PRACTICA No.2: Ley de Beer‐Lambert II1.

 
 Curvas de Calibración y Método Estadístico de Mínimos Cuadrados. 
 
Palabras Clave: Curva de Calibración, Blanco Analítico, Método de Mínimos Cuadrados, Coeficiente de Correlación Lineal. 
 
Introducción: 
La  gran  mayoría  de  métodos  instrumentales  requieren  una  calibración,  proceso  que 
relaciona  la  señal  analítica  medida  con  la  concentración  del  analito.  Los  tres  métodos  más 
frecuentemente utilizados son: la realización y el uso de una curva de calibración, el método de 
la adición estándar y el del patrón interno1.   
Para  realizar  el  Método  de  la  Curva  de  Calibración  se  procede  a  realizar  una  serie  de 
soluciones de concentración conocida de analito, los cuales se introducen en el instrumento y se 
registra la señal instrumental. Normalmente esta señal se corrige por medio de la señal de un 
Blanco Analítico en el que se establece el cero de absorbancia, este blanco contiene todos los 
componentes  de  la  matriz  del  análisis  (Ejemplo:  agua  destilada,  agua/etanol)  a  excepción  del 
analito que se desea medir. El blanco es preparado en el instante en que se preparan las demás 
muestras a determinarse ya debe imitar las condiciones de análisis a las que se cometen éstas 
últimas. 
 
Fundamento: 
La  absorción  de  la  luz  por  una  solución  diluida,  viene  dada  por  la  ley  de  Beer,  que 
relaciona la concentración de la fase absorbente con la radiación. La relación entre la absorción 
de la luz y el camino recorrido por ésta (o sea, el espesor de la cubeta, viene dado por las leyes 
de  Lambert.  La  fusión  de  estas  leyes  empíricas  nos  da  la  absorbancia  total  por  un  cuerpo, 
cuando interacciona con un haz  monocromado.  
Mediante un método que obedezca la ley de Beer‐Lambert se puede realizar un análisis 
cualitativo  de  cualquier  especie  en  solución,  conociendo  por  supuesto  la  longitud  de  onda  de 
máxima  absorbancia  del  analito,  esto  por  medio  de  la  determinación  de  la  absorbancia  en 
función  de  soluciones  de  concentración  conocida  a  través  de  la  elaboración  de  una  curva  de 
calibración que las relacione de manera proporcional y linealmente, para lo que se requiere de 
un método estadístico. El método estadístico clásico y que se adecua a las características para la 
realización de dicha actividad es el de los Mínimos Cuadrados en los que se grafica la ordenada 
(la  variable  independiente)  con  los  datos  de  la  respuesta  del  aparato  y    la  abscisa  (variable 
dependiente)  en  donde  se  coloca  la  concentración  o  el  tanto  por  ciento  del  analito,  lo  más 
habitual (y deseable) es que la gráfica se aproxime a una línea recta, sin embargo puede darse el 
caso  de  que  los  valores  no  coincidan  en  una  recta  debido  a  errores  aleatorios  del  proceso  de 
medida,  el  método  de  los  mínimos  cuadrados  nos  sirve  para  intentar  ajustar  la  “mejor”  línea 
recta  que  conecte  los  puntos.  La  ecuación  canónica  de  la  recta  se  expresa  matemáticamente 
como:  
Y = mx + b 
y  en  el  método  de  mínimos  cuadrados  estos  valores  se  obtienen  realizando  las  siguientes 
operaciones manuales: 
m =            y,       b =   

1
Elaborada por Jorge Reyes y William Quiroa.
  Donde n, indica el número de datos y ∑ las sumatorias correspondientes de los términos 
tabulados. Esto se simplifica con el uso de calculadoras científicas en cuyas opciones estadísticas 
se encuentra por lo regular la opción de calculo de regresión lineal, al igual que en programas de 
ordenador como Exel y otras hojas electrónicas. La viabilidad del método de curva de calibración 
queda establecida por el valor del cuadrado del Coeficiente de Correlación Lineal (r2), que debe 
ser superior a 0.998, para realizar un estudio cualitativo adecuado. 
 
 
Objetivos 
1. Elaborar  una  curva  de  calibración  para  relacionar  la  señal  analítica  medida  con  la 
concentración del analito. 
2. Conocer la importancia de la elaboración de un blanco para la realización de un análisis 
espectrofotométrico. 
3. Aplicar métodos estadísticos esenciales e inherentes a los métodos instrumentales. 
 
