas as principais alternativas
à utilização Ãe n. co-
hnenteé insolúvel e for- /i são eucariotos microbianos. o argumento para a utilização desses organismos é que um
). A recuperação da pro. eucarioto microbiano, como uma levedura ou um fungo filamentoso, ? um parente mais
I sua conversão na forma
próximo de um animal e, por isso, pode ser capaz delidar com a síntese de proteínas
mente, sob tais circuns- recom-
binantes mais eficientemente do que E. coti. Leveduras e fungos podem ser multiplicados
em cultivos contínuos tão facilmente quanto bactérias e podem expressar um gene
exatamente, entretanto" clonado
a partir de um organismo superior e processar a proteína resultante
de uma maneira mais si-
r dela um alvo preferen- milar àquela que ocorïe naturalmente.
13.3.1 Proteínas recombinantes produzidas a partir de leveduras e de

m problemas de seqüên-
fungos filamentosos
mntes pode ser reduzida
Eciente em uma ou mais O potencial de eucariotos microbianos para a expressão de genes exógenos já foi
ampla-
n de proteínas recombi- mente reconhecido e esses organismos estão sendo utilizados na rotina de produção
de di-
versas proteínas animais. Os vetores de expressão continuam sendo necessários,
pois os
292 T. A. Bnowr.r
promotores e outros sinais de expressão de genes animais geralmente não funcionam de

maneira eficiente nesses eucariotos inferiores. Os vetores utilizados são baseados naqueles
descritos no Capítulo 7.
Saccharomyces cerevisiae como hospedeira para a síntese de

proteínas recombi nantes
A levedura Saccharomyces cerevisiae é atualmente o eucarioto microbiano mais popular
para a produção de proteínas recombinantes. Os genes clonados são freqüentemente colo-
cados sob o controle do promotor GAL(Figura 13.16a), que está normalmente a montante
do gene que codifica a galactose-epimerase, uma enzima envolvida no metabolismo da ga-
lactose. O promotor GAL é induzido por galactose, constituindo-se, por isso, em um siste-
ma simples para a regulação da expressão de um gene exógeno clonado. Outros promoto-
res úteis são PHO5, que é regulado pelo nível de fosfato no meio de cultivo, e CUPl, qae é
induzido por cobre. A maioria dos vetores de expressão de levedura também possui uma se-
qüência de terminação de um gene de S. cerevisiae, porque sinais de terminação de genes
animais não funcionam eficientemente em leveduras.
O rendimento da produção de proteínas recombinantes em S. cerevisiae é relativamente
elevado, mas essa levedura é incapaz de glicosilar proteínas animais corretamente. Muitas
vezes ela adiciona um número excessivo de unidades de açúcar ("hiperglicosilação"), em- Figura í3.16
bora isso possa ser evitado ou pelo menos amenizado a partir da utilização de uma linha- Quatro promotores
gem mutante . S. cerevisiae também não possui um sistema eficiente para a secreção de pro- utilizados Íreqüente-
teínas para o meio. Na ausência de secreção, as proteínas recombinantes ficam retidas na mente em vetores de
célula e, conseqüentemente, têm sua purificação dificultada. O viés de códons (p. 290) tam- expressão de euca-
bém pode ser um problema. riotos microbianos.
P - promotor.
Apesar desses inconvenientes, S. cerevisiae permanece sendo o eucarioto microbiano
mais freqüentemente utilizado para a síntese de proteínas recombinantes. Isso se deve, em
parte, ao fato de ela ser aceita como um organismo seguro para a produção de proteínas pa-
ra utllizaçáo em medicamentos ou alimentos. Além disso, foi adquirida ao longo dos anos
uma riqueza de conhecimentos muito grande a respeito da bioquímica e da genética de S.
cerevisiae, o que torna relativamente mais fácil a elaboração de estratégias para a superação
das dificuldades que eventualmente surgem.
Outras leveduras e Íungos

Embora S. cerevisiae seja o organismo eucariótico preferido por muitos biólogos molecu-
lares para a síntese de proteínas recombinantes, existem outros eucariotos microbianos
igualmente qualificados, se não mais eficientes, para a execução dessa tnefa. Pichia pasto-
ris, em especial, uma segunda espécie de levedura, é capaz de sintetizar grandes quantida-
des de proteína recombinante (até307o da proteína celular total) e as glicosilações feitas por
ela são muito similares àquelas de células animais. As estruturas de açúcar que ela sinteti-
zanão são precisamente as mesmas que as versões animais (Figura 13.17), mas as diferen-
ças são muito pequenas e provavelmente não têm um efeito significativo na atividade da
proteína recombinante. Mais importante ainda, é improvável que as proteínas glicosiladas Figura l
produzidas por P. pastorls induzam uma reação antigênica se injetadas na corrente sangüí- Comparação entre
estrutura de glicosil
nea, um problema freqüentemente encontrado com proteínas glicosiladas em excesso sin-
típica encontrada em
tetizadas por S. cerevisiae. Vetores de expressão para P. pastoris utilizam o promotor da ál- proteína animal e a
cool-oxidase (AOX) (Figura 13.16b), que é induzido por metanol. O único problema signi- truturas sintetizada
ficativo com P pastoris é a degradação eventual das proteínas recombinantes antes de elas P. pastoris e S. cerev,
Clonnoev GÊNrcA E ANÁLrsE oe DNA 293
não funcionam & (a) O promotor GÁL

são baseados naqueles Galactose
p GAL 10 ..\
síntese de Transcrição
-a
iano mais popular (b) O promotor
-ll ÁOX
freqüentemente colo'
Metanol
mente a montante Gene da
no metabolismo da ga álcool-oxidase
,
por isso, em um siste- Transcrição
Outros promote -a,------tr
cultivo, eCUPL,queê
tambémpossui uma s (c) O promotor da glicoamilase
de terminação de genes oÏoo Xilose
Gene da
p glicoamilase
é relativamenE tr ..+\- lrâÍìSCÍlQâO +\ Sem transcnçao
is corretamente. Muim
icosilação"), er -a'---=-
Figura 13.16
tlrzaçáo de uma linh* Quatro promotores (d) O promotor da celobioidrolase
para a secreção de pro- utilizados freqüente- Celulose
inantes ficam retidas n mêntê êm vetores de daGene \
de códons (p. 290) tan' expressão de euca- p celobioidrolase \
lranscÍlçao
riotos microbianos.
P - promotor. -a!-----.-D
o eucarioto microbiam,
. Isso se deve,
de proteínas prr
irida ao longo dos
e da genética dc t,
muitos biólogos
/
Vr
Açúcares
glicosilações feitas
de açúcar que ela
13.17), mas as
ivo na atividade
YI
I
as proteínas glicosi
as na corrente
ilizam o promotor da
Figura 13.17
Comparação entre uma
estrutura de glicosilação
típica encontrada em uma
t
-Asn-
I
-Asn- -Asn-
proteína animal e as es-
O único problema si Homem P pastoris S. cerevisiae
truturas sintetizadas por
inantes antes de P pastoris e S. cerevisiae.
294 T. A. Bnowr.r
poderem ser purificadas, mas isso pode ser controlado pelo uso de um meio de cultrvo es- sadas corn
pecial. Outras leveduras que vêm sendo utilizadas para a síntese de proteínas recombinan- a abordagt
tes são Hansenula polymorpha, Yarrowia lipolytica e Kluveromyces lactis. Esta última tem a possibili,
o atrativo especial de poder ser cultivada em meio derivado de resíduos da indústria de ali- procedime
mentos. Produçã
Os dois fungos filamentosos mais populares são Aspergillus nidulans e Trichoderma
reesei. As vantagens desses organismos são as suas boas propriedades de glicosilação e a
Células dt
capaci<lade de secretarem proteínas para o meio de cultivo. Esta última vantagem é uma ca-
cultura, a:
racterística particularmente forte do fungo T. reesei, que, em seu hábitat natural, secreta en- têm como
produzirer
zimas celulolíticas que degradam a madeira em decomposição sobre a qual ele vive. As ca-
O siste
racterísticas secretórias implicam que esses fungos são capazes de produzir proteínas re-
em inseto:
combinantes em uma forma que auxilia na purificação das mesmas. Vetores de expressão
paraA. nidulans geralmente possuem o promotor da glicoamilase (Figura 13.16c), induzi- o gene da
corpos de
do por amido e reprimido por xilose; aqueles paraT. reesei uÍilìzamo promotor da celobioi-
único gen
drolase (Figura 13.16d), que é induzido por celulose.
lares de pi
13.3.2 Utilizando células animais para a produção de proteínas ne exóger
rias protet
recombinantes
corretam(
As dificuldades inerentes à síntese de proteínas animais inteiramente ativas em um hospe- vantagem
deiro microbiano levaram os biotecnólogos a explorarem a possibilidade de utilizar células
animais para a síntese de proteínas recombinantes. Para proteínas com estruturas de glico- Pharmi
silação complexas e essenciais, uma célula animal pode ser o único tipo de célula hospedei- de anin
ra na qual a proteína ativa pode ser sintetizada. Uma inor
nantes é i
Produção de proteínas em células de mamíÍeros
em todas
Os sistemas de cultivo para células animais já estão disponíveis desde o início da década de (p. 160).
1960, mas somente durante os dez últimos anos foram desenvolvidos métodos para a cultu- rável, por
ra contínua e em larga escala dessas células. Um dos problemas de algumas linhagens de ne clonat
células animais decorre do fato de elas exigirem uma superfície sólida para sua multiplica-
ção, o que complica a concepção dos recipientes utilizados no cultivo. Uma das soluções
encontradas foi o preenchimento do interior do recipiente com placas, que suprem a deman-
da por uma grande área plana. Isso, contudo, tem a desvantagem de tornar bastante difícil a
mistura completa e contínua do meio no interior do recipiente. Uma segunda possibilidade
é a de uilizar um recipiente comum, mas colocar no seu interior pequenas partículas iner-
tes (por exemplo, partículas de celulose) sobre as quais as células podem se multiplicar. Em
comparação com microrganismos, a velocidade de multiplicação e as densidades celulares
máximas que podem ser atingidas são muito menores para as células animais, limitando o
rendimento da produção de proteínas recombinantes. Isso, contudo, pode ser tolerado, se
essa for a única maneira para a obtenção da proteína ativa.
Obviamente, a clonagem gênica pode não ser necessáriapara a obtenção de uma proteí-
na animal a partir de um cultivo de células animais. Apesar disso, vetores de expressão e ge-
nes clonados são ainda utilizados para a maximizaçáo do rendimento, colocando o gene sob
controle de um promotor que é mais forte do que aquele ao qual ele está normalmente liga-
do. Esse promotor é freqüentemente obtido de um vírus, como SV40 (p. 160). Linhagens de
Corpos de inclusi
células de mamíferos derivadas de tecidos humanos ou de hamster vêm sendo utilizadas na
cleos de células
síntese de várias proteínas recombinantes e, em todos os casos, essas proteínas são proces- (
Cr-oruneeu GÊNrcA E ANÁLlsE DE DNA 295
;meio de cultivo es- sadas corretamente e são indistinguíveis das versões não-recombinantes. Entretanto, essa é
fteínas recombinan- a abordagem mais cara para a produção de proteínas recombinantes, especialmente porque
rni. Esta última tem a possibilidade de co-purificação de vírus com as proteínas implica o emprego de rigorosos
p da indústria de ali- procedimentos de controle de qualidade para a garantia de que o produto é seguro.
'lbns e Trichoderma Produção de proteínas em células de inseto

I de glicosilação e a Células de inseto representam uma alternativa para a produção de proteínas animais. Em
ivantagem é uma ca- cultura, as células de inseto comportam-se da mesma maneira que as de mamíferos, mas
lnatural, secretaen- têm como grande vantagem a característica de, graças a um sistema natural de expressão,
qual ele vive. As ca- produzirem as proteínas recombinantes com um alto rendimento.
pduzir proteínas re- O sistema de expressão é baseado nos baculovírus, um grupo de vírus que são comuns
Ptores de expressão em insetos, mas apaÍentemente não infectam vertebrados. O genoma do baculovírus inclui
o gene da poliedrina, cujo produto normal acumula-se nas células de inseto como grandes
lra 13.16c), induzi-
Iomotor da celobioi- corpos de inclusão nucleares ao final do ciclo de infecção (Figura 13.18). O produto desse
único gene freqüentemente chega a representar 5OVo da proteína celular total. Níveis simi-
lares de produção de proteína também ocorrem se o gene normal for substituído por um ge-
fteínas ne exógeno. Vetores de baculovírus vêm sendo utilizados com sucesso na produção de vá-
rias proteínas de mamífero, mas, infelizmente, as proteínas resultantes não são glicosiladas
corretamente. Em relação a esse aspecto, o sistema de baculovírus não oferece qualquer
f,inu, .- um hospe- vantagem em comparação a S. cerevisiae ou P' pastoris.
he de utilìzar células
lot-turu, de slicG- Pharming: proteínas recombinantes produzidas a partir
I de célula rrorJ.a"l- de animais vivos
f^
Uma inovação recente e potencialmente importante para a produção de proteínas recombi-
i nantes é autllizaçáo de um animal transgênico, um animal que contém um gene clonado
i
I
em todas as suas células, geralmente introduzido por microinjeção em um óvulo fecundado
lirri.io da década de (p. 160). A produção de animais transgênicos é cara, mas a relação custo-benefício é favo-
fetoaos para a cultu- rável, porque, depois de o animal ter sido produzido, ele pode reproduzir-se e passar o ge-
[u*ur linhagens de ne clonado a sua progênie, de acordo com os princípios mendelianos básicos'
foara sua multiplica-
[- Urnu das soluções
pe suprem a deman-
par bastante difícil a
fuunda
possibilidade
bnas partículas iner-
h se multiplicar. Em Citoplasma
pnsidades celulares
himais, limitando o
h'de ser tolerado. se
ì Membrana nuclear
foição de uma proteí-

k de expressão e ge-
plocando o gene sob
p normalmente liga-
Figura 13.18
I too;. Linhagens de Corpos de inclusão cristalinos em nú- Corpos de inclusão
I sendo utilizadas na
I cleos de células de inseto infectadas
foteínas são proces- com um baculovírus.
296 T. A. Bnowlr
A abordagem mais bem-sucedida até agora para a produção de proteínas recombinantes

em animais transgênicos utiliza animais de fazenda, como ovelhas ou porcos, com o gene
clonado ligado ao promotor do gene da p-lactoglobulina do animal. Esse promotor é ativo
no tecido mamário, o que significa que a proteína recombinante é secretada no leite (Figu-
ra 13.19)' A produção de leite pode ser contínua durante a vida adulta do animal, resultãn-
do em um grande rendimento na produção da proteína. Além disso, como a proteína é se-
cretada, a sua purificação é relativamente simples. Mais importante ainda é ó futo d" on"-
lhâs e porcos serem mamíferos, de modo que proteínas humanas produzidas dessa maneira
são modificadas corretamente. A produção de proteínas de uso farmacêutico em animais
de
fazenda vem sendo chamada de pharming (do inglês pharmaceuticals xfarming). Apesar
de controversa, essa técnica é uma das que oferece maiores perspectivas para a síntese de
proteínas humanas corretamente modificadas para utilização na medicina.
13.3.3 Proteínas recombinantes produzidas a partir de vegetais

Os vegetais representam a última possibilidade para a produção de proteínas recombinan-
tes. Plantas e animais possuem atividades de processamento de proteínas similares e a
maioria das proteínas animais produzidas em plantas passa pelas modificações pós-tradu-
ção corretas, sendo, portanto, completamente funcionais. O cultivo de células ueg"tui, é
uma tecnologia bem estabelecida, que já vem sendo utilizada para a síntese comercial de
produtos naturais de plantas. Alternativamente, plantas intactas podem ser cultivadas a cam-
po em altas densidades, o que determina um elevado rendimento na produção de proteínas
recombinantes, com bom potencial para armazenamento de longo prazo, emórgãos como
tubérculos ou frutos, naturalmente ricos em proteína.
Seja qual for o sistema de produção utilizado, as plantas oferecem meios baratos e de
baixa tecnologia para a produção massiva de proteínas recombinantes. Uma ampla gama de
proteínas já foi produzida em sistemas experimentais, inclusive produtos farmacêuticos
im-
portantes, como interleucinas e anticorpos. Essa é uma ârea depesquisa intensa no
momen-
to, com viírias empresas de biotecnologia vegetal desenvolvendo sistemas que estão próxi-
mos da produção comercial. Uma das possibilidades futuras mais promissoras é a uìitiru-
ção de plantas para a produção de vacinas, o que serviria de base para programas de vaci-
nação baratos e eficientes.
ra
!
296 T. A. Bnowlr
A abordagem mais bem-sucedida até agora para a produção de proteínas recombinantes

em animais transgênicos utiliza animais de fazenda, como ovelhas ou porcos, com o gene
clonado ligado ao promotor do gene da B-lactoglobulina do animal. Esse promotor é ativo
no tecido mamário, o que significa que a proteína recombinante é secretada no leite (Figu-
ra 13.19). A produção de leite pode ser contínua durante a vida adulta do animal, resultan-
do em um grande rendimento na produção da proteína. Além disso, como a proteína é se-
cretada, a sua purificação é relativamente simples. Mais importante ainda é o fato de ove-
lhas e porcos serem mamíferos, de modo que proteínas humanas produzidas dessa maneira
são modificadas corretamente. A produção de proteínas de uso farmacêutico em animais de
fazenda vem sendo chamada de pharming (do inglês pharmaceuticals xfarming). Apesar
de controversa, essa técnica é uma das que oferece maiores perspectivas para a síntese de
proteínas humanas corretamente modificadas para utilização na medicina.
13.3.3 Proteínas recombinantes produzidas a partir de vegetais

Os vegetais representam a última possibilidade para a produção de proteínas recombinan-
tes. Plantas e animais possuem atividades de processamento de proteínas similares e a
maioria das proteínas animais produzidas em plantas passa pelas modificações pós-tradu-
ção corretas, sendo, portanto, completamente funcionais. O cultivo de células vegetais é
uma tecnologia bem estabelecida, que já vem sendo utilizada para a síntese comercial de
produtos naturais de plantas. Alternativamente, plantas intactas podem ser cultivadas a cam-
po em altas densidades, o que determina um elevado rendimento na produção de proteínas
recombinantes, com bom potencial para arÍnazenamento de longo prazo, em órgãos como
tubérculos ou frutos, naturalmente ricos em proteína.
Seja qual for o sistema de produção utilizado, as plantas oferecem meios baratos e de
baixa tecnologia para a produção massiva de proteínas recombinantes. Uma ampla gama de
proteínas já foi produzida em sistemas experimentais, inclusive produtos farmacêuticos im-
portantes, como interleucinas e anticorpos. Essa é uma fuea de pesquisa intensa no momen-
to, com viirias empresas de biotecnologia vegetal desenvolvendo sistemas que estão próxi-
mos da produção comercial. Uma das possibilidades futuras mais promissoras é a utiliza-
ção de plantas para a produção de vacinas, o que serviria de base para programas de vaci-
nação baratos e eficientes.
Cr-oruaeeu GÊNrcA E ANÁLrsE oe DNA 297
recombinantes
lx)rcos, com o gene
promotor é ativo
no leite (Figu-
do animal, resultan-
a proteína é se
é o fato de ove-
Promotor da p-lactoglobulina
dessa maneira
em animais de
xfarming). Apasar Clonagem em uma
ovelha transgênica
para a síntese dc
is
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ínas similares e I
ificações pós-tra&
células vegetais é
síntese comercial dc
ser cultivadas a caÍh
Figura 13.19
Produção de uma
Proteína recombinante
em órgãos como proteína recombi-
secretada no leite
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Uma ampla gama& nica.
farmacêuticos ir
intensa no momcr
que estão próxi-
programas de vaci.
.
Cnpíruloí 4 )
hion in Biotechnology, 10,
licl derived from Íhe trp anil Clonagem Gênica e Análise

h-5.
Qenic Re se arch, 9, 27 9 -99 - de DNA na Medicina
i
ldies: a comparison of Sac-
3. Gene, lg0, 87-gi .
ix for biopharmaceuticals.
I
Lession in Escherichia co-
F
ifor insect and mammalian
Drstems for high level gene

