3752 Catepsina L PDF

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO CARLOS
CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E DE TECNOLOGIA

DEPARTAMENTO DE QUÍMICA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA
“ESTUDO DE PRODUTOS NATURAIS E DERIVADOS SINTÉTICOS

BUSCANDO INIBIDORES SELETIVOS DAS CATEPSINAS L E V”
Emerson Finco Marques*
Dissertação apresentada como parte

dos requisitos para obtenção do título
de MESTRE EM QUÍMICA, área de
concentração: QUÍMICA ORGÂNICA.
Orientador: Dr. Paulo Cezar Vieira

*bolsista FAPESP
São Carlos - SP
2011
Ficha catalográfica elaborada pelo DePT da
Biblioteca Comunitária da UFSCar
Marques, Emerson Finco.

M357ep Estudo de produtos naturais e derivados sintéticos
buscando inibidores seletivos das catepsinas L e V /
Emerson Finco Marques. -- São Carlos : UFSCar, 2011.
135 f.
Dissertação (Mestrado) -- Universidade Federal de São

Carlos, 2011.
1. Produtos naturais. 2. Catepsinas lisossomais. 3.

Inibidores enzimáticos. 4. Gênero Zanthoxylum. 5.
Alcalóides. I. Título.
CDD: 547.3 (20a)

De tudo ficaram três coisas:
A certeza de que estamos começando,

A certeza de que é preciso continuar e
A certeza de que podemos
ser interrompidos antes de terminar
Fazer da interrupção um caminho novo,

Fazer da queda um passo de dança,
Do medo uma escola,
Do sonho uma ponte,
Da procura um encontro,
E assim terá valido a pena existir!
Fernando Sabino
ii

Dedico este trabalho...
Aos meus pais, que venceram na vida juntos com

todas as dificuldades e fizeram com que eu chegasse até
aqui.
Às minhas irmãs Solange e Aline, que sempre
estiveram ao meu lado.
iii

Agradecimentos
Aos meus pais, Sérgio e Mária, e minhas irmãs Solange e Aline, que sempre
estiveram do meu lado e me ajudaram a chegar até aqui..
Ao Professor Dr. Paulo Cezar Vieira pela amizade, pela orientação e ensinamentos
transmitidos nestes últimos anos e acima de tudo pela confiança depositada em
mim, por ter sido extremamente aberto a todas as minhas idéias e empreitadas.
Ao Professor João Batista Fernandes por ter sido o primeiro a me aceitar para
trabalhar no laboratório de Produtos Naturais e devido a isto ter me tornado
apaixonado pela área.
À professora Dra. Maria Fátima Graças Fernandes da Silva pelos ensinamentos e

por todo o suporte desprendido.
Aos demais professores do DQ-UFSCar pelos ensinamentos e contribuição na

minha formação, em especial à professora Dra. Quézia Bezerra Cass e ao professor
Dr. Edson Rodrigues Filho.
À professora Dra. Arlene Corrêa e seus alunos pela colaboração e por cederem os
compostos sintéticos e ao professor Dr. Rafael Guido.
À professora Dra. Richele Priscila Severino por ter me acompanhado desde a

iniciação, pela amizade, pelos ensinamentos incalculáveis, mostrando que não
existem barreiras para nossos ideais.
Aos meus amigos da Turma de 2004 de Química Licenciatura , Thales, Barbie,

Cabelo, Tássia, Lilica, Cyber, Fabrício, Pantera, Puttini, por todo o suporte
psicológico, amizade, desabafos, companheirismo e por me tornarem uma pessoa
melhor e fazerem parte dos melhores anos da minha vida.
iv

Aos meus amigos do Bloco 30, em especial ao Luiz Fernando Gorup, ao Boniek
Gontijo Vaz e a Camila Palombo.
Aos meus colegas e amigos conquistados nestes quase sete anos dentro do PN, em
especial as grandes amigas e pessoas Dra. Tatiane Regina Albarici, Dra. Ana Paula
Terezan e Dra. Simone Simote.
A Ariani, pela competência e auxilio neste trabalho.
Ao professor Massuo Jorge Kato e Professor Paolo Di Mascio do Instituto de

química da USP, por terem me apoiado na finalização deste trabalho e a todos que
me ajudaram e deram suporte no IQ-USP.
A Giovana Cássia Freitas e ao Thiago Sevilhano pela amizade, pelo compareirismo

e por todo apoio desprendido na finalização deste trabalho.
Aos funcionários do DQ e técnicos, em especial a Luciana, ao Waldir e ao Ademir.
À vida, pelos caminhos traçados e alcançados, pelas oportunidades e aprendizados

imutáveis.
A todos que direta ou indiretamente contribuíram na realização deste trabalho.
A FAPESP pela bolsa concedida.

v

ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
µg micro-grama
µL micro-litro
µM micro-molar
0
C Graus Celsius
Ø Diâmetro
δ Deslocamento químico em partes por milhão (ppm)
λem Comprimento de onde de emissão
λex Comprimento de onde de excitação
ACN Acetonitrila
Asn Asparagina
Bn Grupo benzila
Cat catepsina
CCDA Cromatografia em camada delgada analítica
CG-EM Cromatografia Gasosa acoplada a Espectrometria de Massas
CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
COSY Correlation spectroscopy
Cys Cisteína
d dupleto
DAD Detector de Conjunto de Fotodiodos
DCM diclorometano
dd duplo dupleto
DMSO Dimetilsulfóxido
DTE Ditioeritreitol
E Enzima
E-64 L-3-carboxi-trans-2,3-epoxipropionil-leucilamido(4-guanino)butano
EDTA Ácido etilenodiaminotetracético
EI Complexo enzima-inibidor
EM Espectrometria de Massas
EP Complexo enzima-produto
ES Complexo enzima-substrato
ESI Complexo enzima- substrato-inibidor
eV Elétron-volt
vi

FDA Food and Drug Administration
h Altura
His Histidina
HMBC Heterocuclear Multiple Quantum Correlation
HSQC Heterocuclear Single Quantum Correlation
HTS High throughput screening
Hz Hertz
IC50 Potência inibitória
IE Impacto Eletrônico
J Constante de acoplamento
Ki Constante de dissociação do complexo enzima-inibidor
Km Constante de Michaelis-Menten
M Molar (mol/L)
m Multipleto
m/z Relação massa/carga
MCA 7-amino-4-metilcumarina
MeOD Metanol deuterado
MHz Mega hertz
NCEs New Chemical Entities
P Produto
PDB Protein Data Base
pH Potencial hidrogeniônico
RMN Ressonância Magnética Nuclear
RMN 13C Ressonância Magnética Nuclear de Carbono 13
RMN 1H Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio
SAR Relação Estrutura Atividade
s singleto
SPE Extração em fase sólida
t tripleto
USA United State of America
UV-vis Região do Ultra Violeta e Visível
Vmax Velocidade máxima de reação
Z-FR-MCA Carbobenzoxi-fenilalanina-arginina-7-amino-4-metilcumarina
DHP Didridrotestosterona
vii

S Seletividade
HIV Human immunodeficiency virus
HMG-CoA hidroxi-3-methyl-glutaril-CoA
NADPH Nicotinamida adenina dinucleótido fosfato
viii

LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Fármacos que atuam por mecanismo inibição enzimática .......................................... 8

Tabela 2. Expressão, localização e atividade fisiológica das catepsinas .................................. 10
Tabela 3. Espécies do gênero Zanthoxylum, partes vegetais e localização. ........................... 27
Tabela 4. Extratos das diferentes espécies do gênero Zanthoxylum ........................................ 29
Tabela 5. Condições experimentais utilizadas para as catepsinas. ........................................... 35
Tabela 6. Valores de inibição dos extratos de Zanthoxylum (250 µg) frente a catepsina L. .. 44
Tabela 7. Concentrações das diluições a partir da solução estoque dos extratos de ZAFD . 45
Tabela 8. Valores de inibição das diluições dos extratos de Zanthoxylum frente a catepsina L
(250; 100; 50; 25; 10; 0,5; 0,1;0,01; 0,001 µg / poço) ................................................................... 45
Tabela 9. Valores de inibição frente a catepsina L para diferentes ensaios ............................. 47
Tabela 10. Valores de inibição para as frações de ZAFD (250 µg) ............................................ 48
Tabela 11. Dados de RMN 1H das cumarinas 2, 3 e 5. ................................................................ 69
Tabela 12. Dados de RMN 1H das cumarinas 5 e 6. .................................................................... 71
Tabela 13. Dados de RMN 13C das cumarinas 5 e 6. ................................................................... 77
Tabela 14. Dados de RMN 1H dos alcalóides 7 e 8 ...................................................................... 84
Tabela 15. Dados de RMN 13C do alcalóide 9. .............................................................................. 89
Tabela 16. Dados de RMN de 1H e de 13C da substância 10 ...................................................... 92
Tabela 17. Valores de inibição a 25 µM para os compostos isolados de Z. acuminatum frente
a catepsina L e V. ............................................................................................................................... 94
Tabela 18. Valores de potência e de seletividade dos alcalóides acridônicos isolados frente
as catepsinas L e V. ........................................................................................................................... 96
Tabela 19. Valores de potência e de seletividade dos ácidos N-aril antranílicos frente às
catepsinas L e V. .............................................................................................................................. 101
Tabela 20. Valores de potência e de seletividade dos alcalóides acridônicos sintéticos frente
a catepsinca L e V. ........................................................................................................................... 105
Tabela 21. Valores de potência e de seletividade dos alcalóides sintéticos 4-quinolínicos-2-
substituídos sintéticos frente a catepsina L e V. .......................................................................... 107
Tabela 22. Valores de dissociação do complexo EI (Ki). ........................................................... 120
ix

LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Estruturas de alguns dos Produtos Naturais utilizados como fármacos. .................... 3

Figura 2. Diferentes fontes terapêuticas (N = 1184). ...................................................................... 4
Figura 3. Substâncias isoladas do gênero Zanthoxylum ................................................................ 6
Figura 4. Mecanismo de hidrólise de peptídeos pelas cisteínos peptidases. ........................... 15
Figura 5. Estrutura do substrato comercial Z-FR-MCA ................................................................ 16
Figura 6. Equilíbrio cinético verificado entre enzima e substrato ................................................ 17
Figura 7. Esquema clássico de inibidor competitivo ..................................................................... 18
Figura 8. Esquema clássico de inibidor não-competitivo ............................................................. 18
Figura 9. Esquema clássico de inibidor incompetitivo. ................................................................. 19
Figura 10. Esquema do sistema de extração em cartucho. ........................................................ 30
Figura 11. Cromatogramas e análises por CCD das frações obtidas de ZAFD 5-8 ................ 33
Figura 12. Cromatograma com eluição gradiente da fração SPE_1_ZAFD_2. Condições
cromatográficas: gradiente linear de 5% a 100% de ACN (solvente B) em 60 minutos; vazão
1mL/min; λ = 334 nm com detecção em DAD; Vinj=20 µL; [ ] = 0,2 mg/mL ............................... 34
Figura 13. Cromatograma com eluição isocrático da fração SPE_1_ZAFD_2. Condições
cromatográficas: gradiente linear de 5% a 100% de ACN (solvente B) em 60 minutos; vazão
1mL/min; λ = 334 nm com detecção em DAD; Vinj=20 µL; [ ] = 0,2 mg/mL ............................... 34
Figura 14. Esquema geral dos ensaios enzimáticos com substrato fluorogênico. .................. 36
Figura 15. Gráfico ilustrativo de determinação dos valores de potência (IC50). ....................... 37
Figura 16. Controle da Atividade Catalítica da Catepsina L. ....................................................... 43
Figura 17. Gráfico de comparação para diferentes ensaios do extrato CH2Cl2 de folhas de Z.
acuminatum ......................................................................................................................................... 48
Figura 18. Cromatograma em eluição gradiente do extrato bruto de ZAFD. Condições
cromatográficas: Usando gradiente linear de 5% a 100% de ACN (solvente B) em 60
minutos, vazão 1 mL/min. λ DAD, Vinj= 20μL, [ ] = 10 mg/mL. .................................................. 50
Figura 19. Cromatograma em eluição gradiente do extrato bruto de ZAFM. Condições
cromatográficas: Usando gradiente linear de 5% a 100% de ACN (solvente B) em 60
minutos, vazão 1 mL/min. λ DAD, Vinj= 20μL, [ ] = 10 mg/mL. .................................................. 51
Figura 20. Ampliação do espectro de RMN 1H do extrato CH3OH de Z. acuminatum (DMSO,
200 MHz). ............................................................................................................................................ 52
Figura 21. Cromatograma referente a cumarina 5. Condições cromatográficas: Usando
gradiente linear de 5% a 100% de ACN (solvente B) em 60 minutos, vazão 1 mL/min. λ
DAD, Vinj= 20μL, [ ] = 0,01 mg/mL. ................................................................................................. 52
Figura 22. Cromatograma referente ao alcalóide 7. Condições cromatográficas: Usando
DAD, Vinj= 20μL, [ ] = 0,01 mg/mL .................................................................................................. 53
Figura 23. Cromatograma referente ao alcalóide 8. Condições cromatográficas: Usando
DAD, Vinj= 20μL, [ ] = 0,01 mg/mL .................................................................................................. 53
Figura 24. Espectro de RMN de 1H da substância 1 (200 MHz, CDCl3) ................................... 58
Figura 25. Espectro de CG-EM da substância 1 (IE em 70 eV). ................................................ 58
Figura 26. Esquema geral para a rota biosintética das cumarinas............................................. 59
x

Figura 27. Espectro de RMN de 1H da cumarina 2 (200 MHz, MEOD) ..................................... 61
Figura 28. Espectro de massas da cumarina 2 (ESI q-TOF). ..................................................... 61
Figura 30. Ampliação do espectro de RMN de 1H da substância 3 (400 MHz, CDCl3) ........... 63
Figura 31. Espectro de massas da cumarina 3 (ESI q-TOF) ...................................................... 63
Figura 33. Espectro de COSY 1H-1H da substância 4 (400 MHz, CDCl3) ................................. 64
Figura 34. Mapa de contorno do experimento de HSQC da substância 4 (400 MHz, CDCl3)
............................................................................................................................................................... 65
Figura 35. Mapa de contorno do experimento de HMBC da substância 4 (400 MHz, CDCl3)
............................................................................................................................................................... 66
Figura 36. Espectro de massas da substância 4 (ESI TOF) ....................................................... 67
Figura 36. Espectro de massas da substância 4 (ESI TOF) ....................................................... 68
Figura 37. Espectro de RMN 1H da substância 5 (300 MHz, CDCl3) ......................................... 70
Figura 39. Espectro de RMN 13C da substância 5 (300 MHz, CDCl3) ........................................ 72
Figura 40. Espectro RMN COSY 1H-1H da substância 5 (300 MHz, CDCl3) ............................. 73
Figura 41. Mapa de contorno do experimento RMN HSQC da substância 5 (300 MHz,
CDCl3) ................................................................................................................................................... 74
Figura 42. Mapa de contorno do experimento de HMBC da substância 5 (300 MHz, CDCl3) 75
Figura 43. Espectro de massas [M+Na] da substância 5 e EM/EM 30 eV (ESI q-TOF) ......... 76
Figura 44. Rearranjo de McLafferty para a geração do fragmneto m/z 163. ............................ 76
Figura 45. Espectro de EM/EM do íon [M+Na] de razão m/z de 337 (ESI-q-TOF) .................. 76
Figura 53. Espectro de massas da substância 7 (ESI Q-TOF) ................................................... 84
Figura 55. Espectro de RMN de 1H da substância 9 (300 MHz, MeOD) ................................... 85
Figura 56. Espectro de COSY 1H-1H da substância 9 (300 MHz, MeOD)................................. 86
Figura 57. Mapa de correlações de HSQC da substância 9 (300 MHz, MeOD). ..................... 87
Figura 58. Mapa de correlações de HMBC da substância 9 (300 MHz, MeOD). ..................... 87
Figura 60. Espectro de RMN de 1H da substância 10 (200 MHz, CDCl3). ................................ 90
Figura 61. Mapa de correlações de HSQC da substância 10 (400 MHz, CDCl3). ................... 91
Figura 62. Mapa de correlações de HMBC da substância 10 (400 MHz, CDCl3). ................... 91
Figura 63. Espectro de massas da substância 10 com respectivas variações de energia de
colisão (ESI Q-TOF – 15 / 25 / 35 / 45 eV) ..................................................................................... 93
Figura 64. Gráfico de IC50 da substância 5 frente a catepsina L. ............................................... 95
Figura 65. Gráfico de IC50 da substância 5 frente a catepsina V. ............................................... 95
Figura 66. Estrutura geral para o ácido N-aril antranílico .......................................................... 100
Figura 67. Gráfico de Lineawaver-Burk do composto PN_AC_01 frente à catepsina L. ...... 112
Figura 68. Gráfico de Lineawaver-Burk do composto PN_AC_03 frente à catepsina L. ...... 112
Figura 69. Gráfico de Lineawaver-Burk do composto AC_01 frente a catepsina L. .............. 113
Figura 70. Gráfico de Lineawaver-Burk do composto AC_05 frente a catepsina L. .............. 113
Figura 71. Gráfico de Lineawaver-Burk do composto PN_AC_01 frente a catepsina V. ...... 114
Figura 72. Gráfico de Lineawaver-Burk do composto PN_AC_03 frente a catepsina V. ...... 114
xi

Figura 73. Gráfico de Lineawaver-Burk do composto AC_01 frente a catepsina V. ............. 115
Figura 74. Gráfico de Lineawaver-Burk do composto AC_05 frente a catepsina V. ............. 115
Figura 75. Gráfico de Lineawaver-Burk do composto A_10 frente a catepsina L. ................. 117
Figura 76. Gráfico de Lineawaver-Burk do composto A_11 frente a catepsina L. ................. 117
Figura 77. Gráfico de Lineawaver-Burk do composto A_10 frente a catepsina V. ................ 118
Figura 78. Gráfico de Lineawaver-Burk do composto A_11 frente a catepsina V. ................ 118
Figura 80. Gráfico padrão para determinação do valor de Ki .................................................... 120
Figura 81. Modo de interação proposto por docagem molecular com o programa FlexX para
o substância AC_05 frente a catepsina L ..................................................................................... 123
Figura 82. Modo de interação proposto por docagem molecular com o programa FlexX para
o substância AC_05 frente a catepsina V ..................................................................................... 123
xii

LISTA DE FLUXOGRAMAS
Fluxograma 1. Metodologia para a preparação dos extratos ...................................................... 28

Fluxograma 2. Fracionamento da fração ZAFD em eluição gradiente ...................................... 31
Fluxograma 3. Fracionamento da fração ZAFD 8 – 9 por SPE................................................... 32
xiii

RESUMO
ESTUDO DE PRODUTOS NATURAIS E DERIVADOS SINTÉTICOS BUSCANDO
INIBIDORES ESPECÍFICOS DAS CATEPSINAS L e V. Este trabalho descreve a
busca de metabólitos secundários bioativos em espécies de plantas do gênero
Zanthoxylum e a partir de derivados sintéticos visando inibidores específicos das
catepsinas L e V.
Os produtos naturais estão envolvidos em cerca de 50% de todos os fármacos
comercializados. As catepsinas representam uma classe de enzimas que têm função
primária de degradar aleatoriamente proteínas nos lisossomos e também estão
envolvidas em diferentes patologias, tais como aterosclerose, artrite reumatóide,
osteoporose e diferentes tipos de cânceres. Neste trabalho foi realizado o
monitoramento dos extratos do gênero Zanthoxylum por ensaios fluorimétricos e
cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). Dentre as espécies avaliadas, os
extratos mais promissores foram os extratos metanólico e diclorometânico e de
Zanthoxylum acuminatum, sendo este último selecionado para isolamento. A
metodologia cromatográfica levou ao isolamento de um triterpeno; o lupeol (1), as
cumarinas; a umbeliferona (2), heradenol (3), nordentatina (4), anisocumarina
(5),derivado do 6´, 7´-epoxi-7-geraniloxicumarina (6); alcalóides do tipo cantinônicos;
5-metoxicantin-6-ona (7), 4,5-dimetoxicantin-6-ona (8); um alcalóide β-carbonílico; 7-
hidroxi-1-etil-β-carbolina (9); e um do tipo acridônico; arborinina (10). Todos foram
ensaiados na concentração de 25 µM e a cumarina 5 apresentou inibição superior a
50%, mostrando maior ativade e seletivade frente a catepsina L. O valor de potência
(IC50) deste composto foi 30 µM para a catepsina L e de 102 µM para a catepsina V.
Além disso, foram determinados os valores de potência, seletividade e mecanismo
de ação para alcalóides acridônicos isolados de Swinglea glutinosa, ácidos N-aril
antranílicos, alcalóides acridônicos sintéticos e uma série de alcalóides 4-
quinolínicos-2-substituídos. O composto considerado mais promissor foi o alcalóide
acridônico AC_05, com valor IC50 de 0,5 µM e Ki 0,18 µM. Além disto, este
composto AC_05 apresentou-se como um inibidor competitivo frente as duas
catepsinas, estando de acordo com o modelo de interação proposto por modelagem
molecular.
xiv

