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BIOQUÍMICA 2014
Arlindo Ugulino Netto.

ELETROFORESE E PROTEÍNAS PLASMÁTICAS

O plasma humano contém mais de 500 proteínas identificáveis. Entre essas, estão presentes proteínas
carreadoras, anticorpos, enzimas, inibidores enzimáticos, fatores da coagulação e proteínas com outras funções. A
avaliação das concentrações de proteínas séricas e as proporções das diferentes frações de proteína têm considerável
valor no diagnóstico em desordens agudas e crônicas.
A eletroforese de proteínas (EFP) no soro é uma técnica simples para separar as proteínas do soro. É o teste de
triagem mais utilizado para investigação de anormalidades das proteínas séricas. Em condições normais, são separadas
cinco bandas do soro: albumina, alfa-1, alfa-2, beta e gamaglobulinas. Eventualmente, pode ser observada a
presença da pré-albumina. O reconhecimento de paraproteínas, normalmente encontradas nas gamopatias benignas ou
malignas é o uso diagnóstico mais importante para a EFP. Quando alteradas, as bandas apresentam-se com padrões
conhecidos para importantes patologias.
A banda da albumina é relativamente homogênea, porém as demais são compostas por uma mistura de
diferentes proteínas. Informações adicionais podem ser encontradas nos títulos referentes às diferentes proteínas que
compõem as bandas identificadas pela eletroforese como: albumina, alfa-1-antitripsina, alfa-1-glicoproteína ácida,
haptoglobina, ceruroplasmina, entre outras.

METODOLOGIA

MATERIAL E REAGENTES
 Fonte de Energia: pode ser a mesma cuba, sendo dotada de dois eletrodos: um positivo e outro negativo. As
proteínas vão correr no sentido NEGATIVO  POSITIVO
 Cuba e ponte para eletroforese: aparelho onde será depositada parte da solução tampão e sobre ela, põe-se a
ponte com a fita de acetato celulose sobre ela.
 Fitas de acetato de celulose: inicialmente, passa 15min numa solução tampão (pH 9,5 ± 0,2) e depois
conservada em metanol à 40% para não ressecar. O tratamento em fita de acetato serve para retirar a condição
de isoeletricidade entre as proteínas, para que elas obtenham cargas para que seja possível a sua migração na
fita.
 Aplicador: aparelho especialmente elaborado para colher pequena parte da amostra do soro para ser aplicada
na fita.
 Espectrofotômetro ou Densitômetro
 Tampão veronal (pH 8,5)
 Corante: Ponceau´S
 Descorante: ácido acético 5%
 Eluente: ácido acético 80%
 Desidatrante: metanol
 Solução Transparentizadora: 84 mL de metano
1 mL de Glicerol
15 mL de ácido acético glacial

TÉCNICA
1. Colocar cerca de 100 mL do tampão em cada compartimento da cuba.
2. Retirar as fitas de acetato de celulose da solução conservante (metanol 40%) e colocar na solução tampão por
cerca de 20 minutos.
3. Retirar o excesso do tampão, enxugando-a entre duas folhas de papel de filtro e adaptá-la na ponte de
eletroforese.
4. Aplicar a amostra na fita e aguardar 5 minutos, para completa absorção da amostra. Ligar a fonte na corrente
elétrica durante 45 minutos.
5. Desligar a fonte e colocar em solução corante (Ponceau´S) durante 5 minutos.
6. Transferir a fita para a solução descorante (ácido acético a 5%), lavando várias vezes, para tirar o excesso do
corante.
7. A quantificação das frações pode ser feito pelo método da eluição (espectrofotômetro) ou transparentização
(densitometria).
8. Eluição:
a) Identificar 6 tubos : Branco, albumina, alfa-1-globulina, alfa-2-globulina, β-globulina e gama-globulinas.

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b) Colocar 2,0 mL de solução eluente (ácido acético 80%), em cada tubo, com exceção do tubo
correspondente a albumina que será 4,0 mL (após a leitura da absorbância, multiplicar por 2).
c) Cortar as frações separadamente e colocar nos tubos correspondentes. Agitar até a completa
dissolução. Para o branco, cortar uma parte da fita onde não haja fração protéica.
d) Efetuar a leitura no filtro verde (520nm).

