ROESY (rotating-frame NOE spectroscopy),31 una técnica específica para amplificar el efecto NOE

para tiempos de correlación correspondientes a masas moleculares de ese orden.

NOE: EFECTO OVERHAUSER

Fenómeno a nivel nuclear consistente en una interacción o acoplamiento (v. resonancia
magnética nuclear) que se da entre los núcleos de dos átomos a través del espacio y no por
medio de los enlaces en una molécula con un cierto grado de rigidez estructural.
Para que la interacción ocurra, es necesario que los núcleos se encuentren en una disposición
espacial adecuada (no pueden ser distantes); gracias a esto, ha sido posible determinar la
estereoquímica (v.) precisa y la orientación en el espacio de los sustituyentes de ciertas
moléculas con toda exactitud sin tener que recurrir a otras técnicas cuyo tiempo en el que se
desarrollan es considerablemente mayor, como el análisis por difracción de rayos X.

El NOE es útil para la espectroscopía de RMN para la asignación de estructuras. 1 En dicha

aplicación, el NOE difiere del acoplamiento espín-espín en que el NOE ocurre a través del
espacio, no a través de enlaces químicos. De este modo, átomos próximos en el espacio pueden
dar un NOE, mientras que el acoplamiento de espín solo es observado cuando los átomos están
conectados por 2-3 enlaces químicos. Las distancias interatómicas derivadas del NOE a
menudo ayudan a confirmar la estructura tridimensional de una molécula.

experimento 2-D que involucre el desacoplamiento del núcleo X (HMQC y HSQC) o un bloqueo de
giro (TOCSY y ROESY).

Un tipo de espectroscopia de RMN heteronuclear en la que se emplea una segunda dimensión de

frecuencia, basada en el efecto de mejora de Overhauser nuclear (NOE) en el que se observan
correlaciones entre los núcleos que están espacialmente próximos dentro de una molécula (\\ leq 6
\\ AA separados). El bloqueo de giro se emplea para garantizar que se vea la correlación entre los
giros, que están cerca en el espacio pero que tienen cero NOE. Esta técnica se usa para moléculas
cuyo régimen de volteo se encuentra en el límite de las respuestas NOE positivas y negativas.

El experimento 2D ROESY (espectroscoPY Overhauser de marco rotatorio) (también denominado

CAMELSPIN (experimento de relajación cruzada apropiado para minimoléculas emuladas por SPIN
bloqueado) ofrece una forma sencilla de obtener información NOE en una molécula mediante un
solo experimento y sin el conocimiento previo de Asignación espectral o estructura molecular. En el
experimento ROESY, las relajaciones cruzadas se llevan a cabo en el marco giratorio con
magnetización por giro y esto significa que el NOE en el plano transversal (ROE) es siempre positivo
(sin condición de anulación como en los experimentos de tipo NOESY) y, además, El intercambio
químico siempre se puede distinguir.

La secuencia de pulsos básica del experimento ROESY (84JACS811 y 85JMR207-63) sigue los mismos
principios de los experimentos homonucleares en 2D. Después de un pulso de excitación de 90º 1H,
la magnetización transversal evoluciona durante un período t1 de evolución variable libre. Durante
el tiempo de mezcla, se aplica un período de bloqueo de giro, generalmente una onda continua de
baja potencia, y, finalmente, las resonancias de protones se detectan como de costumbre. También
se propuso un experimento ROESY con filtro z (87JMR557-74).

Cuando un protón está saturado o invertido, los protones espaciales cercanos pueden experimentar
un aumento de la intensidad, que se denomina Efecto Overhauser Nuclear (NOE). El NOE es único
entre los métodos de RMN porque no depende de los acoplamientos J de enlace pasante, sino que
solo depende de la proximidad espacial entre los protones. En otras palabras, la fuerza del NOE
proporciona información sobre qué tan cerca están dos protones. Para moléculas pequeñas, se
puede observar un NOE entre protones que están separados hasta 4Å, mientras que el límite
superior para moléculas grandes es de aproximadamente 5Å.

The maximum possible NOE depends on the correlation time (or approximately the inverse of the
rate of molecular tumbling), which is in large part determined by the molecular weight and solvent
viscosity. Larger molecular weights and higher viscosities lead to larger correlation times. The NOE
is positive for small molecules (MW< 600), goes through zero for medium-sized molecules (MW
range 700 – 1200), and becomes negative for large molecules (MW>1200). (These MW ranges are
approximate only.) For medium sized molecules, the NOE may be theoretically zero. See the figure
below that is adapted from Newhaus and Williamson text. The ROESY experiment (rotating frame
NOE) is preferred for mediumsized molecules since the ROE is always positive.