ABSTRACT
STUDY OF NATURAL PRODUCTS AND SYNTHETIC DERIVATIVES SEARCHING
SPECIFIC INHIBITORS OF CATHEPSINS L AND V.
The present work describes the search of bioactive secondary metabolites in plant
species of genus Zanthoxylum and synthetic derivatives seeking specific inhibitors of
cathepsins L and V.
The natural products are involved in approximately 50% of all drugs marketed.
Cathepsins represent a class of enzymes that has the primary function of randomly
degrade proteins at lysosomes, but are also involved in different pathologies, such
as, atherosclerosis, rheumatoid arthritis, osteoporosis and various cancers. This work
was carried out monitoring Zanthoxylum extracts by fluorimetric assays and by High-
performance liquid chromatography (HPLC). Among the species studied, the most
promising extracts were methanol and dichloromethane extracts of Zanthoxylum
acuminatum, the latter being selected for isolation. The chromatographic
methodology afforded the isolation of a triterpene: lupeol (1), the coumarins
umbelliferone (2), heradenol (3), nordentatin (4), anisocoumarin (5), derivated of
6´,7´-epoxy-7-geranyloxycoumarin (6); canthinonic alkaloids 5-methoxycantin-6-one
(7), 4,5-dimehoxycantin-6-ona (8); β-carboline alkaloid; 7-hydroxi-1-ethyl-β-carboline
(9); and acridone alkaloid arborinine (10). All were tested at concentration of 25 mM
and coumarin 5 inhibited over 50%, showing more activity and selective against
cathepsin L. The value potency (IC50) of this compound was 30 µM for cathepsin L
and 102 µM for cathepsin V. Furthermore, were determined the potency values,
selectivity and mechanism of action acridones alkaloids isolated from Swinglea
glutinosa, N-aryl anthranilic acids, synthetic acridone alkaloids and a series of
alkaloids 4-quinoline-2-substituted. The most promising compound was the alkaloid
acridone AC_05 with a IC50 of 0.5 µM and Ki of 0.18 µM. Moreover, the compound
AC_05 presented as a competitive inhibitor against both cathepsins, which is
consistent with the interaction model proposed by molecular modeling.
xv

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO 2
1.1 Produtos naturais como precursores de fármacos 2
1.2 Estratégias para a descoberta de candidatos a fármacos 5
1.3 Gênero Zanthoxylum 5
1.4 Enzimas como alvo terapêutico. 7
1.5 Cisteíno peptidades lisossomais. 9
1.5.1 Catepsinas como alvo terapêutico 11
1.5.2 Catepsinas estudadas 13
1.5.3 Características estruturais e mecanismos de ação das catepsinas 15
1.6 Substratos fluorogênicos 16
1.7 Inibidores enzimáticos 17
1.7.1 Modo de ligação e mecanismo de ação 17
2 OBJETIVO 23
2.1 Objetivo geral 23
2.2 Objetivos específicos 23
3 Metodologia 25
3.1 Materiais 25
3.1.1 Solventes 25
3.1.2 Suporte para cromatografia 25
3.1.3 Reagentes 25
3.1.4 Enzimas 26
3.2 Equipamentos 26
3.3 Coleta e Identificação do Material Vegetal 27
3.4 Preparação dos Extratos 28
3.5 Metodologia para extração em fase sólida 29
3.6 Metodologia para CLAE Analítico 31
3.7 Metodologia para isolamento dos metabólitos. 31
3.7.1 Fracionamento do extrato ZAFD 31
3.7.2 Fracionamento da fração ZAFD 5 – 8 32
3.7.3 Isolamento e purificação da cumarina da fração SPE_1_ZAFD_2 34
3.8 Metodologia dos ensaios enzimáticos 35
3.8.1 Metodologia e condições gerais dos ensaios cinéticos em placa de Elisa 35
xvi

3.8.2 Triagem de inibidores frente a catepsina L e V 36
3.8.3 Determinação da potência dos inibidores (IC50) 37
3.8.4 Determinação da seletividade (S) 38
3.8.5 Determinação do Mecanismo de Ação 38
3.8.6 Modelagem Molecular dos inibidores frente a catepsina L e V 39
4 RESULTADOS E DISCUSSÕES 41
4.1 Atividade enzimática 43
4.1.1 Biomotoramento dos extratos de Zanthoxylum 43
4.2 Perfil cromatográfico dos extratos brutos/frações 49
4.3 Substâncias identificadas 54
4.4 Determinação estrutural 57
4.4.1 Triterpeno 57
4.4.2 Cumarinas 59
4.4.2 Alcalóides 81
4.5 Estudo de produtos naturais na busca por inibidores 94
4.5.1 Produtos naturais isolados de Zanthoxylum acuminatum 94
4.5.2 Produtos naturais isolados de Swinglea glutinosa 95
4.6 Estudo de produtos sintéticos na busca de inibidores 99
4.6.1 Produtos sintéticos: ácidos N-aril antranílicos 99
4.6.2 Produtos sintéticos: alcalóides acridônicos 104
4.6.3 Produtos sintéticos: alcalóides 4-quinolínicos-2-substituídos 107
4.7 Determinação do mecanismo de inibição 110
4.8 Estudos de docagem modelagem e modelos de interação. 121
5 Conclusões, Perspectivas e Considerações finais 124
6 Referências 127
xvii

In
ntroodu
uçã
ão

1. INTRODUÇÃO
1.1 Produtos naturais como precursores de fármacos
Desde os primórdios da civilização humana faz-se o uso de substâncias

naturais, provenientes de diferentes fontes, com finalidade terapêutica. Os relatos
mais antigos são datados de 3500 a 5000 anos a.C., descritos em placas de argila
da Mesopotâmia e também em papiros do antigo Egito.
Nos dias modernos os produtos naturais ainda são a grande fonte de
agentes terapêuticos e inovação para o tratamento de diversas doenças infecciosas
causadas por bactérias e fungos, cânceres, distúrbios lipídicos e imunomoduladores
(CLARD & WALSH, 2004), sendo vistos como alvo importante e uma das maiores
fontes de novas drogas pois (STICHER, 2008):
Apresentam alta diversidade estrutural e biológica;

Agregam substâncias com massa relativa <2000 Da;
Podem ser facilmente absorvidos e metabolizados pelo organismo
humano;
Alta diversidade estrutural biológica
Diferentes produtos naturais foram descobertos e utilizados no tratamento

de várias doenças. Na Figura 1 são apresentadas algumas estruturas de origem
natural, isoladas de bactérias e plantas e utilizadas como fármacos: estaurosporina
(1), empregada no mecanismo de inibição de proteínas quinases no sitio de ATP,
efedrina (2), usada como adrenérgico, morfina (3), utilizada no tratamento
hipnoanalgésico, Taxol (4) empregado nos tratamentos de câncer e vancomicina (5)
usada no tratamento de infecções de bactérias gran-positivas nas quais é verificada
resistência a penicilina, esta também de origem natural (CLARDY & WALSH, 2004;
SCHENKEL et al., 1999).
2

H
N
O
HO
OH
H
N O
N N
O N
H
HO
CH3O
NHCH3
(1) (2) OH (3)

OH
NH2
O
O OH
HO
O
O
O OH O Cl
O
O O
H
O NH O
HO OH
Cl
O O O
O H H
O O O N N NHCH3
OH O N N N
OH H H H
O HN CO2H O O O
O
NH2
(4) OH (5)
HO OH
Figura 1. Estruturas de alguns dos Produtos Naturais utilizados como fármacos.
De acordo com dados do USA - FDA (Food and Drug Administration) do total
de Novas Substâncias Ativas (NASs – New Active Substances) registradas nos
últimos 25 anos (período de 01/1981 a 06/2006), cerca de 5% são produtos naturais
e aproximadamente 28% são espécies químicas derivadas de produtos naturais com
modificações sintéticas (NEWMAN & CRAGG, 2007). Na Figura 2 é possível
observar que, em geral, os produtos naturais estão envolvidos direta ou
indiretamente em aproximadamente 50% dos fármacos aprovados pela FDA.
3

5%
14% PN
23%
10% DPN
S
4%
S*
10%
SPN
30% V
B
Figura 2. Diferentes fontes terapêuticas (N = 1184).

PN: produtos naturais; DPN: derivado de produto natural; S: sintéticos; (S*) produtos naturais
mimitizados (apresentam influência dos produtos naturais ou são protótipos com derivatizações
sintéticas, grupo farmacofórico ou imitação da natureza); SPN: sintético baseado em produto natural;
V: vacinas; B: Biológicos (peptídios ou proteínas isolados de organismos/linhagens de células ou
produzidos biotecnologicamente). FONTE: (NEWMAN & CRAGG, 2007).
Um dos grandes desafios atuais para os grupos de pesquisa em produtos

naturais distribuídos pelo mundo é a descoberta de substâncias que sejam bioativas,
bem como seus respectivos análogos (LEE et. al. 2010). Assim, as plantas
representam um alvo de estudo importante na busca destas novas substâncias,
sendo consideradas uma fonte promissora de diversidade molecular para inibidores
enzimáticos seletivos e de síntese para inúmeros compostos bioativos.
A exploração racional da biodiversidade brasileira, estimada em cerca de
22% das espécies vegetais do planeta (FERRO et. al. 2006) (a maior existente no
mundo) torna-se essencial para a vida humana e desenvolvimento econômico do
Brasil; seu estudo sustentável e consciente, através de uma abordagem
interdisciplinar química e biológica, faz-se instrumento importante na busca de novos
fármacos ou substâncias que sirvam como seus protótipos.
4

1.2 Estratégias para a descoberta de candidatos a fármacos
A descoberta de novos fármacos é um caminho que desprende longo tempo

de pesquisa e altos investimentos financeiros. No decorrer da história este caminho
passou por várias etapas, com a descoberta de fármacos tais como penicilina e
benzodiazepínicos e programas de busca aleatória de substâncias sintetizadas que
apresentassem atividade biológica. (SILVERMAM, 1992).
Os programas de busca aleatória de triagem de substâncias são baseados na
metodologia HTS (High Throughput Screening), que utiliza grandes bibliotecas de
substâncias químicas avaliadas frente a um alvo pré determinado.
A grande meta dos programas HTS não é a identificação de novas drogas
mas sim determinar pontos iniciais para a química medicinal, ou seja, novas
substâncias químicas que possam servir de parâmetro para o desenvolvimento de
um novo fármaco. Além disto, busca ensaiar grande diversidade de compostos e
assim verificar relações entre estrutura química e atividade biológica.
A metodologia pautada na utilização de grandes bibliotecas de substâncias
alvos apresenta-se como a principal metodologia para a descoberta de novas
moléculas bioativas. O escalonamento desta metodologia, utilizando bancos de
dados de extratos de plantas, fungos, ou qualquer outro alvo relevante, assim como
bibliotecas de substâncias isoladas e não somente sintéticas passa a ser um desafio
para os programas HTS; isto representa caminhos alternativos para a descoberta de
novas espécies químicas bioativas.
1.3 Gênero Zanthoxylum

A família Rutaceae é largamente distribuída pelas regiões dos trópicos
úmidos e temperados, reunindo cerca de 1.600 espécies de árvores e arbustos em
150 gêneros. Na região neotropical ocorrem 52 gêneros; destes, 33 no Brasil, com
centro de dispersão na Amazônia e na Mata Atlântica (SOUZA et al., 1999). O
gênero Zanthoxylum pertence à família Rutaceae e é constituído por cerca de 250
espécies de árvores e arbustos (ARRUDA et al., 1992).
5

A sinonímia do gênero Zanthoxylum, com o táxon mais próximo Fagara, foi
por muito tempo causa de controvérsia. Zanthoxylum foi mantido separado do
gênero Fagara com base nas estruturas de seus periantos e, posteriormente,
observou-se que três espécies apresentavam morfologia de transição entre os dois
gêneros. Morfologicamente e anatomicamente, Zanthoxylum é considerado
originado através da redução do duplo perianto de Fagara; assim, Fagara foi
considerada sub-gênero de Zanthoxylum.
Estudos realizados por WATERMAN mostraram que a distribuição de
alcalóides e cumarinas nos dois gêneros reforçam a combinação em um único
gênero. (ARRUDA et. al., 1992), o qual é responsável pela produção de diferentes
classes de metabólitos secundários. Investigações fitoquímicas de diferentes
espécies revelaram a presença de diferentes classes de alcalóides, com destaque
para os cantinônicos (FERREIRA et al., 2002 e FERREIRA et al., 2007) e
benzofenantridínicos (TANE et al., 2005; HU et al., 2007; FERNANDES et al., 2009),
cumarinas (CHEN et.al. 2005; SMITH et al.,2005), flavonóides (FERNANDES et al.,
2009), polifenóis (KUSUDA et. al. 2006), terpenos, (GUEDES et al., 2008) e lignanas
(FACUNDO et.al. 2005; MBAZE et al., 2009) (Figura 3).
OH
HO O N
OH N
OH OH O
OH OCH 3
HO O
OH HO
OH
OH
O O O
O
O
HO
O
N
O HO CH 3O
O N
OCH3 O
CH 3O O O
OCH 3
Figura 3. Substâncias isoladas do gênero Zanthoxylum
6

Desta forma, o emprego do gênero Zanthoxylum é muito promissor, pois são
descritos na literatura diversas atividades biológicas, tais como atividade
antichagásica, tripanocida, antiplasmódica, anti-HIV, antiinflamatória, anti-helmíntica
(MOCECELLI et al., 2009), bactericida (FARNSWORTH et al., 1976), fungicida
(AHMAD et al., 2003), leishmanicida (FERREIRA et al., 2002), anti-reumática,
antileucêmica (LEWIS, 1983) e inseticida (MACRAE et. al., 1984).
A medicina moderna utiliza diferentes espécies de Zanthoxylum para o
tratamento de inúmeras doenças tais como problemas cardiovasculares, tuberculose
e malária, entre outras (FACUNDO et. al., 2005). Também são encontradas patentes
da utilização de extratos com espécies do gênero para o tratamento de doenças
cerebrovasculares como mal de Parkinson e aterosclerose (Patent Number:
CN101502585) e um gel indicado para a prevenção de doenças da pele (Patent
Number: CN101385800-A).
1.4 Enzimas como alvo terapêutico.

Enzimas são macromoléculas responsáveis por catalisar reações biológicas
essenciais para a manutenção da vida. Dentre todas as biomoléculas existentes, são
as mais notáveis em função de alta especificidade e poder catalítico. Processos nos
quais há problemas de regulação da atividade catalítica enzimática levam a estados
patológicos; em alguns casos, a mutação de genes responsáveis pela produção de
enzimas específicas pode levar a um nível anormal de concentração ou acarretar um
aumento da atividade catalítica enzimática; ambos processos resultam em
patologias específicas. (COPELAND, 2005).
A inibição seletiva de enzimas em organismos infecciosos, como vírus,
bactérias e parasitas multicelulares, representam intervenção terapêutica eficiente
que pode levar a cura de doenças infecciosas. Esta estratégia é bem representada
na medicina moderna, com uma significante parcela de fármacos antivirais,
antibióticos e antiparasitários em uso clínico nos quais propriedade e eficiência
terapêutica processam-se por inibição enzimática (Tabela 1).

7

Enzimas são alvos atrativos na busca para intervenção farmacológica frente à
inúmeras doenças, cerca de 50% dos medicamentos atuais agem sobre um
mecanismo de inibição enzimático.
Tabela 1. Fármacos que atuam por mecanismo inibição enzimática

COMPOSTO ENZIMA ALVO USO CLÍNICO
Acetazolamida Anidrase Carbônica Glaucoma
Amphenavir, indinavir, HIV protease AIDS
nelfinavir, ritonavir, saquinavir
Alopurinol Xantina oxidase Gota
Argatroban Trombina Doença do Coração
Aspirina Ciclooxigenase Inflamação, dor, febre
Amoxilina Proteínas ligadas a parede Infecção bacteriana
celular
Captropil, enalapril Enzima conversora da Hipertensão
angiotensina
Carbidopa Dopa descarboxilase Doença de Parkinson´s
CI-1040, PD0325901 MAP quinase quinase Câncer
Clavulanato β-lactamase Resistência Bactericida
Digoxina Sódio e Potássio ATPase Doença do Coração
Efavirenz, nevirapina Transcriptase reversa AIDS
Epristerida, finasterida, Esteróide 5α-redutase Hiperplasia benigna da
dutasterida próstata, calvície masculina
Fluorouracil Timidilato sintase Câncer
Leflunomida Diidroorotato desidrogenase Inflamação
Lovastatina e similares HMG-CoA redutase Redução do Colesterol
Nitecapona Catecol-O-metiltranferase Doença de Parkinson
Norfloxacina DNA girase Infecções do trato urinário
Omeprazol H+, K+ ATPase Úlceras pepticas
PALA Aspartato transcarbamilase Câncer
Sorbinol Aldose redutase Diabete retinopática
Trimetoprima Diidrofolato redutase Infecção bactericida
bacteriano
Viagra, Levitra Fosforodiesterase Disfunção erétil
(Fonte: COPELAND, 2005).
8

1.5 Cisteíno peptidades lisossomais.

Cisteíno peptidases lisossomais são encontradas em diferentes formas de
vida tais como fungos, vírus, bactérias, plantas, invertebrados, peixes e mamíferos;
formam uma numerosa e importante família de enzimas do tipo papaína (TURK &
GUNCAR, 2003).
As peptidases, também conhecidas como proteases, representam uma larga
família de enzimas responsáveis pela clivagem de ligações peptídicas, estão
envolvidas na regulação de diferentes processos biológicos e são classificadas em
endopeptidases e exopeptidases, de acordo com o tipo de aminoácido presente em
seu respectivo sítio catalítico: serino, cisteíno, aspartil, metalo e treonina peptidases
e (MOHAMED & SLOANE, 2006).
Nos mamíferos, uma das mais importantes cisteíno peptidases são as
catepsinas lisossomais. O termo catepsina foi introduzido em 1929 por Willstätter e
Bamann para diferenciar uma protease que era ativa em pH ácido, da protease da
pepsina porém, atualmente, este termo descreve proteases intermoleculares que
encontram-se localizadas em lisossomos com valor de pH fracamente ácido (OTTO
et al., 1997). Todas as cisteíno peptidases lisossomais de mamíferos são
conhecidas como catepsinas, embora o contrário não seja verdadeiro (PALERMO &
JOICE, 2007).
As catepsinas estão distribuídas entre as famílias das aspartil endopeptidades
(catepsinas D e E), serino peptidases (catepsinas A e G) e cisteíno peptidases (B, C,
F, H, K, L, O, S, V, W e X) (TURK et al., 2002 e BROMME et al., 2002). Atualmente,
após o seqüenciamento do genoma humano, foram catalogadas 11 catepsinas: B,
C, F, H, K, L, O, S, V, W e X (CATALDO & NIXON, 1990). Estas enzimas são
geralmente conhecidas como enzimas que degradam aleatoriamente proteínas
presentes nos lisossomos, estão envolvidas em processos fisiológicos seletivamente
controlados e possuem funções associadas a sua restrita localização tecidual, como
descrito na Erro! Fonte de referência não encontrada..
Entretanto, recentemente foi demonstrado que algumas dessas enzimas não
se encontram estritamente nos lisossomos e podem se acumular em diferentes
tecidos e células (MOHAMED & SLOANE, 2006), o que leva a processos
patológicos como progressão de tumores (PALERMO & JOYCE, 2007),
9

aterosclerose (HEENEMAN et al., 2007), doença de Alzheimer (CATALDO &
NIXON, 1990), artrite reumatóide e osteoporose (YASUDA et al., 2004).
Tabela 2. Expressão, localização e atividade fisiológica das catepsinas

Nome Expressão Função
Lisossomal, extracelular;
processamento proteolítico
Catepsina B Ubíquo
de APP na invasão de
tumores e metástase
Lisossomal; ativação de
Catepsina C Ubíquo serino proteases, fator XIII de
neuramidases
Coração; músculos do Lisossomal: papel na invasão
Catepsina F esqueleto; cérebro; de tumores e metástase
testículos; ovário;
Cérebro; fígado; rins; Lisossomal; degradação da
Catepsina H
amígdala cadeia invariante (Ii)
Predominantemente em Lisossomal, extracelular;
óssos (osteoclastos); reabsorção óssea;
Catepsina K
presente na maioria dos degradação de ECM e
tecidos epiteliais fibrinogênio
Lisossomal, extracelular;
nuclear (truncada);
Catepsina L Ubíquo apresentação de antígeno,
degradação Ii, regulação do
ciclo celular.
Catepsina O Amplamente expressa Lisossomal; proteína turnover
Macrófagos alveolares, Lisossomal, extracelular; Ii,

Catepsina S testículos, células epiteliais, degradação, artereogenese,
células-T, baço AP, angiogenese
Predominantemente em
tímus; testículos; presente
Lisossomal; AP, degradação
Catepsina V no cérebro; córnea epitelial;
Ii
células N, pele, baço e
células-T citotóxicas
Resposta imune, regulação
Baço, células-T citotóxicas;
Catepsina W da atividade citotóxica das
células NK
células T
Amplamente expressa;
Lisossomal; não-proteolíticos
Catepsina X diversos tumores primários e
na adesão celular
células cancerígenas
10