I
lgenic Research, 9, 301-4-
i
;
Icoli strains deficient in all
|otechnology, 12, I 107-10.
pntes em E. coll.l Produção de medicamentos recombinantes, 299 Terapia gênica,3l4
ksion controlled by the P., Identificação de genes responsáveis por doenças
humanas. 309
hslation of genes in Escàe-

i
Vin Escherichia coli as fu-

i
A medicina foi e continua a ser a maior beneficiária da revolução do DNA recombinante; as-
Iúesis and secretion of h€- sim, um livro inteiro poderia ser escrito a respeito deste tópico. Mais adiante, neste capítulo,
I
I aborda-se a forma como as técnicas de DNA recombinante estão sendo utilizadas para iden-
I recombinant protein pro-
tificar genes responsáveis por doenças hereditiírias e para o desenvolvimento de novos trata-
mentos para esses distúrbios. Inicialmente, será dada continuidade ao tema tratado no capítu-
lo anterior e examinada a maneira como os genes clonados estão sendo utilizados na produ-
ção de medicamentos recombinantes.
14.1 Produção de medicamentos recombinantes

Diversas doenças humanas podem ser identificadas como decorrentes da ausência ou do mau
funcionamento de uma proteína normalmente sintetizada no colpo. A maioria dessas enfermi-
dades pode ser tratada a partir do fornecimento ao paciente da versão coÍïeta da proteína, mas,
para que isso seja possível, é necessário que a proteína relevante esteja disponível em quanti-
dades relativamente grandes. Se o defeito pode ser corrigido apenas com a administração da
proteína humana, a obtenção de quantidades suficientes da mesma pode ser um grande pro-
blema, a menos que sangue fornecido por doadores possa ser utilizado como fonte piÌra sua
purificação. Por isso, proteínas de origem animal são usadas sempre que possível. Entretanto,
não existem muitas enfermidades que podem ser tratadas com proteínas animais e, além dis-
so, há sempre a possibilidade de ocorrência de efeitos colaterais quando elas são empregadas,
como, por exemplo, uma resposta alérgica.
O Capítulo 13 mostrou que a clonagem gênica pode ser utilizada para a obtenção de gran-
des quantidades de proteínas recombinantes humanas. Como essas técnicas estão sendo apli-
cadas à produção de proteínas que serão usadas como medicamentos?
5
Ì
F
n
[.'
300 T. A. Bnowr.r
14.1.1 Insulina recombinante

A insulina, sintetizada pelas células B das ilhotas de Langerhans, no pâncreas, controla o ní-
vel de glicose no sangue. Uma deficiência em insulina manifesta-se como diabete melito, um
complexo de sintomas que podem levar à moÍe, quando não-tratados. Felizmente, muitas for-
mas de diabete podem ser atenuadas por um programa contínuo de injeções de insulina, su-
plementando assim a quantidade limitada desse hormônio que é sintetizada pelo pâncreas do
paciente. A insulina utilizadano tratamento é tradicionalmente obtida a partir de pâncreas de
suínos e de bovinos abatidos para a produção de carne. Embora a insulina de origem animal
seja geralmente satisfatória, ela pode eventualmente causar problemas quando utilizada no Lí
tratamento do diabete humano. Um dos problemas decorre das pequenas diferença's entre a
proteína humana e as de origem animal, que podem levar a efeitos colaterais em alguns pa-
cientes. Outro problema é a dificuldade dos procedimentos de purificação, que nem sempre
eliminam contaminantes potencialmente perigosos.
A insulina apresenta duas características que facilitam a sua produção por técnicas de
DNA recombinante. Primeiramente, a proteína humana não é modificada após a tradução pe-
la adição de moléculas de açúcar (p.289); portanto, a insulina sintetizada por uma bactéria de-
ve ser ativa. A segunda vantagem relaciona-se ao tamanho da molécula. A insulina é uma pro-
teína relativamente pequena, composta por dois polipeptídeos, um de 21 aminoácidos (a ca-
deiaA) e o outro de 30 (a cadeia B; Figura 14.1). No homem, tais cadeias são sintetizadas co-
mo um precursor chamado pré-proinsulina, que contém os segmentos A e B ligados por uma
terceira cadeia (C) e é precedido por uma seqüênciaJíder. A seqüêncialíder e a cadeia C são
removidas após a tradução, deixando os polipeptídeos A e B ligados um ao outro por duas
pontes de dissulfeto.
Viárias estratégias já foram utilizadas para a obtenção de insulina recombinante. Um dos
primeiros projetos, envolvendo a síntese de genes artificiais para as cadeiâs A e B seguida pe-
la produção de proteínas em E. coli, ilustra inúmeras técnicas gerais usadas na produção de
proteínas recombinantes.
Síntese e expressão de genes de insulina artificiaas Figura 14.1

A estrutura da mo-
No final da década de 1970, aidéia de sintetizar um gene artificial era extremamente inova- lécula de insulina
dora. Naquela época, a síntese de oligonucleotídeos estava na sua infância e os métodos dis- e um resumo da
poníveis para a produção de moléculas de DNA artificiais eram muito mais complicados do sua síntese por
que as técnicas automatizadas atuais. Apesar disso, genes codificando as cadeias A e B da in- processamento da
sulina foram sintetizadosjá em 1978. pré-proinsulina. ;-
A estratégia utilizada sintetizava trinucleotídeos representando todos os códons possíveis,
que foram então unidos na ordem ditada pelas seqüências de aminoácidos das cadeias A e B.
Os genes artificiais não tinham necessariamente as mesmas seqüências nucleotídicas que os
segmentos gênicos reais que codificam essas cadeias, mas, ainda assim, eles especificavam os gênio (p. 287r. t
polipeptídeos corretos. Dois plasmídeos recombinantes foram consffuídos, um carregando o de pontes de dis
gene artificial para a cadeia A e o outro, o gene da cadeia B. A etaPa final
Em ambos os casos, o gene artificial foi ligado a uma fase de leitura de.lacZ',presente em ciente. Um aprn
um vetor do tipo pBR322 (Figura 14.2a). Os genes de insulina estavarri, portanto, sob o con- duais, mas de to
trole do forte promotor lac (p.283) e foram expressados como proteínas de fusão, as quais (Figura 14.l). Is
consistiam nos primeiros aminoácidos da B-galactosidase seguidos pelo polipeptídeo A ou B DNA, mas apro
(Figura 14.2b). Cada gene foi projetado de modo a que seus segmentos de pontaneamente
B-galactosidase e
de insulina fossem separados por um resíduo de metionina, para que esses dois componentes correspondente
pudessem ser liberados por clivagem, proporcionada por tratamento com brometo de ciano- proteolítica.
L.
?
E
)
Ct-orueeeu GÊNtcA E AlrÁr-sì-õí DNA
pâncreas, controla o ú- 30 aminoácidos

bmo diabete melito, tm : CadeiaB
muitas for-
iFelizmente,
ffeções de insulina, sw
lizada pelo pâncreas do 21 aminoácidos
ia partir de pâncreas de A molécula de insulina
hina de origem animal
$ guando utilizada no Líder
ienas diferença's entre e
(Proinsulina = BCA - sem líder)
platerais em alguns pa- Pré-proinsulina
bação, que nem sempÍE
I
I
Enovelamento espontâneo
iú"çao por técnicas dc j
iada após a tradução pe-
ha por uma bactéria de-
f- A insulina é uma pK>
b 2l aminoácidos (a e.
pias sao sinteúzadas e
iA e B ligados por nÍrn
hlfdereacadeiaCsão
b um ao outro por dum
I
i
precombinante. Um dm
ideiasAeBseguidape-
[usadas na produção dc
t Clivagem
I'
t
f Figura 14.1
I A estrutura da mo-
p extremamente inov+ lécula de insulina
B
pncia e os métodos dir- e um resumo da çç

SS
lo mais complicados & sua síntese por I ^ I
A
Insulina
processamento da
[ascadeiasAeBdair
i pré-proinsulina.
ps os códons possíveis*
das cadeias A e B-
lidos
ps nucleotídicas que c
lq eles especificavam oe gênio (p. 287). As cadeias A e B purificadas eram então ligadas uma à outra, pela formação
Fídos, um carregando o de pontes de dissulfeto em tubo de ensaio.
r
A etapa final, envolvendo a formação de pontes de dissulfeto, mostrou-se bastante inefi-
pde lacZ', presente €n ciente. Um aprimoramento posterior da técnica permitiu a síntese não de genes A e B indivi-
$, portanto, sob o con- duais, mas de toda a fase de leitura da proinsulina, especificando cadeia B-cadeia C-cadeia A
pÍnas de fusão, as qn*h (Figura 14.1). Isso constitui-se em uma proposição mais desafiadora em termos de
síntese de
po polipeptídeo A ou B DNA, mas a produção do pró-hormônio trouxe consigo a grande vantagem de enovelar-se es-
$ de p-galactosidase c pontaneamente na estrutura correta, com a formação das pontes de dissulfeto. O segmento
pses dois componentes correspondente à cadeia C podia, então, ser removido com relativa facilidade por clivagem
bom brometo de ciano proteolítica.
i
-
302 T. A. Bnowr.r
(a) Os genes aÍtiÍiciais A son

proteína n
te adequar
lacZ'
.a
ma descrir
Promotor /ac
Gene A Gene B tor lacZ' I
nogênio.
A sínt
() tem uma Í
ficial corr
fícil, pois
Vetor carregando o
\_/ Por isso, I
Vetor carregando o
gene A artificial gene B artiÍicial mentar (c
(b) Síntese da proteína insulina mensageir
po human
írq fina conú
T,4 Células de E coll va em doi
/\ /{ transformadas
l9l, foi n
Á_ \ /\ sintetizam as
proteínas de nor foi su
1-- - ---\ 1-. - - --\ fusão A e B
A B
somatotÍo
Segmento da I
modificad
B-galactosidase I I .
I
cadeia A
-)-, "ô"ru,
met rã-
I
tt
Brometo de I
cranogenro
I i
Proteínas de Íusão
clivadas
PuriÍicação das cadeias A e B,

associação por pontes de dissulÍeto
-rr- Figura 14.2

A síntese da insulina
recombinante a partir
lnsulina
de genes artiÍiciais
dascadeiasAeB.
14.1.2 síntese de hormônios de crescimento humanos em E. coti

Aproximadamente na mesma época em que foi produzida pela primeira vez a insulina
recom-
binante em E- coli, outros pesquisadores estavam trabalhando em projetos
similares envolven-
do os hormônios de crescimento humanos somatostatina e somatotrofina.
Essas duas proteí-
nas agem em conjunto para controlar processos de crescimento no corpo
humano e o mau
funcionamento das mesmas leva a enfermidades dolorosas e incapacitanìes, Fi
como a acrome-
galia (crescimento ósseo descontrolado) e o nanismo. Produção de somdo
cú
tË
*
k
#
E-t
a\
E
F
É
F
Ct-orunceu GÊnrcn e ANÁLtsE or DNA 303
A somatostatina foi a primeira proteína humana a ser sintetizada em E coli.por ser uma
proteína muito pequena, com uma extensão de apenas 14 aminoácidos, elaeç particularmen-
te adequada para a síntese do gene artificial correspondente. A estratégia utitr iàadafoia mes-
ma descrita para a insulina recombinante, envolvendo a inserção do genà artificial em um ve-
tor lacZ'(Figura 14.3), a síntese de uma proteína de fusão e a clivagem com brometo de cia-
nogênio.
A síntese de somatotrofïna foi um problema de solução mais complexa. Essa proteína
tem uma extensão de 191 aminoácidos, equivalente a quase 600 pb, e a síntese do gene arti-
ficial correspondente representava, no final da década de l97},uma tarefa extremamente di-
fícil, pois seria um desafio até mesmo para a capacidade de síntese de DNA dos dias atuais.
Por isso, foi utilizada uma combinação de síntese artificial e de clonagem de DNA comple-
mentar (cDNA) para a obtenção da linhagem de E. coli produtora de somatotrofina. RNA
mensageiro (mRNA) foi obtido da pituitária, a glândula que produz a somatotrofina no cor-
po humano, e, a partir dele, foi preparada uma biblioteca de cDNA. O cDNA da somatotro-
fina continha um sítio único para a endonuclease de restrição HaeIlI, que, portanto, o cliva-
va em dois segmentos (Figura 14.4a). O segmento mais longo, incluindo os códons de 24 a
191, foi mantido para utilização na construção do plasmídeo recombinante. O fragmento me-
nor foi substituído por uma molécula de DNA artificial, que reproduzia o início do gene da
somatotroÍina e incluía os sinais corretos para a tradução em E coli (Figura 14.4b). O gene
modificado foi então ligado a um vetor de expressão portador do promotor /ac.
lacZ'
Promotor /ac Gene artificial da somatostatina
- L.
>.Rí.
14.2
/ \ ---.-
síntese da insulina
( ) \ rransrormação
te a paíÍ \ / \oee.cori
genes artiÍiciais
cadeias A e B.
\--./ \
Segmento da
p-galactosidase
'1,"\-
'
Proteína
met \\ oe Ìusao
Somatostatina
E. coli
Brometo de
a insulina recm.
cianogênio
similares envolven
Essas duas proteí- \
hUmanO e O ÍÍtil
Figura 14.3 Somatostatina
como a acrorln-
Produção de somatostatina re-
-
combinante.
Cloruaoeu GÊrurca e ANÁLtsE oe DNA 303
A somatostatina foi a primeira proteína hur{ana a ser sintetizada em E coli.Por ser uma
proteína muito pequena, com uma extensão de a[gna$ 14 aminoácidos, ela era particularmen-
te adequada para a síntese do gene artificial correspondente. A estratégia utilizada foi a mes-
ma descrita para a insulina recombinante, envolvendo a inserção do gene artificial em um ve-
tor lacZ' (Figura I4.3), a síntese de uma proteína de fusão e a clivagem com brometo de cia-
nogênio.
A síntese de somatotrofina foi um problema de solução mais complexa. Essa proteína
tem uma extensão de 191 aminoácidos, equivalente a quase 600 pb, e a síntese do gene arti-
ficial correspondente representava, no final da década de 1970, uma tarefa extremamente di-
fícil, pois seria um desafio até mesmo para a capacidade de síntese de DNA dos dias atuais.
Por isso, foi utilizada uma combinação de síntese artificial e de clonagem de DNA comple-
mentar (cDNA) para a obtenção da linhagem de E. coli produtora de somatotrofina. RNA
mensageiro (mRNA) foi obtido da pituitária, a glândula que produz a somatotrofina no cor-
po humano, e, a partir dele, foi preparada uma biblioteca de cDNA. O cDNA da somatotro-
fina continha um sítio único para a endonuclease de restrição HaeIII, que, portanto, o cliva-
va em dois segmentos (Figura 14.4a). O segmento mais longo, incluindo os códons de 24 a
191, foi mantido para utilização na construção do plasmídeo recombinante. O fragmento me-
nor foi substituído por uma molécula de DNA artificial, que reproduzia o início do gene da
somatotrofina e incluía os sinais corretos para a tradução em E. coli (Figwa I4.4b). O gene
modificado foi então ligado a um vetor de expressão poÍador do promotor /ac.
lacZ'
Promotor /ac Gene artificial da somatostatina
- L,
).4
/ \ --..-
Figura14.2 (
Â síntese da insulina ) \ rransÍormação
a partir \ / \deeco/r
de genes artiÍiciais \_-,' \
dascadeiasAeB.
Segmento da
p-galactosidase .af\_ Proteína
' \ Oe lusao
met \
Somatostatina
E. coli
Brometo de
vez a insulina recom- cianogênio
similares envolven- tl)
. Essas duasproteí-
humano o mau
e
Figura 14.3 -- Somatostatina
como a acrome- Produção de somatostatina re-
combinante.
t
F_
r
h
F
t,
F
É,
E-
T
3
t
304 T. A. Bnowlt
(a) Preparação do Íragmento de GDNA da somatotroÍina cedimento coÍ

cesso de purifi
las virais presr
mofílicos por i
Códons 0 24 19.1
contaminação,
Haelll O gene do:
dido em 26 éx
I
I Restrição com Haelll (com 2.351 an
I pós-traduçtu, I
0 24 24 dade maior, dc
7
191
nor, derivada d
17 pontes & d
-
Descartado -"' teína tÍio grand
coli.
Por isso, as
lulas de marní
(b) Expressão em células de I
baixo. Issogo
o24 191 retamente nõ I
va, compro{nÉí
,/I
separados obtÍ
Líder sintético / CDNA
tro codificanü
/ Pressão, ajnse
/ lnserçáo em um globina de cod
vetorde expressão
/ Os plasmídec
Promotor /ac
TransÍormação
Síntese da
em E. coti somatotrofina
Figura 14.4
Produção da somatotroÍina
recombinante.
14.1.3 FatorVlll recombinante