Procedimiento: 
• Elaboración de una Curva de Calibración. 
Preparación de Soluciones de Trabajo. 
1. Transvasar  los  100  mL  de  solución  coloreada  de  la  práctica  1  (o  lo  que  queda  de  las 
mismas) y transvasar cuantitativamente a un balón aforado de 250 mL, asignar un valor 
nominal de concentración arbitrario a cada una (por ejemplo: 0.05 N). [Solución Madre] 
2. De esta solución madre tomar 4 alícuotas de 1, 2, 3, 5, 10 respectivamente y diluirlas en 
balones  de  100  mL  (o  del  volumen  que  asigne  el  instructor)  con  agua  destilada.  
[Soluciones Estándar] 
3. Determinar las concentraciones de estos estándares mediante la ecuación C1V1 = C2V2. 
 
Proceso de Calibración. 
1. Ejecutar  la  calibración  del  Spectronic  20  empleando  el  procedimiento  descrito  en  la 
sección de Técnicas Complementarias. 
 
Resultados. 
1. Graficar  respuesta  del  aparato  (Absorbancia  promedio)  en  eje  Y,  contra  unidades  de 
concentración del colorante en el eje X. 
2. Ingresar los valores a una calculadora de calculo de regresión lineal para determinar la 
pendiente m y el intercepto en eje x: b según la ecuación canónica de la recta: y = mx + 
b.  Recuerde  borrar  las  lecturas  estadísticas  de  cálculos  pasados  de  la  memoria  de  su 
calculadora antes de ingresar nuevos datos. 
3. Calcular  el  cuadrado  del  coeficiente  de  regresión  lineal  [r2],  el  valor  deberá  estar 
comprendido entre 0.990 a 0.999.  El valor no puede ser mayor a 1. Recordar que esto 
indica que la señal o respuesta del  instrumento puede asociarse  de un 99 a 100% con la 
concentración del analito. 
 
Análisis de Resultados.  
¿La Ley de Beer‐Lambert se demuestra con el experimento que se realizó?, ¿Se logró determinar 
la  concentración  de  la  muestra  desconocida  por  medio  del  método?,  ¿Según  el  coeficiente  de 
correlación  determinado  para  el  análisis  cree  que  es  confiable  el  valor  de  concentración  de 
muestra  desconocida,  y  si  no  se  cree  así  por  que  razón  existe  cierto  error?  ¿Por  qué  es 
importante la ley de Beer? 
Los  métodos  instrumentales  incluyen  procesos  estadísticos,  ¿A  la  hora  de  medir  el  valor  de  la 
absorbancia de los estándares y la muestra desconocida cree que es suficiente llevar a cabo solo 
una  vez  la  medición….?  ¿Podría  medirse  2  o  tres  veces  y  realizar  un  promedio  de  absorbancia 
para incrementar la reproducibilidad o confiabilidad del método? 
 
Cuestionario. 
1. ¿Si en lugar del color asignado en el laboratorio se  hubiese tenido que trabajar con una 
solución de otro color como un color secundario como el violeta, sería necesario hacer 
un barrido para determinar el máximo de absorbancia? 
2. ¿Si la solución stock fuese incolora cree que se puede llevar a cabo una determinación 
en el Spectronic 20? 
3. ¿Si la solución stock estuviera coloreada pero al mismo tiempo extremadamente turbia 
como afectaría esto el análisis? 
 
 
4. ¿Qué  es  un  cromóforo  y  como  se  aplica  en  análisis  cuantitativos  por  la  técnica 
espectrofotométrica? 
 
Bibliografía. 
1. Skoog, D. A., Holler, F.J. & T. A. Nieman (2001) Principios de Análisis Instrumental. 5ta 
Edición, Editorial McGraw‐Hill, México. 1028 pp. 
2. American Public Health (APH) et. al.  Métodos Estándar para el Exámen de Aguas y 
Aguas de Desecho, Incluyendo Sedimentos Bentables y Lodos. (1963) 11 Ed. Trad. 
I.Q.Pedro Caballero. Editorial Interamericana S. A. México, 609 pp. 
 
 
Internet: Para más información puede visitar: 
1. Beer’s Law. Autor: Sheffield Hallam University. Última Actualización: Desconocida. 
[http://teaching.shu.ac.uk/hwb/chemistry/tutorials/molspec/beers1.htm] 
2. Beer‐Labmbert Calculator. Autor: Chang Bioscience. Última Actualización: 2004. 
[http://www.changbioscience.com/calculator/BeerLambert.html] 
TM
3. Use of the Spectronic 20  at a Fixed Wavelegth. Autor: Departament of Chemistry of University 
of Wisconsin‐Madison. Última actualización: 1997. 
[http://inst.sfcc.edu/chemscape/catofp/measurea/concentr/spec20/spec20b.htm] 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Estándar  Concentración  Medida de %T  %T  Absorbancia  Absorbancia 
Promedio  Promedio 
           
1     
   
           
2     
   
           
3     
   
           
4     
   
           
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