1.5.1 Catepsinas como alvo terapêutico
Nos últimos anos, diferentes funções fisiológicas específicas foram

descobertas e descritas para diferentes catepsinas.; além disso, estas enzimas
foram associadas a diferentes processos patológicos, despertando grande interesse
para o entendimento real destes processos, assim como, grande interesse pelas
indústrias farmacêuticas (KUESTER, et al., 2008).
As catepsinas têm sido associadas à progressão de câncer em diferentes
tecidos, como relatado nos últimos anos em diversos artigos, principalmente para o
caso da catepsina B: em alguns casos de câncer, mudanças na expressão ou na
atividade das catepsinas ajudam na determinação de um diagnóstico ou prognóstico
desta doença. Também foi verificado aumento da expressão da catepsina B,
atividade e localização em tumores humanos e em ratos de laboratório
(BERDOWSKA, 2004).
Estudos com células tumorais demonstram que a regulação biossintética dos
níveis de produção de uma ou mais catepsinas leva a super regulação, associação
com a membrana e secreção de uma catepsina específica. Extensos estudos de
expressão de catepsinas em diferentes tipos de câncer, incluindo melanoma e
carcinomas de pulmão, cólon, próstata e mama revelaram um aumento da
expressão das catepsinas B, L ou D em humanos (VASILJEVA, et al., 2007). A
localização da catepsina B e L aumenta, bem como altera o nível de gravidade dos
tumores humanos (KUESTER, et al., 2008).
As catepsinas também estão envolvidas em diferentes processos
inflamatórios: catepsinas D, B e L são importantes para a degradação intracelular de
proteínas e o aumento nos valores da expressão destas está relacionado a doenças
inflamatórias como problemas de periodontia, artrite reumatóide, aterosclerose,
pancreatite e gastrite (KUESTER, et al., 2008). Há também estudos com ratos
deficientes em catepsina D, os quais nasceram normais, mas morreram após 26
dias devido a massa intestinal necrosada, tromboembolismo e linfopenia (MENZEL,
et al., 2006).
A remodelação de proteínas da matriz extracelular (ECM) também envolve as
catepsinas; a destruição de tecidos ricos em elastina durante processos de
inflamação está associada ao acúmulo local de macrófagos que contêm altos níveis
11

de enzimas elastinóliticas como as catepsinas B e L (FIEBIGER, et al., 2002). Esta
remodelagem da matriz extracelular (ECM) é um dos mecanismos subjacentes em
doenças cardiovasculares, processo no qual as catepsinas desempenham papel
central, associadas ao desenvolvimento e progressão de doenças cardiovasculares
(LUTGENS, et al., 2007).
A expressão de algumas catepsinas é altamente regulada em tipos
específicos de células, como a catepsina K nos osteoclastos, e a catepsina S nas
células imunes; foi demonstrado em ratos deficientes que a catepsina K está
associada à remodelagem óssea, enquanto a catepsina S é a principal enzima que
processa a cadeia invariante do antígeno MHC class II, estando envolvida em
diversas doenças degenerativas, como o mal de Alzheimer (MOHAMED & SLOANE,
2006; MUNGER et al., 1995).
Inibidores da catepsina K foram originalmente desenvolvidos para o
tratamento de doenças que envolvem a excessiva perda óssea, como osteoporose.
Neste caso, a catepsina K é secretada pelos osteoclastos ósseos e apresenta-se
como potente colagenase. Diversas companhias farmacêuticas apresentam
diferentes inibidores, baseados na catepsina K, em fase de testes pré-clinicos e
clínicos. Os resultados iniciais demonstram que estes potentes inibidores são
capazes de, não somente prevenir a reabsorção óssea, como também permitir sua
reformulação (PALERMO & JOYCE, 2007). Além disto, testes clínicos que utilizam
os inibidores da Novartis AFG-495 e GSK reduziram , de modo experimental, a
metástase óssea (GAUTHIER et al., 2008).
Alguns inibidores baseados na catepsina S também estão em fase de testes
clínicos contra artrite reumatóide e psoríase, além de outras doenças auto-imunes,
como esclerose e lúpus, demonstrando que as catepsinas representam um alvo
terapêutico de grande importância e relevância (PALERMO & JOYCE, 2007). Desta
forma a busca de inibidores para as catepsinas representa uma intervenção
terapêutica de suma importância e imensa contribuição para a saúde humana.
12

1.5.2 Catepsinas estudadas
1.5.2.1 Catepsina L (EC 3.4.22.15)
A catepsina L é descrita em humanos e em diferentes tipos de organismos,

estando envolvida basicamente na degradação de proteínas nos lisossomos, na
morfogênese dos folículos capilares, no processo de diferenciação epidermal e
também na formação de antígenos (TURK & GUNCAR, 2003).
A catepsina L em células normais é transcrita a partir de uma pré-proteína
através do complexo de Golgi, armazenada como a enzima “madura” nos
lisossomos, não apresentando a pró-catepsina nenhuma atividade catalítica. A
catepsina L é expressa na maioria das células eucarióticas.
Estudos com ratos deficientes em catepsina L apresentaram distintos
problemas na MHC classe II processados em células epiteliais do timo,
comprometimento das funções do miocárdio, hiperplasia epidermal, acantose,
hiperqueratinose e perda progressiva de pelagem (LETO et al., 2010; PETERMAN,
et al., 2006).
Evidências sugerem que a catepsina L, juntamente com outras proteinases,
como a catepsina B, podem facilitar a progressão de tumores, estando esta hipótese
sustentada por grande número de observações experimentais e clínicas, em que é
verificado um aumento da expressão celular da catepsina L em muitos tumores
humanos. Além disto, o aumento de sua expressão celular é associado com o início
de tumores mais agressivos e/ou com resultados clínicos mal sucedidos
(LANKELMA et al., 2010).
A catepsina L está envolvida na regulação da reabsorção óssea em
condições normais e patológicas, estando em menor concentração nos osteoclastos
que a catepsina K. O envolvimento da catepsina L em metástase de doenças ósseas
é bem fundamentado, uma vez que alterações na expressão desta enzima têm sido
observadas em tumores ósseos, como osteosarcoma, tumores de células gigantes
do osso, mieloma múltiplo e chondrosarcoma (LETO et al., 2010).
A catepsina L também participa da invasão de células de melanona;
recentemente foi demostrado que células de melanona não metastáticas são
convertidas em células metastáticas pela super expressão da catepsina L. A
13

associação da catepsina L com a membrana em humanos e celulas de melanona
sugere uma função extra lisossomal em metástases (ISHIDOH & KOMINAMI, 1998).
Além disso, também foi veirificado que o potente inibidor da catepsina L, a cistatina
C, bloqueia a mobilidade e invasão de células de melanoma (COX et al., 1999;
ERVIN & COX, 2005).
1.5.2.2 Catepsina V (EC 3.4.22.43)
A catepsina V é predominantemente expressa no timo, nos testículos e na

córnea epitelial, sendo descrita como a mais abundante protease encontrada na
córnea epitelial (BROMME et al., 1999). Seu papel fisiológico ainda não é bem
definido, entretanto, há indícios que ela esteja envolvida no controle da seleção das
células T humanas (TOLOSA et al., 2003).
A atividade elasteolítica da catepsina V é descrita como a mais potente dentre
as enzimas proteolíticas conhecidas (YASUDA et al., 2004); sua presença é
verificada em macrófagos nas áreas de formação de placas ateroscleróticas
(LUTGENS, et al., 2007).
Dados demonstram que a expressão específica da catepsina V no timo
sugere que a mesma pode representar um papel crítico na apresentação de
antígenos do timo ainda maior que em relação a catepsina L e apresenta-se como
novo alvo para o tratamento de desordens auto-imune (BROMME et al., 1999).
As catepsinas V e L apresentam alta similaridade, com identidade de 77%
para a proenzima e 80% para a enzima madura; também apresentam genes de
codificação próximos, assim como a organização dos seus cromossomos. No geral,
as similaridades na seqüência e a organização genômica sugerem que a catepsina
V e L divergiram na evolução. Apesar da semelhança entre as catepsinas V e L, elas
diferem na especificidade do substrato e da distribuição tecidual.
14

1.5.3 Características estruturais e mecanismos de ação das catepsinas
As catepsinas apresentam atividade proteolítica altamente conservada e são

formadas por uma tríade catalítica dos resíduos: Cys25, His159 e Asn175, de acordo
com a numeração da papaína.
O grupo imidazol do resíduo de histidina polariza o grupo SH do resíduo de
cisteíno levando a desprotonação do tiol, formando um par iônico altamente
nucleofílico, o qual é estabilizado por ligação de hidrogênio pelo resíduo Asn175. O
resíduo de cisteíno ataca o carbono do grupo carbonila da ligação peptídica do
substrato levando a formação de um intermediário tetraédrico. Em seqüência, por
processo de acilação, este intermediário tetraédrico libera a porção C-terminal do
substrato, deixando a enzima acilada (enzima-substrato tiol éster). Um segundo
intermediário tetraédrico é formado a partir da hidrólise do complexo E-S-tiol-éster,
que em seguida sofre uma reação de desacilação, liberando a porção N-terminal e a
enzima livre ao meio (Figura 4) (OTTO et al., 1997 e LECAILE et a.l, 2002).
O-
R
-
S S
OH
Cys25 Cys25
H H
E desacilação E +
+
N N
His159 His159
NH NH
O
0
2 intermediário tetraédrico
R OH
O
R´
R N
H
O- O
R
S acilação S R
NH R´
Cys25 Cys25
H R´ NH2
E E
+
N N
His159 His159
NH NH
10 intermediário tetraédrico
Figura 4. Mecanismo de hidrólise de peptídeos pelas cisteínos peptidases.

15

1.6 Substratos fluorogênicos
A utilização de substratos fluorogênicos propiciou um avanço considerável no

estudo das peptidases. Dentre esses, destacam-se os peptídeos que contêm a
sonda fluorescente 7-amino-4-metilcumarina (MCA). Estes substratos, quando
hidrolisados, apresentam um espectro de absorção e de emissão diferentes
daqueles da 7-amino-4-metilcumarina (MCA) ligados aos peptídeos. O fator limitante
no uso destes substratos é permitir o estudo da especificidade dos sub-sítios S. Esta
restrição deve-se ao fato da fluorescência aparecer somente quando a ligação X-
MCA (X = diferentes aminoácidos) é clivada e o produto fluorescente é liberado. O
uso do substrato fluorescente Z-Phe-Arg-MCA (ZFRMCA), Figura 5, tem sido
amplamente utilizado devido à sua alta sensibilidade em relação a dosagem do
produto fluorescente 7-amino-4-metilcumarina (BARRET & KIRSCHKE, 1981).
O O
O
O N
Phe Arg
Figura 5. Estrutura do substrato comercial Z-FR-MCA

As diferenças espectrais dos diversos substratos (peptidil-MCA) e do produto
de hidrólise permitem que as atividades enzimáticas das peptidases sejam
acompanhadas a partir de um fluorímetro usando os comprimentos de onda de
excitação de 380 nm e de emissão de 460 nm (JULIANO et al., 2002).
Por outro lado, o estudo de especificidades pode ser estendido a inibidores
provenientes de coleções de substâncias isoladas de plantas e produtos sintéticos,
que proporcionam um ensaio com grande variedade estrutural levando a
informações do modo de interação destes inibidores com as enzimas e assim um
maior entendimento das relações de estrutura e atividade.
16

1.7 Inibidores enzimáticos
Inibidores enzimáticos são substâncias que modificam a atividade catalítica

de uma enzima agindo através da redução da velocidade da reação; interagem com
uma enzima por meio de ligações reversíveis e irreversíveis, alterando assim o
equilíbrio que é estabelecido entre a enzima, o substrato e o produto de interesse.
No geral, as reações catalisadas por enzimas ocorrem através da associação de
uma enzima (E) ao seu substrato (S), levando a formação de um complexo
denominado complexo enzima-substrato (E●S).
A formação deste complexo acontece de forma rápida e reversível; em
seqüência, o complexo E●S atinge um rápido estado de transição (ES‡) levando ao
complexo enzima-produto (E●P), que se dissocia rapidamente liberando a enzima
intacta (E) e o produto de interesse (P) no meio (esse processo é ilustrado na Figura
6); a formação das espécies é determinante na velocidade da reação e formação
dos produtos. (COPELAND, 2005).
E+S ES (ES‡) EP E+P

Figura 6. Equilíbrio cinético verificado entre enzima e substrato
1.7.1 Modo de ligação e mecanismo de ação
Os inibidores enzimáticos atuam através de mecanismos que podem ser

reversíveis ou irreversíveis; para tanto, associam-se a enzima formando um
complexo enzima-substrato que podem ser formado por ligação intermolecular
covalente (E●I) ou covalentes (E-I). Os inibidores irreversíveis acarretam a
inativação da enzima enquanto que os reversíveis ligam-se a enzima levando a uma
perda da atividade enzimática que pode ser recuperada com a remoção do inibidor
(COPELAND, 2000).
Na busca de inibidores enzimáticos para o planejamento de fármacos é
desejável que o inibidor ligue-se a enzima de forma não covalente, rápida e
reversivelmente, sem alterar a estrutura da enzima, levando a formação do
complexo (E●I). Os inibidores reversíveis podem ser classificados em três tipos:
17

1) inibidores competitivos: são substâncias que competem diretamente com o
substrato natural pelo sítio de ligação enzimática, levando a formação das
espécies E●S ou E●I. Estes inibidores normalmente apresentam estruturas
que se assemelham ao substrato natural, porém diferem por não apresentar
reatividade e não levar a formação de produtos pela ação da enzima, como
mostrado na Figura 7.
Km Kcat
E + S ES E + P
Ki
EI
Figura 7. Esquema clássico de inibidor competitivo
2) inibidores não competivos: são substâncias que mostram afinidade tanto

para enzima livre como para o complexo E●S, ligando-se aos sítios que
participam da ligação ao substrato bem como ao sítio que participa da
catálise. Estes inibidores induzem mudanças na estrutura da enzima, levando
a modificação do sítio ativo, impedindo uma interação eficaz com o substrato,
como mostrado na Figura 8:
Km Kcat
E + S ES E + P
+ +
I I
Ki αKi
α Km
EI ESI
Figura 8. Esquema clássico de inibidor não-competitivo

18

3) inibidores incompetitivos: são substâncias que se ligam diretamente ao
complexo E●S e não a enzima livre. Estes inibidores afetam a atividade
catalítica da enzima sem afetar a ligação ao substrato, como mostrado na
Figura 9:
Km Kcat
E + S ES E + P
Ki
ESI
Figura 9. Esquema clássico de inibidor incompetitivo.
19

Objetivos

2 OBJETIVO
2.1 Objetivo geral
O presente trabalho teve como objetivo geral a busca de inibidores seletivos

para enzimas, a partir de extratos de plantas do gênero Zanthoxylum, de
substâncias isoladas e de derivados sintéticos.
2.2 Objetivos específicos
1. Aplicação de metodologia fluorimétrica na triagem enzimática com extratos de

plantas do gênero Zanthoxylum;
2. Aplicação de perfil cromatográfico, via CLAE, nas análises de extratos brutos

e frações;
3. Isolamento e identificação de metabólitos secundários ativos do extrato de

Zanthoxylum selecionado;
4. Triagem bioquímica com compostos isolados e determinação de potência IC50

para os inibidores mais promissores;
5. Determinar IC50, seletividade e mecanismo de ação dos alcalóides

acridônicos isolados de Swinglea glutinosa frente a catepsina L;
6. Triagem bioquímica com compostos sintéticos;
7. Determinar IC50, Ki, seletividade e mecanismo de ação dos inibidores

sintéticos mais promissores;
8. Estudo de interações intermoleculares através de modelagem molecular.
23

Metodologia

3 Metodologia

3.1 Materiais
3.1.1 Solventes

Solventes: foram utilizados solventes comerciais (Hexano, Diclorometano,
Acetato de Etila, Metanol), recuperados e destilados no DQ – UFSCar;
Solventes para HPLC: solventes comercias ULTRA ANALYSIS, marca
Tedia;
Solventes para ensaio: Dimetilsulfóxido (DMSO), marca Mallinckrodt
Chemicals;
Solvente para RMN: CDCl3, MeOD, marca Sigma Aldrich.
3.1.2 Suporte para cromatografia

Sílica gel 60 (70-230 mesh);
Sílica do tipo “flash” (230-400 mesh);
Sephadex LH-20 da Amershan Pharmacia Biotech AB;
C-18 da Phenomenex (5 e 10 µm);
CCDA – com sílica gel 60 F245, φ = 0,2 mm em folhas de alumínio da Sigma
Aldrich.
3.1.3 Reagentes

Substrato Z-FR-MCA (Cbz-Phe-Arg-MCA ou 7-amino-4-metilcumarina),
marca Bachem Inc. e Sigma;
Inibidor E-64 (L-3-carboxi-trans-2,3-epoxipropionil-leucilamido(4-
guanino)butano);
DTT, marca Sigma Aldrich;
25

Acetato de Sódio trihidrato, marca J.T. Baker;
EDTA, marca J.T. Baker.
3.1.4 Enzimas
Catepsina L e V são enzimas recombinantes humanas e foram cedidas pelo

Prof. Dr. Dieter Brömme, da Univerversity of British Columbia, Vancouver
3.2 Equipamentos
Evaporadores rotativos
Extratos e frações foram evaporados em evaporadores do tipo Büchi

Rotavapor R-114 com banho Büchi Watherbath B-480, e recirculador
refrigerado NESLAB, modelo CFT-25, mantido a 50C.
CLAE
analítico
Equipamento marca Shimadzu, modelo SPD-M10A, com detector de fotodiodo
e software CLASS-VP;
Preparativo
Equipamento marca Shimadzu, modelo SPD-M10A, com detector de
Ultravioleta e software CLASS-VP.
Fluorímetro
Equipamento com leitor de Placa com 96 poços, Molecular Devices, marca
Corporation – Spectra, modelo MAX GEMINI XS
RMN
Espectrômetros de Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio, marca
Bruker, modelos DRX 200 MHz, DRX 300 MHz e 400 MHz.

26

GC e GC/MS
Cromatógrafo à gás com detector FID, marca Shimadzu, modelo GC-17A;
Cromatógrafo à gás acoplado a espectrômetro de massas, marca Shimadzu,
modelo GCMS_QP5000, equipado com coluna apolar DB-5 (30 m x 0,25 mm)
e ionização via imapcto eletrônico (70 eV).
MS
Espectrômetro de massas de alta resolução com fonte eletrospray (ESI) e
analisador de massas q –TOF, marca Bruker Daltonics.
3.3 Coleta e Identificação do Material Vegetal

Todas as espécies do gênero Zanthoxylum e suas respectivas partes vegetais
foram coletadas pelo grupo de Produtos Naturais da UFSCar, com a colaboração
com Prof. Dr. José Rubens Pirani, do Departamento de Botânica da Universidade de
São Paulo (USP – São Paulo), responsável pela identificação das mesmas (Tabela
3):
Tabela 3. Espécies do gênero Zanthoxylum, partes vegetais e localização.
ESPÉCIE Partes Vegetais Local de Coleta
(g)
Zanthoxylum sp Folhas (217g) Reserva Pau Brasil/Porto Seguro - Bahia
Galhos (44g)
Zanthoxylum ridelianum Folhas (620g) Serra do Cabral – Minas Gerais
Zanthoxylum arenarium Folhas (504g) Estrada Piuma/Maratraizes – ES
Zanthoxylum pohlianum Folhas (282g) Estrada Praia do Sol - Minas Gerais
Galhos (1224g)
Zanthoxylum minutiflorum Folhas (570g) Estrada Rio Bananal/Fazenda Santo
Galhos (450g) Antônio, Linhares – Espírito Santo
Zanthoxylum acuminatum Folhas (620g) Estrada Rio Bananal/Fazenda Santo
Galhos (345g ) Antônio. Linhares – Espírito Santo
Caule (517g)
A análise deste material levou à separação das espécies em cinco grupos de

plantas, uma vez que as espécies Z. arenarium e Z. pohlianun são, na verdade, a
espécie Z. monogynum.
27

3.4 Preparação dos Extratos
As diversas partes vegetais foram secas separadamente em estufa com
circulação de ar a 450 C e, após, pulverizadas em moinho do tipo Willey. A extração
do material vegetal moído foi realizada por maceração utilizando os solventes
hexano, diclorometano e metanol, durante cinco dias, por três vezes, conforme
representado no
Fluxograma 1.
Material Percolação com
Vegetal Solvente por
Seco 5 dias
e Moído

“Torta” Filtração
Concentração do
EXTRATO Solvente
Fluxograma 1. Metodologia para a preparação dos extratos
No total, foram obtidos 31 extratos, conforme mostrado na Tabela 4; destes

extratos, foram selecionados os extratos diclometânico e metanólico e ensaiados
frente a catepsina L e a catepsina V.
28

Tabela 4. Extratos das diferentes espécies do gênero Zanthoxylum
Espécie Parte Vegetal código Massa dos Extratos (g)
Zanthoxylum sp Folhas ZFH 6,9491
ZFD 4,4244
ZFM 0,3514
Galhos ZGH 0,4007
ZGD 0,2977
ZGM 2,2426
Zanthoxylum ridelianum Folhas ZRFH 12,7042
ZRFD 10,8817
ZRFM 7,5599
Zanthoxylum arinarium Folhas ZArFH 8,2984
ZArFD 19,2734
ZArFM 39.1876
Zanthoxylum poliano Folhas ZPFH 3,3961
ZPFD 5,6724
ZPFM 38,5929
Galhos ZPGH 1,0812
ZPGD 4,3151
ZPGM 14,4906
Zanthoxylum minutiflorum Folhas ZMFH 1,5383
ZMFD 16,6364
ZMFM 56,4990
Galhos ZMFH 1,0268
ZMFD 2,0998
ZMFM 16,5011
Zanthoxylum acuminatum Folhas ZAcFH 2,7433
ZAcFD 8,0040
ZAcFM 4,8014
Galhos ZAcFH 0,3800
ZAcFD -
ZAcFM 1,7368
Caule ZAcCH 1,8770
ZAcCD -
ZAcCM 16,400
F = folhas; G = galhos; C = caule; H = hexano; D = diclorometano; M = metanol
3.5 Metodologia para extração em fase sólida