Embora vários compostos de uso farmacêutico tenham sido
obtidos a partir de genes clona-
dos em E' coli, os problemas gerais associados ao uso de
bactérias para síntese de proteínas
exógenas (p. 288) levou, em muitos casos, à substituição
desses organismos por eucariotos.
um exemplo de medicamento recombinante produzido em células zucarióticas
é o fatorvlll
humano,,uma proteína que tem uma função õentral na
coagulação sangüínea. A forma mais
comum de hemofilia no homem resulta da incapacidade de
sintãtizar útor vIII, o que leva
a uma intemrpção na rota de coagulação sangüínea e
aos conhecidos sintomas associados a
essa doença. Figura 14.5
Até recentemente, a única maneira de tratar a hemofilia era com O gene do fatorVlll e o
injeções da proteína fator
vIII purificada de sangue humano obtido de doadores. A purificaçãoão rutorvtu seu produto de tradu-
é um pro-
ção.
Ë
F
È
F
Ë
F
E
È
i:t
f
F.
Ë
I
Cr-oruaeeu GÊrrce e ANÁLtsE oe DNA 305
cedimento complexo e, por isso, o tratamento é bastante caro. Para piorar a situação, o pro-
cesso de purificação é problemático, especialmente no que diz respeito à remoção
de partícu-
las virais presentes no sangue. A hepatite e a AIDS podem ser, e já foram, transmitidas
a he-
mofilicos por injeções de fator VIII. Assim, o fator VIII recombinante, livre de problemas de
contaminação, seria uma conquista importante para a biotecnologia.
O gene do fator VIII é muito grande. Ele tem uma extensão de mais de 186 kb e está divi-
dido em 26 éxons e 25 íntrons (Figura 14.5a). O seu mRNA codifica um grande polipeptídeo
(com 2.351 aminoácidos), que passa por uma série complexa de eventos de procesiamento
pós-tradução, acabando por resultgr-eq uma proteína dimérica, que consiste em uma subuni-
dade maior, derivada da região a Érontjünte do polipeptídeo inicial, e em uma subunidade me-
nor, derivada do segmento a jusante (Figura 14.5b). As duas subunidades contêm um total de
17 pontes de dissulfeto e vários sítios glicosilados. Como pode ser antecipado para uma pro-
teína tão grande e complexa, é impossível a síntese da sua versão recombinarúe ativa em E
coli.
Por isso, as tentativas iniciais para a obtenção do fator VIII recombinante envolveram cé-
lulas de mamíferos. Nos primeiros experimentos executados, o cDNA completo foi clonado
em células de hamster, mas o rendimento da produção da proteína foi desapontadoramente
baixo. Isso provavelmente aconteceu porque os eventos pós-tradução, embora executados cor-
retamente nas células de hamster, não converteram todo o produto inicial em uma forma ati-
va, comprometendo o rendimento final. Como alternativa, foram utilizados dois segmentos
separados obtidos a partir do cDNA, um codificando a subunidade polipeptídica maior e ou-
tro codificando a subunidade menor. Cada fragmento de cDNA foi ligado a um vetor de ex-
pressão, a jusante do promotor Ag (um híbrido entre seqüências de p-actina de galinha
e B-
globina de coelho) e a montante de um sinal de poliadenilação do vírus SV40
@ìgura la.6).
Os plasmídeos foram introduzidos em uma linhagem celular de hamstere obtidas as proteí-
i (a) O gene do ÍatorVlll

t4
I
lda somatotroÍina Exons lntrons

Ì
lnte.
,
I
20 kb
Itir de genes clona- (b) PÍocessamento pós-tÍadução do Íator Vlll

liíntese de proteínas
hos por eucariotos.
fticas é o fatorVIII Produto de tradução
hea. A forma mais \ primário (2.351
lor VIII, o que leva Eventos de processamento \ aminoácidos)
fumas associados a
\
i Figura 14.S \
bs da proteína fator
O gene do fator Vlll e o *c ProteÍna Íator Vlll madura
seu produto de tradu-
htor VIII é um pro-
ção.
-A
:.
I
306 T. A. Bnowr.r
Thbela 14.1 A
cDNA do Íator Vlll dos em bactéri:
Promotor Ag Seqüência de Proteína

de SV40
Insulina
Somatostatina
Figura 14.6 Somatotrofila
Os sinais de expressão utilizados na produção do fator Vlll recombinante. O promotor é um FatorVIII
híbrido artiÍicial de seqüências de B-actina de galinha e B-globina de coelho e o sinal de po' Fator D(
liadenilação (necessário para o processamento correto do mRNA antes de sua tradução em Interferon-cr
proteína) é obtido do vírus SV40.
Interferon-p
Interferon-y
Interleucinas
Fator estimuk
nas recombinantes correspondentes. O rendimento foi mais de l0 vezes superior àquele obti-
Fator de necÍoÍ
do a partir de células contendo o cDNA completo e a proteína fatorVIII resultante era funcio-
Fator de crescir
nalmente indistinguível da forma nativa.
A tecnologia mais recente para a produção do fator VIII envolve o pharming (p. 295). O Fator de crescir
cDNA humano completo foi ligado ao promotor do gene suíno da proteína acídica do soro do Eritropoietina
leite, levando à síntese do fator VIII humano em tecido mamário suíno e à subseqüente secre- Ativador de plz
ção da proteína no leite. O fator VIII produzido dessa maneira parece ser exatamente o mes- Superóxidodir
mo que a proteína nativa e é inteiramente funcional em ensaios de coagulação sangüínea.
Proteína surfac
14.1.4 Síntese de outras proteínas humanas recombinantes ot,-antitripsina
A lista de proteínas humanas sintetizadas por tecnologia recombinante continua a crescer (Ta- Albumina sfic
bela l4.l). Além das proteínas utilizadas no tratamento de doenças por substituição ou suple- Relaxina
mentação da atividade das versões não-funcionais, a lista também inclui viírios fatores de Desoxirribonrx
crescimento (por exemplo, interferons e interleucinas) com potencial para utilização na tera-
pia do câncer. Tais proteínas são sintetizadas em quantidades muito limitadas no corpo, de
modo que a tecnologia recombinante representa a única maneira viável para a obtenção das (2) As grandr
mesmas nas quantidades necessárias para propósitos clínicos. Outras proteínas, como a albu-
em geral r
mina sérica, são mais facilmente obtidas, mas necessárias em quantidades tão grandes que a
da hepatit
produção em microrganismos ainda é uma opção mais atraente.
Produção d
14.1.5 Vacinas recombinantes A utilização da
A categoria final das proteínas recombinantes é um pouco diferente dos exemplos dados na pecíficos são às
Tabela 14.1. Uma vacina é uma preparação antigênica que, depois de injetada na coÍïente san- tra componentr
güínea, estimula o sistema imune a sintetizar anticorpos que protegem o corpo contra uma in- das das proteír
fecção. O material antigênico presente na vacina é normalmente uma forma inativada do identif,rcar e iru
agente infeccioso. Por exemplo, vacinas antivirais freqüentemente consistem em partículas de cas de um detet
vírus que foram atenuadas por aquecimento ou por um tratamento similar. No passado, dois animais poderir
problemas dificultaram a preparação de vacinas virais atenuadas. utilização corn
e de serem obti,
(1) O processo de inativação deve ser IOOVo efrciente, pois a presença na vacina de apenas Infelizment
uma partícula viral viva já poderia resultar em infecção. Esse tem sido um problema pa- porque as prote
ra vacinas para a aftosa bovina. des antigênicas
:
i:
;
;
F
I
I
E
f
n
Clorunoeu GÊNtcA E Ar.rÁlrse oe DNA 907
Tabela 14'1 Algumas das-proteínas humanas que foram

sintetizadas aparrirde genes clona-
dos em bactérias e/ou células eucarióticas ot por pharming
Proteína Utilizada no tratamento de

Insulina Diabete
Somatostatina Anomalias no crescimento
i
I Somatotrofina Anomalias no crescimento
Ante.Opromotoréum Fator VIII Hemofilia
poelhoeosinaldepe Fator IX
p de sua tradução ent
Interferon-cr
Doença de Christmas
Leucemia e outros cânceres
Interferon-B Cânceres, AIDS
Interferon-y Cânceres, artrite reumatóide
Interleucinas Cânceres, enfermidades do sistema imune
i
superior àquele úti- Fator estimulador de colônia de granulócitos Cânceres
faes
p resultante era funcie Fator de necrose tumoral Cânceres
Fator de crescimento epidérmico úlceras
t
Io pharming (p. 295)- O Fator de crescimento de fibroblastos úlce.u.
peína acídica do soro& Eritropoietina Anemia
peàsubseqüentesecÍÈ Ativador de plasminogênio tecidual Ataque cardíaco
F ser exatamente o ÍÍH- Superóxido-dismutase Danos por radicais livres em
[agulação sangüínea
transplantes renais
i Proteína surfactante pulmonar
prtes Insufi ciência respiratória
I
cr,-antitripsina Enfisema
p continua a crescer (T* Albumina sérica Utllizada como um suplemento de plasma
substituição ou sr4b Relaxina Utilizada como auxiliar no parto
inclui viírios fatores & Desoxirribonuclease
para utilização na E*. Fibrose cística
limitadas no corgn-- &,
para a obtenção dr:
proteínas, como a db
(2) As grandes quantidades de partículas virais necessárias para
a produção de vacinas são
em geral obtidas a partir de culturas de tecidos. Infelizmente,
tão grandes qrcn uìgun, vírus, sobretudo o
da hepatite B, não se multiplicam nesse tipo de cultura.
Produção de vacinas como proteínas recombinantes

A utilização da clonagem gênica na áreabaseia-se na descoberta de que
dos exemplos dadorin anticorpos vírus-es-
i pecíficos são às vezes sintetizados em resposta
não a toda a partícula virat, mas também con-
iiol"tuou nu corrente srF tra componentes isolados do vírus. Isso é particularmente
verdade para preparações purifica-
p o corpo contra u'nf,foF das das proteínas presentes no capsídeoìiral (Figura
14.7).4; h;iesse possibilidade de
lma forma inaúvada &, identificar e inserir em um vetor de expressão os genes
que codificam as proteínas antigêni-
lnsistem em partículro&, cas de um determinado vírus, os métodos descrito-s
ant".iorm"nte p*u à ,int"r. de proteínas
Fmitar. No passado, dú; animais poderiam ser empregados para a produção
de proteínas rËcombinantes passíveis de
I utilização como vacinas, as quais teriam ai vantagens
dã não conter partículas virais intactas
I e de serem obtidas em grandes quantidades.
[ça na vacina de apenc Infelizmente, tal abordagem não tem sido aplicada
com inteiro sucesso, principalmente
hm sido umproblemapr porque as proteínas de capsídeo recombinantes
muitas vezes não posru"-,odu, as proprieda-
I des antigênicas do vírus intacto. uma experiência
bem-suceoida foi feita com o vírus da he-
:-D
a
308 T. A. Bnowlr
a
aa
a'a lnjeção na correntê sangüínea
a
Proteínas de capsídeo
viral isoladas
.C.t
r.
Anticorpos especíÍicos
contra a proteína de
ts . o)-- capsídeo
P o:= )-
/ lnlecçâo posterior por
/
um vírus completo
/
t/
>.Ì'3% '
-{.tcrn
// tF
a}- Figura 14.7
'l'$ :í
;'"' ËT[ï'"ï;ff."ffffiãi"
O princípio subjacente ao
uso de uma preparação
de proteínas de capsídeo
Figura t4-O
O princípio subja-
viral isoladas como uma cente ao uso poten-
vacina. cial de um vírus de
vacínia recombi-
nante.
patite B, cuja proteína de capsídeo (o "antígeno de superfície principal") foi sintetizada em

Saccharomyces cerevisiae, utilizando um vetor baseado no plasmídeo de 2 pm (p. lag). A
proteína foi obtida em quantidades razoavelmente elevadas e, quando injetada emmacacos, rir imunid
protegeu os animais contra a hepatite B. Essa vacina recombinante já foi aprovada para utili- possibilid
zação em humanos. ção de qu
do vírus d
Vacinas recom bi nantes vivas rus do her
quesüio il
O uso do vírus da vacínia vivo como uma vacina para a varíola data de 1796, quando
Edward logia viral
Jenner descobriu que esse vírus, inócuo para humanos, eracapazde estimular imunidade
con- fera por n
tra o vírus da varíola, muito mais perigoso. O termo "vacina" vem de vacínia; o seu
uso resul-
tou na erradicação mundial da varíola em 1980.
Uma idéia mais recente considera que vírus de vacínia recombinantes poderiam ser usa-
dos como vacinas vivas contra outras doenças. Se um gene codificando uma proteína
14.2 ldentiÍir
de cap-
sídeo viral, como, por exemplo, o antígeno de superfície principal da hepatite B, for
ligado ao
doença
genoma de vacínia sob o controle de um promotor do próprio vírus, ele será expressãdo
1pi-
gura 14.8). Após injeção na corrente sangüínea, a replicação do vírus recombinante Uma segu
resulta
não apenas em novas partículas de vacínia, mas também em quantidades significativas
do an-
grande iq
tígeno de superfície principal. O resultado disso é o desenvolvimento de imunidade tanto 14s. fJma
con- r
tra varíola quanto contra hepatite B. cífico (Tat

Essa técnica notável tem um potencial considerável. Vírus de vacínia recombinantes sição ao d
ex-
pressando vários genes exógenos já foram construídos e se demonstraram capazes hereditária
de confe-
Cr-orunceu GÊrurcn e AruÁr-lse oe DNA 30g
Promotor de
z\
Gene do antígeno de superfÍcie
vacínia -- _ ,/- principal da hépatite B ---
-
/\
íl ---_\ tnjeção das partícutas de vacínia
\ / recombinates na corrente sangüínea
\
) Genoma de vacínia
recombinante
\
proteÍna da
hepatite B
O sistema imune
sintetiza anticorpos
tanto contra vacínia - Vírus de vacínia
como contra hepatite B
14.7
%.
ípio subjacente ao
de uma preparação Figura 14.8
O princípio subja-
ï= Antivacínia
proteínas de capsídeo
isoladas como uÍna cente ao uso poten-
cial de um vírus de
Y= Anti-hepatite B
vacínia recombi-
nante.
nl") foi sintetizada en

n de 2 pm (p. 140). A
o injetada em macacosi
rir imunidade contra as doenças correspondentes
em animais experimentais (Thbela
possibilidade do desenvolvimento de vãcinas l4.z). A
foi aprovada para utili- de amplo espectro surge a partir da
demonstra-
ção de que um único vírus de vacínia recombinante,expressando
os genes da hemaglutinina
do vírus da gripe, do antígeno de superfície
principal aa hepatite Beã glicoproteína
rus do herpes simples, confere imunidade do ví-
u u-u d"rru, d";;;* em macacos. uma
questão importante que agora deve ser "ont "ádu
respondida é se sabemos o ,un"ìãnr" a respeito
?1196, quando Edward logia viral para estarmos certos de que
a liberação de vírus a" ua"rnia.e"ombinantes
da bio-
fimular imunidade con- fera por meio de programas de vacinação na bios_
pode ser permitida.
lracínia; o seu uso resul-
:
btes poderiam ser usa- 14.2 ldentifica.ção de genes responsáveis por

b u.u proteína de cap
lepatite B, for ligado ao
doenças humanaè
He será expressado (E-
b recombinante resulte uma segunda iírea importante de pesquisa
médica na qual a cronagem gênica
grande impacto é na identificação-e vem tendo um
fes significativas do an- nô isolamenÌo de glnes r"rpoírau"i, por
nas. uma doença genética ou h_ereditária doenças huma_
le imunidade tanto con- é aquela cauJada pr, il;;;ro
I cífico (Tabela r4.3), com os indivíduos portaàores em um gene espe_
dogeneìefe"ri* upr"r"ntando predispo_
hia recombinantes ex- sição ao desenvolvimento da doença
utguÀ estágú de suas vidasim algumas
tam capares de confe- hereditrírias, como a hemofilia, o g"n" "- doenças
fr"r"nt" no cromossomo X, de modo que homens
"tta
1t
I
ii
310 T. A. Bnowr.r
Tâbela 14.2 Alguns dos genes exógenos que foram expressados em vírus de quanto as do€q
vacínia recombinantes cam a segundar
pecialmente e4
Gene que seu início s
Posição 4 teis d
Antígeno de superfiçier\ Plasmodiumfalciparum (o parasito da malária)
cuidadosa reaÀ
Proteínas de capsídeo do |írus da gripe sencadeameúo
Proteína G do vírus daíaiva As doenças
Antígeno de superficie principal da hepatite B tância das mesr
vacinação, c a
Glicoproteínas do herpes simples
doenças infecci
Poteínas de envoltório do vírus da imunodeficiência humana (HIV) alta mortalidad
Proteínas de capsídeo do vírus da estomatite vesicular lação morre agt
Proteínas do vírus Sindbis nifestação taü
pesquisa médic
igualmente exí
Tabela 14.3 Algumas das doenças genéticas mais comuns no Reino Unido Existem inÉ
doenças genâ
Freqüência
Doença Sintomas (nascimentos por ano) (1) A identifi
permitid
Câncer de mama hereditiírio Câncer I a cada 300 mulheres
(2) Aidentif
Fibrose cística Doença pulmonar I em 2.000 nejaruml
Coréia de Huntington Neurodegeneração 1 em 2.000 diúôtm1
Distrofia muscular de Fraqaeza muscular I em 3.000 homens ber acoog
Duchenne progressiva . ncaçãog
a doença
HemofiliaA Hemopatia I em 4.000 homens
ção clínto
Anemia falciforme Hemopatia l em 10.000 (3) A id€ntifi
Fenilcetonúria Retardo mental l em 12.000
B-talassemia Hemopatia 1 em 20.000 14.2.1 Como iden
Retinoblastoma Câncer ocular I em 20.000 NãO existe ÌÌÍÍE
Hemofilia B Hemopatia I em 25.000 homens lhor abordagen
preender oa pri
Doença de Tay-Sachs Cegueira, perda de I em 200.000
difícil. Esse co
controle motor
mas pessoas so
dem levaràla
portadores do gene expressam os sintomas da doença; mulheres com um gene defectivo e um Localizandr
gene correto são saudáveis, mas podem transmitir a doença para a sua progênie do sexo mas-
Se não háinfu
culino. Genes de outras doenças estão presentes em autossomos e, na maioria dos casos, são
do genoma hu
recessivos, de modo que ambos os cromossomos do par devem portar a versão defectiva para
para que possa
a ocorrência da doença; algumas poucas doenças, inclusive a coréia de Huntington, são autos-
no. O mapeam
sômicas dominantes, de forma que uma única cópia do gene defectivo é suficiente para pro-
comparação &
vocar a manifestação da doença.
cos cujas pos(
Em algumas doenças genéticas, os sintomas manifestam-se precocemente durante a vida
estar muito prÍ
do indivíduo afetado. Em outras, os sintomas podem não ser expressados antes que o indiví-
recombinação
duo atinja a meia-idade ou a velhice. A fibrose cística é um exemplo do primeiro caso, en-
Ct-oruaoeu GÊNrcA E Ar.rÁlrse oe DNA 31 1
quanto as doenças neurodegenerativas, como as de Alzheimer e a de Huntington, exemplifi-