CÁLCULO DO TEOR DAS FRAÇÕES PROTÉICAS (ELUIÇÃO)

1. Determinar o teor de proteínas totais da amostra em estudo (biureto).
2. Determinar os valores relativos (percentual de cada fração), dividindo a D.O de cada fração pela soma das D.O
de todas as frações e multiplicar por 100.
∑ D.O → 100
D.O → X

Ex: Cálculo da albumina

0,780 → 100
0,400 → X= 51,3%

3. Determinar o valor absoluto, usando uma regra de três:

PT: proteína total (biureto) = 7,0 g/dL
PT → 100
X → % da fração

Ex: Cálculo da albumina

7,0 → 100
X → 51,3%
X = 3,59 g/dL
Quantificação das Frações Protéicas
Fração ABSORBÂNCIA Valor Relativo g/dL
Albumina
Alfa-1-globulina
Alfa-2-globulina
Beta-globulina
Gama-globulina
∑ D.O

4. Concentração da amostra:
Concentração da Amostra (g /dL) = Absorbância do Teste x [PADRÃO]
Absorbância do Padrão

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PROTEÍNAS PLASMÁTICAS
• Albumina: sintetizada pelo fígado
• Imunoglobulinas: produzidas pelos plasmócitos da medula óssea como parte de uma resposta imune.
• Valor de Referência:
 Proteína total: 6,0 a 8,0 g/dL
 Albumina: 3,5 a 5,5 g/dL
 Globulinas: 1,5 a 2,5 g/dL
• Posições dos valores na fita de acetato de celulose com relação aos pólos dos eletrodos:
FITA DE ACETATO DE CELULOSE: (POLO -) Gama β α2 α1 albumina (POLO +)

1
OBS : O aumento das gamaglobulinas significa uma
gamopatia, que pode ser do tipo policlonal (aumento
relacionado a vários tipos de imunoglobulinas,
apresenta um pico difuso) ou monoclonal (aumento
relacionado a um tipo de imunoglobulina,
característica do mieloma múltiplo e do calazar, e
apresenta um pico fino na eletroforese).
OBS²: Na cirrose hepática, devido ao aumento de
gama-β-imunoglobulinas, não há uma separação
nítida dessas duas frações (banda β larga).
OBS³: Na síndrome nefrótica há uma diminuição
nas taxas de albumina (devido a sua perda nos
glomérulos) e aumento de alfa-globulinas.
4
OBS : Quando α1 e α2 estão aumentadas, tem-se uma fase aguda de uma doença. Quando α1 e α2 estão elevadas
associadas ao aumento das gamaglobulinas, tem-se uma fase de cronicidade.

ALBUMINA
É a proteína mais abundante no plasma, respondendo por cerca de 60% da concentração total de proteínas. É
sintetizada exclusivamente pelo fígado, aparecendo primeiro no citoplasma dos hepatócitos como um precursor
chamado pró-albumina. Possui um papel muito importante em diversas funções do organismo, como o transporte de
diferentes substâncias e em especial a manutenção da pressão oncótica.
Foram descritas mais de 20 variantes genéticas de albumina. O tipo mais comum é chamado albumina A. Essas
albuminas variantes podem resultar em uma faixa de albumina larga na eletroforese de proteína de soro ou podem dar
origem a duas faixas distintas (bisalbuminemia). Nenhuma dessas variantes foi ainda associada a manifestações
patológicas. Na rara síndrome de ausência congênita de albumina, os pacientes podem apresentar edema moderado,
mas podem poupar as consequências hemodinâmicas com a utilização de mecanismos compensatórios, como o
aumento das globulinas do plasma, que assumem algumas das funções da albumina. O problema bioquímico principal
nesses pacientes é uma alteração no metabolismo lipídico, com aumento de colesterol, fosfolipídios e outras
lipoproteínas.
A albumina tem carga elétrica negativa; ao ser colocada no eletrodo negativo da cuba de eletroforese, ela é a
proteína que mais “corre”, afastando-se do polo negativo para chegar ao positivo.

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FUNÇÕES DA ALBUMINA
 Manutenção da pressão osmótica;
 Transporte de hormônios tireoideanos;
 Transporte de hormônios lipossolúveis;
 Transporte de ácidos graxos livres;
 Transporte de bilirrubina não conjugada;
 Transporte de fármacos e drogas;
 Aumento da libido;
 União competitiva com ions de cálcio;
 Controle do pH.