Se puede usar un experimento ROESY para obtener información NOE para la molécula en este
régimen de masa molecular intermedia. Para moléculas de alto peso molecular, un experimento
NOESY y ROESY dará resultados muy similares, con la excepción de que los picos cruzados estarán
en fase con respecto a las diagonales para una NOESY y 180 grados fuera de fase con las diagonales
en el caso de un ROESY
1H-1H ROESY es útil para determinar qué señales surgen de los protones que están cerca uno del
otro en el espacio, incluso si no están unidos. Un espectro de ROESY produce correlaciones
espaciales a través de la relajación spin-spin. ROESY también detecta intercambio químico y
conformacional.

Utilizamos la secuencia de pulsos ROESY convencional (fig. 1). El tiempo de mezcla (tm) nunca debe
ser superior a 300 ms para no sobrecalentar la muestra o el espectrómetro, pero debe estar entre
la mitad de T1 y T2 si T2 no es demasiado largo para lograr una buena sensibilidad para la asignación
espectral. Para ROESY cuantitativo, se debe usar un tiempo de mezcla más corto. La atenuación del
bloqueo de giro debe ajustarse de modo que el pulso de 90 ° sea menor que 1 / (2SWH) (SWH es el
ancho espectral en Hz). Es típica una atenuación de 22 dB con un amplificador de 50 W que produce
un ancho de pulso de 90 ° de 110 μs. Sin embargo, para el ROESY cuantitativo que se utiliza para la
medición de la distancia y el tipo de cambio, se requieren tiempos de mezcla cortos y largos retrasos
de relajación. La intensidad de la señal ROE es proporcional a la sexta potencia inversa de la distancia
entre los átomos, I µ 1 / r6. La comparación de las integrales de pico cruzado en un ROESY
cuantitativo se utiliza como una medida de la distancia entre los protones. La sensibilidad de ROESY
aumenta al aumentar el tiempo de relajación transversal ya sea al elegir un solvente de baja
viscosidad como la acetona-d6 y / o eliminar el oxígeno disuelto de la muestra.
El espectro de ROESY como se muestra en la fig. 2 para etilbenceno (fig. 3) contiene una diagonal y
picos cruzados. La diagonal consiste en el espectro 1D. Las señales de picos cruzados que surgen de
los protones que están cerca en el espacio. Por convención, la diagonal es negativa y todas las
señales de ROE deseadas son positivas y de fase pura. En la práctica, algunos trazan la diagonal
negativa y otros la grafican. Aquí, la diagonal se grafica como positiva y las señales de ROE son
negativas. Las señales ROE son intrínsecamente más débiles que las señales NOE adquiridas en
condiciones ideales. Sin embargo, para moléculas de tamaño intermedio, la intensidad NOE puede
ser cercana a cero. Además, cuando el tiempo de relajación longitudinal es largo, el tiempo de
relajación transversal puede ser mucho más corto, lo que permite la adquisición de ROESY mucho
más rápido que de NOESY. Los artefactos de tipo TOCSY aparecen en correlaciones que también
están vinculadas. La señal TOCSY es pura fase y negativa por convención, pero representada como
positiva aquí. El etilbenceno (fig. 3) no muestra correlaciones ROE fuertes. La correlación entre H1
'y H2' a 2,65 y 1,24 ppm es principalmente del tipo TOCSY. Una correlación a través del espacio
mucho más débil aparece entre H1 'y H2 a 2,65 y 7,20 ppm. Las señales de intercambio también son
negativas por convención, pero parecen positivas a medida que las trazamos. Además, los artefactos
(señales no deseadas) también aparecen en el espectro como rayas verticales (interferencia y ruido
f1) ya lo largo de la 'V' invertida. Estos artefactos rara vez están en fase con las señales deseadas y
aparecen en ubicaciones específicas (FIG. 4).
Fase relativa de los picos cruzados

La fase de ROE, NOE y picos cruzados de intercambio químico pueden ser diferentes y se resumen
en la siguiente figura. En esta figura, se supone que los protones A y B tienen un NOE o ROE, mientras
que los protones C y D están experimentando un intercambio químico. Tenga en cuenta que el
comportamiento de la fase difiere para moléculas grandes y pequeñas. Para moléculas pequeñas,
los picos diagonales y los picos cruzados NOE tienen fase opuesta. Si la diagonal es negativa,
entonces los picos cruzados NOE serán positivos. Para moléculas grandes, los picos cruzados
diagonales y NOE tienen la misma fase. La fase de los picos cruzados, entonces, indica si la molécula
está en la región de la molécula grande o pequeña, lo que tiene implicaciones importantes para la
cuantificación, como se explica a continuación. Tenga en cuenta que el comportamiento de esta
fase se debe a la naturaleza positiva / negativa de NOE que se describe al comienzo de este folleto.

Los picos cruzados debido al intercambio químico, si está ocurriendo, tienen la misma fase que la
diagonal para las moléculas grandes y pequeñas tanto en ROESY como en NOESY.