cam a segunda situação. Em diversas patologias que parecem ter componentes genéticos, es-
pecialmente em cânceres, a síndrome global é complexa e a doença perÍnanece dormente até
que seu início seja desencadeado por algum estímulo metabólico ou ambiental. Se a predis-
posição a tais doenças pudesse ser diagnosticada, seria possível reduzir o fator de risco pela
cuidadosa readequação do estilo de vida do paciente, de modo a minimizar as chances de de-
sencadeamento do processo patológico.
As doenças genéticas sempre estiveram presentes nas populações humanas, mas a impor-
tância das mesmas vem crescendo em décadas recentes. Isso ocorre porque os programas de
vacinação, os antibiótiços e a melhoria das condições sanitiírias reduziram a prevalência de
doenças infecciosas, como a varíola, a tuberculose e a cólera, que erÍÌm responsáveis por uma
alta mortalidade no início do século XX. O resultado disso é que uma maior parcela da popu-
lação morre agora de doenças que têm componentes genéticos, especialmente aquelas de ma-
nifestação tardia, que agora são mais comuns devido ao aumento da expectativa de vida. A
pesquisa médica foi bem-sucedida no controle de muitas doenças infecciosas; poderá ela ser
igualmente exitosa no controle de doenças genéticas?
Existem inúmeras razões que tornam importante a identificação de genes responsáveis por
doenças genéticas.
por ano) (1) A identificação do gene pode fornecer uma indicação da base bioquímica da doença,
permitindo a elaboração de estratégias terapêuticas.
cada 300 mulheres
(2) A identificação da mutação presente em um gene defectivo pode ser utilizada para pla-
2.000 nejar um programa de triagem, de modo a identificar a presença do gene mutante em in-
2.000 divíduos poÍadores que ainda não desenvolveram a doença. Os portadores podem rece-
3.000 homens ber aconselhamento a respeito das chances de seus filhos herdarem a doença. A identi-
ficação precoce da forma mutante do gene em indivíduos que ainda não desenvolveram
a doença permite que sejam adotadas precauções para reduzir o risco de sua manifesta-
4.000 homens
ção clínica.
10.000 (3) A identificação do gene é um pré-requisito para a terapia gênica (p. 31a).
12.000
20.000 14.2.1 Como identiÍicar um gene responsável por uma doença genética
20.000 Não existe uma estratégia única para a identificação de genes que causÍÌm doenças, pois a me-
25.000 homens lhor abordagem depende das informações disponíveis a respeito de cada patologia. Para com-
preender os princípios desse tipo de trabalho, será considerado o cenário mais comum e mais
200.000
difícil. Esse ceniário ocoffe quando tudo o que sabemos a respeito de uma doença é que algu-
mas pessoas sofrem dela. Mesmo com um ponto de partida tão vago, as técnicas de DNA po-
dem levar à localização do gene relevante.
um gene defectivo eum Localizando a posição aproximada do gene no genoma humano

progênie do sexo mas-
Se não há informação a respeito do gene desejado, como ele pode ser localizado naseqüência
maioria dos casos, são
do genoma humano? A resposta a essa questão é o retorno aos princípios genéticos básicos,
a versão defectiva Pan
para que possa ser determinada aproximadamente a posição do gene no mapa genético huma-
Huntington, são autoe-
no. O mapeamento genético é geralmente executado por análise de ligação, que envolve a
é suficiente para PÍr>
comparação do padrão de herança do gene-alvo com os padrões de herança de lócus genéti-
cos cujas posições no mapajá são conhecidas. Se dois lócus são herdadosjuntos, eles devem
durante a vide
estar muito próximos um ao outro no mesmo cromossomo: se esse não é o caso, eventos de
$aOos antes que o indiú-
recombinação e a segregação aleatória dos cromossomos durante a meiose resultarão em ló-
plo do primeiro caso, eÍF
312 T. A. Bnowru
cus que apresentÍìm diferentes padrões de herança (Figura 14.9). A demonstração de ligação sendo possível
com um ou mais lócus genéticos mapeados é, portanto, a base para a determinação da posi- marcadores de
ção cromossômica de um gene não-mapeado. Para ilustra
Com a espécie huma2a-n(o é possível a realização de programas de cruzamentos dirigi- nes relacionad
dos, visando à determiíação $h posiÇão de mapa de um gene desejado. Em vez disso, o ma- ocorreu em 19
peamento de genes associadós a doenças deve utilizar os dados disponíveis a partir de aná- fragmentos&
lises depedigree, nas quais a herança do geneé examinada em famílias com uma alta inci- Berkeley. O es
dência da doença que está sendo estudada. E importante que seja viável a obtenção de mero significa
amostras de DNA de pelo menos três gerações de cada família - e quanto maior for o nú- chamadaDITS
mero de membros de uma famflia estudados a cada geração, melhor. Via de regra, é possí- mo 17 (Figura
vel encontrar pedigrees adequados, a menos que a doença seja muito incomum. A ligação no braço longo
entre a presença/ausência da doença e a herança de outros genes pode ser estudada, mas, tremamente im
ne do câncer dl
to, acredita-se
Portanto, o pró
nar BRCAI w
(a) Os genes estão ligados Isso foi cor
petições cuÍtas
la mais precisa
alelos possívei
em um mesmo
mapeamento d
BRCAI de 20 I
um gene é deo
Figura 14.9
lÊ âl ât l3
Padrões de herança
para genes ligados e
não-ligados. Três ÍamÊ
lias são mostradas,
com os círculos repre-
sentando indivíduos do
sexo Íeminino e os
(b) Os genes estão em (c) Os genes estão no mesmo quadrados represen-
cromossomos diÍerentes cÍomossomo, mas distantes tando indivíduos do se-
um do outro xo masculino. (a) Dois
genes com ligação es-
treita são quase sem-
pre herdados em con- Mapeamento do gen
junto. (b) Dois genes mama. lnicialmente, o g
em diÍerentes cromos- do em um segmento de
somos apresentam se- mossomo 17 (região real
gregação aleatória. (c) nho à esquerda). Experil
Dois genes em um peamento adicionais res
ollo
"llo ollo "ll, ât l; olo
t; mesmo cromossomo,
mas distantes um do
segmento a uma região r
queada por dois lócus pn
peados, D1751321 e D|,
outro, são Íreqüente-
mente herdados jun- nho central). Após o r
Produto de tos, mas eventos de re- qüências expressadas,
recombinação combinação podem se- um Íorte candidato a ser
pará-los.
Cloruroeu GÊNrcA E ANÁLtsE oe DNA 313
pnstração de ligação sendo possível a análise de amostras de DNA, é geralmente preferida a análise de ligação a
bterminação da posi- marcadores de DNA (p.262).
Para ilustrar como a aniílise de ligação éatilizada, será visto brevemente como um dos ge-
Ècruzamentos dirigi- nes relacionados ao câncer de mama humano foi mapeado. O primeiro avanço desse projeto
,Em vez disso, o ma- ocorreu em 1990, como resultado de análises de ligação de polimorfismos de tamanho de
úveis a partir de aná- fragmentos de restrição (RFLP) executadas por um grupo da Universidade da Califórnia em
ìs com uma alta inci- Berkeley. O estudo mostrou que, em famflias com alta incidência de câncer de mama, um nú-
riável a obtenção de mero significativo de mulheres que sofriam da doença possuía a mesma versão de uma RFLP,
tanto maior for o nú- chamada Dl7574.Essa RFLP havia sido previamente mapeada no braço longo do cromosso-
Via de regra, é possí- mo 17 (Figura 14.10): o gene buscado - BRCAL - deveria, portanto, também estar localizado
,incomum. A ligação no braço longo do cromossomo 17. Esse resultado inicial da análise de ligação mostrou-se ex-
le ser estudada, mas, tremamente importante, pois indicou em qual região do genoma poderia ser encontrado o ge-
ne do câncer de mama, embora ainda estivesse longe de indicar a sua localização exata. De fa-
to, acredita-se que mais de 1.000 genes estejam nessa porção de 20 Mb do cromossomo 17.
Portanto, o próximo objetivo era arealização de mais estudos de ligação para tentar posicio-
nar BRCA| com maior precisão.
Isso foi conseguido inicialmente pelo exame da região contendo BRCAI em busca de re-
petições curtas em tandem (STRs) (p.262).As STRs são úteis para o mapeÍÌmento em esca-
la mais precisa porque muitas delas existem em três ou mais formas alélicas, em vez dos dois
alelos possíveis para uma RFLP. Portanto, vários alelos de uma STR podem estar presentes
em um mesmo pedigree, o q\e viabiliza a execução de um mapeamento mais detalhado. O
mapeamento de ligações de repetições curtas em tandem reduziu o tamanho da região de
BRCAI de 20 Mb para apenas 600 kb (Figura 14.10). Essa abordagem para a localização de
um gene é denominada clonagem posicional.
lura 14.9
hrões de herança
hÍa genes ligados e
lo-ligados. Três famÊ
b são mostradas,
iln os círculos repre-
bntando indivíduos do
Ero Íeminino e os
padrados represen-
I
lrdo indivíduos do se-
b masculino. (a) Dois
pres com ligação es-
Eita são quase sem- Figura 14.10
ire herdados em con- Mapeamento do gene do câncer de D17s74-[,.. |""",
nto. (b) Dois genes mama. lnicialmente, o gene Íoi mapea-
do em um segmento de 20 Mb do cro-
;n diÍerentes cromos-
DÍÍìos apresentam se-
pegação aleatória. (c)
mossomo 17 (região realçada no dese-
nho à esquerda). Experimentos de ma-
peamento adicionais restringiram esse
I
lois genes em um
nesmo cromossomo, segmento a uma região de 600 kb Ílan-
queada por dois lócus previamente ma-
ms distantes um do
[tro, são Íreqüente-
nente herdados jun-
peados, D1751321 e D1751325(dese-
nho central). Após o exame das se-
qüências expressadas, foi identiÍicado
I
DS, mas eventos de re- Cromossomo 17
DÍnbinação podem s+ um forte candidato a ser BBCÁí (dese- (80 Mb)
nrá-los. nho à direita).
314 T. A. Bnowr,r
ldentificação de candidatos a genes responsáveis por doenças

reta do g
uâtÀtdeterminada a posição do gene no mapa, poderia-se imaginar que a próxima etapa de qualq
seria simplesmente analisar a seqüência do genoma para identificar o gene procurado. examina
Infeliz-
mente, ainda resta uma grande quantidade de trabalho a ser feita, pois o mapeamento cas envo
genéti-
co' mesmo na sua forma mais precisa, dá apenas uma indicação aproximadaãa
localização do
gene. No projeto câncer de mama, os pesquisadores tiveram sorte de
conseguir reduzir-aárea 14.3.1 Terapii
de busca para apenas 600 kb; freqüentemente, uma extensão de l0 Mb
ou mais de seqüência Existem
de DNA deve ser examinada. Esses longos segmentos de DNA podem conter
muitos genes: terapia d
os 600 kb da região do câncer de mama contêm mais de 60 genei e qualquer
um deles pode- uma cóp
rjaser BRCAI.
for bem-
Viírias abordagens podem ser empregadas pa.ra identificar qual dos genes da região
ma- resultant
peadaé responsável pela doença.
célula-or
hereditrár
(1) Os perhs de expressão dos genes-candidato podem ser examinados por análise
de hibri- A ter
dização ou por transcrição reversa-reação em cadeia da polimerase
6r-ecn; (p. 230) de las que p
RNA de diferentes tecidos. poderia-se esperar que BRCAI, por exemplo, hibridizasse
po. Essa
com RNA preparado a paftir de tecido mamiírio e também com RNA de tecido ovariano,
talassem
pois câncer de oviírio freqüentemente está associado a câncer de mama.
dula óssr
(2) uma análise por hibridização de Southem (p. 206) pode ser executada com DNA de di_
consiste
ferentes espécies (os chamados zoo blots). A base disso é que um gene humano
impor- tar essas
tante quase que certamente terá homólogos em outros mamíferos e esses homólogos,
qüente n
embora tendo seqüências um pouco diferentes da versão humana, serão detectáveis
por sente en
hibridização com uma sonda adequada.
viral é q
(3) As seqüências dos genes podem ser examinadas em indivíduos com e sem a doença, pa-
permite r
ra verificar se os genes de indivíduos afetados contêm mutações capues

de explicarior o novo I
que eles têm a doença.
A ter
(4) Para confirmar a identidade de um gene-candidato, pode ser possível preparar-se
um ca- monares
mundongo-nocaute (p.269), que possui uma versão inativa do gene correspondente.
se do emli;
o camundongo-nocaute apresentar sintomas compatíveis com a doença humana,
então dução nr
o gene-candidato é quase que certamente o correto.
apenas d
eficiente
Quando aplicado à região do câncer de mama, esse tipo de análise resultou na identifica- Para
ção de um gene de aproximadamente 100 kb, que é um iorte candidato a ser BRCÁ1. Ele é
dificar u
formado pot 22 óxons e codifica uma proteína de 1.863 aminoácidos. Transcritos
do gene fo- remoção
ram detectados em tecidos mamiírio e ovariano e genes homólogos a
ele estão pr"rJnt", genética
camundongos, ratos, coelhos, ovelhas e porcos, mas não em galinhas.
E, mais iÀportante, "*
os quadm p
genes de cinco famflias suscetíveis continham mutações (como
mutações de muáança de fa- mas tam
se ou sem sentido), que provavelmente levam a uma proteína
não-funcional. Embora circuns- que pror
tanciais, as evidências em suporte do candidato foram suficientemente
convincentes paÍa que modo qr
esse gene fosse identificado como sendo BRCÁ1.
uma técl
aplicaçã
14.3 Terapia gênica 14.3.2 Terapi
A aplicação final da tecnologia de DNA recombinante na medicina que será aqui A utiliza
conside- Já foram
rada é a terapia gênica. Esse é o nome que foi originalmente dado
uìétodo, que têm por fecção d
objetivo a cura de uma doença hereditária pela introdução, no paciente,
de umã cópia cor-
sa mais i
)
Cr-orecev GÊr'ircn e ANÁLtsE oe DNA 315
[oenças reta do gene defectivo. O conceito de terapia gênica foi agora estendido para incluir a
cura
de qualquer doença pela introdução de um gene clonado no paciente. Primeiramente,
Ique a próxima etapa serão
I procurado. Infeliz- examinadas as técnicas utilizadas na terapia gênica e depois serão tratadas as questões éti-
cas envolvidas.
Imapeamento genéti-
hda da localizacão do
14.3.1 Terapia gênica para doenças hereditárias
fsegui, reduzir a rírea
bu mais de. seqüência Existem duas abordagens básicas para a terapia gênica: a terapia de linhagens germinais e a
ponter murtos genes: terapia de células somáticas. Na terapia de linhagens germinais, um óvulofecundudo recebe
Suer um deles pode-
I
uma cópia da versão correta do gene relevante e é reiLptantado na mãe. Se o procedimento
for bem-sucedido, o gene estará presente e será expressado em todas as células do indivíduo
da região ma- resultante. A terapia de linhagens germinais é geralmente feita pela microinjeção de DNA na
Is"n",
célula-ovo isolada (p. 11 1) e, teoricamente, poderia ser utilizada para ftatar qualquer doença
I
hereditária.
ir por análise de hibri- A terapia de células somáticas envolve a manipulação de células comuns, em geral aque-
knr-pcn) (p.230) de las que podem ser removidas do organismo, transfectadas e depois colocadas de volta no cor-
[emplo, hibridizasse po. Essa técnica é mais promissora para hemopatias hereditiírias (por exemplo, hemofilias e
[A de tecido ovariano, talassemias), com o tratamento sendo feito pela introdução de genes em células-tronco da me-
h*u. dula óssea, que dão origem a todos os tipos celulares especializados no sangue. A estratégia
hdu.o- DNA de di- consiste em preprÌrar um extrato de medula óssea contendo viírios bilhões de células, transfec-
[gene
humano impor- tar essas células com um vetor de tipo retroviral e depois reimplantáJas no paciente. A subse-
I e esses homólogos, qüente replicação e diferenciação de transfectantes faz com que o gene adicionado esteja pre-
detectáveis por sente em todas as células sangüíneas maduras (Figura 14. I 1). A vantagem de um vetor retro-
frão viral é que tal tipo de veículo tem uma freqüência de transfecção extremamente alta, o que
in ,"* a doença, pa- permite que uma grande proporção das células-tronco em um extrato de medula óssea receba
"
pzes de explicar por o novo gene.
I A terapia de células somáticas também tem potencial para o tratamento de doenças pul-
fel lr"p*ar-se um ca- monares, como a fibrose cística, pois DNA clonado em vetores adenovirais (p. 160) ou conti-
fe correspondente. Se do em lipossomos (p. 155) pode ser incorporado por células epiteliais pulmonares após intro-
Snça humana, então dução no trato respiratório por meio de um inalador. Entretanto, a expressão do gene ocorre
i apenas durante poucas semanas e, até agora, essa estratégia ainda não é considerada um meio
r eficiente para o tratrÌmento da fibrose cística.
huttou na identifica- Para aquelas doenças genéticas cuja patologia surge em função de o gene mutado não co-
I ,", BRCA\.Ele
u é dificar uma proteína funcional, é necessiírio fornecer à célula uma versão correta do gene: a
pnscritos do gene fo- remoção dos genes defectivos não é necessária. A situação é mais complicada para doenças
Jeestão presentes em genéticas dominantes (p. 31 l), pois, nelas, é o produto do gene defectivo que rãsponde pelo
I mais importaxte, os quadro patológico, de modo que a terapia deve incluir não somente a adição do gene
correto,
S de mudança de fa- mas também a remoção da versão defectiva. Isso requer um sistema de transferência
do gene
hd. Embora circuns- que promova a recombinação entre a cópia fornecida pelo vetor e a cópia cromossômica,
de
fonvincentes para que modo que a cópia cromossômica defectiva seja substituída pelo g"n" do vetor. Trata-se
de
uma técnica complexa e inconfiável, não tendo ainda sido desenvolvidos procedimentos
t de
aplicação mais amplos para ela.
l
t
14.3.2 Terapia gênica e câncer
A utilização clínica da terapia gênica não está limitada ao tratamento de doenças hereditiírias.
f" *.u aqui conside-
Já foram feitas tentativas de utilização da clonagem gênica para a interrupçãode ciclos de in-
ptodos que têm por
fecção de patógenos humanos, como o vírus da AIDS. Contudo, atualmente, a fuea depesqui-
l, de uma cópia cor- sa mais intensiva na terapia gênica está relacionada à sua utilização no tratamento do câncer.
316 T. A. Bnowlr
desenvolvim
Célula-tronco isolada
o
do seja incorl
Uma nova
matasse seleti
eeficiente pa
Novo gene compreensão
'ì TransÍecção
da. São conh
em um tunx)Í
O aspecto bás
às células ca
um sistema ú
expressado 4r
motor que é a
@ "u,,,", Umaoumr
Reimplante
temaimuneú
@ aasoriro nos teoricam
fortes, que sã
muitas outras
/..3 Eosinórito
ta contra o câ
\.t/
14.3.3 As questõ
NeutróÍilo A terapia g€ni
Figura 14.11
tões éticas, es
A diferenciação de
jeção justificá
uma célula-tronco
Monócito ne da fibrme I
transfectada faz
com que o novo dula são aceiti
gene esteja pre- mopatias porl
Todas as células maduras sente em todas as rível que a rc
contêm o novo gene células sangüÊ criticável com
neas maduras. Por outro I
quesüio. O prr
doenças hered
A maioria dos cânceres resulta da ativação de um oncogene que leva à formação ção, nessas m
de um tu- senvolvimenta
mor ou à inativação de um gene que normalmente suprime u roà fo.-ução.
Em ambos os ca- nética" mas, si
sos, pode-se considerar a terapia gênica para o tratamento do câncer. A
introdução de um ge- plo, alteraçõe
ne que codifica uma cópia de RNA anti-senso (p.32D de um oncogene
poderia, po.
plo, reduzir ou impedir a expressão do oncogene e reverter a sua atividadã "*Ã_ pulação, no ç
tumorogênica. Se ehereditiíri4 é
o câncer é causado pela inativação de um gene supressor de tumor,
a terapia gênica iria envol- dificil amaniF
ver a introdução de uma versão ativa daquele gene. O maior obstáculo no
momento não é a solucionafuso r
identificação dos genes apropriados parautilização na terapia gênica do
câncer, mas, sim, o dzds dg sansãr
Cr-oruacev GÊuca e ANÁLtsE oe DNA 317
desenvolvimento de métodos de administração adequados, que assegurem que o gene clona-

do seja incorporado pelas células cancerosas.
Uma nova aplicação da terapia gênica para o câncer seria a introdução de um gene que
matasse seletivamente células cancerosas. Essa abordagem é considerada como a mais geral
e eficiente para o tratamento de muitos tipos de câncer, principalmente porque não requer
uma
compreensão detalhada das bases genéticas da doença que está sendo especificamente trata-
da. São conhecidos muitos genes que codificam proteínas tóxicas e a introdução de um deles
em um tumor deveria resultar na morte das células cancerosas e na recuperação do paciente.
O aspecto básico dessa estratégia é que o gene clonado deve ser direcionado especificamente
às células cancerosas, para que células saudáveis não sejam atingidas e mortas. Isso exigiria
um sistema de administração bastante acurado ou algum meio de assegurÍÌr que o gene fosse
expressado apenas nas células cancerosas, por exemplo, colocando-o sob controle de um pro-
motor que é ativo apenas naquelas células.
Uma outra abordagem utllizaaterapia gênica para aumentar a eficiência com a qual o sis-
tema imune do paciente naturalmente mata as células cancerosas. Isso pode ser feito, pelo me-
nos teoricamente, com um gene que faça com que as células tumorais sintetizem antígenos
fortes, que são eficientemente reconhecidos pelo sistema imune. Todas essas abordagens e
muitas outras que não são baseadas em terapia gênica estão sendo atualmente testadas na lu-
ta contra o câncer.
: 14.3.3 As questões éticas provocadas pela terapia gênica