Seu excesso ocasiona diversas doenças, como problemas

renais e hepáticos. Além disso, o consumo excessivo de albumina
provoca ganho de peso, sendo que um aumento em massa muscular
sem acúmulo de gorduras e também é responsável pelo fator anti-
catabólico ou seja bloqueia a perda de músculos.

CORRELAÇÕES CLÍNICAS
• Hipoalbuminemia: níveis de albumina abaixo de 3,5 mg/dL  resulta na formação de edema.
• Hiperalbuminemia:
 Condição rara, podendo ocorrer na desidratação
 Uso prolongado do torniquete na coleta de sangue venoso
• Analbuninemia: edema moderado, acredita-se que as concentrações das outras proteínas plasmáticas
aumentam e compensam a deficiência relativa da albumina.

CAUSAS DA DEFICIÊNCIA DA ALBUMINA

 Síntese diminuída: Desnutrição, má absorção ou hepatopatia crônica.
 Distribuição anormal ou diluição: A hipoabuminemia pode ser induzida pela superidratação ou pelo aumento da
permeabilidade capilar (septicemia).
 Excreção anormal ou degradação: Síndrome nefrótica, enteropatias, queimaduras hemorragias.

PRÉ-ALBUMINA (20-45 mg/dL)

Sintetizada pelo fígado, tem como função conhecida ser carreadora da tiroxina e desempenhar um papel
significativo no metabolismo da vitamina A. Forma um complexo com o retinol, que se liga posteriormente à vitamina A.
Devido à sua baixa concentração no soro, com frequência deixa-se de observá-la na eletroforese de proteínas séricas.
Entretanto, consegue ultrapassar a barreira hematoencefálica e pode também ser sintetizada por células do plexo
coroide, o que explica seu aparecimento frequente na eletroforese do líquor cefalorraquidiano.
Os níveis de pré-albumina estão significativamente diminuídos em diversas patologias hepáticas e aumentados
em pacientes em uso de esteroides, como também na falência renal e durante a gravidez.
Por apresentar uma meia-vida muito curta e ser bastante sensível às variações do aporte alimentar e ao estado
funcional hepático, é considerado um bom marcador do estado nutricional.
• Função: transporte de hormônio tiroxina (T4)
• Significado clínico: Reduzido processos inflamatórios agudos e nas hepatopatias

ALFA-1-GLOBULINAS
A alfa-1-antitripsina responde por cerca de 90% das proteínas que correm na faixa das alfa-1-globulinas. A
deficiência da alfa-1-antitripsina está associada ao enfisema pulmonar e à cirrose hepática. Só é detectável pela
eletroforese quando homozigótica; os estados heterozigóticos só podem ser identificados por técnicas imunoenzimáticas
que também são utilizadas para confirmação das deficiências homozigóticas.
É uma das proteínas de fase aguda e pode ser encontrada em outros fluidos orgânicos, como lágrimas, sêmen,
bile e líquido amniótico. Nos 10% restantes, estão a alfa-1-glicoproteína ácida, a alfafetoproteína e outras proteínas. Os
níveis se elevam nas doenças inflamatórias agudas e crônicas, neoplasias, após traumas ou cirurgias e durante a
gravidez ou estrogenioterapia. Nos hepatocarcinomas, a elevação pode acontecer pelo aumento da alfafetoproteína.
 Alfa-1-glicoproteína ácida (65%): elevada nos processos inflamatórios agudos. Nunca chega ao pico que a
albumina chega pois não tem afinidade a corantes proteicos.
 Alfa Lipoproteína (HDL)
 Alfa-fetoproteína: origem placentária e fetal.