A extração em fase sólida (SPE) foi realizada com o auxilio de cartucho prepSep
C18, marca Fisher Scientific; esta extração consiste em um procedimento de pré-
tratamento da amostra, realizada em quatro etapas:
1) Condicionamento: ativação da fase estacionária por solvatação, a qual

depende do tipo de metodologia a ser empregado na separação;
29

2) Aplicação da Amostra: espera-se a retenção dos compostos de interesse,
enquanto os interferentes são descartados na eluição;
3) Lavagem: remoção de interferentes menos retidos que os compostos de
interesse. A fase móvelr utilizada depende do modo de eluição e das
características da amostra;
4) Eluição: eluição dos compostos retidos, usando solventes que rompam as
interações do analito com a fase estacionária.
Para a extração em fase sólida utilizou-se o procedimento no qual um cartucho

foi condicionado com metanol (3 vezes o seu volume final de 6 mL) e em seguida
com água (1 vez o seu volume final de 6 mL), conforme apresentado na Figura 10:
Figura 10. Esquema do sistema de extração em cartucho.
A amostra, extrato ZAFD, foi solubilizada em metanol, filtrada em filtro de teflon

de 0,45 µm e, em seguida, aplicada um volume de 100 µL no cartucho já
condicionado. Após a aplicação utilizou-se 10 mL de uma mistura de H2O:ACN (7:3)
para eluição da amostra.
Em seqüência às aplicações do extrato, procedeu-se a limpeza do cartucho:
eluição de 5 mL de água após, de 10 mL de metanol e, por fim, 10 mL de
acetonitrila.
A metodologia empregada foi escalonada para uma coluna contendo C18, a fim
de reproduzir em larga escala o procedimento de extração em fase sólida por
cartucho SPE, com a finalidade de reter clorofila e obter os metabólitos de interesse.
30

3.6 Metodologia para CLAE Analítico
O perfil cromatográfico para os extratos selecionados foi realizado a partir de
uma eluição gradiente exploratória, utilizando eluição em fase reversa com coluna
de 15 x 0.7 mm.
O gradiente de eluição foi realizado empregando como fase móvel solvente
acetonitrila e variando-se a concentração deste solvente de 5 a 100% em 60
minutos, com recondicionamento da coluna por 20 minutos; este método está
baseado na proposta de SNYDER e DOLAN (1996).
3.7 Metodologia para isolamento dos metabólitos.
3.7.1 Fracionamento do extrato ZAFD

A fração ZAFD foi submetida a uma coluna contendo sílica como fase
estacionária (Ø x h = 18,0 x 4,0 cm) e eluições de gradiente com: hexano 100%,
hexano/acetato 9:1, 8:2, 7:3, 6:4, 5:5, 4:6, 3:7, 2:8, 1:9 e 100% acetato,
acetato/metanol 9,5:0,5, 9:1, 7:3 e 100% metanol. Esta separação forneceu 14
frações de 800 mL, como mostrado no Fluxograma 2:
ZAFD (2,4 g)
ZAFD 01 ZAFD 02 ZAFD 03 ZAFD 04 ZAFD 05 ZAFD 06 ZAFD 07
ZAFD 08 ZAFD 09 ZAFD 10 ZAFD 11 ZAFD 12 ZAFD 13 ZAFD 14
Fluxograma 2. Fracionamento da fração ZAFD em eluição gradiente.
Na fração 2 verificou-se a presença de um sólido branco e identificado como

o triterpeno lupeol; esta fração foi codificada como substância 1.
Da fração 4 foram isolados um sólido de coloração branco-amarelada,
identificado como cumarina umbeliferona (7-hidroxicumarina) e codificado
como substância 2, além de um alcalóide acridônico identificado como
arborinina e codificado como substância 10. Estes compostos foram
31

purificados e isolados por cromatografia em camada delgada preparativa em
hexano/acetato (8:2).
As frações 5 – 8 e as frações 9 – 11 foram avaliadas por CLAE-DAD e
reunidas em duas novas frações, as quais foram submetidas à metodologia
SPE em coluna.
3.7.2 Fracionamento da fração ZAFD 5 – 8

A fração ZAFD 5 -8 foi submetida a uma coluna em fase reversa (C18) (Ø x h =
18,0 x 4,0 cm) e eluições de gradiente com MeOH/H2O 9:1, metanol 100%;
diclorometano 100%; após lavagem com acetona foram obtidas quatro novas
frações, como descrito no Fluxograma 3:
ZAFD 5 -8
SPE 1 SPE 2 SPE 3 SPE 4

Fluxograma 3. Fracionamento da fração ZAFD 8 – 9 por SPE
As frações foram ensaiadas frente a catepsina L nas mesmas

condições que os extratos brutos; a fração SPE 1 apresentou inibição de 100%;
estas frações também foram avaliadas pelas técnicas analíticas CLAE-DAD, CCD e
RMN, como mostrado na Figura 11; foi constatada a presença de alcalóides e
cumarinas.

32

mAU
3500
3000
SPE 01
2500
2000
SPE 01
1500
vanilina
1000
500
0 10 20 30 40 50 min
mAU
3000
2500 SPE 02
2000
1500
1000
500
SPE 01
0
0 10 20 30 40 50 min
draggerdorff
mAU
3000
2500
SPE 03
2000
1500
1000
500
0 10 20 30 40 50 min
Figura 11. Cromatogramas e análises por CCD das frações obtidas de ZAFD 5-8
A fração SPE 1 foi submetida à eluição gradiente em fase reversa em coluna

(C18) (Ø x h = 18,0 x 4,0 cm) com MeOH/H2O e gradiente 40% a 75% (taxa gradiente
de 5%), 80%, 90% e 100% de metanol, seguida de DCM 100%, obtendo-se 12
novas frações.
Destas frações foram isoladas as seguintes substâncias:
Da fração 1 foi identificada cumarina umbeliferona (7-hidroxicumarina),
codificada como substância 2.
Da fração 2 foi identificada cumarina de coloração marrom, a qual foi isolada
e purificada a partir de CLAE preparativo; esta substância foi codificada como
substância 3.
As frações 3 e 4 foram combinadas e desta combinação foram extrídosos
dois alcalóides cantinónicos, codificados respectivamente como substância 7
e 8, além de um alcalóide β-carbonílico, codificado como substância 9, todos
isolados por cromatografia em camada delgada preparativa.
A fração 5 apresentou uma mancha azulada bem intensa quando revelada
em solução de vanilina. Posterior separação por CCDP levou ao isolamento
de duas cumarinas com substituinte O-geranila, codificadas respectivamente
como substâncias 5 e 6.
33

Da fração 8 foi isolada, pela técnica analítica CCDP, uma cumarina de
coloração amarelada, codificada como substância 4.
3.7.3 Isolamento e purificação da cumarina da fração SPE_1_ZAFD_2

Foi realizado perfil cromatográfico em fase reversa e eluição gradiente
acetonitrila/água, como mostrado na Figura 12. Seqüencialmente, foi realizada
analise em eluição isocrática utilizando-se fase móvel acetonitrila/água (7:3), como
mostrado na Figura 13, com posterior escalonamento para escala semi-preparativa
levando ao isolamento da cumarina codificada como substância 3.
D et ect o r A- 334 n m
E07
E07001
200
200
150
150
mAU
mAU
100
100
50
50
0
0
10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30
Minut es
Figura 12. Cromatograma com eluição gradiente da fração SPE_1_ZAFD_2.

Condições cromatográficas: gradiente linear de 5% a 100% de ACN (solvente B) em
60 minutos; vazão 1mL/min; λ = 334 nm com detecção em DAD; Vinj=20 µL; [ ] = 0,2
mg/mL
D et ect o r A-252 n m 333 n m

E07_iso cratico E07_iso cratico
E07_iso cratico 007 E07_iso cratico 007
60
60
50
50
40
40
mAU
mAU
30
30
20
20
10
10
0
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
Min u t e s
Figura 13. Cromatograma com eluição isocrático da fração SPE_1_ZAFD_2.

Condições cromatográficas: gradiente linear de 5% a 100% de ACN (solvente B) em
60 minutos; vazão 1mL/min; λ = 334 nm com detecção em DAD; Vinj=20 µL; [ ] = 0,2
mg/mL
34

3.8 Metodologia dos ensaios enzimáticos
3.8.1 Metodologia e condições gerais dos ensaios cinéticos em placa de

Elisa
A determinação da atividade enzimática é baseada na hidrólise do substrato
ZFR-MCA monitorada diretamente pelo aumento de fluorescência em função do
tempo de reação. Este experimento foi realizado em placa de Elisa com volume final
de 200 µL , temperatura 270C, comprimento de onda de excitação (λex) 380 nm e
emissão (λem) 460 nm. Para os ensaios foram utilizadas as catespinas L e V e
condições experimentais como descrito na Tabela 5:
Tabela 5. Condições experimentais utilizadas para as catepsinas.

Tampão Acetato de sódio 100 mM, 5 mM EDTA
Catepsina L Catepsina V
pH 5,5 5,5
[DTT] mM 2,5 2,5
[enzima] nM ~ 2,8 ~ 2,8
[ZFR-MCA] µm 10,0 10,0
A concentração de enzima foi utilizada de modo que a hidrólise do substrato

não fosse superior a 5% nos 300 primeiros segundos do experimento; os valores de
fluorescência obtidos foram convertidos para μM/min usando-se curva de calibração
determinada através da hidrólise total do peptídeo ZFR-MCA.
As enzimas são pré-ativadas com DTT (2,5 mM) por 5 minutos,
posteriormente pré-incubadas por 5 minutos, com os possíveis inibidores dissolvidos
em DMSO. O controle negativo é realizado na presença de DMSO, enquanto que o
controle positivo é feito em presença do inibidor E-64. A determinação da atividade
enzimática foi realizada através do monitoramento contínuo e direto da hidrólise do
substrato fluorogênico (ZFR-MCA) por 300 segundos (5 minutos).
A metodologia geral utilizada no ensaio está esquematizada na Figura 1.
35

Tampão O
7-amino-metil-cumarina (MCA)
+ N
O O
Enzima O Phe Arg
Z CH3
Baixa Fluorecência
EXTRATO Ponto de clivagem

Hidrólise pelas Catepsinas
ZFR‐MCA MCA Livre
O H2N O O
O Phe Arg
Leitura por Z
CH3
300 segundos Alta Fluorecência
Figura 14. Esquema geral dos ensaios enzimáticos com substrato fluorogênico.
3.8.2 Triagem de inibidores frente a catepsina L e V

A triagem bioquímica com os compostos puros foi realizada em uma dupla
triplicata em concentração única de 25 µM. O percentual de inibição foi determinado
a partir da atividade enzimática em situações de ausência e presença de inibidor,
conforme a equação,
% Inibição = 100 x ( 1 – Vi )
V0
onde Vi é a velocidade obtida na presença de inibidor e V0 , a velocidade obtida na

ausência de inibidor.
Os compostos que apresentaram inibição significativa, estimada para valores
igual ou superior a 50% frente a catepsina L e V, foram selecionados para a
determinação dos valores de IC50. Os processos de triagem representam um
importante meio na identificação de candidatos a inibidor, bem como ferramenta útil
para a determinação da faixa de potência em que se encontra o inibidor.
36

3.8.3 Determinação da potência dos inibidores (IC50)
A determinação da potência dos inibidores (IC50) é definida como a
concentração de inibidor que provoca queda de 50% na atividade da enzima. Este
valor é uma convenção utilizada com o objetivo de comparação de valores de
potência entre inibidores.
A determinação dos valores da potência foi realizada de maneira direta
empregando-se o ensaio cinético apresentado com a utilização de substrato
fluorogênico. Os percentuais de inibição foram obtidos em diferentes concentrações
de inibidor (6 a 9 concentrações, em dupla triplicata). Nesta determinação foi
explorada uma faixa de inibição entre 15 e 90%, com obtenção de uma curva
concentração versus reposta. Os dados cinéticos foram obtidos e tratados para a
determinação dos valores de IC50, a partir do método de regressão não linear de
melhor ajuste empregando o programa Sigmaplot 9.0. Uma curva típica de cinética
empregada na análise por regressão linear é apresentada na Figura 15:

100
80
60
% Inibição
40
20
0
0 5 10 15 20
[Inibidor]
Figura 15. Gráfico ilustrativo de determinação dos valores de potência (IC50).
37

3.8.4 Determinação da seletividade (S)
A seletividade dos inibidores avaliados neste trabalho foi estabelecida a partir
dos dados obtidos com os experimentos de potência. A seletividade enzimática é
obtida a partir da razão entre os valores de IC50 de acordo com a equação,
S = IC50 (catepsina L)
IC50 (catepsina V)
onde valores iguais à unidade indicam a inexistência de seletividade, valores

maiores que 1 indicam seletividade frente a catepsina V e, valores menores que 1,
seletividade frente a catepsina L.
3.8.5 Determinação do Mecanismo de Ação

A determinação do mecanismo de inibição dos compostos selecionados frente
ao substrato Z-FR-MCA foi obtida a partir de dados experimentais coletados e
avaliados pelo método de Lineweaver-Burk. A metodologia experimental consiste em
medir a velocidade de reação em 5 concentrações de substratos, na ausência e na
presença de quatro diferentes concentrações de inibidor. As concentrações dos
inibidores utilizados foram 0,5, 1,0, 3,0, 5,0, 7,0 e 9,0 µM, baseadas nos valores de
IC50 obtidos nos experimentos de potência. As concentrações do substrato
empregadas foram de 0.8, 1.6, 3.2, 6.4, 9.6, 12.8 e 19 µM para a catepsina L e 3,2,
6,4, 9,6, 12,8, 19 e 39 µM para a catepsina V; estas concentrações foram escolhidas
de acordo com valor de Km para a catepsina L (3.1 µM) e catepsina V (6.2 µM).
Os dados obtidos foram tratados e graficados em gráficos de duplo-recíproco,
nos quais tem-se o inverso da velocidade da reação (1/v0 para o eixo y) em função
do inverso da concentração de substrato (1/[S] para o eixo x). Por fim, o mecanismo
pelo qual os inibidores atuam é determinado a partir do padrão de intersecção das
curvas no plano das coordenadas cartesianas.
38

3.8.6 Modelagem Molecular dos inibidores frente a catepsina L e V
Esta parte do trabalho foi realizada em colaboração com Prof. Dr Rafael V.C.
Guido, Instituto de Física de São Carlos – IFSC USP. Para a realização dos estudos
de modelagem foi utilizado o programa de dosagem molecular Flex, no qual
inspeção visual foi obtida pelo programa Pymol.
39

Resultados e
Discussões

4 RESULTADOS E DISCUSSÕES
Na busca por inibidores seletivos de cisteíno peptidases foi selecionada a
catepsina L, uma vez que os compostos avaliados pelo grupo apresentaram
relevante inibição frente a essa enzima. Um fato muito relevante foi a escassez de
estudos visando o encontro de inibidores específicos para a catepsina L,
principalmente estudos com produtos naturais envolvendo a triagem com extratos.
A importância do estudo desta classe de enzimas está baseada nos
processos patológicos nos quais elas estão envolvidas e à dificuldade de se
encontrar inibidores seletivos, visto que há similaridade estrutural entre as
catepsinas.
As cisteínos peptidases lisossomais representam um alvo de grande interesse
para a indústria farmacêutica, pois estão diretamente associadas a inúmeras
doenças atuais (SOMOZA et al, 2000; LECAILE et al, 2002). Um dos grandes
desafios é a descoberta de substâncias que possam atuar como inibidor de alta
potência bem como apresentem alta seletividade.
Os vegetais são fontes de substâncias com grande variedade estrutural e
representam um alvo com alto potencial farmacológico; assim, as plantas
apresentam-se como fonte promissora de diversidade molecular na busca de
inibidores enzimáticos.
Para o estudo de plantas foi selecionado o gênero Zanthoxylum, para o qual
foi empregada metodologia desenvolvida e adaptada para placa de Elisa
(SEVERINO, 2008), de modo a `biodirecionar´ o estudo químico e assim realizar
apenas o estudo de extratos que representam entidades químicas com maiores
potenciais inibidores enzimáticos das catepsinas.
Ainda de interesse são os extratos que apresentam seletividade frente a
catepsina L. Para tal, uma metodologia abordando o acoplamento dos ensaios
enzimáticos fluorogênicos com o monitoramento do perfil químico por cromatografia
líquida de alta eficiência (CLAE-DAD) foi adotada, a fim de selecionar os
extratos/frações e proceder ao isolamento e purificação dos metabólitos
secundários.
A importância do uso de um ensaio na abordagem empregada baseia-se no
fato de que o mesmo pode proporcionar uma forma rápida, econômica e
41

ambientalmente viável para o isolamento apenas dos metabolitos de interesse, pois
a descoberta de novas entidades químicas que venham a servir como protótipos
para fármacos é um caminho longo que desprende altos investimentos financeiros.
42

4.1 Atividade
A enzimátic
ca
4.1.1 Biomotorramento dos extra

atos de Zanthoxyl
Z lum
O extrato
Os os de Za
anthoxylum
m foram avaliados
a quanto à potência
a como
inibidorres da catepsina L. Os ensaio
os enzimátticos foram
m realizado
os em fluo
orímetro
de placca de 96 po
oços ajustado para comprimen
c nto de onda de excita
ação (λex) 380 nm
e emissão (λem) 460
4 nm, com
c monito
oramento direto
d da hidrólise
h do
o substrato
o Z-FR-
MCA através do aumento
a d fluoresccência em função
de f do tempo de reação.
O ensaio
Os os foram re
ealizados com contrrole da ativvidade cattalítica da enzima
no iníccio e final de cada leitura, co
onforme apresentado
o na Figura 16, a fim de
monitorar a ativiidade da enzima du
urante tod
do o temp
po de leitu
ura na pla
aca. Os
ensaioss foram re
ealizados em
e triplica
ata e, para
a fins esta
atísticos, um dos pontos foi
descarttado.

Figura 16. Contro

ole da Ativiidade Cata
alítica da Catepsina
C L
L.

Para a rea
alização do
os ensaioss com extrratos frente
e a catepssina L foi utilizada
u
solução
o estoque
e de conccentração 10 mg/mL
L em dim
metilsulfóxid
do. Os melhores
m
extratos, selecion
nados em função da solubilid
dade apressentada frrente ao solvente
s
utilizado para o ensaio
e enziimático, foram os dic
clorometânicos e mettanólicos.
B
Baseando-
-se no volume final do ensaio (200 µL/ poço), foi verificado que ao
nar o volume de exxtrato (5 µL
adicion µ por poç
ço) foi ob
btida masssa de 250
0 µg de
43

extrato/poço. Todas as soluções estoques foram testadas frente a catepsina L e as
respectivas porcentagens de inibição estão apresentadas na Tabela 6:
Tabela 6. Valores de inibição dos extratos de Zanthoxylum (250 µg) frente a

catepsina L.
ATIVIDADE INIBIÇÃO
EXTRATO
ENZIMÁTICA (%) (%)
ZFD 4 96
ZFM 51 49
ZGM 87 13
ZRFD 55 45
ZRFM 86 14
ZArFD 55 45
ZArFM 49 51
ZPFD 22 78
ZPFM 47 53
ZPGD 20 80
ZPGM 91 9
ZMFD 22 78
ZMFM 43 57
ZMGD 9 91
ZMGM 75 25
ZAcFD 0 100
ZAcFM 0 100
ZAcGM 65 35
ZAcCM 46 54
Assim, foram selecionados para trabalho os extratos alvos que apresentaram

inibição enzimática igual ou superior a 70% e, a partir deste resultado, foram feitas
oito diluições destas soluções estoques, totalizando nove diferentes concentrações,
a fim de encontrar uma relação entre concentração do extrato e poder de inibição.
Uma vez que a solução estoque apresenta o equivalente a 250 µg de

extrato/poço, a escolha das concentrações foi baseada no volume final do poço,
como descrito na Tabela 7:
44

Tabela 7. Concentrações das diluições a partir da solução estoque dos extratos de
ZAFD
Massa de
Concentrações
extrato por
(mg mL-)
poço ( µg )
4 100
2 50
1 25
4X10-1 10
2 X10-2 0,5
4 X10-3 0,1
4 X10-4 0,01
4 X10-5 0,001
As soluções diluídas foram ensaiadas nas mesmas condições que a solução

estoque e suas respectivas porcentagens de atividade e inibição encontram-se
descritas na Tabela 8:
Tabela 8. Valores de inibição das diluições dos extratos de Zanthoxylum frente a

catepsina L (250; 100; 50; 25; 10; 0,5; 0,1;0,01; 0,001 µg / poço)
EXTRATO ATIVIDADE INIBIÇÃO

CONTROLE 100 0
ZFD 1 16 84
ZFD 2 42 58
ZFD 3 91 9
ZFD 4 100 0
ZFD 5 100 0
ZFD 6 100 0
ZFD 7 100 0
ZFD 8 100 0
ZFD 9 100 0
CONTROLE 100 0
ZPFD 1 33 67
ZPFD 2 66 34
ZPFD 3 100 0
ZPFD 4 100 0
ZPFD 5 100 0
ZPFD 6 100 0
ZPFD 7 100 0
ZPFD 8 100 0
ZPFD 9 100 0
CONTROLE 100 0
ZPGD 1 13 87
ZPGD 2 46 54
45