( A terapia gênica deve ser utilizada na cura de doenças humanas? Como muitas outras ques-
Fgura 14.11 tões éticas, essa pergunta não tem uma resposta simples. Certamente não haveria qualquer ob-
I diÍerenciação de jeção justif,rcável à rotina de aplicação, via um inalador respiratório, de versões corretas
Lna célula-tronco do ge-
ne da fibrose cística para tratamento dessa doença. Da mesma forma, se transplantes de me-
hansÍectada Íaz
dula são aceitáveis, fica dificil argumentar contra terapias gênicas destinadas à correção de he-
bm que o novo
mopatias por meio de transfecção de células-tronco. Ademais, o câncer é uma doença tão ter-
fene esteia pre-
bnte em todas as rível que a recusa de métodos de tratamento eficientes por motivos morais seria ela mesma
lélulas sangüÊ criticável como imoral.
bas maduras. Por outro lado, a terapia de linhagens germinativas representa um aspecto mais difícil da
questão' O problema é que as técnicas utilizadas para a coffeção, em linhagens germinais, de
! doenças hereditiárias são exatamente as mesmas que poderiam ser utilizadas parã a manipula-
i ção, nessas mesmas linhagens, de quaisquer outras características hereditiárias. De fato, o de-
fonnaçao de um tu- senvolvimento dessa técnica para animais não foi feito visando à cura de qualquer doença ge-
L Em ambos os ca- nética, mas, sim, com o objetivo de "melhorar" animais domésticos, proàuzindo, por exem-
pdução de um ge- plo, alterações genéticas que resultem em um menor conteúdo de gordura. Tal tipó de mani-
poderia, por exem- pulação, no qual a constituição genética de um organismo é alterada de uma
-unãi.a dirigida
I tumorogênica. Se e hereditária, é claramente inaceitável para humanos. Atualmente, problemas
:^. técnicos tornam
lgenlca rna envol- difícil a manipulação de linhagens germinais humanas. Antes de problemas como esses serem
Dmomento não é a solucionados, deveríamos nos assegurar de que o desejo de fazer o bem não trará a possibili-
Éncer, mas, sim, o dade de causar um mal muito maior.
li' t
r
t
Cnpírulo 15
Clonagem Gênica e Análise de
coli of a DNA sequence
l
DNA na Agricultura
synthesized genes
synthesized gene for üe
atual do desenvolvimen-
ovarian cancer suscepti-
factorVIII in milk-
Oxford. [Contém
gênica.l (Publicado em
A estratégia de adição de um gene na engenharia Problemas com vegetais geneticamente modifi cados,
genética vegetal, 320 330
A subtração de genes, 324
A agriculhrra, ou, mais especificamente, o cultivo de plantas, é a mais antiga biotecnologia do

mundo, com uma história conúnua que se estende para mais de 10.000 anos. Durante todo es-
se período, os homens têm constantemente procurado melhorar as variedades de suas cultu-
ras: variedades com melhores qualidades nutricionais, maior rendimento, ou características
que auxiliam no seu cultivo e colheira. Durante os primeiros milênios, as melhorias nas lavou-
ras ocoÍrerÍìm de uma maneira esporádica, mas, nos últimos séculos, novas variedades foram
obtidas por meio de programas de cruzamento cada vez mais sofisticados. No entanto, o pro-
grama de cruzamento mais sofisticado ainda retém o elemento do acaso, dependendo dele pa-
ra que ocorra a união aleatória das caracteísticas parentais na descendência híbrida que é pro-
duzida. O desenvolvimento de uma nova variedade de cultura, apresentando uma combinação
precisa das características desejadas, é um processo longo e difícil.
A clonagem gênica fornece uma nova dimensão para os cruzamentos na agricultura, por
possibilitar que modificações direcionadas sejam realizadas no genótipo da planta, enganan-
do o processo aleatório, inerente dos cruzamentos convencionais. Duas estratégias gerais são
utilizadas:
(1) A adição de um gene, na qual a clonagem é utilizada para alterar as características de

uma planta por fornecer a ela um ou mais genes.
(2) A subtração de um gene, na qual técnicas de engenharia genética são utilizadas para
inativar um ou mais genes existentes na planta.
Inúmeros projetos estão sendo realizados em todo o mundo, muitos por companhias bio-
tecnológicas, objetivando a exploração do potencial da adição ou da subtração gênica na me-
lhoria das culturas. Neste capítulo, será investigada uma seleção representativa desses proje-
tos, bem como analisados alguns dos problemas que devem ser resolvidos, caso a engenharia
genética vegetal seja amplamente aceita na agricultura.
32O T. A. Bnowlr
15.1 A estratégia de adição de um gene na engenharia Tabela 15.1 I

genética vegetal B. thuringiensi
Tipo de &endr
A adição de um gene envolve a utilização de técnicas de clonagem para introduzir em uma
planta um ou mais genes novos, que codificam características úteis que a planta não possui. CryI
Um bom exemplo da técnica é fomecido pelo desenvolvimento de plantas que resisrcmão a12- CrytI
que de insetos por meio da síntese de inseticidas codificados pelos genes clonados.
CTyIII
15.1.1 Plantas que produzem os seus próprios inseticidas CryIV
As plantas estão sujeitas à predação por praticamente todos os demais tipos de organismos CryV
vírus, bactérias, fungos e animais -, mas, em termos de agricultura, os maiores prúlemas são
- CryVI
causados por insetos. Para reduzir as perdas, as culturas são regularmente vaporizadas com in-
seticidas. A maioria dos inseticidas convencionais (p. ex., piretróides e organofosfatos) é um
veneno relativamente não-específico, que mata uma ampla variedade de insetos, não apenas
aqueles que devoram as lavouras. Devido à sua elevada toxicidade, viírios desses inseticidas
também possuem efeitos colaterias extremamente perigosos pÍÌra os outros membros da bios- e danificando a
fera local, incluindo, em alguns casos, o homem. Tais problemas são intensificados pela ne- qüentemente, r
cessidade de aplicação de inseticidas convencionais nas superfícies das plantas por intermé- em diferentes 1
dio de vaporização, o que significa que os deslocamentos subseqüentes dos proãutos quími- dades apresenr
cos no ecossistema não podem ser controlados. Além disso, insetos que vivem dentio das As toxinas,
plantas, ou nas partes de baixo das folhas, podem, algumas vezes, escapa.r totalmente dos efei- ra a sua utilizr
tos tóxicos. ocorreram vári
Quais as características que um inseticida ideal deveria apresentar? Certamente ele deve- mas suas biode
rá ser tóxico aos insetos contra os quais é direcionado, mas, se possível, essa toxicidade deve- veriam ser rci{
ria ser altamente seletiva, de forma que o inseticida fosse inofensivo para os demais insetos e custos do agric
não venenoso aos animais e aos homens. O inseticida deveria ser biodegradável, de forma que tem de reaplic
qualquer resíduo que pennanecesse após a colheita da cultura, ou que fosse arrastado para 247), modifica
longe da plantação pela chuva, não permanecesse por um longo período para não prejudicar abordagem é n
o meio ambiente. Além disso, deveria ser possível aplicar o inseticida de tal maneiru qu"
to- Clonando u
das as partes da planta, não somente suas superfícies superiores, fossem protegidas
contra o
ataque dos insetos. O milho consti
O inseticida ideal não foi ainda descoberto. O mais próximo que se tem são as õ-endoto- convencionais.
xinas produzidas pela bactéria do solo Bacillus thuringiensis. dentro da plant
escapando dos
As ô-endotoxinas de Baciilus thuringiensis tenção dessa g
Os insetos não comem apenas plantas: as bactérias também constituem uma parte ocasional realizada pelos
da sua dieta. Em resposta, vírios tipos de bactérias desenvolveram mecanismos Eles trabalhara
de defesa con-
tra a predação dos insetos, um exemplo sendo B. thuringiensis, a qual, durante a esporulação, da serumapml
forma corpos cristalinos intracelulares que contêm uma proteína inseticida chamaàa to situado entrr
ô-enOo-
toxina' A proteína ativada é altamente venenosa aos insetos, algo 80.000 vezes mais tóxico ba-Geigy cons
que os inseticidas organofosfatos, e é relativamente seletiva. Diferentes linhagens síntese gênica a
de bactéria
sintetizam proteínas efetivas contra as larvas de diferentes grupos de insetos (Tabela 15.1). ra melhorar a s
A proteína ô-endotoxina que se acumula na bactéria é um piecursor inativo. Após a inges- artificial foram
tão pelo inseto, essa pró-toxina é clivada por proteases, resultando em versões pares GC do ge
mais curtas da
proteína que apresentam a atividade tóxica, ligando-se na parte interna do intestino são bacteriana I
do inseto
(p 285), entre !
Ct-onnceu GÊr.rrcr e ANÁLtsE DE DNA 321
haria Tabela 15.1 A abrangência de insetos envenenados pelos viírios tipos de ô-endotoxinas de
B. thuringiensis
Tipo de ô-endotoxina Efetiva contra

F introduzir em uma
I a planta não possui.
CryI Larvas de lepidópteros (traça e borboleta)
b que resistem ao ata- CryII Larvas de lepidópteros e dípteros (mosca de duas asas)
i clonados. CryIII Larvas de lepidópteros
CryIV Larvas de dípteros
5
CryV Vermes nematódeos
foos de organismos -
CryVI Vermes nematódeos
piores problemas são
ivaporizadas com in-
brganofosfatos) é um
b insetos, não apenas
bs desses inseticidas
e danificando a superficie epitelial, de forma que o inseto é incapaz de alimentar-se e, conse-
membros da bios-
ios qüentemente, molre de fome (Figura 15.1). A variação na estrutura desses sítios de ligação,
tsnsificados pela ne- em diferentes grupos de insetos, é, provavelmente, a principal causa das elevadas especifici-
Íplantas por intermé-
dades apresentadas pelos diferentes tipos de ô-endotoxinas.
ldos produtos quími-
As toxinas de B. thuringíensis não são descobertas recentes, sendo a primeira patente pa-
fue vivem dentro des ra a sua utilização na proteção de lavouras sido concedida em 1904. Com o passar dos anos,
f totalmente dos efei-
:
ocoÍïeram várias tentativas de transformá-las em inseticidas inofensivos ao meio ambiente,
mas suas biodegrabilidades atuaram como uma desvantagem, pois isso implicava que elas de-
Frrtamente ele deve-
veriam ser reaplicadas em intervalos regulares durante o período de cultivo, aumentando os
essa toxicidade deve-
custos do agricultor. As pesquisas atuais visam à obtenção de ô-endotoxinas que não necessi-
a os demais insetos e
tem de reaplicações regulares. Uma abordagem é por meio da engenharia de proteínas (p.
adável, de forma que
247), modifrcando-se a estrututra da toxina, de forma a torná-la mais estável. Uma segunda
fosse arrastado para
abordagem é modificar a cultura, para que ela própria sintetize a toxina.
l para não prejudicar
b tal maneira que to- Clonando um gene de ô-endotoxina no milho
n protegidas contra o
O milho constitui-se em um exemplo de lavoura que não é bem protegida pelos inseticidas
convencionais. A maior peste é a broca do milho (Ostrinia nubilialis), a qual forma um túnel
fuem sao as ô-endoto- dentro da planta, a partir de ovos depositados nas superfícies internas das folhas, e, portanto,
I
i escapando dos efeitos dos inseticidas aplicados por vaporização. A primeira tentativa de con-
!
I:
tenção dessa peste foi a modificação de plantas de milho para a produção de ô-endotoxinas,
i realizada pelos biotecnologistas vegetais do laboratório da Ciba-Geigy, na Carolina do Norte.
I uma pane ocasional Eles trabalharam com a versão CryIA(b) da toxina, a qual havia sido previamente demonstra-
hismos de defesa con-
da ser uma proteína de I . 155 aminoácidos, com a atividade tóxica localizada em um segmen-
hrante a esporulação
to situado entre os aminoácidos 29 a6OT.Emvezde isolarem o gene natural, o grupo da Gi-
iida chamada ô-ende
I ba-Geigy construiu uma versão mais curta, contendo os primeiros 648 códons, por meio de
l)0 vezes mais tóxico
síntese gênica artificial. Essa estratégia possibilitou a introdução de modificações no gene pa-
iiot ug"n, de bactéria
ra melhorar a sua expressão nas plantas de milho. Por exemplo, os códons utilizados no gene
betos (Tabela 15.1).
artificial foram aqueles que se sabia serem os preferidos pelo milho, tendo o conteúdo total de
foativo. Após inges-
a
pares GC do gene sido ajustado para65Vo, comparado com o conteúdo de GC de387o da ver-
lnrsões mais curtas da são bacteriana nativa do gene (Figura 15.2a). O gene artificial foi ligado em um vetor-cassete
fo intestino do inseto (p 285), entre um promotor e um sinal de poliadenilação do vírus do mosaico da couve-flor
:
I
322 T. A. Bnowr.r
Gene da &endotoxina
Expressão - na
bactéria
Toxina ativa
Danos às células epiteliais

do intestino
Figura 15.1
Modo de ação de uma
ô-endotoxina.
Figura 15ú
Etapas importantes n
procedimento utilizad
para a obtenção ú
(Figura 15.2b), e introduzido em embriões de milho, pelo bombardeamento de microprojéteis plantas de milho gene
cobertos com DNA (p. 111). Os embriões desenvolveram-se em plantas maduras, e os trans- ticamente modifica
formantes foram identificados pela aniílise dos DNAs extraídos pela reação de polimerização das, expressando un
em cadeia (PCR), utilizando-se iniciadores específicos para um segmento do gene artificial gene de ô-endotoÍni
(Figura 15.2c). artificial
A etapa seguinte foi utilizar um teste imunológico para determinÍÌr se a õ-endotoxina es-
tava sendo sintetizada pelas plantas transformadas. Os resultados demonstraram que o gene
artificial era ativo, mas as quantidades de õ-endotoxina produzidas variavam de uma planta
para outra, desde aproximadamente 250 a 1.750 ng de toxina por miligrama de proteína total.
Tais diferenças eram, provavelmente, devidas aos efeitos de posição; o nível de expressão de
um gene clonado em uma planta (ou animal) freqüentemente é influenciado pela localização
exata do gene nos cromossomos do hospedeiro (Figura 15.3).
As plantas transformadas eram capazes de resistir aos ataques da broca do milho? Isso foi
testado em trabalhos de campo, nos quais plantas de milho transformadas e normais foram ar-
tificialmente infestadas com larvas e os efeitos da predação, medidos durante um peúodo de
seis semanas. Dois critérios foram utilizados: (l) a quantidade de perdas apresentada pela fo-
lhagem das plantas infestadas e (2) a extensão dos úneis produzidos pelas larvas que penetra-
Figura 153
ram nas plantas. Em ambos os aspectos, as plantas transformadas apresentaram melhores re-
EÍeitos de posição.
{a
il,:
I'
t"
E*
ê*
b
ft
F
Ë
E
E
b
P
b.
F.
Crorueeeu GÊrurcn E ANÁLtsE oe DNA 323
(a) Síntese de um gêne de õ-endotoxina artiÍicial

1 1155
Gene de B. thuringiensis
Gene artificial
29 607
Códons preferenciais e conteúdos

de GC apropriados ao milho
-
(b) Ligação de um promotor e sinal de poliadenilação
-
Seqüência promotora
Seqüência de poliadenilação
(c) Análise por PCR das plantas maduras