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ALFA-2-GLOBULINAS
Incluem a haptoglobina, a alfa-2-macroglobulina e a ceruloplasmina. Raramente encontram-se alterações nessa
banda eletroforética, já que a diminuição de um componente é compensada pelos demais mesmo dentro da faixa de
referência.
Níveis elevados de alfa-2-macroglobulina associados à diminuição da albumina acontecem na síndrome
nefrótica. Os níveis de haptoglobina e de ceruloplasmina podem apresentar-se elevados em numerosas situações que
levam à reação de fase aguda. Os níveis de haptoglobina apresentam-se diminuídos nas hepatopatias graves, na
anemia megaloblástica, nas situações de aumento da hemoglobina livre, como na hemólise de eritrócitos ou na
reabsorção de grandes hematomas e na terapia com estrogênios e corticóides. Os níveis de ceruloplasmina aumen-tam
na estrogenioterapia e se encontram diminuídos na doença de Wilson, na desnutrição, na síndrome nefrótica e nas
enteropatias com perda de proteína.
 Alfa-2-macroglobulina
 Função: transporte hormonal e inibidor das enzimas proteolíticas.
 Siginificado clínico: Aumenta na síndrome nefrótica.
 Haptoglobina (50%).
 Alfa-1-antiquimiotripsina (elevada nos processos inflamatórios agudos).
 Alfa-2-macroglubulina:
 Função: transporte hormonal e inibidor das enzimas proteolíticas
 Significado clínico: aumentado na síndrome nefrótica, hemólises, hepatite, neoplasias e cirrose.
 Haptoglobina:
 Função: formar complexo proteico com a hemoglobina livre plasmática.
 Significado clínico: aumentado nos processos inflamatórios agudos e diminuído nas doenças
hemolíticas.

BETA-GLOBULINAS
Composta pelas beta-lipoproteínas (LDL), transferrina, C3 e outros componentes do complemento, beta-2-
microglobulina e antitrombina III. A redução dessa banda não é frequente. A anemia por deficiência de ferro leva ao
aumento da transferrina. O hipotireoidismo, a cirrose biliar, as nefroses e alguns casos de diabetes mellitus podem se
evidenciar pelo aumento de colesterol e consequente aumento das beta-lipoproteínas (LDL). A beta-globulina está
frequentemente elevada nos casos de icterícia obstrutiva e menos frequentemente em alguns casos de hepatite. Quase
sempre, está elevada nos casos de cirrose hepática. Nesses casos, pode aparecer junto com sobreposição ou fusão das
bandas beta e gama pelo aumento de IgA, que ocorre nas cirroses hepáticas, infecções de pele ou trato respiratório e na
artrite reumatoide. Elevações causadas provavelmente pelo aumento dos componentes do complemento podem ocorrer
em hipertensão maligna, doença de Cushing, poliarterite nodosa e carcinomas.
 Transferrina:
o Função: transporte de ferro plasmático
o Significado clínico: aumentado na deficiência de ferro e reduzido nas hepatopatias crônicas
 Complemento C3:
o Significado clínico: aumentado nos processos inflamatórios agudos
 Beta-lipoproteína (LDL)
o Função: transporte do colesterol

GAMAGLOBULINAS
Composta pelas imunoglobulinas, predominantemente pela IgG. As imunoglobulinas A,M,D,E e proteína C
reativa encontram-se na área de junção beta-gama. A ausência ou a diminuição da banda gama indica
imunodeficiências congênitas ou adquiridas. O aumento dessa banda sugere o aumento policlonal das gamaglobulinas
associadas a doenças inflamatórias crônicas, reações imunes, doenças hepáticas ou neoplasias disseminadas.
As principais características das gamaglobulinas são:
 Migram desde a zona beta;
 Deficiência no uso da quimioterapia;
 Aumentado nos processos crônicos, doenças hepáticas e mieloma.

Bandas oligoclonais podem eventualmente ser observadas em infecções virais crônicas, em algumas infecções
bacterianas como as pneumonias por pneumococos e as hepatites crônicas ativas.
Tuberculose, sarcoidose, linfogranuloma venéreo e sífilis terciária são doenças crônicas que levam ao aumento
dessa banda. Artrite reumatoide, lúpus eritematoso sistêmico e outras colagenoses podem apresentar níveis normais a
acentuadamente aumentados, dependendo da fase de atividade da doença. Níveis aumentados também são
encontrados em linfomas malignos, doença de Hodgkin e leucemia linfocítica crônica. Tipicamente, a macroglobulinemia
de Waldenström e o mieloma múltiplo exibem um pico homogêneo, que pode ou não resultar do aumento total da área
gama.
As hepatopatias cursam frequentemente com aumento da banda das gamaglobulinas. Na hepatite, verifica-se
um aumento das beta e gamaglobulinas com redução da albumina. Nas cirroses, o padrão mais sugestivo consiste na
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elevação da gamaglobulina de base ampla, juntamente com a fusão da beta e da gamaglobulina, sem a individualização
dos picos da chamada ponte beta-gama. Apenas cerca de 20% dos cirróticos apresentam a fusão completa, e cerca de
3% apresentam a fusão parcial.
As características particulares de cada imunoglobulina são:

IgG (75%) IgA IgM

 Peso molecular: 155.000  Peso molecular: 170.000 Daltons  Peso molecular: 950.000
Daltons (155 KDa) (170 KDa) Daltons (950 KDa)
 Concentração: 700-1450 mg/dL  Concentração: 90-450 mg/dL  Concentração:
 Imunoglobulina mais  Representa 7-15% das Ig  H: 55-220 mg/dL
abundante: representa 75% das plamáticas  M: 45-180 mg/dL
imunoglobulinas circulantes  Meia-vida: 6 dias  Contribui com 5-10% das
 Protege os espaços teciduais e  Abundante nas secreções imunoglobulinas
atravessa livremente a placenta  Barreira antisséptica, protege as  Meia-vida de 5 dias
vida-média de 22 dias. superfícies mucosas  É a primeira imunoglobulina
 Entre a 18a e 20a de gestação,  Importante componente do sintetizada em resposta a um
a IgG é transportada colostro (primeira barreira antígeno.
ativamente através da placenta, imunológica)
fornecendo deste modo, a  Promove a fagocitose
imunidade humoral para o feto  Induz a degradação eosinofílica
e o recém-nascido, antes da  Valor de referência: 80-385
maturação do sistema imune. mg/dL
 Valor de referência: 700-1.500
mg/dL

GAMOPATIAS
 Tipo policlonal: forma não específica em uma grande variedade de infecções: aumento difuso das várias
imunoglobulinas em toda região das gama globulinas observada na eletroforese de proteínas. Ex: Hepatopatia
crônica, cirrose hepática (beta larga: fusão da beta-gamaglobulinas), hepatite crônica.

 Monoclonal:
 Denominada de Paraproteína
 Caracteriza-se pela elevação de uma determinada imunoglobulina, formando um pico estreito na fração
gamaglobulinas.
 Proliferação de um só tipo de clone de plasmócitos que vão sintetizar um único tipo de imunoglobulina.
 Ex: mieloma múltiplo, macroglobulinemia de Waldenström, calazar.

MIELOMA MÚLTIPLO
 O mieloma múltiplo (MM) É uma doença dos plasmócitos (Discrasia Plasmocitária Maligna). Esses plasmócitos
se proliferam de forma desordenada, e passam a produzir imunoglobulinas e citocinas (responsáveis por boa
parte das manifestações clínicas características da doença: anemia e ativação dos osteoclastos e inibição dos
osteoblastos, que promovem as lesões ósseas).
 Epidemiologia: Homens, negros, >50-60 anos
 Características:
 Redução da produção da série branca e da série vermelha e de formação de plaquetas
 Metastase óssea, apresentando dor óssea
 Diminuição da produção de imunoglobulinas normais
 Consequências:anemia e susceptibilidade à infecção
 Manifestações clínicas:
 Anemia de doença crônica
 Lesões ósseas líticas
 Hipercalcemia (aumento de cálcio no sangue)
 Insuficiência renal
 Em 50% dos casos de mieloma as cadeias leves são produzidas em maior quantidade do que as pesadas
 Em 15% dos casos; apenas cadeias leves
 Tratamento: diz-se que MM não tem cura; o que se faz, é terapia para aumentar a sobrevida.
 Drogas supressoras da medula óssea
 Plasmaférese (substituição do plasma do paciente por plasma normal, com retenção dos seus próprios
componentes celulares)

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EXEMPLOS

1, 3, 5, 8 - Padrão Normal 1, 4, 5, 8 - Padrão Normal

2, 7 - Gamopatia Policlonal 2 - Gamopatia Policlonal
6 – Gamopatia Monoclonal (IgA)
3 - Gamopatia Monoclonal (IgA)
6 - Gamopatia Monoclonal (IgG)