ZPGD 3 100 0
ZPGD 4 100 0
ZPGD 5 100 0
ZPGD 6 100 0
ZPGD 7 100 0
ZPGD 8 100 0
ZPGD 9 100 0
CONTROLE 100 0
ZMFD 1 26 74
ZMFD 2 46 54
ZMFD 3 80 20
ZMFD 4 100 0
ZMFD 5 100 0
ZMFD 6 100 0
ZMFD 7 100 0
ZMFD 8 100 0
ZMFD 9 100 0
CONTROLE 100 0
ZMGD 1 18 82
ZMGD 2 47 53
ZMGD 3 100 0
ZMGD 4 100 0
ZMGD 5 100 0
ZMGD 6 100 0
ZMGD 7 100 0
ZMGD 8 100 0
ZMGD 9 100 0
CONTROLE 100 0
ZAcFD 1 0 100
ZAcFD 2 23 77
ZAcFD 3 44 56
ZAcFD 4 72 28
ZAcFD 5 93 7
ZAcFD 6 100 0
ZAcFD 7 100 0
ZAcFD 8 100 0
ZAcFD 9 100 0
CONTROLE 100 0
ZAcFM 1 8 92
ZAcFM 2 45 55
ZAcFM 3 65 35
ZAcFM 4 93 17
ZAcFM 5 95 5
ZAcFM 6 100 0
ZAcFM 7 100 0
ZAcFM 8 100 0
ZAcFM 9 100 0
46

O experimento de verificação de dose versus resposta demonstrou que os
extratos da espécie de Z. acuminatum eram os únicos que apresentavam inibição
significativa frente a catepsina L após diminuição da concentração.
Os extratos que apresentaram inibição acima de 70% foram ensaiados em
triplicata, em dias alternados, a fim de verificar a eficiência da metodologia
empregada. Os ensaios demostraram comportamento muito similar frente a
catepsina L; os valores de atividade e inibição apresentaram boa precisão e
encontram-se descritos na Tabela 9:
Tabela 9. Valores de inibição frente a catepsina L para diferentes ensaios
EXTRATO ENSAIO 1 ENSAIO 2 ENSAIO 3 DESVIO

Inibição (%) Inibição (%) Inibição (%) PADRÃO
ZFD 1 (250 µg) 96 84 99 7,9
ZFD 2 (100 µg) 43 58 51 7,5
ZFD 3 (50 µg) 17 9 6 5,7
ZPFD 1 (250 µg) 78 67 66 6,6
ZPFD 2 (100 µg) 36 34 51 9,3
ZPFD 3 (50 µg) 2 0 3 1,5
ZPGD 1 (250 µg) 80 87 82 3,6
ZPGD 2 (100 µg) 50 54 52 2,0
ZPGD 3 (50 µg) 7 0 1 3,8
ZMFD 1 (250 µg) 78 74 72 3,0
ZMFD 2 (100 µg) 58 54 49 4,5
ZMFD 3 (50 µg) 26 20 24 3,0
ZMGD 1 (250 µg) 91 82 94 6,2
ZMGD 2 (100 µg) 65 53 79 13
ZMGD 3 (50 µg) 0 0 0 0,0
ZAcFD 1 (250 µg) 100 100 89 6,3
ZAcFD 2 (100 µg) 57 57 70 7,5
ZAcFD 3 (50 µg) 39 40 43 2,0
ZAcFD 4 (0,1 µg) 21 28 26 3,6
ZAcFD 5 (0,01 µg) 0 0 2 1,1
ZAcFM 1 (250 µg) 100 92 100 4,6
ZAcFM 2 (100 µg) 62 55 52 5,1
ZAcFM 3 (50 µg) 32 30 37 3,6
ZAcFM 4 (0,1 µg) 14 17 13 2,0
ZAcFM 5 (0,01 µg) 3 6 6 1,7
Os valores obtidos com os extratos para os diferentes ensaios demonstraram

reprodutibilidade confiável, como apresentado no gráfico apresentado na Figura 17:
47

100
Ensaio 1
Ensaio 2
Ensaio 3
80
Inibição (%)
60
40
20
0
250A ug 100Bug 50C ug 25Dug 0,5Eug
Massa de extrato por poço

Figura 17. Gráfico de comparação para diferentes ensaios do extrato CH2Cl2 de
folhas de Z. acuminatum
Dentre as espécies estudadas, os extratos de folhas em CH2Cl2 e CH3OH da
espécie Z. acuminatum apresentaram as maiores porcentagens de inibição a uma
concentração, bem como para as diluições e, portanto, foram selecionados para
estudo da busca de inibidores.
O extrato ZAFD foi submetido à separação cromatográfica em fase
estacionária normal e utilizando fase móvel em ordem crescente de polaridade,
originando novas 15 frações. Estas frações foram ensaiadas frente a catepsina L,
nas mesmas condições do extrato bruto; foi verificado que as frações ZAFD_05 até
ZAFD_08 apresentaram inibição em uma faixa entre 70 a 85%.
As frações de ZAFD_05 a ZAFD_08 foram reunidas e submetidas à coluna de
C18 fazendo o uso de bomba de vácuo em uma metodologia em extração em fase
sólida (SPE), a fim de reter a clorofila e eluir os constituintes de interesse; foram
obtidas quatro novas frações, as quais foram ensaiadas nas mesmas condições
frente a catepsina L. Os resultados destes ensaios encontram-se descritos na Erro!
Auto‐referência de indicador não válida.:
Tabela 10. Valores de inibição para as frações de ZAFD (250 µg)
Fração do Extrato Inibição (%)
SPE_ZAFD_01 100
SPE_ZAFD_02 0
SPE_ZAFD_03 0
SPE_ZAFD_04 0
48

Em decorrência da alta inibição constatada para fração SPE_ZAFD_01, esta
foi submetida a diferentes metodologias cromatográficas visando o isolamento de
metabólitos com possível ação inibidora da catepsina L. Da fração SPE_ZAFD_01
foram isolados compostos tais como triterpeno, três cumarinas; pirano e furano
cumarina, duas cumarinas 7-geraniladas, dois alcalóides cantinônicos, um alcalóide
β- carbolínico e um alcalóide acridônico.
4.2 Perfil cromatográfico dos extratos brutos/frações

O perfil cromatográfico obtido é representativo da diversidade química das
espécies estudadas e permite caracterizar as atribuições fundamentais de
“integridade”, “semelhança” e “diferenças” encontradas nos extratos analisados
(BELTRAME, 2005).
Os extratos que apresentaram inibição da atividade catalítica acima de 50%
frente a catepsina L foi traçado um perfil cromatográfico em CLAE-DAD, sendo
Zanthoxylum sp (folhas CH2Cl2); Zanthoxylum poliano (folhas e galhos CH2Cl2);
Zanthoxylum minutiflorum (folhas e galhos CH2Cl2) e Zanthoxylum acuminatum
(folhas CH2Cl2 e CH3OH).
Inicialmente, testaram-se as solubilidades dos extratos selecionados, sendo
preparada para analise uma solução contendo 10 mg de extrato, solubilizadas em 1
mL de solvente. Todas as amostras foram filtradas em filtro Millipore® de 0,5 μm.
Para avaliação das características de composição química dos extratos das
espécies estudadas foi utilizado análise cromatográfica em coluna C18 Hypersil®,
com gradiente de eluição e detector de fotodiodo na região entre 200 e 900
nanometros.
O procedimento cromatográfico com eluição gradiente exploratória foi
baseado no método desenvolvido por SNYDER e DOLAN, no qual utiliza-se fase
reversa e eluição de mistura de H2O (solvente A) e solvente orgânico (solvente B;
acetonitrila ou metanol) como constituintes da fase móvel.
Neste procedimento varia-se a concentração de B em um intervalo de tempo
de 60 minutos, sob vazão constante de 2,0 mL/min. A variação da razão de solvente
por minuto (Δ% B/min.) é determinada de acordo com a equação,
49

onde % B / min = variação do solventte B por tempo (inclin gradiente); Δ%B =
nação do g
diferença entre a % final de
e B e a % inicial e tg = tempo de
d gradientte.
S
SNYDER e DOLAN relatam que
q o dese
envolvimen
nto de um método analítico
a
por CLAE em fasse reversa
a é melhor iniciado e, se possívvel, finaliza
ado, utiliza
ando-se
acetonitrila como
o solvente B, a misttura de H2O/ACN como fase móvel ap
presenta
menor viscosidad d onda infferiores a 210 nm
de, ocorre absorção em comprrimentos de
e há melhor
m pod
der de deccisão na escolha
e en
ntre condiçção gradie
ente ou iso
ocrática
mais ap
propriada para
p a aná
álise da am
mostra
N
Neste trab
balho, o perfil cromato
ográfico fo
oi utilizado como form
ma de direc
cionar e
monitorar o extra
ato estuda
ado, monittorando os
s composttos de inte
eresse, po
ossíveis
inibidorres da cate
epsina L, a partir dass bandas cromatográ
c áficas verifficadas na eluição
gradien
nte utilizada.
N
Nas Figurra 18 e Fiigura 19 são
s aprese
entados o perfis cro
omatográfficos do
extrato diclorometânico e metanólicco de Z. acuminattum, respe
ectivamentte. Nos
cromattogramas é possível observar que
q existe uma band
da com alta
a intensida
ade com
tempo de retençã
ão em torno de 32 minutos.
331nm
m 254nm
2000
ZAFD ZAFD 2000

00
ZAFD001 ZAFD001
1500
1500
00
1000
mAU
mAU
1000
00
500
500
0
0 5 10 15 20 2
25 30 35 40 45 50 55 60
Minutes
Figura 18. Crom matograma a em elu uição graddiente do extrato bruto de ZAFD.
Condiçções crommatográficas: Usandoo gradientte linear de 5% a 100% de ACN
(solven 6 minutoss, vazão 1 mL/min. λ DAD, Vinj= 20μL, [ ] = 10 mg/m
nte B) em 60 mL.
50

331nm 254nm
ZAFM ZAFM
ZAFM001 ZAFM001 Spectrumat time 31.27 min.
125
125
31.27min
Lambda max : 206 322 402 405 434
2000
Lambda min : 204 259 403 381 385
m AU
100
1000
100
Spectrumat time 24.66 min.
0
200 250 300 350 400 450
75
75
24.66min
nm
mAU
mAU
750
Lambda max : 202 239 245 355 372
500
Lambda min : 243 226 345 365 272
m AU
50
50
250
0
200 250 300 350 400 450

25
25
nm
0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
Minutes
Figura 19. Cromatograma em eluição gradiente do extrato bruto de ZAFM.

Condições cromatográficas: Usando gradiente linear de 5% a 100% de ACN
(solvente B) em 60 minutos, vazão 1 mL/min. λ DAD, Vinj= 20μL, [ ] = 10 mg/mL.
Além das análises cromatográficas CLAE-DAD, foram realizadas análises em

cromatografia em camada delgada e RMN de Hidrogênio (400 MHz).
A análise por CCDA, utilizando reagentes específicos e radiação UV, revelou
a presença de alcalóides (controle positivo em solução em Draggendorff).
A análise de Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio dos extratos
brutos indicou a presença de uma substância química majoritária em ambos
extratos; de acordo com deslocamentos químicos e multiplicidades (vide Figura 20),
pode-se sugerir que esta substância seja uma cumarina:
No espectro de RMN 1H foram observados sinais em δ= 6,25 ppm (d, J = 9,5
Hz) e δ= 7,96 ppm (d, J = 9,5 Hz), atribuídos respectivamente aos hidrogênios
olefínicos H-3 e H-4.
O sinal em δ= 7,58 ppm (d, J = 8,6 Hz) é referente ao H-5; o sinal em δ= 6,91
ppm (dd, J = 8,6; 2,3 Hz) ao H-6; o sinal em δ= 6,94 (d, J = 2,3 Hz) é referente ao H-
8 do anel aromático. Os demais singletos na região entre δ= 1,0 e 1,7 ppm são
referentes à hidrogênios de grupos metílicos: um sinal em δ= 4,61 ppm (d, J = 6,4
Hz), referente a um hidrogênio oximetilênico e um multipleto entre δ= 5,0 e 5,3 ppm,
referente à hidrogênios olefínicos; estes sinais indicaram a presença de um grupo
geranila ligado a anel cumarínico.
51

7.9754
7.9516
7.9136
7.8900
7.6005
7.5790
7.5012
7.4801
6.9884
6.9809
6.9475
6.9422
6.9187
6.9128
6.8973
6.8911
6.7706
6.7650
6.7494
6.7438
6.6898
6.6842
5 4
6 3
R O O
8
8.05 8.00 7.95 7.90 7.85 7.80 7.75 7.70 7.65 7.60 7.55 7.50 7.45 7.40 7.35 7.30 7.25 7.20 7.15 7.10 7.05 7.00 6.95 6.90 6.85 6.80 6.75 6.70 6.65
ppm
Figura 20. Ampliação do espectro de RMN 1H do extrato CH3OH de Z. acuminatum

(DMSO, 200 MHz).
A análise dos cromatogramas dos extratos brutos mostra três regiões de
importância, referentes á bandas com tempo de retenção de 15 e 32 minutos, as
quais sugerem a presença de inibidores da catepsina L.
Após procedimento de purificação, estas substâncias foram novamente

injetadas e pôde-se então inferir que a substância com tempo de retenção em torno
de 15 minutos é referente à cumarina umbeliferona (2), enquanto que a substância
com tempo de retenção em torno de 32 minutos trata-se da cumarina 7-geranilada
(5), substância majoritária do extrato, como mostrado na Figura 21:
150
150
Spectrumat time 32.06 min. OH

125
125
32.06min O O O
Lambda max : 201 323 486 580 378
500
Lambda min : 259 375 377 381 384

100
100
m AU
250
mAU
mAU
75
75
0
200 225 250 275 300 325 350 375
nm
50
50
25
25
0
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
Minutes
Figura 21. Cromatograma referente a cumarina 5. Condições cromatográficas:

Usando gradiente linear de 5% a 100% de ACN (solvente B) em 60 minutos, vazão 1
mL/min. λ DAD, Vinj= 20μL, [ ] = 0,01 mg/mL.
52

Além disso, pôde-se inferir que a banda com tempo retenção 25 minutos
refere-se aos seguintes compostos alcalóides cantinônicos: composto 5-
metoxicantin-6-ona (7), e composto 4,5-dimetoxicantin-6-ona (8), como mostrado
nas Figuras 22 e 23, e o composto 7-hidróxi-1-etil-β-carbolina (9):
40
Spectrum at time 26.87 min. 40

200
26.87min
Lambda max : 204 245 240 355 372
Lambda min : 198 243 223 344 365
N
N
100
m AU
30
30
O
0
200 300 400 500 600

mAU
mAU
20
nm OCH3 20
C15H10N2O2
6
10
10
0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
Minutes
Figura 22. Cromatograma referente ao alcalóide 7. Condições cromatográficas:

mL/min. λ DAD, Vinj= 20μL, [ ] = 0,01 mg/mL
200
200
Spectrum at time 26.71 min.
26.71min
1000
Lambda max : 204 245 240 355 372

Lambda min : 194 243 222 344 365 N
N
150
m AU
150
500
O OCH3
0
200 300 400 500 600

OCH 3
100
mAU
mAU
100
nm
C16H12N2O3
50
50
0
0 5 10 15 20 25 30 35 40
Minutes
Figura 23. Cromatograma referente ao alcalóide 8. Condições cromatográficas:

mL/min. λ DAD, Vinj= 20μL, [ ] = 0,01 mg/mL
53

4.3 Substâncias identificadas

A metodologia cromatográfica levou ao isolamento de um triterpeno; o lupeol
(1), as cumarinas; a umbeliferona (2), heradenol (3), nordentatina (4), anisocumarina
(5),derivado do 6´, 7´-epoxi-7-geraniloxicumarina (6); alcalóides do tipo cantinônicos;
5-metoxicantin-6-ona (7), 4,5-dimetoxicantin-6-ona (8); um alcalóide β-carbonílico; 7-
hidroxi-1-etil-β-carbolina (9); e um do tipo acridônico; arborinina (10).
Triterpeno
(1)
m = 2,9 mg
identificação: p. 57
HO
Cumarinas
(2)
HO O O m = 22 mg
O O O (3)
O
m = 0,4 mg
HO
OH
54

OH
(4)
m = 0,9 mg
O O O identificação: p. 64
(5)
OH
m = 26 mg
(6)
m = 2,1 mg
O
55

Alcalóides
(7)
N
N
m = 1,0 mg
O
O
N (8)
N
m = 0,8 mg
O O identificação: p. 81
O
(9)
N
HO N m = 1,6 mg
H identificação: p. 84
O OH (10)
O m = 2,9 mg
N O
56

4.4 Determinação estrutural
4.4.1 Triterpeno

Os terpenóides formam uma larga e diversa família de produtos naturais
derivados da unidade isoprênica C5. Dentro da classe dos triterpenos, as diferentes
estruturas típicas contêm esqueletos que são representados pela fórmula (C5)n.
Os triterpenos são compostos que apresentam (C5)6 igual a C30, ou seja,
possuem trinta átomos de carbono em sua estrutura química; são substâncias
formadas a partir de duas moléculas de bifosfato de farnesila, as quais fundem-se
por adição eletrofílica, levando à formação de hidrocarboneto escaleno; este, por
sua vez, sofre ciclização do intermediário 2,3-óxido de escaleno, produzido pela
reação catalisada por uma flavoproteína em presença de O2 e NADPH (DEWICK,
2002).
4.4.1.1 Identificação da substância 1
A substância 1 foi isolada do extrato diclorometânico das folhas de Z.

acuminatum como um sólido de coloração branca; a identificação deste composto
como um triterpeno do grupo lupânico, o lupeol, foi possível graças às técnicas
analíticas RMN 1H e CG-EM.
A B
HO
Substância 1
57

No espectro de RMN 1H da substância 1, acima representado na Figura 24,
podem ser observados seis singletos na região entre δ= 0,77 – 1,05 ppm, os quais
podem ser atribuídos aos hidrogênios metílicos ligados a carbonos terciários. A
presença de um singleto em δ=1,69 ppm correspondente a um grupamento metila
ligada a um carbono insaturado. Esses dados, juntamente com os sinais de
deslocamento químico em δ= 4,58 ppm (dd, J = 2,4 e 1,4 Hz) e em δ= 4,70 ppm (d, J
= 2,3 Hz), atribuídos à átomos de hidrogênio olefínicos, levaram à suposição da
natureza do triterpeno como do tipo lupânico.
1.04
0.98
0.77
0.84
0.96
1.70
4.70
4.58
4.58
4.71
4.57
4.59
3.19
3.16
2.38
3.24
2.41
1.92
1.94
1.87
1.99
3.22
1.88
2.35
2.44
2.46
8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0
Chemical Shift (ppm)
Figura 24. Espectro de RMN de 1H da substância 1 (200 MHz, CDCl3)

A presença de um sinal com deslocamento químico em δ= 3,20 ppm (dd, J =

5,1 e 10,2 Hz) e atribuído a um hidrogênio carbinólico em C-3 sugere a presença de
um grupamento hidroxila disposto em configuração equatorial. Os dados de RMN 1H
sugerem a identidade da substância 1 como triterpeno lupeol e cuja confirmação
estrutural foi conseguida através da técnica de espectrometria de massas, Figura 25,
com sinal de íon molecular m/z 426 Daltons referente a formula estrutural C30H50O:
Figura 25. Espectro de CG-EM da substância 1 (IE em 70 eV).