-
123
t--------1 t----------, t-------7
1. Marcadores de tamanho de DNA
de ação de urrar : 2. Resultado da PCR com DNA
Figura 15.2 de uma planta transÍormada
Etapas importantes no
procedimento utilizado 3. Resultado da PCR com DNA
para a obtenção de de uma planta não-transformada
de microprojércir plantas de milho gene-
maduras, e os tranÍF ticamente modiÍica-
de polimeri"afr das, expressando um
do gene artificiCl gene de ô-endotoxina
artiÍicial.
a ô-endotoxina*
de uma plante
de proteína total-
úvel de expressão dc
iado pela localização \----..-...- Gene inserido
na posição A -
fracamente expressado
do milho? Isso fci
e normais foram r-
te um período de
Cromossomo \ o"n" inserido na posição B -
altamente expressado
apresentada pela fo-
larvas que penetra-
Figura 15.3
melhores re-
EÍeitos de posição.
324 T. A. Bnowr.r
sultados dos que as normais. Em especial, o comprimento médio dos túneis das larvas foi re- Tabela 15.i
duzido de 40,7 cm nos controles para apenas 6,3 cm nas plantas modificadas. Em termos
reais, esse é um nível de resistência muito significativo.
Gene de
15.1.2 Outros proietos de adição de genes
ô-endotoxin
O milho não é a única planta que foi modificada para produzir a ô-endotoxina. Projetos seme- Inibidores d
lhantes foram realizados com anoz, algodáo, batata, tomate e outras culturas. Tampouco a re- Chitinase
sistência a insetos é a única abordagem. Resultados igualmente bem-sucedidos foram obtidos Glucanase
com genes que codificam inibidores de proteinases, pequenos polipeptídeos que interrompem Proteína in"a
a atividade de enzimas no intestino do inseto, impedindo ou retardando o crescimento. Inibi- Omitinoca
dores de proteinases são produzidos naturalmente por viírios tipos de plantas, principalmente RNA-polim
legumes, tais como ervilhas e o feijão comum, e seus genes têm sido, de forma exitosa, trans-
feridos para outras culturas, as quais normalmente não produzem quantidades significativas RNAs sarél
dessas proteínas. Os inibidores são eficientes sobretudo contra larvas de besouros que se ali- Proteínas d
mentam de sementes e, assim, podem ser uma alternativa melhor do que as õ-endotoxinas pa- 2'-5'-oligoa
ra plantas, cujas sementes são estocadas por longos peíodos. Acetolacta!
Exemplos de outros projetos de adição de genes estão listados na Tabela l1.Z.Emmuitos Enolpiruvil
casos, o objetivo é melhorar a capacidade da planta de resistir a pestes, tais como insetos, fun- fosfatosi
gos, bactérias e vírus, ou de torná-lacapaz de resistir aos efeitos tóxicos dos herbicidas utili- Glifosato-o
zados para controlar ervas daninhas. Outros projetos estão começando a explorar a utilização Nitrilase
da modificação genética para melhorar a qualidade nutricional das plantas cultiváveis, por
Fosfinorict
Inibidor da
exemplo, pelo aumento do conteúdo de aminoácidos essenciais e pela alteração da bioquími-
ribonucle
ca da planta, de forma que uma maior quantidade de nutrientes fique disponível para ser uti-
DNA-adeni
lizada durante a digestão nos seres humanos ou animais.
Proteína ri<
Aminocick
15.2 A subtração de genes ácido carì
S-Adenosil
A subtração de genes é uma denominação imprópria, pois a modificação não envolve a remo-
ção real de um gene, simplesmente a sua inativação. Existem várias maneiras pelas quais um Monelina
único gene escolhido pode ser inativado em uma planta viva, a mais bem-sucedida até o mo- Taumatina
mento, em termos práticos, vem sendo a utilização da tecnologia do anti-senso. O exemplo Proteína ú
que será analisado é um dos mais importantes, uma vez que resultou emum dos primeiros gê- degnpo
neros alimentícios geneticamente modificados a ser aprovado para a venda ao público geral. Delta-12ì
15.2.1 O princípio subjacente à tecnologia do anti-senso

Em um experimento de anti-senso, o gene a ser clonado é ligado em um vetor na orientação
inversa (Figura 15.4). Isso significa que quando o "gene" clonado é transcrito, o RNA que é
sintetizado é o complemento reverso do RNA mensageiro (mRNA) produzido a partir da verde qual se
são normal do gene. Esse complemento reverso será referido como um RNA anti-senso, algu- uma IIüme
mas vezes abreviado com asRNA.
Um RNA anti-senso pode impedir a síntese do produto do gene contra o qual ele é dire-
15.2.2 O RNA t
cionado. O mecanismo de como isso ocorre não está totalmente esclarecido, mas é quase cer- em Íruti
to que envolve a hibridização entre as cópias anti-senso e senso do RNA (Figura 15.5). É pos- Até o merr
sível que o bloqueio na expressão surja porque a molécula de RNA de fita dupla resultante é mente mll
rapidamente degradada pelas ribonucleases celulares, ou a explicação pode ser que o RNA an- tados até c
ti-senso simplesmente impede que os ribossomos se liguem à fita senso. Independentemente o processi(
it
c
t
Ë.
b
Crorunesu GÊNtcA E ANÁLtsE oe DNA gàs
flqnmfuire Thbela 15.2 Exemplos de projetos de adição de genes em plantas

F:mrm,
Característica conferida
Gene de Organismo de origem à planta modihcada
ô-endotoxina B. thurtngiensis
mrrotmmrwr. Resistência a insetos
Inibidores de proteases Vários legumes Resistência a insetos
Chitinase Arroz Resistência a fungos
ffima@olüfu Glucanase Alfafa Resistência a fungos
úffimsqltu Proteína inativadora de ribossomos Cevada Resistência a fungos
m#. Ornitino-carbomil-transferase Pseudomonas syringae Resistência a bactérias
RNA-polimerase, helicase Luteovírus da folha Resistência a vírus
enrolada da batata
Ugmnm;m RNAs satélites Viírios vírus Resistência a vírus
pmd[. Proteínas do capsídeo viral Viírios vírus Resistência a vírus
2'-5'-oligoadenilato-sintetase Rato Resistência a vírus
Acetolactato-sintase Nicotiana tabacum Resistência a herbicidas
mmnün Enolpiruvilchiquimato- 3- Agrobacterium spp. Resistência a herbicidas
olrw-*'*hr- fosfato-sintase
Glifosato-oxido-redutase Ochrobactrum anthropi Resistência a herbicidas
omtífrc+tu Nitrilase Klebsiella ozaenae Resistência a herbicidas
Fosfinotricino-acetil-transferase Streptomyces spp.
mm Resistência a herbicidas
Inibidor da barnase- B acíllus amyloliquefaciens Esterilidade do macho
ribonuclease
mmmür-
DNA-adenino-metilase E. coli Esterilidade do macho
Proteína rica em metionina Nozes brasileiras Conteúdo de enxofre
aumentado
Aminociclopropano- Vários Amadurecimento de frutas
ácido carboxílico-deaminase
modificado
.l-Adenosilmetionino-hidrolase Bacteriófago T3 Amadurecimento de frutas
modificado
Monelina Thaumatococc s dan ie ll i
u Doçura
Taumatina danielli
Orqp Proteína tioesterase portadora
T.
Umbellularia
Doçura
Conteúdo de gordura/
de grupos acila califurnica óleo modificado
Delta- I 2-desafurase Glycine max Conteúdo de gordura./
óleo modificado
de qual seja o mecanismo, a síntese de um RNA anti-senso

em uma planta transformada é
uma maneira eficiente de realizar_se a subtração de um gene.
15.2.2 o RNA anta-senso e a modificação do amadurecimento

em Írutas e no tomate
Até o momento, os tomates comercialmente cultivados e
as frutas mais frágeis são normal-
mente colhidos antes de seu amadurecimento completo,
a fim de garantir que sejam transpor-
tados até os superrnercados antes de estarem totalmente
estragadãs. Isso é essencial para que
o processo seja economicamente viável, mas existe probleria
o de que a maioria das frutas e
326 T.A.Bnowru
dos tomales i
Gene na orientação
correta esE
antes de
freqüentem
Duas compa
do - utilizra
de tomateq d
ao produtrd
no qual o sd
mRNA transpoÍte e r
O papel dr
Gene na orientação O espaçodel
inversa semanas4ú
desde o iníci
o-_ o amaúuecir
I merodeger
Promotor le que codifi
poligalacnrú
amolecimen
\',," rnúto teryo
A inativr
# RNAanti-senso
senvolviffi
(complemento reverso
do mRNA) Figura 15.4 hzadzpaal-
RNA anti-senso. A clonag:
Oexperiro
tas daICIS.
décadade lg
dapotigala
""-" dora (Figura
RNA anti-senso co da cmrs
ì-"''"'* s;.."""
Ribossomos não
podem se ligar?
Figura 15.5 Fqlr
Possíveis mecanis- A elevação da erçresd
mos para a inibição gene da poligalacün
da expressão gêni- vista durante os esüí(i
Degradado por
ca por meio do RNA nais do amadurecinsr
ribonucleases?
anti-senso. E
Croruaeeu GÊwrcn e ANÁLrsE oe DNA 327
dos tomates imaturos não desenvolve totalmente seu sabor, caso sejam removidos da planta
antes de estarem totalmente amadurecidos. O resultado é que a produção massiva de tomates
freqüentemente possui um sabor brando, o que os torna menos atraentes aos consumidores.
Duas companhias biotecnológicas - Calgene, nos Estados Unidos, e ICI Seeds no Reino Uni-
do - utilizaram a tecnologia do anti-senso como forma de modificar geneticamente as plantas
de tomates, de maneira que o seu processo de amadurecimento foi retardado. Isso possibilita
ao produtor deixar as frutas na planta para que elas amadureçam até um determinado esúgio,
no qual o sabor tenha sido completamente desenvolvido, com tempo ainda suf,rciente para o
transporte e a comercialização da cultura antes que ela se estrague.
O papel do gene da poligalacturonase no amadurecimento do tomate

O espaço de tempo para o desenvolvimento de uma fruta é medido como o número de dias ou
semanas após o florescimento. No tomate, esse processo leva aproximadamente oito semanas,
desde o início até o seu término, com as modificações na coloração e no sabor associadas com
o amadurecimento iniciado após cerca de seis semanas. Nesse período, um determinado nú-
mero de genes envolvidos nos estágios finais do amadurecimento é induzido, incluindo aque-
le que codifica a enzima poligalacturonase (Figura 15.6), a qual degrada lentamente o ácido
poligalacturônico, componente da parede celular do pericarpo das frutas, resultando em um
amolecimento gradual. O amolecimento torna o fruto palatável, mas se ele se prolonga por
muito tempo, o resultado é um tomate amassado e estragado, pouco atraente.
A inativação parcial do gene da poligalacturonase deveria aumentar o período entre o de-
senvolvimento do sabor e o estrago da fruta. Como a tecnologia do anti-senso poderia ser uti-
lizadapar:a a obtenção desse resultado?
A clonagem do "gene" anti-senso da poligalacturonase

O experimento que será analisado foi realizado pelo Departamento de Biotecnologia de Plan-
tas da ICI Seeds, juntamente com cientistas da Universidade de Nottingham, em meados da
década de 1980. Um fragmento de restrição de 730 pb foi obtido a partir da região 5' do gene
da poligalacturonase normal, representando apenas menos da metade da seqüência codifica-
dora (Figura 15.7). A orientação do fragmento foi revertida e um promotor do vírus do mosai-
co da couve-flor foi ligado no início dessa seqüência, além de um sinal de poliadenilação de
oo
(ú
'ãg
E.6 Expressão do gene
s3
(ú ì(ú
Éo
50 da poligalacturonase
-Eo
c6)
(Ú:
õõ
lura 15.5 Figura 15.6
hsíveis mecanis- A elevação da expressão do
$ para a inibição gene da poligalacturonase
I expressão gêni- vista durante os estágios Íi-
I por meio do RNA nais do amadurecimento do
ili-senso. tomate.
Ë
F
F
328 T. A. Bnowr.r
calos, co
Gene da poligalacturonase crescime
que confi
ficados e
Os re
Clivagem, ligação a seqüências
(1) A1
controladoras na orientação inversa
me
(2) Ar
(p.
RÀ
promotor Sinal de poliadenilação (3) Ot
\/ \ -=- t
nÍu
col
Figura Í5.7
"Gene" anti-senso Tai
Construção de um "gêne"
da poligalacturonase m2
anti-senso da poligalacturo-
- nase. R = sítio de restrição. pla
- (4) As
pla
plantas tendo sido ligado no seu final. A construção foi, então, inserida no vetor plasmidial Ti ap
binário, pBINl9 (p. 152). Uma vez dentro da planta, a transcrição a partir do promotor do ví- da
rus do mosaico da couve-flor deveria resultar na síntese de um RNA anti-senso, complemen- rat
tar à primeira metade do mRNA do gene da poligalacturonase. Experimentos anteriores com gu
RNA anti-senso haviam sugerido que isso deveria ser o suficiente para reduzir, ou mesmo im-
pedir, a tradução do mRNA-alvo. Mait
A transformação foi realizada por intermédio da introdução das moléculas de pBINl9 re- dual, po
combinantes na bactéria Á grobacterium tumefaciens e, depois, permitindo que a bactéria in- rem. Iss
fectasse segmentos do caule do tomate (Figura 15.8). Quantidades pequenas de material dos galacnr
ra Íetart
sesmentodocaure í;t'íff5tffi3iïïli,lïlt"
do tomate
-----'--<---ì -"3'z"o
-l------- : | .
tl- -'t' ''
,.,/i :.\-)i:'
./.-)-2 zZ . lncubação
---.//,/7'z ' \ Porváriosdias

Meio ágar
Figura 15.8
Teste para Obtendo plantas
Calos crescidos ----") resistência
à canamicina
transÍormadas por
..ir,l ./7 meio da inÍecção As diÍerenças
,z
n
,r/ de segmentos do poligalacturona
z') caule com A. tume-
faciens recombi-
normais e em frú
do o "gene" anti.
nantes. !
_ --_
Cloruneeu GÊrurcn e ANÁLtsE oe DNA 329
calos, coletadas das superfícies desses segmentos; foram testadas para a sua capacidade de
crescimento em meio ágar contendo canamicina (lembre-se de que pBINl9 contém um gene
que confere resistência à canamicina; Figura 7.14). Transformantes resistentes foram identi-
ficados e deixados para se desenvolverem em plantas maduras.
Os resultados do experimento foram analisados das seguintes maneiras:
(1) A presença do "gene" anti-senso no DNA das plantas transformadas foi verificada por
meio de hibridização de Souúern (p.206).
(2) A expressão do gene anti-senso foi medida de acordo com a hibridização de northern
(p.230), com uma sonda de DNA de fita simples que deveria hibridizar somente com o
RNA anti-senso.
(3) O efeito da síntese do RNA anti-senso sobre a quantidade de mRNA de poligalacturo-
nase nas células de frutas amadurecidas foi determinado por hibridização de northern,
com uma segunda sonda de DNA de fita simples, essa específica para o mRNA senso.
de um "gene" Tais experimentos mostraram que as frutas amadurecidas, a partir das plantas transfor-
da poligalacturo- madas, continham menos mRNA de poligalacturonase do que as frutas originadas de
sítio de restrição. plantas normais.
(4) As quantidades de enzima poligalacturonase produzidas nas frutas amadurecidas de
plantas transformadas foram estimadas, a partir da intensidade das bandas relevantes,
vetor plasmidial Ti após a separação das proteínas da fruta por meio da eletroforese em gel de poliacrilami-
promotor do ví- da, e da medição direta das atividades enzimáticas nas frutas. Os resultados demonstra-
complemen- rÍrm que uma menor quantidade de enzima foi sintetizada nas frutas transformadas (Fi-
anteriores com gura 15.9).
, oumesmo im-
Mais importante, as frutas transformadas, embora apresentassem um amolecimento gra-
de pBINl9 re- dual, poderiam ser estocadas por um peíodo de tempo mais prolongado, antes de se estraga-
que a bactéria in- rem. Isso indicava que o RNA anti-senso não havia inativado completamente o gene da poli-
de material dos galacturonase, mas, apesar de tudo, produzido uma redução suficiente na expressão gênica pa-
ra retardar o processo de amadurecimento, conforme desejado.
o
a
(ú
c
I
oE
:E
y9.50
=9'
EË
go-
fura 1s.8 €€
(Ú0)
fendo plantas ttE
Eõ
fsiormadas por Figura 15.9 EË
fo Ca intecçao As diÍerenças na atividade da oË
pegmentos do poligalacturonase em tomates 0
Ie com A. tume- normais e em Írutas expressan-
Frs recombi- do o "gene" anti-senso da poli-
ps. galacturonase.
I
I
i
5.
I
E
r'
il
e:
iD
E
330 T. A. Bnowr.r
15.2.3 outros exemplos da utilização do RNA anti-senso na engenharia cópia do

genética vegetal das sejan
nptll,ten
Em termos gerais, as aplicações da subtração de genes na engenharia genética vegetal são pro-
seu prodr
vavelmente menos amplas do que aquelas da adição de genes. É muito mais fácil pensar nas
que a ne(
caracteísticas úteis que uma planta não possui e quais poderiam ser introduzidas pela adição
animais-r
de genes, do que identificar características desvantajosas que a plantajá possua e quais pode-
riam ser removidas pela subtração de genes. No entanto, existe um número crescente de pro- (1) Po<
jetos de biotecnologia vegetal baseados na subtração de genes (Tabela 15.3) e a abordagem do
irá, provavelmente, aumentar em importância, à medida que as incertezas que circundam os bió
princípios que fundamentam a tecnologia do anti-senso forem gradualmente resolvidas. (2) Po<
resr
15.3 Problemas com vegetais geneticamente modificados Nenì

atual. Po
Tomates com o amadurecimento retardado, produzidos pela subtração de genes, foram os pri- de um al
meiros gêneros alimentícios geneticamente modificados aprovados totalmente para a comer- riana do
cialização. Em parte devido a isso, a engenharia genética vegetal tem servido de campo de ba- transfeú
talha, no qual biotecnologistas e outras partes interessadas têm discutido em relação à segu- De form;
rança e às questões éticas que surgem, a partir da capacidade de alterar-se a constituição ge- modifica
nética dos organismos vivos. Inúmeras das questões mais importantes não dizem respeito di- COmUnS r
retamente aos genes e tampouco os conhecimentos necessários para respondê-las serão encial não
contrados neste livro. Não podemos discutir de uma maneira confiável o possível impacto, Osn
bom ou mau, que as culturas geneticamente modificadas possam causar nas práticas agúco- do os bir
las locais nos países em desenvolvimento. Tampouco podemos comentar os motivos subja- após a o,
centes ao desenvolvimento de plantas resistentes a herbicidas por companhias que também mado h
comercializam o herbicida que os agricultores deverão utilizar com a cultura modificada. No sa fragn
entanto, podemos - e devemos - examinar os aspectos biológicos. (Figura
nageÍn I
15.3.1 A segurança em relação às marcas de seleção de seleç

Cre. Ap
Um dos principais pontos de preocupação a surgir, a partir do debate sobre os tomates gene-
DNA da
ticamente modificados, foram os possíveis efeitos danosos das marcas de seleção genética uti-
lizadas com os vetores de clonagem em plantas. A maioria dos vetores de plantas possui uma
Thbela 15.3 Exemplos de projetos de subtração de genes em plantas
Gene-alvo Caracteística modifi cada