En ROESY, los picos diagonales y los picos cruzados de ROE tienen una fase opuesta para todas las
moléculas, ya que el ROE es siempre positivo. Los picos cruzados de TOCSY son el principal artefacto
en los espectros de ROESY. Los picos de TOCSY tienen la misma fase que la diagonal y, por lo tanto,
son similares a los picos de intercambio. El TOCSY se produce entre giros que están acoplados en J
y que están relativamente cerca en el cambio químico. También ocurre con los picos que son
simétricos con respecto a o1p. Una posible complicación es el relevo de ROE a través de TOCSY que
resulta en falsos puntos cruzados de ROESY. Por ejemplo, los picos de metileno geminal a menudo
muestran picos cruzados de TOCSY. Supongamos que hay un tercer protón que debería tener un
ROE solo para uno de los protones geminales, pero no para su compañero. TOCSY puede transferir
el ROE a su compañero y puede parecer que el tercer protón tiene un ROE para ambos protones
geminales. Si se sospecha este tipo de procesos, se debe utilizar la secuencia EASY-ROESY.
TÉCNICA TOCSY: (Correlación total).

Esta técnica se basa en el mecanismo de relajación escalar.

Secuencia de pulsos:

El primer pulso de 90º pasa la magnetización longitudinal a magnetización transversal.

Pasado un tiempo T1 se aplica otro pulso de 90ºx que restaura parte de la magnetización
longitudinal.
El tercer pulso nos permite ver la variación de la intensidad de los distintos protones que provocan
la transferencia de polarización (se denomina pulso de medida).

TÉCNICA 1D TOCSY:

Es una variante muy importante de la anterior ya que requiere un tiempo de registro bajo.

El pulso de 90º que se da en esta variante, es selectivo, es decir, solo afecta a un determinado
protón. Al ser selectivo hace desaparecer la magnetización longitudinal de ese núcleo
transformándola a transversal.

Al hacer desaparecer la magnetización del núcleo irradiado, al estar interconectados los núcleos en
la molécula afectará a las intensidades de el resto.

- Si TM es corto: solo se transferirá entre los núcleos con acoplamiento grande respecto al
irradiado.

Por tanto, al ir aumentando el tiempo de mezcla se irá viendo como se transfiera la

magnetización entre los núcleos de una cadena.

1
H, 1H ROESY (Rotating-frame Overhauser Enhancement SpectroscopY)

Sistemas de espín acoplados dipolarmente (a través del espacio, en acoplamiento directo).

Identifica espines que evolucionan mediante relajación cruzada en condiciones de spin-lock
(espines fuertemente acoplados).

Determina en un sólo experimento todas las variaciones de señal por NOE que se pueden
producir en la molécula.
Tiene las misma aplicaciones que la secuencia NOESY y complementa a esta en los casos en
los que se anula el NOE (0c=1), lo cual suele ocurrir para moléculas con pesos moleculares
comprendidos entre 1000 y 2000 daltons.

Signo:

- Para dos espines acoplados directamente, las señales ROE son positivos.

El signo de las señales de correlación puede ser igual o distinto al de las señales de la diagonal
principal.

Signo Señales Diagonal Origen de Pico Cruce Signo Pico Cruce

ROE Directo Negativo

ROE Negativo Positivo (débil)

Intercambio Químico Positivo

Positiva
Tipo COSY Fase mezclada/Antifase

TOCSY Positivo

Falso ROE (TOCSYROE) Negativo

-Interferencias Posibles:

Interferencias en ROESY Solución

a) Señales tipo TOCSY Repetir los experimentos con diferente frecuencia

de referencia [las señales tipo TOCSY se verán
fuertemente alteradas)]
 Usar una baja potencia de radiofrecuencia (2-3
KHz)

Usar secuencias de pulsos de spin lock especiales

a) -(y-)n- con º

b) -(x--x)n-

b) Señales tipo COSY. Son debidas a que la secuencia spin-lock actuó como un pulso de 90º. Las

señales suelen ser poco intensas.

c) Atenuación de los picos de cruce por efecto off-resonance

9.7.1 La secuencia de ROESY 2D

La secuencia ROESY original y más simple (Fig. 9.44) tiene el período de mezcla definido por la

duración de un pulso de giro de rf de baja potencia y baja potencia durante el cual se desarrolla

el ROE. La magnetización no paralela al eje de bloqueo del giro se desfasa por la falta de

homogeneidad del campo rf (Fig. 9.45), por lo que el único ciclo de fase requerido es el de la

supresión del pico axial y la cuadridetección f1. También se han presentado variantes

seleccionadas por gradiente [14]. Para moléculas pequeñas y de tamaño mediano, la selección

de τm sigue a la presentada para NOESY con, típicamente, τm ≤ 600 ms, mientras que para

moléculas grandes en el límite de difusión-espín, los valores más cortos son más apropiados ya

que la tasa de crecimiento del ROE es el doble que el NOE (Sección 9.5). El espectro 2D mapea

las interacciones a través del espacio a través de picos cruzados que tienen una fase opuesta a

la diagonal.