58

4.4.2 Cumarinas
As cumarinas representam uma classe de metabólitos secundários com

ampla distribuição no reino vegetal, com ênfase para as famílias da
Umbeliferae/Apiaceae e Rutaceae, as quais apresentam cumarinas com grande
diversidade estrutural.
As cumarinas têm origem biossintética a partir do ácido cinâmico, que ao
sofrer hidroxilação na posição orto, leva a formação do anel lactônico, dando origem
a estrutura denominada de cumarina. O ácido 4-cinâmico, por sua vez, leva a
formação da umbeliferona.
Além dessas cumarinas, outras estruturas mais complexas são encontradas
nas quais carbonos extras são incorporados a partir da unidade isoprênica, um
resumo da rota biosintética para as cumarinas esta esquematizada na
Figura 26.
isomerização cis-trans anel lactônico
CO2H CO2H
CO2H
OH OH O O
ácido cinámico
cumarina
CO2H CO2H
CO2H
HO HO OH HO OH HO O O
ácido 4-cumárico umbeliferona
OPP
DMAPP
DIFERENTES
CUMARINAS
Figura 26. Esquema geral para a rota biosintética das cumarinas
1
Os espectros de RMN H desta classe de compostos são facilmente
identificados pela presença de um sistema AX, referentes a dois dupletos em torno
59

de δ= 6,1 - 6,4 ppm e δ= 7,5 - 8,3 ppm, característicos de átomos de hidrogênio
olefínicos H-3 e H-4 do anel lactônico. (MURRAY, et al. 1982).
4.4.2.1 Identificação estrutural das cumarinas 2 – 5
As cumarinas 2 até 6, cujas estruturas químicas estão apresentadas abaixo,

foram isoladas da fração diclorometânica do extrato das folhas de Z. acuminatum,
identificadas e caracterizadas através de experimentos de RMN de uma e duas
dimensões e por espectrometria de massas.
OH
O O O
HO O O O O O
O
2
3 4
HO
OH
O O O O O O
O
OH
5 6
1
Na análise do resultados dos experimentos de RMN H das substâncias 2 até
6 são observados sinais com deslocamento químico em δ= 6,15 ppm e δ= 7,94 ppm
(1H, J = 10 Hz), característicos dos átomos de hidrogênio H-3 e H-4 do esqueleto
cumarínico.
O espectro de RMN 1H da cumarina 2, apresntado na Figura 27, mostra um
sinal dubleto com deslocamento químico em δ= 7,44 ppm (1H, J = 8,5 Hz), referente
ao átomo de hidrogênio H-5 acoplado em posição orto, com grande valor de
constante de acoplamento, ao átomo de hidrogênio H-6; um sinal duplo dubleto com
60

deslocamento químico em δ= 6,78 ppm (1H, J = 8,5 e 2,3 Hz) e referente ao mesmo
átomo de hidrogênio H-6 acoplado aos os átomos de hidrogênio H-5 em posição orto
e H-8 em posição meta e um sinal dubleto com deslocamento químico em δ= 6,70
ppm (1H, J = 2,3 Hz), atribuído ao átomo de hidrogênio H-8 acoplado com H-6 com
pequeno valor de constante de acoplamento:

1.00 0.98 1.04 0.78 0.85
8.1 8.0 7.9 7.8 7.7 7.6 7.5 7.4 7.3 7.2 7.1 7.0 6.9 6.8 6.7 6.6 6.5 6.4 6.3 6.2 6.1 6.0
1.00 0.98 1.04 0.85
8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0
1
Figura 27. Espectro de RMN de H da cumarina 2 (200 MHz, MEOD)

Estes dados espectroscópicos sugerem a estrutura da cumarina 2 como 7-
hidroxicumarina, a qual foi confirmada pelo espectro de massas com sinal do pico
[M+H] com m/z 163,0470 referente à fórmula molecular C9H6O3; este espectro de
massas está apresentado na Figura 28:
Intens. +MS, 0.1-0.3min #(3-16)
x105
4 163.0407
151.1132
0
60 80 100 120 140 160 m/z
Figura 28. Espectro de massas da cumarina 2 (ESI q-TOF).
A Figura 29 apresenta o espectro de RMN 1H da cumarina 3: além dos sinais

dos átomos de hidrogênio olefínicos H-3 e H-4 do esqueleto cumarínico, há a
61

presença de dois sinais dubletos com deslocamento químico em δ=7,88 ppm e
δ=6,96 ppm (J = 2,0 Hz) referentes aos átomos de hidrogênio de um anel furano.
Segundo MURRAY, duplos dubletos com constantes de acoplamento de 2,0
Hz conferem a uma furanocumarina um anel aromático orto com substituinte R em
posição orto em relação ao átomo de oxigênio do anel furano.
A presença de um sinal singleto largo com deslocamento químico em δ=7,57
ppm, além dos dados de multiplicidade para os átomos de hidrogênio do anel furano
e ausência de um acoplamento em W, no caso de um átomo de hidrogênio na
posição H-8 (dd, J = 1,0 Hz), confirmam uma estrutura do tipo furanocumarina
substituída em H-8.
2.66
1.24
1.28
1.00 1.08 1.05 0.94 1.06
8.1 8.0 7.9 7.8 7.7 7.6 7.5 7.4 7.3 7.2 7.1 7.0 6.9 6.8 6.7 6.6 6.5 6.4
7.57
7.89
7.88
6.96
6.96
4.46
3.86
3.85
4.48
4.45
3.87
4.43
3.84
6.40
6.37
8.04
8.02
4.74
4.73
4.76
4.76
1.00 1.08 1.05 0.94 1.06 0.14 1.30 1.34 3.25 3.19
9.5 9.0 8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0

O substituinte R foi identificado como O-3,3-dimetil-2,3-diidroxi proprila; este
composto foi caracterizado pela presença de dois sinais singletos com deslocamento
químico em δ=1,24 ppm e δ=1,28 ppm, referentes a dois grupamentos metila, bem
como um sistema ABM com deslocamentos químicos em δ=4,78 ppm (dd, J = 2,8 e
10,0 Hz), δ=4,45 ppm (dd, J = 2,8 e 10,0 Hz) e δ=3,86 ppm (dd, J = 2,8 e 8,0 Hz),
(Figura 30). A região na qual se encontram estes sinais é mostrada na Figura 30:

62

H H
H OH
OH
0.24 1.46 1.50
4.80 4.75 4.70 4.65 4.60 4.55 4.50 4.45 4.40 4.35 4.30 4.25 4.20 4.15 4.10 4.05 4.00 3.95 3.90 3.85 3.80
Figura 30. Ampliação do espectro de RMN de 1H da substância 3 (400 MHz, CDCl3)

O espectro de massas da cumarina 3 é mostrado na Figura 31; observam-se
um pico do íon protonado [M+H] com m/z 305,1015 e um pico do íon com aduto de
sódio [M+Na] com m/z 327,0833; estes valores de m/z estão de acordo com a
fórmula molecular C16H16O6 e com dados da literatura, indicando que a estrutura
proposta é heradenol (ROCHA, 2004):
Intens. +MS, 0.2-1.6min #(9-94)
x105
1.5
327.0833
1.0
305.1015
0.5
308.9744
328.0867
306.1049 312.0837
304.1079 316.0786 322.1279
0.0
305.0 307.5 310.0 312.5 315.0 317.5 320.0 322.5 325.0 327.5 m/z
Figura 31. Espectro de massas da cumarina 3 (ESI q-TOF)

No espectro de RMN 1H da substância 4 mostrado na Figura 32, observam-se
dois sinais singletos com deslocamento químico em δ=1,44 ppm (6H) e δ=1,65 ppm
(6H) e referentes a quatro grupamentos metila.
63

1.66
1.46
0.01
6.18
6.16
6.45
5.74
6.48
5.71
6.27
6.31
6.29
6.34
0.93 1.05 1.10 0.83
6.50 6.45 6.40 6.35 6.30 6.25 6.20 6.15 6.10 6.05 6.00 5.95 5.90 5.85 5.80 5.75 5.70
cumarina_P2_02.esp
4.87
4.90
4.87
4.89
4.92
4.92
4.96
4.96
6.18
6.16
7.97
6.45
8.00
5.74
6.48
5.71
4.87
4.90
4.92
4.96
6.27
6.31
2.59
5.05 5.00 4.95 4.90 4.85 4.80 4.75

1.00 0.93 1.05 1.10 0.83 2.59 6.10 5.63
8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0

Além destes sinais, há ainda os sinais referentes aos átomos de hidrogênio H-
3 e H-4, presença de sinal dubleto com deslocamento químico em δ=6,45 ppm (d, J
= 10 Hz) que acopla com um átomo de hidrogênio e um sinal dubleto com
deslocamento químico em δ=5,71 ppm (d, J = 10 Hz) e referente à átomos de
hidrogênio olefínico de um anel crômeno, como mostrado na Figura 33:
4.5
6.3, 4.92
5.0
6.47, 5.69 5.5

F1 Chemical Shift (ppm)
6.0
7.98, 6.16
6.5
7.0
7.5
8.0
8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0

Figura 33. Espectro de COSY 1H-1H da substância 4 (400 MHz, CDCl3)

Através dos espectros de HMBC e HSQC pode-se atribuir os valores de
deslocamentos químicos de todos os carbonos da substância 4. Segundo MURRAY,
sinais de duplos dubletos com deslocamento químico em torno de δ= 4,8 ppm
64

sugerem a presença de uma ligação dupla terminal. A interpretação do resultado do
experimento RMN HSQC, apresentado na Figura 34, mostra a presença de um sinal
de um átomo de hidrogênio com deslocamento químico em δ=6,29 ppm (dd, J = 10,8
e 17,2 Hz) acoplado a dois sinais de átomos de hidrogênio com deslocamento
químico em δ= 4,92 ppm (dd, J = 1,6 e 17,2 Hz) eδ= 4,86 ppm (dd, J = 1,6 e 10,7
Hz), juntamente com as correlações do sinal com deslocamento químico em δ= 6,29
ppm com o sinal em δ=150,0 ppm e dos sinais com deslocamento químico em
δ=4,92 ppm e 4,86 ppm com o sinal em δ=105,8 ppm:

1.45, 27.48
1.65, 29.78 20
40
60

80
4.93, 108.31 100

6.45, 114.84
4.87, 108.31
120
5.71, 130.43
140
7.97, 138.86
160
8 7 6 5 4 3 2
Figura 34. Mapa de contorno do experimento de HSQC da substância 4 (400 MHz,
CDCl3)
O resultado do experimento RMN HMBC apresentado na Figura 35 mostra os

acoplamentos verificados entre os grupamentos metila com deslocamento químico
em δ= 1,65 ppm (6H) e os átomos de carbono com deslocamento químico em
δ=30,0 ppm δ=40,1 ppm, δ=110,8 ppm e δ=150,0 ppm, os quais confirmam a
presença de um substituinte 1,1-dimetilalila:

65

-20
0
5.73, 27.62 1.45, 27.62
6.3, 29.84 4.94, 41.26 1.65, 29.84 20
4.87, 41.25 1.65, 41.8
40

60
5.71, 77.35 1.45, 77.27
80
6.45, 77.36 6.16, 104.11
100
1.45, 130.38
5.72, 106.12 120
1.65, 116.48
7.98, 154.63 1.65, 150.29 140
6.15, 161.43
160
6.45, 155.99
7.97, 161.43
8 7 6 5 4 3 2 1
Figura 35. Mapa de contorno do experimento de HMBC da substância 4 (400 MHz,
CDCl3)
A inexistência de um singleto referente a um átomo de hidrogênio aromático
levou à suposição da substituição de um grupamento hidroxila, o que pode ser
confirmado pela presença de um sinal de átomo de carbono com deslocamento
químico em δ=148,0 ppm, como mostrado acima no mapa de contorno para o
experimento RMM HMBC.
O sinal do átomo de hidrogênio com deslocamento químico em δ=7,94 ppm
referente ao átomo de hidrogênio H-4 e o sinal do átomo de hidrogênio com
deslocamento químico em δ=6,45 ppm e referente ao átomo H-3’ apresentam
acoplamento com o átomo de carbono com deslocamento químico em δ=148,0 ppm,
confirmando as presenças da hidroxila em posição C-5 e do anel pirano meta linear
66

OH
115,0 148,0 139,0
100,6 100,4
130,1 111,0
77,0 162,0
110,8
28,0 155,0
O 156,0 O O
41,0
30,0 150,0
110,8 .
O espectro de massas obtido e mostrado na Figura 36 apresenta o pico do

íon molecular protonado [M+H] com m/z 313,1421 e referente à fórmula molecular
C19H20O4; esta informação, juntamente com os dados espectroscópicos de RMN e
da literatura permitiram a identificação da cumarina 4 (SU et al, 2009):

I n te n s. + M S , 0 .1 -0 .9 m i n # (7 -5 1 )
x1 0 4
3 1 3 .1 4 2 1
8
6
2 7 9 .1 5 4 9
3 0 1 .1 3 8 6
2 0 5 .0 8 4 7
2 2 3 .0 9 5 9 2 5 7 .1 3 0 9
0
160 180 200 220 240 260 280 300 m /z
Figura 36. Espectro de massas da substância 4 (ESI TOF)

A inexistência de um singleto referente a um átomo de hidrogênio aromático
levou à suposição da substituição de um grupamento hidroxila, o que pode ser
confirmado pela presença de um sinal de átomo de carbono com deslocamento
químico em δ=148,0 ppm, como mostrado acima no mapa de contorno para o
experimento RMM HMBC.
O sinal do átomo de hidrogênio com deslocamento químico em δ=7,94 ppm
referente ao átomo de hidrogênio H-4 e o sinal do átomo de hidrogênio com
deslocamento químico em δ=6,45 ppm e referente ao átomo H-3’ apresentam
67

acoplamento com o átomo de carbono com deslocamento químico em δ=148,0 ppm,
confirmando as presenças da hidroxila em posição C-5 e do anel pirano meta linear.
OH
115,0 148,0 139,0
100,6 100,4
130,1 111,0
77,0 162,0
110,8
28,0 155,0
O 156,0 O O
41,0
30,0 150,0
110,8
O espectro de massas obtido e mostrado na Figura 36 apresenta o pico do

íon molecular protonado [M+H] com m/z 313,1421 e referente à fórmula molecular
C19H20O4; esta informação, juntamente com os dados espectroscópicos de RMN e
da literatura permitiram a identificação da cumarina 4 (SU et al, 2009):

In te n s. + M S , 0 .1 -0 .9 m i n # (7 -5 1 )
x1 0 4
3 1 3 .1 4 2 1
8
6
2 7 9 .1 5 4 9
3 0 1 .1 3 8 6
2 0 5 .0 8 4 7
2 2 3 .0 9 5 9 2 5 7 .1 3 0 9
0
160 180 200 220 240 260 280 300 m /z

Figura 37. Espectro de massas da substância 4 (ESI TOF)

Os dados de RMN 1H das cumarinas 2, 3 e 4 em comparação com os dados
da literatura estão sumarizados e apresentados na Tabela 11:
68

Tabela 11. Dados de RMN 1H das cumarinas 2, 3 e 5.
2 3 4
H/C H* H1 H* H2 H* H3
(CDCl3) (MEOD) (CDCl3) (CDCl3) (CDCl3) (CDCl3)

3 6,27 (d, 10,0 Hz) 6,10 (d, 9,5 Hz) 6,41 (d, 9,5 Hz) 6,37 (d, 9,5 Hz) 6,16 (d, 9,5 Hz) 6,11 (d, 9,6 Hz)
4 7,94 (d, 10,0 Hz) 7,79 (d, 9,5 Hz) 8,06 (d, 9,5 Hz) 8,07 (d, 9,5 Hz) 7,98 (d, 9,5 Hz) 8,09 (d, 9,6 Hz)
5 7,55 (d, 8,0 Hz) 7,42 (d, 8,4 Hz) 7,57 (sl) 7,39 (s) ‐ ‐
6 6,88 (dd, 8,0 e 2,0 6,77 (dd, 8,4 e 2,2 ‐ ‐ ‐ ‐
Hz) Hz)
8 6,80 (d, 2,0 Hz) 6,71 (d, 2,2 Hz) ‐ ‐ ‐ ‐
1’ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐
2’ ‐ ‐ 7,88 (d, 2,0 Hz) 7,69 (d, 2,0 Hz) ‐ ‐
3’ ‐ ‐ 6,96 (d, 2,0 Hz) 6,83 (d, 2,0 Hz) 6,45 (d, 10,0 Hz) 6,56 (d, 10,0 Hz)
4’ ‐ ‐ ‐ ‐ 5,71 (d, 10,0 Hz) 5,69 (d, 10,0 Hz)
5’ ‐ ‐ ‐ ‐ 1,44 (s) 1,44 (s)
6’ ‐ ‐ ‐ ‐ 1,44 (s) 1,44 (s)
1’’ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐
2’’ ‐ ‐ 4,45 (dd, 2,8 e 4,78 (dd, 1,0 e 2,4 6,29 (dd, 10,8 e 6,30 (dd, 10,6 e
10,0 Hz) Hz) 17,2 Hz) 17,3 Hz)
3a’’ ‐ ‐ 4,78 (dd, 2,8 e 4,78 (dd, 8,4 e 9,8 4,92 (dd, 1,6 e 4,93 (d, 17,3 Hz)
10,0 Hz) Hz) 17,2 Hz)
3b’’ ‐ ‐ 3,86 (dd, 2,8 e 8,0 3,82 (dd, 2,4 e 8,4 4,86 (dd, 1,6 e 4,87 (d, 10,7 Hz)
Hz) Hz) 10,7 Hz)
4’’ ‐ ‐ 1,24 (s) 1,25 (s) 1,65 (s) 1,66 (s)
5’’ ‐ ‐ 1,28 (s) 1,30 (s) 1,65 (s) 1,66 (s)
Valores experimentais ( * ); Valores de referência ( 1 ); CHEN et al, 2005, ( ); 2
ROCHA, 2004, ( 3 ); SU et al, 2009.
As substâncias 5 e 6 foram isoladas como um sólido viscoso de coloração

incolor e identificadas por RMN 1H, 13
C , COSY, HSQC, HMBC e Espectrometria de
massas.
1
Nos espectros de RMN H das substâncias 5 e 6, apresentados
respectivamente nas Figuras 37 e 38, são observados os sinais característicos de
átomos de hidrogênio H-3 e H-4 do anel cumarínico bem como os sinais dos átomos
de hidrogênio de um anel aromático C-7 substituído, conforme dados mostrados na
Erro! Fonte de referência não encontrada.:
69

7.65478
7.62353
7.38329
7.35496
7.27000
6.86617
6.85836
6.83785
6.83004
6.82320
6.26996
6.23822
5.59756
5.57657
5.55703
5.19911
5.17079
4.63658
4.61559
4.55064
4.54039
4.52330
4.51304
2.35474
2.32740
2.30933
2.28247
2.26050
2.24390
2.21509
2.19800
1.82445
1.71848
1.70579
9525b_1H
1.00 0.94 1.87 0.93 0.91 0.87 1.77 1.01
7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5

2.16
5 2.4 2.3 2.2 2.1
1.00 0.94 1.87 0.93 0.91 0.87 1.77 1.01 2.16 2.37 2.39 2.52
0.0 9.5 9.0 8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0
Figura 38. Espectro de RMN 1H da substância 5 (300 MHz, CDCl3)
umarina_geranil2_H.esp
7.67359
7.64201
7.39965
7.37123
6.88967
6.88137
6.86124
6.85335
6.84546
6.83756
6.28613
6.25455
5.68299
5.67746
5.66010
5.63957
5.53655
5.51878
5.51444
5.51010
5.49234
4.63618
4.61447
2.81452
2.79518
1.76692
1.73495
1.73100
1.72034
1.71600
1.34496
1.27273
1.01 0.94 2.04 0.84 1.78 0.79 0.61 2.21
7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5

1.01 0.94 2.04 0.84 1.78 0.79 0.61 2.21 0.66 1.14 0.03 2.14 1.31 3.71 1.28
7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0
70

Tabela 12. Dados de RMN 1H das cumarinas 5 e 6.
H 5* 5** 6*
(CDCl3) (CDCl3) (CDCl3)
3 6,25 (1H, d, J = 9,4 Hz) 6,22 (1H, d, J = 9,5 Hz) 6,27 (1H, d, J = 9,5 Hz)
4 7,64 (1H, d, J = 9,4 Hz) 7,62 (1H, d, J = 9,5 Hz) 7,65 (1H, d, J = 9,5 Hz)
5 7,37 (1H, d, J = 8,2 Hz) 7,34 (1H, dd, J = 0,5; 8,3 7,38 (1H, d, J = 8,2 Hz)
Hz)
6 6,82 81 (1H, dd, J = 2,3 6,81 (1H, dd, J = 2,4; 8,3 6,81 (1H, dd, J = 2,3;
Hz) Hz) 8,3 Hz)
8 6,86 (1H, d, J = 2,3 Hz) 6,79 (1H, dd, J = 2,4; 0,5 6,88 (1H, dd, J = 2,5
Hz) Hz)
1’ 4,59 (2H, d, J = 6,4 Hz) 4,59 (2H, br d, J = 6,5 Hz) 4,62 (2H, d, J = 6,4 Hz)
2’ 5,50 (1H, br t, J = 6,4 Hz) 5,55 (1H, tq, J = 6,5; 1,2 5,51 (1H, tq, J = 6,5;
Hz) 1,3 Hz)
3’ - - -
4’ 2,23 (2H, d, J = 13,6; 6,0 2,25 (2H, d, J = 13,8; 6,1 ~5,6 (2H, m)
Hz) Hz)
5’ 4,53 (1H, ddd, J = 7,2; 5,3; 4,51 (1H, ddd, J = 7,3; 5,4; ~5,6 (2H, m)
6,0 Hz) 6,1 Hz)
6’ 5,18 (1H, dq, J = 7,2; 1,5 5,15 (1H, dq, J = 7,3; 1,4 2,8 (1H, d, J = 5,8 Hz)
Hz) Hz)
7’ - - -
8’ 1,71 (3H, sl) 1,67 (3H, d, J = 1,4 Hz) 1,35 (3H, s)
9’ 1,82 (3H, s) 1,80 (3H, br d, J = 1,2 Hz) 1,27 (3H, s)
10’ 1,70 (3H, sl) 1,67 (3H, d, J = 1,4 Hz) 1,77 (3H, sl)
( * ) Valores experimentais; ( ** ) Valores de referência: ADJUIJ et al., 1989.
Além dos sinais característicos observados no espectro de RMN 1H da

substância 5, há sinais referentes à átomos de hidrogênio metilênico com
deslocamento químico em δ=4,59 ppm (2H, d, J = 6,4 Hz) e δ=2,23 ppm (2H, dd, J =
13,6; 6,0 Hz), à átomos de hidrogênio olefínico com deslocamento químico em δ=
4,53 ppm (2H, ddd, J = 7,2; 5,3; 6,0 Hz) e δ=5,15 ppm (1H, dq, J = 7,2; 1,5 Hz) e à
átomos de hidrogênio de grupos metila ligados à átomos de carbono com
hibridização sp2 e deslocamento químico em δ=1,71 ppm; δ=1,82 ppm e δ=1,70 ppm
(3H, sl).
71