Poligalacturonase Retardamento do estrago em tomates
Aminociclopropano-ácido Modificação no amadurecimento
carboxflico-sintase do tomate
Polifenol-oxidase Inibição do descoloramento em frutas e vegetais
Sintase de amido Redução do conteúdo de amido em vegetais
Delta- 12-desaturase Conteúdo elevado de ácido oléico em soja
Chalcono-sintase Modificação da coloração da flor em viárias plantas decorativas I
Excisão de DNÁ
enzima recor
Clouoera GÊrurce e ANÁLrsE oe DNA 331
engenharia cópia do gene que confere resistência à canamicina, possibilitando que as plantas transforma-
das sejam identificadas durante o processo de clonagem. O gene kanR, tambémchamado de
nptll,temorigem bacteriana e codifica a enzima neomicina-fosfotransferase IL Esse gene e o
vegetal são pro- seu produto enzimático estão presentes em todas as células da planta modificada. O receio de
is fácil pensar nas que a neomicina-fosfotransferase pudesse ser tóxica ao homem foi abrandado por testes com
uzidas pela adição animais-modelo, mas duas outras questões de segurança peÍnanecem:
possua e quais pode-
crescente de pro- (1) Poderia o gene kanR presenteem um alimento geneticamente modificado ser transmiti-
15.3) e a abordagem do para bactérias do intestino humano, tornando-as resistentes à canamicina e aos anti-
que circundam os bióticos relacionados?
resolvidas. (2) Poderia o gene knn* ser transmitido para outros organismos do meio ambiente, podendo
resultar em prejuízo ao ecossistema?
os Nenhuma dessas questões pode ser totalmente respondida com o nosso conhecimento
atual. Pode ser argumentado que o processo de digestÍio poderia destruir todos os genes kan*
de um alimento geneticamente modificado antes de que esse pudesse alcançar a flora bacte-
genes, foram os pri-
para a comer- riana do intestino, e que, mesmo se um gene escapasse da destruição, as chances de ele ser
transferido para uma bactéria seriam muito pequenas. No entanto, o fator de risco não é zero.
de campo de ba-
De forma semelhante, embora experimentos sugiram que o cultivo de plantas geneticamente
em relação à segu-
modificadas teria um efeito insigniÍicante no meio ambiente, uma vez que genes kanR já são
a constituição ge-
comuns em ecossistemas naturais, a futura ocorrência de algum evento indesejado e prejudi-
dizem respeito di-
las serão en- Çial não pode ser considerada uma impossibilidade absoluta.
Os receios que cercam a utilização de kanR e de outros genes marcadores têm estimula-
o possível impacto,
nas práticas agríco-
do os biotecnologistas a desenvolver maneiras de remover tais genes do DNA das plantas,
após a ocorrência do evento de transformação. Uma dessas estratégias faz uso de uma enzi-
os motivos subja-
que também ma do bacteriófago Pl, chamada Cre, a qual catalisa um evento de recombinação que exci-
sa fragmentos de DNA flanqueados por seqüências de reconhecimento de 34 pb específicas
modificada. No
(Figura 15.10). Para utilizar esse sistema, a planta é transformada com dois vetores de clo-
nagem, o primeiro contendo o gene a ser adicionado à planta, juntamente com a sua marca
de seleção kanR, flanqueada pelas seqüências-alvo de Cre, e o segundo contendo o gene
Cre. Após a transformação, a expressão do gene Cre resulta na excisão do gene kan* do
os tomates gene- DNA da planta.
seleção genética uti-
plantas possui uma
Seqüências-alvo para Cre
/\
--. Molécula de DNA
Recombinação
catalisada por Cre
vegetais
fe -_______________I___
Ftals
FOJA
lias plantas decorativas Figura 15.10 Fragmento flanqueado pelas
Excisão de DNA por meio da seqüências-alvo é excisado
enzima recombinase Cre.
ç
332 T. A. Bnowlr
E se o próprio gene Cre for de alguma forma prejudicial? Isso é impossível, uma vez que Leituras adicit
os dois vetores utilizados na transformação provavelmente irão integrar seus fragmentos de
DNA em cromossomos diferentes, de forma que a segregação aleatória durante a reprodução Bachem, C.WJ
sexual irá resultar em uma primeira geração de plantas que contém um dos fragmentos de genqs inlÌih
DNA integrado, mas não o outro. A planta que não contenha nem o gene Cre e nem a marca Courtney4rm
de seleção kan*, mas que contenha o gene de interesse, que se deseja adicionar no genoma da cation offl
genetics. B
planta, poderá, assim, ser obtida.
Feitelson J-S-I
talhes de &
15.3.2 A possibilidade de eÍeitos preiudiciais ao meio ambiente Fischhoff, D-A-
807-13. [A
Uma segunda área de preocupação, em relação às plantas geneticÍìmente modificadas, é que Flavell, R-B- D
as suas novas combinações genéticas possam prejudicar o meio ambiente de alguma manei- l4l4-l
10,
ra. Determinados problemas foram destacados com respeito às plantas modificadas serem re- neticam
sistentes à infecção viral. Uma estratégia aqui é transforïnar a planta com os genes que codi- Koziel, M-G- X
ficam as proteínas do capsídeo de um vírus patogênico. A expressão desses genes não resulta an insecrii
Shade, R.E- Sc
em sintomas de doença, mas fornece à planta um grau de proteção contra a infecção pelo ví- commmh
rus intacto. Um receio é que a planta que está sintetizando proteínas do capsídeo de um vírus resisenrcs
patogênico pode ser atacada por um segundo tipo de vírus, cuja replicação poderia originar Smith, CJS- \
uma progênie híbrida, contendo genomas de vírus infecciosos, empacotados nas proteínas do uansgsnb
Tepfer, M" (19!
capsídeo sintetizadas pela planta. Tais híbridos poderiam apresentarpropriedades inesperadas
lr2r3z I
e danosas, por exemplo, as novas proteínas do capsídeo poderiam ampliar a faixa de hospe-
Truve,E-Aq
deiro do segundo vírus, capacitando-o a infectar novas plantas, que norÍnalmente eram resis- lat€ sYÍÍrÉ
tentes, resultando em doenças. tUanipür
Há também a questão de se um novo gene, introduzido em uma planta geneticamente mo- Yoder, J.I. lk C
dificada, poderia "escapar" e colonizar plantas selvagens e, caso isso acontecesse, qual o im- tecffig
pacto que teria no meio ambiente. Pesquisas com plantas nativas e geneticamente modifica-
das estão gradualmente acumulando dados, a partir dos quais essas questões serão respondi-
das. Porém, é importante perceber que a determinação do efeito que plantas geneticamente
modificadas podem ter sobre o meio ambiente será possível somente se experimentos adequa-
dos forem realizados, em sistemas-modelos, antes que a liberação em larga escala das plantas
seja permitida. Tais experimentos serão incompletos se não envolverem testes com plantas ge-
neticamente modificadas cultivadas sob condições rigorosamente controladas no ambiente
natural. Se não for possível realizar esses testes corretamente, então efeitos prejudiciais pode-
rão ser perdidos.
^
CnpÍrulo 16
Clonagem Gênica e Análise de
DNA na Ciência Forense
i
Análise do DNA na identificação de suspeitos Identificação do sexo por meio da análise do DNA,
criminais, 335 340
Estudando o parentesco por meio do perfil do DNA,
339
A ciência forense é a última área da biotecnologia que será considerada neste volume. Dificil-
mente uma semana termina sem uma reportagem na imprensa sobre mais um crime hediondo
que tenha sido solucionado graças à aniílise do DNA. As aplicações da biologia molecular no
laboratório criminal centralizam-se, em grande parte, na capacidade da análise do DNA em
identificar um indivíduo a partir de cabelos, manchas de sangue e outros itens recuperados do
local do crime. Nos meios de comunicação populares, essas técnicas são conhecidas como
datiloscopia genética (genetic fingerprinting), embora o termo mais preciso paÍa os procedi-
mentos utilizados hoje em dia seja perfil do DNA. Este capítulo inicia com um exame dos
métodos utilizados na datiloscopia genética e no perfil do DNA, incluindo suas utilizações,
tanto na identificação de indivíduos quanto na confirmação se indivíduos são membros de
uma mesma famflia, o que nos levará a uma exploração das maneiras pelas quais as técnicas
genéticas estão sendo usadas em iíreas de criminalística e em outras, além da investigação po-
licial, como a arqueologia.
16.1 Análise do DNA na identificação de suspeitos criminais

É provavelmente impossível alguém cometer um crime sem deixar um rastro de seu DNA.
Cabelos, sangue e mesmo impressões digitais convencionais contêm traços de DNA suficien-
tes para serem estudados por meio da reação de polimerização em cadeia (PCR). A aniílise
não necessita ser realizada imediatamente. Nos últimos anos, um certo número de crimes do
passado foi solucionado e o criminoso levado à Justiça, graças ao teste de DNA realizado com
material arquivado. Assim sendo, como tais métodos poderosos funcionam?
A base da datiloscopia genética e do perfil do DNA é que os gêmeos idênticos são os úni-
cos indivíduos que possuem cópias idênticas do genoma humano. É claro, o genoma humano
é mais ou menos o mesmo em todas as pessoas - os mesmos genes estarão na mesma ordem
'ij
L'
E.
l-
i;.
L
h
336 T.A. Bnowru
com as mesmas seqüências de DNA de regiões intergênicas entre eles. Mas o genoma huma- A técn
no, bem como o dos demais organismos, contém muitos polimorfismos, posições onde cias polim
a se-
qüência de nucleotídeos não é a mesma em cada membro da população. Já havia sido cia curta,
desta- r
cada a principal importância desses sítios polimórficos anteriormente, pois as seqüências seqüencia
va-
riáveis são aquelas mesmas utilizadas como marcadores de DNA no .rrup"u-"nio genômico
lCAl,, na
(p.262). Elas incluem polimorfismos de comprimento de fragmentos dó restriçaolRFlps), O nún
repetições curtas em tandem (STRs) e polimorfismos de nucleotídeos individuaii (SNpO. 1'o- adicionad;
das essas três podem ocoffer dentro de genes, e em regiões intergênicas, existindo, no total,
ção do Dì
vários milhares desses sítios polimórficos no genoma humano, destacando-se os SNps como de uma de
os mais comuns. petições. Ì
terminado
16.1.1 A datiloscopia genética por meio da sondagem por hibridização meio de P
O primeiro método de utilização da análise do DNA para identificar indivíduos foi desenvol- uma repet
vido em meados da década de 1980 por SirAlec Jeffreys, da Universidade Leicester. Essa téc- gel de agz
nica não se baseou em qualquer um dos tipos de polimorfismos recém-listados, mas em um na ÍÌmosuì
tipo de variação no genoma humano chamada de seqüência repetitiva dispersa hipervariá- uma única
vel. Como o nome indica, trata-se de uma seqüência repetida que ocoÍïe em vários lugares mossomo
("dispersa") do genoma humano. A característica fundamental dessas seqüências é que Umarr
suas
posições genômicas são variáveis: elas estão localizadas em diferentes posições nos genomas de resulta
de diferentes pessoas (Figura 16.1a). tados são 1
A repetição específica que foi inicialmente utilizada na datiloscopia genética contém a se- cia em uu
qüência GGGCAGGANG (onde N é qualquer nucleotídeo). Para preparar uma datiloscopia,
uma amostra de DNA é clivada com uma endonuclease de restrição, os fragmentos são sepa-
rados por eletroforese em gel de agarose e é realizado um experimento de South em (p.207).
A hibridização da membrana com uma sonda marcada contendo a seqüência repetida revela
uma série de bandas, cada uma representando um fragmento de restrição que contém a repe-
tição (Figura 16.1b). Uma vez que os sítios de inserção da seqüência repetiãa são variáveis, o
mesmo procedimento, realizado com uma amostra de DNA de uma segunda pessoa, irá for-
necer um padrão diferente de bandas, as quais são datiloscopias genéticas para aqueles
indi-
víduos.
16.1.2 O perfil do DNA por meio da pCR de repetições

Figura 16.1
curtas em tandem A datiloscopia ge-
Estritamente falando, a datiloscopi a genética refere-se somente às análises de hibridização nética. (a) As por*-
das seqüências repetidas dispersas. Essa técnica, embora valiosa no trabalho
criminalista, foi ções das repeti@es
penalizada por três limitações: polimórÍicas, tais
como as seqüêc"
(1) Uma quantidade relativamente grande de DNA é necessária, pois a técnica depende
da
cias repetitivas dis-
análise por hibridização. A datiloscopia não pode ser úilizadacom as quantidades persas hipervariá-
ínfi- veis, nos genoÍÌÌaÍ;
mas de DNA de cabelos e manchas de sangue.
(2) de dois indivíduos.
A interpretação da datiloscopia pode ser difícil, em decorrência de variações nas inten-
Nos segmentos cK>
sidades dos sinais de hibridização. Em um processo judicial, pequenas diferenças
na in_ mossômicos mos-
tensidade das bandas entre uma datiloscopia-teste e outra realizadade um suspeito
po- trados, a segunda
dem ser suficientes para que este seja inocentado. pessoa possui urna
(3) Embora os sítios de inserção das seqüências repetidas sejam hipervariáveis, existe seqüência repetida
um
limite dessa variabilidade e, portanto, uma pequena chance á" qu" dois indivíduos adicional. (b) Uma
não-relacionados possam ter as mesmas, ou pelo menos muito semelhantes, datilos_ auto-radiograÍia eÍ-
copias. Novamente, essa consideração pode levar à absolvição, quando um caso é le- be as datiloscopias
vado ao tribunal. genéticas de dois
indivíduos.
Croueeu GÊrurcn e ANÁusE oe DNA ggz
o genomahuma- A técnica mais poderosa do perfil do DNA evita tais problemas. perfis utilizam
seqüên-
ições onde a se- cias polimórficas chamadas STRs. Conforme descrito na página
262,umaSTR é uma ,"qticn-
havia sido desta- cia curta, de 1 a 13 nucleotídeos de comprimento, que é repetida várias
vezes em um arranjo
seqüências va- seqüencial. No genoma humano, o tipo mais comum ae SfR é
a repetição dinucleotídica
genômico [cA],, na qual "n", o número de repetições, está normalmente entre s Ë zo 6igur a 16.2a).
(RFLPs), O número de repetições em uma determinada STR é variável, pois repetições
podem ser
is (SNPs). To. adicionadas ou, menos freqüentemente, removidas por erros qu"
o"orr"- durante a replica-
istindo, no total, ção do DNA. Na população como um todo, devem existir emiorno de l0 versões diferentes
os SNPs como de uma determinada STR, cada um dos alelos caracterizados por
um número diferente de re-
petições. No perfil do DNA, os alelos de um número selecionado
de STRs diferentes são de-
terminados. Isso pode ser rapidamente obtido e com quantidades muito pequenas
de DNA por
meio de PCRs com iniciadores que se anelam às seqüências de DNA Ëm
ambos os lados de
foi desenvol- uma repetição (Figura l2.ll). Após a PCR, os produtos são examinados por
eletroforese em
Essa téc-
gel de agarose' com o tamanho da banda ou bandas indicando o alelo
ou os alelos presentes
mâs em um na amostra de DNA testada (Figura 16.2b). Dois alelos de uma STR podem
estar presentes em
hipervariá- uma única amostra de DNA, visto que existem duas cópias Oe caAa StR,
uma vinda do cro-
rários lugares mossomo herdado da mãe e a outra, do cromossomo herdado do pai.
ias é gue suas Uma vez que a PCR éutllizada, o perfil do DNA é muito sensível e possibilita
a obtenção
genoüras de resultados com cabelos e outros materiais que contenham apenas
EOS traços de DNA. Os resul-
tados são precisos e uma identidade entre perfis de DNA é normalmente
aceita como evidên-
contém a se- cia em um julgamento. É importante destacar que o perfil do DNA, quando
conduzido com
datiloscqia
são s€p&
$.w7).
repetida revela
çmfuaÍEpe- (a) Seqüências repetidas polimórficas no genoma humano
sfro vui:f;veis, o
Íiìsqsm, irá fü-
Primeira Pessoa
eryeles iudi-
DNAs cromossômicos
---------- Segunda pessoa
-----
Figura 16.1
A datiloscopia ge- o posições das seqüências
repetidas
nética. (a) As posi-
ções das repetições
polimórficas, tais (b) Duas datiloscopias genéticas
como as seqüên-
dlFìCrríL df cias repetitivas dis- Linhas 1 e 2:
persas hipervariá-
G veis, nos genomas
1
DNA de dois
indivíduos
de dois indivíduos.
rf ingr- Nos segmentos cro-
nil[F mossômicos mos-
surycimpo. trados, a segunda
pessoa possui uma
FriflürìUr seqüência repetida
hffim adicionat. (b) Uma
ffie- auto-radiograÍia exi-
be as datiloscopias
cesoéh-
genéticas de dois
indivíduos.
;
e
f-
h
338 T. A. Bnowrir
STRs com um grande número de alelos, fornece uma probabilidade estatística elevada de que os prod
uma identidade entre um perfil-teste e o de um suspeito seja significativa e não devida a um empmi
acaso de similaridade entre duas pessoas diferentes. É possível alcançar o grau necessiírio de são mer
ceÍteza pela análise de um painel de nove STRs, que pode ser estabelecido em uma única da dos I
PCR multiplex, na qual um conjunto de pares de iniciadores é utilizado em uma única rea-
ção. Os resultados podem ser interpretados, porque as PCRs são projetadas de tal maneira que
16.2 Estud
Assimr
(a) Os dois alelos de uma STR ra infer
doéch
dade.
....CACACACACA.. n=5
....cAcAcAcAcAcA n=6 16.2.1 lndiví
O peÍfl
sua mã
(b) Os resultados da PCR apaÍent
@guÍa
petiçft
criança
alelo ú
ceíe72
1. DNA marcador de tamanho
víduo's,
:2 2, 3. PCRs de uma única STR em urnaI'Íl

dois indivíduos
16.2.2 O per
4. PCR multiplex de três STRs (1-3)
Umex
cido pe
memhr
ção Ru
Apos, c
dadoo
(c) Análise dos resultados de uma PCR multiplex em um seqüenciador de DNA automático
Í00 150 2OO Tamanho (pb)
Figura 16.2
O perfit do DNA. (a) O perfil do DNA Íaz uso de STRs, as quais possuem unidades repetidas variáveis.
(b) Um gel obtido após o perfil do DNA. Nas linhas 2 e 3 a mesma STR foi examinada em dois indivÊ Figura 163
Padrão de he'
duos. Essas duas pessoas possuem perfis diÍerentes, mas uma banda em comum. A linha 4 mostra o
rança de alelos
resultado de uma PCR multiplex, na qual três STRs Íoram determinadas em uma única PCR. (c) Um
de STRs em
seqüenciador de DNA automático pode ser utilizado para determinar o tamanho dos produtos da PCR.
uma Íamília
Cloruneeu GÊrurcn e ANÁLtsE oe DNA 339
elevada de qrre os produtos obtidos, a partir de cada STR, possuem tamanhos diferentes e, assim, aparecem
não deüda a rrm em posições diferentes no gel de agarose (Figura 16.2b).Alternativamente, se os iniciadores
messário de são marcados com fluorocromos diferentes, os resultados podem ser visualizados pela corri-
em umâ unlca da dos produtos em um seqüenciador de DNA automático (Figura 16.2c).
uma rrntca IEa_
tal maneiraqre
16.2 Estudando o parentesco por meio do perfil do DNA
Assim como na identificação de criminosos, o perfil do DNA pode também ser utilizado pa-
ra inferir se dois ou mais indivíduos são membros de uma mesma famflia. Esse tipo de estu-
do é chamado de análise do parentesco e a sua aplicação dirária dá-se nos testes de paterni-
dade.
16.2.1 lndivíduos relacionados possuem perfis de DNA semelhantes