13
O espectro de RMN C da substância 5 apresentou sinais de 19 átomos de
carbono, indicando a presença de um átomo de carbono lactônico com
deslocamento químico em δ=161,9 ppm e atribuído ao átomo de carbono C-2; uma
dupla ligação conjugada com grupamento carbonila com deslocamento químico em
δ =13,1 ppm e δ=143,4 ppm referentes aos átomos de carbono C-3 e C-4; um átomo
de carbono de grupamento éter com deslocamento químico em δ=65,2 ppm e outro
átomo de carbono ligado a grupamento hidroxila com deslocamento químico em
δ=66,4 ppm e atribuídos, respectivamente, aos átomos de carbono C-1’ e C-5’, e
sinais de duas duplas ligações referentes à cadeia alquílica com deslocamento
químico em δ =21,7 ppm, δ=138,9 ppm, δ=128,7 e δ=135,7 ppm referentes,
respectivamente, aos átomos de carbono C-2’, C-3’, C-6’ e C-7’, como mostrado nas
Figuras 39:

161.98576
161.21626
155.85358
143.38298
138.88103
135.53728
128.69908
127.29494
121.76567
113.17428
113.05529
101.57233
49525_13C
77.42442
77.00000
76.57559
66.38968
65.20370
47.70756
25.70154
18.21283
17.09032
176 168 160 152 144 136 128 120 112 104 96 88 80 72 64 56 48 40 32 24 16 8 0
Figura 40. Espectro de RMN 13C da substância 5 (300 MHz, CDCl3)
Estas multiplicidades indicaram a presença de um substituinte em C-7 O-

geranilado; as multiplicidades dos átomos de hidrogênio foram confirmadas a partir
do resultado do experimento RMN COSY, apresentado na Figura 41:
72

Giovana.003.esp
0.5
1.0
5.19, 1.71 1.5

4.63, 1.82
4.55, 2.26 2.0
2.5
3.0
3.5

4.0
5.19, 4.53
4.5
5.0
5.5
4.63, 5.58
7.65, 6.26 6.0
6.5
7.0
7.37, 6.83
7.5
6.86, 7.38
8.0
8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0
Figura 41. Espectro RMN COSY 1H-1H da substância 5 (300 MHz, CDCl3)
O resultado obtido no experimento RMN COSY revela que os átomos de

hidrogênio alílico com deslocamento químico em δ=4,62 ppm correlacionam-se com
os átomos de hidrogênio com deslocamento químico em de δ=5,57 ppm, enquanto
que o átomo de hidrogênio com deslocamento químico em δ=4,53 ppm correlaciona-
se com os átomos de hidrogênio com deslocamento químico em δ-2,25 ppm e
δ=5,18 ppm.
O resultado do experimento RMN HSQC mostrado na Figura 42 apresentou
correlações entre átomos de hidrogênio H-3 e H-4 e átomos de hidrogênio do anel
aromático com os respectivos carbonos. Também foram observadas correlações
entre: átomo de hidrogênio com deslocamento químico em δ=4,62 ppm e átomo de
carbono com deslocamento químico em δ=65,2 ppm; átomo de hidrogênio com
deslocamento químico em δ=5,57 ppm e átomo de carbono com deslocamento
químico em δ=121,7 ppm; átomo de hidrogênio com deslocamento químico em
δ=2,25 ppm e átomo de carbono com deslocamento químico em δ=47,7 ppm; átomo
de hidrogênio com deslocamento químico em δ=4,53 ppm e átomo de carbono com
deslocamento químico em δ=66,4 ppm; átomo de hidrogênio com deslocamento
químico em δ=5,18 ppm e átomo de carbono com deslocamento químico δ=128,7
ppm; átomo de hidrogênio com deslocamento químico em δ=1,82 ppm e átomo de
73

carbono com deslocamento químico em δ =8,2 ppm; átomo de hidrogênio com
deslocamento químico em δ=1,70 ppm e átomo de carbono com deslocamento
químico em δ 17,1 ppm; átomo de hidrogênio com deslocamento químico em δ=1,71
ppm e átomo de carbono com deslocamento químico em com δ=25, 7 ppm.
Giovana.004.esp
-10
0
1.73, 18.14
1.85, 18.17 10
20
30
1.73, 25.49
2.27, 47.73 40
50
4.53, 65.16

4.63, 66.37 60
70
80
90
6.83, 101.52
100
6.89, 114.09 6.25, 114.09

110
5.58, 122.89
120
7.37, 128.73
130
5.19, 128.7
140
7.64, 143.39 150
160
8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0
Figura 42. Mapa de contorno do experimento RMN HSQC da substância 5 (300

MHz, CDCl3)
A análise do resultado experimento RMN HMBC mostrado na Figura 43
permitiu confirmar o esqueleto cumarínico e atribuir as seguintes correlações entre
átomos de hidrogênio e carbono de grupo geranila: em δ 4,62 com δ 121,7 (J2), com
δ 138,78 (J3) e com δ 161,2 (J3), em δ 5,57 com δ 47,7 (J2) e com δ 18,2 (J3) em δ
2,25 com δ 18,2 (J2), com δ 66,4 (J2), com δ 128,7 (J3) e com δ 138,8 (J2), em δ 4,53
com δ 128,7 (J2), em δ 5,18 com δ 17,1 (J3) e com δ 25,7 (J3), em δ 1,82 com δ 47,7
(J3), com δ 121,7 (J3) e com δ 138,9 (J3), em δ 1,70 com δ 25,7 (J2) e δ 1,71 com δ
17,0 (J3) com δ 128,7 (J2) e δ 135,5 (J3).
7,37 7,64 127,3 143,4

6,82 6,15 113,2 113,1
161,2 161,9
O O O 65,2 O O O
4,62 6,86
2,25 5,18 47,7 128,7

5,57 4,53 1,70 121,7 66,4 17,1
135,5 138,8
OH 1,71 18,2
OH 25,7
1,82
74

7,37 7,64
6,82 6,15
4,62
O 6,86
O O
2,25 5,18
5,57 4,53 1,70
OH 1,71
1,82

Giovana.005.esp
-10
5.58, 18.17 1.73, 18.13 10

5.19, 19.67
1.7, 25.68 20
2.28, 18.13
30
5.19, 27.47
5.58, 47.71 1.82, 47.66 40
50
2.28, 66.23 60

70
80
6.82, 101.63 90
6.87, 101.65
100
6.88, 113.12 6.83, 113.22
110
4.63, 121.8 1.83, 121.84
6.25, 113.18 1.73, 128.58 120
7.64, 130.82
2.27, 121.84 130
4.63, 138.76
7.37, 143.4
140
1.73, 135.78
4.53, 138.79
7.38, 156.96 1.83, 138.79 150
160
6.89, 162.34 6.26, 162.03 4.63, 162.03 170

6.82, 162.3
180
8 7 6 5 4 3 2 1

CDCl3)
O espectro de massas obtido para a substância 5 e apresentado na Figura 43

mostra pico do íon molecular com m/z 337,1415 referente ao íon com aduto de sódio
[M+Na], de acordo com a massa molar 314,1518 e fórmula molecular C19H22O4. Esta
informação, juntamente com os dados espectroscópicos de RMN, confirmam a
natureza da substância 5 com uma cumarina geranilada com uma oxidação na
posição C-5’ e conhecida como anisocumarina:
75

Intens. +MS, 0.1-0.4min #(4-21)
x106
337.1430
1.5
1.0
0.5
297.1503
0.0
100 150 200 250 300 m/z
Figura 44. Espectro de massas [M+Na] da substância 5 e EM/EM 30 eV (ESI q-TOF)
Em espectrometria de massas é difícil identificar a razão m/z do íon protonado

[M+H] para as cumarinas geraniladas pois estes compostos sofrem rearranjo que
leva à perda de um substituinte e formação de uma cumarina hidroxilada na posição
C-7, denominada umbeliferona.
O mecanismo proposto para este rearranjo está apresentado na Figura 45:
OH O O OH HO O OH
H
m/z
163,0395
Figura 45. Rearranjo de McLafferty para a geração do fragmneto m/z 163.

Na Figura 45 está apresentado o resultado do experimento EM/EM com
energia de colisão de 30 eV para o íon com m/z 337,1415, no qual são observados
exclusivamente o íon [M+H] com m/z 163 e o respectivo íon [M+Na] com m/z 185:
Intens. +MS2(337.0000), 0.1-0.3min #(4-20)

x104
163.0408
1 185.0229
337.1436
135.1184
0
100 150 200 250 300 m/z
Figura 46. Espectro de EM/EM do íon [M+Na] de razão m/z de 337 (ESI-q-TOF)
Os valores de deslocamentos químicos de átomos de hidrogênio e carbono,

comparados com dados da literatura, estão sumarizados nas Erro! Fonte de referência
76

não encontrada. eTabela 13. A substância 6 não apresenta estrutura conhecida na
literatura tratando-se, portanto, de um composto inédito.
Tabela 13. Dados de RMN 13C das cumarinas 5 e 6.
5 6
H/C 13 13 13
C* C** C*
2 161,9 162,1 162,0
3 113,1 113,1 113,0
4 143,4 143,5 143,4
4a 112,1 112,6 112,5
5 127,3 127,4 127,3
6 113,2 113,2 113,3
7 161,2 161,3 161,3
8 101,6 101,7 101,6
8a 155,8 155,9 155,8
1’ 65,2 65,3 65,4
2’ 121,7 128,8*** 119,1
3’ 138,9 138,9 135,5
4’ 47,7 47,7 124,1
5’ 66,4 66,5 138,8
6’ 128,7 121,8*** 42,1
7’ 135,5 135,5 70,7
8’ 17,1 17,1 29,7
9’ 18,2 18,2 18,2
10’ 25,7 25,7 16,6
( * ) Valores experimentais; ( ** ) Valores de referência: ADJUIJ et al., 1989; ( *** )
Valores invertidos.
A substância 6 foi identificada como um isômero de 5. A comparação dos

resultados dos experimentos RMN 1H e suas respectivas multiplicidades indicam
tratar-se de isômeros estruturais na porção terminal do grupo geranila: o sinal com
deslocamento químico em δ=2,8 ppm (1H, d, J = 5,8 Hz) referente a um átomo de
hidrogênio metínico e a presença de átomos de hidrogênio de grupamento metila
com deslocamento químico em δ=1,77 ppm (sl), em δ=1,35 ppm (s) e em δ=1,27
ppm (s) são característicos de um grupo 6’-7’-epoxigeraniloxi.
Assim, a diferenciação proposta entre 5 e 6 foi a presença de um grupamento
epóxido gerado via ciclização intramolecular da substância 5.
No espectro de RMN 1H da substância 6 mostrado na Figura 46 também
foram observados: sinal referente a um átomo de hidrogênio metilênico com
deslocamento químico em δ=4,62 ppm (2H, d, J = 6,5 Hz), sinais de átomos de
hidrogênio olefínico com deslocamento químico em δ=5,51 ppm (1H, tq, J = 6,4,6;
77

1,2 Hz) e um multipleto com deslocamento químico em δ=5,6 ppm referente a dois
átomos de hidrogênio:
umarina_geranil2_H.esp
7.67359
7.64201
7.39965
7.37123
6.88967
6.88137
6.86124
6.85335
6.84546
6.83756
6.28613
6.25455
5.68299
5.67746
5.66010
5.63957
5.53655
5.51878
5.51444
5.51010
5.49234
4.63618
4.61447
2.81452
2.79518
1.76692
1.73495
1.73100
1.72034
1.71600
1.34496
1.27273
1.01 0.94 2.04 0.84 1.78 0.79 0.61 2.21
7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5

1.01 0.94 2.04 0.84 1.78 0.79 0.61 2.21 0.66 1.14 0.03 2.14 1.31 3.71 1.28
7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0
No resultado do experimento RMN COSY mostrado na Figura 48 é possível

observar as correlações entre átomos de hidrogênio com deslocamento químico em
δ=4,62 ppm e δ=5,51 ppm, δ=2,8 ppm e δ=5,68 ppm, que juntamente com os sinais
de correlações observados no espectro do HSQC (Figura ) do sinal em δ 2,8 com o
carbono em δ 42,1, o multipleto em δ 5,6 com os carbonos em δ 124,1 e δ 140,6 e
os sinais de correlações no espectro de HMBC (Figura) possibilitaram as atribuições
de todos os hidrogênios e carbonos da substância 6.
7,38 7,65 127,3 143,4

6,84 6,27 113,3 113,0
161,3 162,0
4,62
O 6,88
O O 65,4
O 101,6
O O
5,6 O 124,1 O
5,51 1,35 119,1 29,7
2,8 42,1
5,6 135,5 138,8 70,7
18,2
1,77 1,27 16,6
78

Os dados de RMN juntamente com os dados obtidos no espectro de massas
(Figura 47) em que é possível ver o íon protonado com relação m/z de 313,1435
estando de acordo com a fórmula molecular C19H20O4 e sua massa molar de
312,1361 confirmam a estrutura da substância 6.
162.07819
161.30113
155.86185
143.44502
141.03462
140.43201
128.69708
123.86832
119.30122
113.25140
113.01352
112.49020
101.57197
merson.003.esp
77.42816
77.20615
77.00000
76.57976
70.71230
65.43951
42.12032
29.83036
16.77923
176 168 160 152 144 136 128 120 112 104 96 88 80 72 64 56 48 40 32 24 16 8 0
Figura 47. Espectro de RMN de 13C da substância 6 (75 MHz, CDCl3)
cumarina_geranil2_cosy.esp
0.5
1.0
1.5
2.0
5.68, 2.8 2.5
3.0
3.5
4.0
5.5, 4.63
4.5
5.0
5.5
7.67, 6.27 6.0
6.5
7.38, 6.87
7.0
7.5
8.0
8.5
8 7 6 5 4 3 2 1
79

Figura 48. Espectro de COSY 1H-1H da substância 6 (300 MHz, CDCl3)
RMN UFSCAR.012.esp
8
1.77, 16.65
16
1.27, 29.68
1.35, 29.69 24
32
2.8, 41.99
40
48
56
4.63, 65.31

64
72
80
88
6.85, 101.44 96
104
6.27, 112.87
112
6.89, 113.13
120
7.39, 128.54 5.51, 119.17
5.68, 123.7 128
5.68, 140.3 136

7.66, 143.28
144
8 7 6 5 4 3 2 1
Figura 49. Mapa de contorno do experimento de HSQC da substância 6 (300 MHz,

CDCl3)
RMN UFSCAR.013.esp
16
24
32
40
48
56
64
72
80
88
96
104
6.27, 113.13
112
4.63, 119.39 2.81, 119.4
6.86, 113.13 2.81, 124.18 120
7.66, 128.7
128
4.63, 140.88 2.81, 140.21 136

7.38, 143.36
144
7.66, 161.25 152

6.28, 161.92 4.63, 161.92
7.38, 155.78 160
7.38, 162 168
7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0

CDCl3)
80

Intens. +MS, 0.2-1.3min #(8-60)
x105 163.0408
2.5
2.0
1.5
297.1486
1.0
0.5 229.0866
313.1435
0.0
75 100 125 150 175 200 225 250 275 300 m/z
Figura 51. Espectro de massas [M+Na] da substância 6 (ESI q-TOF)
4.4.2 Alcalóides

Os alcalóides representam uma classe de metabólitos secundários com
grande diversidade estrutural e constituem cerca de 20% de todas as substâncias
naturais descritas (DJALMA, 2005).
Os alcalóides são bases orgânicas nitrogenadas e representam uma classe
de metabolitos secundários encontrados principalmente em plantas, porém, há
ocorrências em microorganismos, insetos e anfíbios. Seu caráter básico deve-se à
presença de um ou mais átomos de nitrogênios em anéis heterecíclicos (SIMOTE,
2006).
Na família Rutaceae diferentes classe de alcalóides são encontrados e
classificados de acordo com sua origem biossintética: os derivados da fenilalanina e
tirosina, do triptofano, derivados do ácido antranílico, alcalóides derivados da
histidina e alcalóides de origem não definida, como os carbazóis. Os alcalóides
derivados do ácido antranílico são considerados marcadores quimiotaxonômicos da
família Rutaceae.
4.4.2.1 Alcalóides cantinônicos
As substâncias 7 e 8 foram isoladas do extrato diclorometánico de Z.

acuminatum e apresentaram-se como sólidos de coloração branca/amarelada sendo
identificadas por RMN de 1H e EM de alta resolução.
81

Os alcalóides cantinônicos apresentam espectros de RMN de hidrogênio
particulares, sendo observados dois dupletos em aproximadamente δ 7,90 e δ 8,80,
ambos com constantes de acoplamento igual a 5,0 Hz, referentes aos hidrogênios
H-1 e H-2 do anel piridínico (anel B).
11 1
12 14 2
10
9
13
15
N N
8
N 16 N
4
O 5 O OCH 3
OCH 3 OCH 3

Substância 7 Substância 8
Os espectros de RMN de 1H da substância 7 (Figura 47) e da substância 8

(Figura 48.) quando comparados, indicam que estes compostos diferem pelo número
de metoxilas.
O espectro de RMN 1H destes compostos apresentaram dois dupletos em
aproximadamente δ 7,90 e 8,60 ppm, ambos com J = 5,0 Hz, que são hidrogênios
referentes a H-1 e H-2 de um anel piridínico característico de alcalóides
cantinônicos.
Além disto, nos respectivos espectros de RMN de 1H para os alcalóides 7 e 8
é verificado em comum a presença de sinais de quatro hidrogênios aromáticos em δ
8,13 (dt, J = 7,8, 0,8 Hz) referente a H-8, δ 7,57 (ddd, J = 7,8, 7,5 e 1,0 Hz) referente
a H-9 acoplando com uma constante orto com H-8 e H-10 e uma meta com H-11, δ
7,74 (ddd, J = 7,8, 7,5 e 1,0 Hz) referente a H-10 e δ 8,74 (dl, J = 8,2 Hz) referente a
H-11. Esses dados evidenciam para essas estruturas um anel orto dissubstituído.
A presença de um singleto em δ 7,26 no espectro de RMN 1H da substância 7
indicou que há apenas uma substituição em C-4 ou C-5, sendo que o sinal em δ
4,08 indica que este substituinte deve ser o grupo metoxila. Para a substância 8 a
presença dos dois singletos em δ 4,09 e 4,48 e a ausência do singleto em δ 7,26
evidenciam a substituição em C-4 e C-5 pelos grupos metoxilas.

82

7.26
7.89
7.87
8.78
8.80
8.73
7.57
8.75
8.12
8.14
7.74
7.58
7.72
7.55
7.76
2.07 1.00 0.96 1.08 1.13 0.89
8.8 8.7 8.6 8.5 8.4 8.3 8.2 8.1 8.0 7.9 7.8 7.7 7.6 7.5 7.4 7.3 7.2
7.26
7.89
7.87
8.78
8.80
8.73
7.55 7.57
8.75
8.12
8.14
7.76 7.74
7.58
7.72
2.07 1.00 0.96 1.08 1.13 0.89 2.83
9.0 8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0

7.27
7.95
7.94
8.86
8.85
7.52
7.51 7.52
7.72
7.53
7.54
8.12
8.67
8.68
8.10
7.70
8.11
7.71
8.68
8.66
8.10
7.73
7.73
7.70
7.50
1.01 0.92 1.02 1.00 1.17 1.08
8.9 8.8 8.7 8.6 8.5 8.4 8.3 8.2 8.1 8.0 7.9 7.8 7.7 7.6 7.5 7.4
7.95
7.94
8.86
8.85
7.52
7.72
7.53
7.54
8.12
8.68
8.67
8.10
7.70
8.11
7.71
8.68
8.66
7.73
7.73
7.70
1.01 0.92 1.02 1.00 1.17 1.08 2.86 2.97
9.0 8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0
Os dados de RMN de 1H das substâncias 5 e 6, em comparação com os

dados da literatura, estão sumarizados na Tabela 14. Estes dados juntamente com
os espectros de massas apresenrados nas Figura 52 e 53 e seus respectivos picos
do íon molecular protonado [M+H] com relação m/z de 250,0797, referente à fórmula
molecular C15H10N2O2 e o pico do íon molecular com relação m/z de 280,0848,
referente a fórmula molecular C16H12N2O3, levaram a identificação do alcalóide 7
como o 5-metóxicantin-6-ona e o alcalóide 8 como o 4,5-dimetóxicantin-6-ona.
83

Intens. +MS, 0.1-1.1min #(4-66)
x106
3 251.0816
0
60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 m/z
Figura 49. Espectro de massas da substância 7 (ESI Q-TOF)

Intens. +MS, 0.1-1.3min #(6-80)
x106
281.0933
0
50 75 100 125 150 175 200 225 250 275 m/z

Tabela 14. Dados de RMN 1H dos alcalóides 7 e 8
5 (SIMOTE, 2006) 6 (SIMOTE, 2006)
H
(CDCl3, 400 MHz) (CDCl3, 400 MHz) (CDCl3, 500 MHz) (CDCl3, 400 MHz)
1 7,89 (d, J = 5,0 Hz) 7,84 (d, J = 5,1 Hz) 7,94 (d, J = 5,0 Hz) 7,95 (d, J = 5,0 Hz)
2 8,79 (d, J = 5,0 Hz) 8,76 (d, J = 5,1 Hz) 8,85 (d, J = 5,0 Hz) 8,86 (d, J = 5,0 Hz)
4 7,26 s 7,21, s --- ---

8,13 (dt, J = 7,8, 8,09 (dt, J = 8,0, 8,11 (ddd, J = 7,8, 8,11 (ddd, J = 7,8,
8
0,8 Hz) 1,0 Hz) 7,6, 0,8 Hz) 7,6, 0,8 Hz)
7,74 (ddd, J = 7,8, 7,70 (td, J = 8,1, 7,52 (ddd, J = 7,8, 7,52 (ddd, J = 7,8,
9
7,6, 1,0 Hz) 1,2 Hz) 7,6, 1,0 Hz) 7,6, 1,0 Hz)
7,57 (ddd, J = 7,8, 7,56 (td, J = 7,8, 7,71 (ddd, J = 8,0, 7,71 (ddd, J = 8,0,
10
7,5, 1,0 Hz) 1,2 Hz) 7,0, 0,8 Hz) 7,0, 0,8 Hz)
8,67 (td, J = 8,0, 8,67 (td, J = 8,0,
11 8,74 (d, J = 8,1 Hz) 8,71 (d, J = 8,1 Hz)
1,0 Hz) 1,0 Hz)
4-
--- --- 4,47, s 4,48, s
OCH3
5-
4,08 s 4,07, s 4,09, s 4,09, s
OCH3