O perfil do seu DNA, assim como outros aspectos do seu genoma, é parcialmente herdado de
sua mãe e parcialmente de seu pai. Proximidades dentro de uma famflia, portanto, tornam-se
aparentes quando os alelos de uma determinada STR são destacados emum pedigree familiar
(Figura 16.3). Nesse exemplo, vemos que três de quatro crianças herdaram o alelo de 12 re-
petições de seu pai. Essa observação, por si só, não é suficiente para se deduzir que essas três
crianças são irmãs, embora a probabilidade estatística pudesse ser bastante elevada, caso o
alelo de 12 repetições fosse incomum na população como um todo. Para aumentar o grau de
certeza, mais STRs deveriam ser determinadas, mas, assim como com a identificação de indi-
víduos, as análises não necessitam ser infinitas, pois uma comparação de nove STRs fornece
uma probabilidade aceitável de que as identidades observadas sejam reais.
16.2.2 O perfil do DNA e os resquícios dos Romanov

Um exemplo interessante da utilização do perfìl do DNA em um estudo de parentesco é forne-
cido pelo trabalho realizado durante a décadade 1990 com os ossos dos Romanov, os últimos
membros da famíia dominadora da Rússia. O Tsar Nicholas II foi deposto durante a Revolu-
ção Russa e, juntamente com sua esposa, a Tsarina Alexandra, e seus cinco filhos, foi preso.
Após, os sete foram mortos, além de seu médico e de viírios empregados. Em 1991, após ã que-
da do comunismo, os co{pos foram recuperados de suas covas na margem de uma estrada.
O uutn",.
I Homem
lf famanfro das repetições das STRs
ìranaYs-
ütisindìrí- Figura 16.3
Padrão de he-
4 ÍnÉao
FCR(c) tlm rança de alelos
de STRs em
daFCR
uma Íamília.
340 T. A. Bnowr.r
A análise de STR dos ossos dos Romanov

Os corpos recuperados erÍìm um pouco mais do que uma coleção de ossos, de adultos e de
crianças, misturados, com nenhuma indicação de quais pertenceriam aos Romanov e quais ao
seu médico e aos empregados. No entanto, os únicos ossosjuvenis, dentro da coleção, deve-
riam pertencer às crianças do tsar e da tsarina. Isso significava que os ossos do tsar e da tsari-
na poderiam ser identificados por meio do estabelecimento de quais adultos poderiam ser os
pais das crianças.
O DNA foi extraído dos ossos de cada indivíduo e cinco STRs foram determinadas por
PCR. De fato, apenas duas dessas STRs forneceram informações suficientes pam que o pai e
a mãe das crianças fossem identificados com precisão (Figura 16.4). Mas seriam esses mes-
mos os ossos dos Romanov ou poderiam ser os resquícios de algum outro grupo de pessoas
desafortunadas? Para resolver esse problema, o DNA dos ossos foi comparado com amostras
de DNA de parentes vivos dos Romanov. Esse trabalho incluiu estudos do DNA mitocon-
drial, um pequeno DNA circular de 16 kb contido nas mitocôndrias geradoras de energia das
células. O DNA mitocondrial contém polimorfismos que podem ser utilizados para inferir pa-
rentescos entre indivíduos, mas o grau de variabilidade não é tão grande quanto aquele apre-
sentado pelas STRs, de forma que o DNA mitocondrial raramente é utilizado para estudos de
parentesco entre indivíduos extremamente relacionados, tais como aqueles de uma mesma fa-
mília. Mas o DNA mitocondrial possui a propriedade importante de ser herdado somente da
linhagem feminina, com o DNA mitocondrial do pai sendo perdido durante a fecundação e
não contribuindo para o conteúdo de DNA do filho ou da hlha. Esse padrão de herança ma-
terna torna mais fácil a determinação de parentesco, quando os indivíduos que estão sendo
comparados são mais distantemente relacionados, como foi o caso com os parentes vivos dos
Romanov. Tais estudos do DNA mitocondrial mostraram que os ossos eram com certeza os do
Tsar Nicholas, da Tsarina Alexandra e de três de suas filhas.
As crianças perdidas
Somente três crianças foram encontradas no túmulo dos Romanov. Alexei, o único menino, e
uma das quatro meninas estavÍÌm faltando. Na metade do século XX, vrírias mulheres reivin-
dicavam ser a princesa Romanov, porque, mesmo antes de os ossos serem descobertos, havia
boatos de que uma das meninas, Anastásia, teria escapado da crueldade dos bolchevistas e fu-
gido para o ocidente. Lamentavelmente, testes de DNA mostraram que nenhuma dessas re-
querentes poderia ter sido a filha do tsar e da tsarina e a história de Anastásia é, provavelmen-
te, apenas um romance. A explicação mais provável para a aparente ausência das duas crian-
ças na sepultura é que seus ossos estavam extremamente degradados para serem recuperados,
ou que elas foram enterradas em locais diferentes. De fato, os resquícios de um menino e de
uma menina, a última com jóias semelhantes àquelas usadas por Maria, foram recentemente
encontrados. Fig
Aa
ca(
16.3 ldentificação do sexo por meio da análise do DNA mel
osi
adt
A análise do DNA também pode ser utilizada para identificar o sexo de um indivíduo. A dife- nhr
rença genética entre os sexos é a presença de um cromossomo Y nos indivíduos do sexo mas- tr€s
culino, de forma que a detecção de DNA específico do cromossomo Y deve possibilitar que @n
homens e mulheres sejam distinguidos. Os cientistas criminalistas ocasionalmente têm que qu€
tratar com corpos que estão de tal forma gravemente danificados, que a análise do DNA é a me
única maneira de determinar o sexo. de'
l
Clorunoeu GÊuca e ANÁLtsE oe DNA 341
adultos e de (a) A árvore genealógica da Íamília Romanov

e quars ao
deve-
tsar e da tsari-
Tsarina Alexandra
por
que o pal e
esses mes-
de pessoas
amostras
nitocon-
energia das
inferirpa- Anastásia
aqnele apre-
esndos de
mafa- (b) A análise de STR
mi{mte da
e
humçana- STRs
emÍo $€ndo THOl VWN?l
ryirudm
Criança 1 8,10
crdo 15,16
Criança 2 7,8 15,16
Criança 3 8,10 15,16
m,c Mulher adulta 1 8,8 1s,16

IEflID' Mulher adulta 2 o,o 16,17
hlsir
cfr- Homem adulto 1 9,10 14,20
Homem adulto 2 6,10 17,17
Figura 16.4
A análise de repetições curtas em tandem dos ossos dos Romanov. (a) A árvore genealógi-
ca da Íamília Romanov. (b) Os resultados das análises de STR. THO| e VWA/gl são os no-
mes dos dois lócus de srR. os números nas colunas (8, 10, etc.) são os de repetições para
os alelos determinados em cada indivíduo. O resultado com THOI mostra que a mulher
adulta 2 não pode ser a mãe das crianças, porque ela possui somente o alelo 6, o qual ne-
nhuma das crianças possui. A mulher adulta 1, no entanto, possui o alelo g, o qual todas as
três crianças aprêsentam, e, dessa maneira, ela é identiÍicada como a tsarina. O resultado
com THol exclui o homem adulto 4 de ser o possível pai das crianças, mas não permite
que os outros três homens adultos sejam distinguidos todos poderiam ser o pai de pelo
-
menos duas crianças. Entretanto, o resultado com VWNS| exclui os homens adultos 1 e 2,
de Íorma que o homem adulto 3 é identiÍicado como o tsar.
U2 T.A. Bnowr.r
Testes de DNA também podem ser utilizados para

a identificação do sexo de uma criança
que ainda não nasceu. A descoberta de que um 16.3.2 PCF
feto é um menino óu uma meninu Jg".ut-"n-
te retardada até que as diferenças anatômicas tenham
se desenvolvido e o sexo possí ser iden- Aca
tificado por meio de uma ecografia, mas, sob determinadas cias t
circunstânciar, u-u indicação
mais precoce do sexo é desejável. Um exemplo é quando pedigreeda cador
o família indica que um
menino ainda não-nascido poderá apresentar u-á do"nçu -tr"r"áitá.iu para.
e os pais gostariam de
decidir com antecedência a respeito de continuar ou não a gestação. que a
uma terceira aplicação da identificação do sexo com bãse no DNA c
ponsável por muito do desenvolvimento nesse campo
- e que tem sido res- dos p
- é
cos' Esqueletos de homens e mulheres podem ser diìtinguidos
a análise de espécirnes arqueológi-
se os seus ossos-chave, tais co- te târ
mo o crânio ou a pélvis, estiverem intactos, mas com cadáveres quan
incompletos, ou cadáveres de
criançasjovens, não existem diferenças anatômicas sexuais específicãs onde
suficientes para que
uma identificação precisa seja realizada. Se DNA antigo outra
estiver presente nos ossos, um mé-
todo com base no DNA poderá informar aos arqueologistas um ir
se eles estão tratando com um ho-
mem ou com uma mulher. rente
pois
16.3.1 PCRs direcionadas a seqüências especíÍicas do cromossomoy
A maneira mais simples de utilizar a análise do DNA para determina.r o sexo é planejar
uma (r
PCR específicapata uma região do cromossomo Y. A PCR
deve ser planejada com cuidado,
pois os cromossomos X e Y não são completamente
diferentes, ãlgun, segmentos sendo
compartilhados entre ambos. Porém, há muitas regiões únicas "o- y. Em
dentro Jo
especial, existem viírias seqüências repetidas qu" Ãtao localizadas
apenas"ro--orromo
no cromossomo y,
as quais atuam como alvos múltiplos para a PCR
e, portanto, fornecãm uma maior sensibili-
dade, uma consideração importante, caso se esteja
tràtando com um corpo extremamente da-
nificado ou com um osso muito antigo.
A PcR direcionada a seqüências específicas do cromossomoy poderá
fornecer um produ-
to com o DNA de homem, mas nenhuma banda, caso
a amostra u"nhu d. u-u
16'5)' Essa é uma distinção clara entre as duas alternativas -uitr..ÌFigura
e, portanto, um sistema perfeita-
mente satisfatório para a maioria das aplicações. Mas,
e se a amostra não conúver qualquer
DNA ou se o estiver muito degradado para se trabalhar em uma pcR,
também possuir
fNA ou se a amostra
da DNA-poli-"rui" de Taq,de maneira que a pcR não
il|igores
Todas essas possibilidades podem ocorrer com espécimes
funcione?
arqueológicos, especialmente aque-
les que foram enterrados no solo e tornaram-se contaminados
com ácidos húmicos e outros
compostos conhecidos por inibirem a maioria das enzimas
utilizadas na pesquisa em biologia
molecular' Nesse momento, o teste torna-se incerto, porque
um espécime qu" é in"upuz de for-
necer um produto de PCR por uma ou mais razões poderia
ser enoneÍÌmente identificado co-
mo uma mulher. o resultado seria exatamente o mesmo:
nenhuma banda no gel.
Figura 16.5
A identiÍicação do sexo por
meio da PCR de uma se-
1. DNAs marcadores qüência de DNA especíÍica
- do cromossomo y. O DNA de Figr
- 2. DNA de homem
homem origina um produto
- 3. DNA de mulher de PCR (linha 2), mas o
A idr
gen(
DNA de muther, não (tinha origi
4. PCR fracassada
3). O problema é que uma Gae
PCR Íracassada (linha 4) ori- PCF
gina o mesmo resultado que pos
o DNA de mulher.
Ct-orunoeu GÊNrcA E ANÁLrsE oe DNA 343
macriança 16.3.2 PCR do gene da amelogenina

irnnégeÍalnen-
gmraseriden- A carência na discriminação entre "mulher" e "PCR fracassada" que ocorre quando seqüên-
mml indicação cias específicas do Y são estudadas levou ao desenvolvimento de testes de DNA mais sofisti-
iúcaqueum cados para a identificação do sexo, alguns dos quais fornecem resultados inequívocos, tanto
gMiam para homens quanto para mulheres. O mais amplamente utilizado desses testes envolve PCRs
de
que amplificam o gene da amelogenina.
rcm sido res- O gene da amelogenina codifica uma proteína encontrada no esmalte do dente. Ele é um
dos poucos genes que estão presentes no cromossomoY e, como a maioria desses genes, exis-
uçeológi-
tais co.
te tambóm uma cópia no cromossomo X. Porém, as duas cópias são bastante idênticas, e,
mcadáveres de quando as seqüências de nucleotídeos são alinhadas, um grande número deindels, posições
paÍa qu€ onde um segmento de DNA pode ter sido tanto inserido em uma seqüência como deletado de
moq outra, é identificado (Figura 16.6a). Se os iniciadores de uma PCR anelarem nos dois lados de
um mé-
um indel, os produtos obtidos a partir dos cromossomos X e Y apresentarão tamanhos dife-
oornum [g-
rentes. O DNA da mulher fornecerá uma única banda quando os produtos forem examinados,
pois as mulheres têm apenas o cromossomo X, enquanto os homens irão apresentar duas ban-
é planejar rtma (a) Parte do gene da amelogenina

com cuidado,
sendo
Y. Em Cromossomo Y
cromossomoY,
maior sensibili- Cromossomo X
da- \ Deleção de 6 pb na seqüência

do cromossomo X
umprodu-
mulher (Figrrra
sistema perfeita-
iver qualquer (b) Resultados das PCRs
ür se a âmostra
não funcione?
aque-
hinicos e outros :_-_
isa em biologia
é incapazde for- 1. DNAs marcadores
identi-ficado co-
2. DNA de homem
gel.
3. DNA de mulher
4. PCR fracassada
clo sexo por

de uma se-
DNA especíÍica
Y. O DNA de Figura 16.6
um produto A identiÍicação do sexo por meio da PCR de parte do gene da amelogenina. (a) Um indelno
2), mas o gene da amelogenina. (b) Os resultados das PCRs transpondo o indel. O DNA de homem
não (linha origina dois produtos de PCR, de 106 e 112 pb, no sistema-padrão utilizado em criminalísti-
é que uma ca e na arqueologia biomolecular. O DNA de mulher origina apenas o produto menor. Uma
(linha 4) ori- PCR Íracassada não origina nênhum produto e, assim, é claramente distinguível dos dois ti-
resultado que pos de resultados positivos.
L
F'
t
344 T.A.Bnowx
das, uma do cromossomo X e a outra do cromossomoY (Figura 16.6b). Se a amostra não con-
tiver DNA ou se a PCR fracassou por alguma oatÍarazão, nenhuma banda será obtida: não
Leituras adi
existe a confusão entre o fracasso e um resultado de homem ou mulher.
Brown, K-rl
O desenvolvimento do sistema da amelogenina para a identificação do sexo está tendo um Gill, P- Ívr
impacto importante na arqueologia. Não é mais necessário determinar o sexo de ossos enter- sirr&
rados com base nas diferenças sutis das estruturas dos mesmos. A grande confiabilidade que Jefteyr.f.
o teste do sexo baseado no DNA fornece esú resultando em algumas descoberias inesperadas. tDúÌo
Kravczet"
Em especial, os arqueologistas estão agora revendo suas opiniões prévias sobre o significado
NaLahLì
dos objetos enterrados em uma sepulturajunto com os cotpos. Imaginava-se que se um co{po X-YL
estava acompanhado por uma espada, então ele deveria ter sido de um homem, ou se a sepul-
tura contivesse colares, então o corpo era de uma mulher. O teste de DNA mostrou que esses
estereótipos não estão sempre corretos e que os arqueologistas devem possuir uma visão mais
ampla a respeito da conexão entre pertences na sepultura e sexo. De todos os resultados da re-
volução do DNA recombinante, esse foi, provavelmente, o menos esperado quando a clona-
gem gênica foi inventada no início da décadade 1970.

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T. A.

Luciane Maria Pereira Passaglia

do DNA recombi- Parte 1

r anos de bioquími- 3 Purificação de DNA a Vivas..........

projeto seguisse o * Aplicações da Clonagem Gênica e da Análise de

\ottingham, e com .203

l--................ .... 367

Por Que a Clonagem Gênica e a

O advento da clonagem gênica e da reação em cadeia importantes, l6

1.1 O desenvolvimento inicial da genética

1.2 O advento da clonagem gênica e da reação em rlt

i;r'.::fll \-ìf!- I 'o-rsr:rurr1 r-rciì

Erande era da 1.3 O que é clonagem gênica?

por uma re-

Trinta anos em-7)um clone {

Figura 1.1 Colônias bacterianas

ïoriF:J xìv 'o:st:rUe:; r::ed o

1.4 O que é PCR?

1.5 Por que a clonagem gênica e a PcR são tão importantes

1j!ìiTf \ìrt- 'o:sr,rrrelJ t:ril o

o interior de uma célula

uma colônia, ou clone,

& fita dupla, cada

?_:.rrli:l \ìt. 'o:struc-r; tred

iloriF:l \-H\ 'o:srruu3 e:rd :e

Uma porção muito

Figura 1.4 Como podemos selecionar

srorlPl xuv 'orsouug errd

1.5.2 Isolamento de genes Por PCR (?JHá

Figura 1.5 rmml

r.':::f \ì{Y 'r)-ì:tlu?-i:l ì'lr(l

'.r;r;r1tlr: rrerï ocìtt-ìJ 3af,1oÌu il3 Jnb ird o:;qos oqlg

ciona na biotecnologia, na medicina, na agricultura e na ciência forense.

Na Parte 1, abordamos os princípios básicos. A maioria dos nove capítulos é <

o capítulo 3 descreve como o DNA é purificado a partir de células vivas - tanto

:-j I '\ >: ri :ì'.lJ i,Ìl'!j o

urotrF:[ ruv 'o:srrurr; ert;d

o O 6., algumas contendo RP4

2;Nz Tamanho e número de cóPias

Tabela 2.1 Tamanhos de plasmídeos representativos

pUCS 2,1 1,8 E. coli

I lares entre si quanto a vários aspectos. A base da incompatibilidade não é bem-compreen-

'-r:::rluo: rrcd ocftü.r:l ã^Jl olu Jla inb rrd o :;qos

Célula doadora Célula receptora

rnunado pÌasmídeo que

2.2.2 Fagos lisogênicos

ri(\rIÊ:l \ìy 'o..r'.'u".t, L'r,'a

positivo, pois permitiu a

Figura 2.5 Molécula de DNA

específicas, codifica- Partícula do fago

1 O Íago Íixa-se à bactéria

pela retenção da molé-

ËoriFf l(ìlv 'o:souer3 r:ecí

Uma partícula do fago À

-{ï de ì" circulariza DNA de À

B Novas partículas do fago sãd

O fago M13 fixa-se a uma

Novos fagos Ml3

la e os genes que controlam a integração do profago no genoma do hospedeiro estão agrupa-

As Íormas linear e circular do DNA de ?u

Uma segunda característica de À, relevante para a construção de vetores de clonagem, é a con-

hospedeiro estão agruPa-