4.4.2.2 Alcalóides β-carbolínico
A substância 9 foi isolada do extrato diclorometânico de Z. acuminatum e

1
identificada como alcalóide β-carbolínico por RMN H, HSQC, HMBC e
Espectrometria de massas de alta resolução. Os alcalóides β- carbolínico
1
substituídos na posição 1 podem ser identificados por RMN H através dos
84

deslocamentos químicos dos átomos de hidrogênio H-3 e H-4 na faixa entre δ=8,15
– 8,55 ppm e δ=7,80 – 8,35 ppm, respectivamente, e com constantes de
acoplamento na ordem de 5,0 – 6,0 Hz.
5 4
6 3
9 N
HO 7
8
N 1
H 1´
2´
Substância 9
No espectro de RMN 1H obtido para a substância 9 e apresentado na Figura

55 observam-se dois dubletos com deslocamento químico em δ=8,17 ppm (d, J =
4,4 Hz) e δ=7,88 ppm (d, J = 4,4 Hz), referentes aos átomos de hidrogênio H-3 e H-4
do anel pirimidínico, além de um dubleto com deslocamento químico em δ=8,01 ppm
(d, J = 6,9 Hz), referente ao átomo de hidrogênio H-5 acoplado tanto em posição orto
com átomo de hidrogênio H-6 e deslocamento químico em δ=6,84 ppm (dd, J = 6,9 e
1,7 Hz) quanto em posição meta com deslocamento químico em δ=6,99 ppm (sl):
1.00 1.02 1.00 1.00 1.08
8.2 8.1 8.0 7.9 7.8 7.7 7.6 7.5 7.4 7.3 7.2 7.1 7.0 6.9 6.8
1.46829
1.82 3.53
3.20 3.15 3.10 1.45 1.40

Chemica
1.45286
1.48329
3.18831
6.99816
3.20331
8.02529
8.00815
7.89931
8.18213
8.17141
7.88817
6.85633
6.85290
6.83919
6.83619
3.21917
3.17289
8.59521
0.70 1.00 1.03 0.97 0.99 1.15 1.78 2.78
0 9.5 9.0 8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0
Figura 51. Espectro de RMN de 1H da substância 9 (300 MHz, MeOD)
85

No espectro de RMN 1H acima também são observados um quadrupleto com
deslocamento químico em δ=3,14 ppm (q, J = 6,1 Hz, 2H) e um tripleto com
deslocamento químico em δ=1,46 ppm(t, J = 6,1 Hz, 3H), os quais confirmam a
presença de um grupo etila como substituinte no átomo de carbono C-1.
O acoplamento destes átomos de hidrogênio pode ser observado no resultado
do experimento RMN COSY apresentado na Figura 56:
_ p
3.2, 1.45 1

4
6
8.02, 6.85 7, 6.86
8.16, 7.87
8 7 6 5 4 3 2
Figura 52. Espectro de COSY 1H-1H da substância 9 (300 MHz, MeOD).

86

Os experimentos RMN HSQC e HMBC são mostrados nas Figuras 57 e 58:

RMN_centralUSP.008.esp
3.19, 26.02
1.47, 29.36 20
40

60
80
7, 96.45
6.85, 110.07 100
7.9, 112.07 120

8.18, 135.65
140
8 7 6 5 4 3 2 1
Figura 53. Mapa de correlações de HSQC da substância 9 (300 MHz, MeOD).

RMN_centralUSP.007.esp
3.2, 12.5 0
1.47, 26.01
20
40
60
80
8.18, 111.91
100
6.85, 96.46
8.02, 130.04 120
7.89, 134.02 3.2, 134.15
3.2, 145.36
140
8.02, 143.62 1.47, 145.23

160
8.02, 159.07
180
200
9 8 7 6 5 4 3 2 1
Figura 54. Mapa de correlações de HMBC da substância 9 (300 MHz, MeOD).

87

Os resultados obtidos nos experimentos RMN HSQC e HMBC permitiram a
correlação entre átomos de hidrogênio com deslocamento químico em δ=3,18 ppm e
átomos de carbono com deslocamento químico em δ= 26,0 ppm, δ=125,0 ppm,
δ=145,36 ppm e δ=134,1, os quais podem ser atribuídos, respectivamente, aos
átomos de carbonos C-1’, C-4a e C-9a.
A partir do sinal com deslocamento químico em δ=1,46 ppm foi possível
verificar as correlações dos sinais referentes aos átomos de carbono com
deslocamento químico em δ=26,0 ppm, δ=29,3 ppm e δ=145,36 ppm; estas
correlações levaram `a atribuição dos valores de deslocamentos químicos de todos
os átomos de carbono do alcalóide 9.
Os dados espectroscópicos de RMN 13C apresentados na Tabela 15,
juntamente com o pico do íon molecular protonado [M+H] com m/z 213,1027 e
referente a fórmula molecular C13H12N2O, obtido a partir do espectro de massas
apresentado na Figura 59, confirmaram a natureza do alcalóide como 7-hidróxi-1-
etil- β-carbonila.

Intens. x_alcal_CH2CH3_01.d: +MS, 0.1-1.0min #(6-62)
x105
213.1048
6
0
x104 x_alcal_CH2CH3_02.d: +MS2(213.0000), 0.1-1.2min #(3-69)
2.0
198.0812
1.5
1.0
170.0640
0.5
131.0557 154.0701 181.0793

0.0
60 80 100 120 140 160 180 200 m/z

88

Tabela 15. Dados de RMN 13C do alcalóide 9.
C 9
1 145,2
2 -
3 135,6
4 112,0
4a 130,0
5 122,3
5a 143,6
6 110,0
7 159,0
8 96,45
8a 114,3
9 -
9a 134,1
1’ 26,0
2’ 29,3

4.4.2.3 Alcalóide acridônico
O composto 10 foi isolado como sólido de coloração amarela e identificado

por RMN 1H, HSQC e HMBC, em comparação com a literatura (BERGENTHAL et
aL., 1979).

O OH
8 1
13 12 OCH3
7
2
5
14
N 11
4
3
OCH3

Substância 10

No espectro de RMN 1H de 10 (Figura 56) é possível verificar a presença de
quatro sinais na região de átomos de hidrogênio aromático, com deslocamentos
químicos em δ=8,37 ppm (dd, J = 8,0 e 1,6 Hz), δ=7,69 ppm (ddd, J = 8,8; 7,0 e 1,4
Hz), δ=7,62 ppm (dl, J = 8,4 Hz) e δ=7,25 ppm (ddd, J = 8,0; 7,2 e 1,2 Hz),
referentes aos átomos de hidrogênio H-8, H-7, H-5 E H-6, respectivamente,
evidenciando um anel orto substituído
89

3.94
4.02
3.82
14.76
7.28
6.24
7.52
8.39
8.44
7.68
7.73
7.24
7.71
7.76
0.84 1.10 1.20 1.80 1.00 2.98
14 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0
1
Figura 56. Espectro de RMN de H da substância 10 (200 MHz, CDCl3).

Além disto, foram observados três singletos relativos a grupos metila ligados a
um heteroátomo com deslocamento químico em δ=4,02 ppm, δ=3,94 ppm e δ=3,82
ppm, um singleto de átomo de hidrogênio aromático com deslocamento químico em
δ=6,24 ppm e um sinal com deslocamento químico em δ 14,76 ppm referente a um
grupo hidroxila quelado.
Estes dados espectroscópicos, em conjunto com o conhecimento de que em
plantas da família Rutaceae é verificada a ocorrência de alcalóides derivados do
ácido antranílico, sugere que a substância 10 é um alcalóide acridônico.
A presença de um grupo hidroxila quelado evidencia a presença de uma
substituição em C-1 por uma hidroxila. Os sinais com deslocamento químico em δ=
4,02 ppm, δ= 3,94 ppm e δ= 3,82 ppm apresentam correlações no mapa de HSQC (
apresentado na Figura 57) com átomos com deslocamento químico em δ=61,3 ppm ,
δ= 56,2 ppm e δ= 34,6 ppm, confirmando assim a presença de dois grupos metoxila,
onde o sinal mais blindado em δ=3,82 ppm correspondente a um grupo N-CH3.
No mapa de correlações de HMBC, apresentado na Figura 58, o sinal com
deslocamento químico δ=6,24 ppm apresenta correlação com os sinais de átomos
de carbono com deslocamento em δ=130,2 ppm e 159,8 ppm, confirmando a
presença das metoxilas em C-2 e C-3.
90

20
3.76, 33.41
40
4, 55.18
60

3.92, 62.55
6.22, 86.14 80
100
8.39, 125.75
120
7.26, 120.82
7.7, 133.29 140
9 8 7 6 5 4
Figura 57. Mapa de correlações de HSQC da substância 10 (400 MHz, CDCl3).
20
40
60
7.49, 77.36
80
7.27, 114.6
7.71, 114.81 7.27, 121.34 100
8.4, 130.19 120

7.27, 134.15
8.4, 141.9
6.23, 130.22 140
7.48, 133.76
6.23, 140.3
160
8.4, 180.68 7.27, 142.02
180
7.48, 180.67
6.24, 180.91 200
10 9 8 7 6 5 4 3
Figura 58. Mapa de correlações de HMBC da substância 10 (400 MHz, CDCl3).
91

Os deslocamentos químicos dos átomos de carbono foram atribuídos a partir
dos dados obtidos pelos mapas de correlações de HSQC e HMBC; estes dados
estão sumarizados juntamente com os dados de RMN1H na Tabela 16.
Os dados espectroscópicos indicam que o composto 10 é um alcalóide
acridônico substituído em C-1, C-2 e C-3; este composto é conhecido como
arborinina, com ampla ocorrência na família Rutaceae.
No espectro de massas obtido a partir de respectivas variações de energia de
colisão é possível identificar o pico do íon molecular protonado [M+H] m/z 286,1088,
correspondente à fórmula molecular C16H15N O4. Os dados espectrométricos são
mostrados na Tabela 16 e na Figura 59:
Tabela 16. Dados de RMN de 1H e de 13C da substância 10

1 13 13
H/C H C* C**
1 - 157,2 155,8
2 - 130,2 130,2
3 - 159,8 159,2
4 6,21 (s) 86,8 86,7
5 7,25 (ddd, J = 8,0; 7,2, 115,3 114.5
1,2 Hz)
6 7,62 (dl, J = 8,4 Hz) 133,9 133,9
7 7,69 (ddd, J = 8,8; 7,0, 121,2 121,4
1,4 Hz)
8 8,37 (dd, J = 8,0, 1,6 Hz) 126,2 126,6
9 - 193,7 180,8
10 - - -
11 - 142,6 140,4
12 - 105,4 105,8
13 - 120,0 120,7
14 - 146,6 142,0
N-CH3 3,79 (s, 3H) 34,6 34,1
2-OCH3 3,91 (s, 3H) 61,3 60,8
3-OCH3 4,09 (s, 3H) 56,2 56,0
( * ) Valores experimentais; ( ** ) Valores de referência; BERGENTHAL et aL., 1979.
92

Intens. alcaloide000003.d: +MS, 0.1-1.0min #(7-75)
x105
286.0353
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
239.1740 267.1997
0.0
x105 alcaloide000015.d: +MS2(286.1088), 15eV , 0.7min #36
286.1088
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
1.25 271.0853 286.1091
1.00
0.75
0.50 253.0748
0.25
225.0798
0.00
1.50
225.0796
1.25
1.00
253.0745
0.75
271.0849
0.50
0.25 197.0846
0.00
1.25 225.0789
1.00
0.75
182.0607 197.0839
0.50
0.25 242.0816 253.0738

168.0810 270.0770
0.00
50 75 100 125 150 175 200 225 250 275 m/z
Figura 59. Espectro de massas da substância 10 com respectivas variações de

energia de colisão (ESI Q-TOF – 15 / 25 / 35 / 45 eV)

93

4.5 Estudo de produtos naturais na busca por inibidores
4.5.1 Produtos naturais isolados de Zanthoxylum acuminatum
As substâncias isoladas de Z. acuminatum foram inicialmente ensaiadas

frente a catepsina L e a catepsina V na concentração única de 25 µM, os valores de
inibição frente as duas enzimas estão apresentados na Tabela 17.
Tabela 17. Valores de inibição a 25 µM para os compostos isolados de Z.

acuminatum frente a catepsina L e V.
Substância Catepsina L (%) Catepsina V (%)

1 0 0
2 0 15
3 0 14
4 0 0
5 53 8
6 ND* ND
7 27 17
8 28 15
9 16 15
10 0 0
(*): ND = Não determinado
Dentre os compostos ensaiados, apenas cumarina geranilada,

substância 5, apresentou inibição superior a 50%, mostrando-se mais ativa e
seletiva frente a catepsina L. O valor de IC50 foi de 30 µM para a catepsina L e de
102 µM para a catepsina L. Estes valores de potência frente às catepsinas L e V
foram determinados a partir de método gráfico de regressão não linear e estão
apresentados nas Figura 60 e 65:
94

100
80
60
% Inibição
R Rsqr Adj Rsqr Standard Error of Estimate

0,9930 0,9961 0,9792 4,8613
40 Coefficient Std. Error t P
y0 0,0000 4,8613 0,0000 1,0000
a 140,4500 19,0878 7,3581 0,0018
20 b 29,6687 3,3943 3,5344 0,0241
0
0 10 20 30 40 50 60
[ S_5 ] µM
Figura 60. Gráfico de IC50 da substância 5 frente a catepsina L.
100
80
60
% Inibição
R Rsqr Adj Rsqr Standard Error of Estimate

40
0,9982 0,9964 0,9939 2,3519
Coefficient Std. Error t P
y0 0,0000 2,3519 0,0000 1,0000
20 a 263,1535 64,3519 4,0893 0,0264
b 102,9139 11,6080 3,0622 0,0549
0
0 10 20 30 40 50
[ S_5 ] µM
Figura 61. Gráfico de IC50 da substância 5 frente a catepsina V.
4.5.2 Produtos naturais isolados de Swinglea glutinosa
Visando a busca por inibidores específicos para enzimas e baseando-se nos

resultados preliminares obtidos em projeto de doutorado anterior (SEVERINO,
2008), no qual os alcalóides acridônicos são substâncias alvos de grande
importância na busca por inibidores destas enzima, realizou-se um estudo
complementar com os alcalóides isolados de Swinglea glutinosa frente à catepsina
L.
95

A série avaliada continha 11 compostos de origem natural sem nenhuma
modificação estrutural. Para esta série foi determinado o valor de potencia de
inibição (IC50) frente a catepsina L, a fim de comparação entre as catepsinas V e L.
Os valores de potência e seletividade obtidos para esta série estão apresentados na
Tabela 18:
Tabela 18. Valores de potência e de seletividade dos alcalóides acridônicos isolados

frente as catepsinas L e V.
Catepsina Catepsina
L V Seletividade
Inibidor Estrutura
IC50 (µM) IC50 (µM)* (S)
O OH
PN_AC_01 0,9 ± 0,1 1,5 ± 0,2 0,6
N OH
OH OCH3
O OH
PN_AC_02 0,8 ± 0,09 3,9 ± 0,9 0,2
N OH
OH
O OH
PN_AC_03 1,7 ± 0,2 2,2 ± 0,2 0,8

N OH
OH OCH3
O OH
PN_AC_04 N OH 23 ± 2 26 ± 5 0,9
OH
O OH
PN_AC_05 19 ± 2 9,8 ± 1 2,0

N OH
OH OCH3
96

O OH
PN_AC_06 1,9 ± 0,2 2,2 ± 0,6 0,9

N OCH3
OH OCH3
O OH
OCH3
PN_AC_07 1,5 ± 0,2 1,2 ± 0,1 1,3

N OCH3
OH OCH3
O OH
PN_AC_08 62 ± 5 48 ± 5 1,3
N O
OH
O OH
PN_AC_09 57 ± 5 44 ± 3 1,3
N O
OH OCH3
O OH
PN_AC_10 OH 16 ± 0,9 5,2 ± 0,2 3,0

N O
OH OCH3
OH
O O
PN_AC_11 7 ± 0,5 2,8 ± 0,7 2,5

N OH
OH OCH3
* Dados obtidos no projeto FAPESP 2003/12588-0: (SEVERINO, 2008)

O fator de potência deste grupo de compostos pode ser representado pela
razão entre os valores maiores e menores. Neste caso, as ordens de grandeza são
de aproximadamente 78 para a catepsina L e de 40 para a catepsina V; estes dados
não representam uma ampla faixa de distribuição. A presença de inibidores nas
faixas de alta, moderada e baixa potência é desejada quando se requer informações
97

mais detalhadas sobre a natureza das relações entre a estrutura e atividade (SAR)
de uma série de compostos.
Por outro lado, a pequena faixa de potência verificada pode ser avaliada
como forma a apontar os alcalóides acridônicos como potentes inibidores tanto da
catepsina L como da catepsina VDentre os compostos testados, a variação entre os
valores de IC50 encontrados foi de 0,9 a 57 µM para a catepsina L e de 1,5 a 48 µM
para a catepsina V.
Dentre os compostos testados, a variação entre os valores de IC50
encontrados está entre 0,9 e 57 µM para a catepsina L e entre 1,5 e 48 µM para a
catepsina V. Os compostos considerados como os mais potentes da série foram
PN_AC_01 e o PN_AC_02, com valores respectivos de IC50 de 0,9 e 0,8 µM frente a
catepsina L. O composto PN_AC_07 apresentou-se como o composto mais potente
frente a catepsina V, com valor de IC50 de 1,2 µM.
Na busca por novas espécies químicas que sirvam como fármacos ou
protótipos é de suma importância a seletividade de um composto alvo frente a
apenas uma enzima. As catepsinas L e V apresentam alta similaridade, assim, a
busca por inibidores seletivos é um grande desafio. A seletividade verificada nesta
pequena série de compostos com pouca diversidade estrutural foi baixa, porém,
compostos como PN_AC_05 e PN_AC_11 apresentaram seletividade cerca de duas
vezes maior frente a catepsina V, enquanto que o composto PN_AC_10, cerca de
três vezes.
A presença do grupo substituinte prenila em C-8 no anel A não interfere na
potência destes compostos quando se compara os compostos PN_AC_01 e
PN_AC_03; assim também ocorre com a presença de um grupo metoxila em C-4
quando comparados os compostos PN_AC_01 e PN_AC_02.
Para os compostos PN_AC_03 e o PN_AC_04 verifica-se que a presença do
grupo prenila em C-2 no anel B é grande importância para o mecanismo de inibição,
levando a diminuição no valor de potência por um fator de 25 vezes; a ausência do
grupo prenila no composto PN_AC_05 reafirma esta observação.
Além disto, a comparação entre os compostos PN_AC_05, PN_AC_06 e
PN_AC_07 leva à constatação que o grupo metoxila em C-3 ocasiona um aumento
da potência, porém, o acréscimo de mais um grupo metoxila em C-2 não ocasiona
diferença significativa.
98

É interessante observar que na série de alcalóides ensaiados a presença do
grupo prenila leva a melhor participação na potência em relação aos compostos
onde houve ciclização intra-molecular do grupo prenila com formação de um novo
anel. Além disto, ao comparar os valores de IC50 dos alcalóides prenilados em
relação aos alcalóides que sofreram ciclização, é possível verificar que os prenilados
demonstram uma tendência mais seletiva para a catepsina L, enquanto que os
ciclizados são mais seletivos para a catepsina V.
Mesmo com a moderada seletividade apresentada nesta série, as informações
obtidas são altamente relevantes, podendo servir como subsídio para o
planejamento de rotas de síntese de compostos que apresentem maiores valores de
potência e seletividade frente a uma das enzimas estudadas. Cabe também
ressaltar que os dados obtidos aqui apresentados são inéditos para as enzimas
alvos e reforçam a importância dos mesmos.
4.6 Estudo de produtos sintéticos na busca de inibidores
Em prosseguimento na busca por inibidores específicos para a catepsina L,

após obtenção de resultado preliminar no qual verificou-se que os alcalóides
acridônicos são inibidores de catepsinas, foram ensaiados algumas substâncias
sintéticas tais como ácidos N-aril antranílicos, alcalóides acridônicos sintéticos e
uma série de alcalóides 4‐quinolínicos-2-substituídos sintetizados no Laboratório de
Síntese de Produtos Naturais da UFSCar.
4.6.1 Produtos sintéticos: ácidos N-aril antranílicos
Os ácidos N-aril antranílicos foram sintetizados no Laboratório de Síntese de

Produtos Naturais da UFSCar, de acordo com metodologia sintética por irradiação
com microondas, via acoplamento de Ullmann entre o ácido antranílico e diferentes
brometos de aril (BUENO, et al., 2008).
A série avaliada continha 17 compostos nos quais os substituintes foram
variados aleatoriamente nas posições R1; R2; R3; R4 e R5 , como apresentado na
Figura 62:
99

R4
2 3 5
R R R
R1 N
H COOH
Figura 62. Estrutura geral para o ácido N-aril antranílico

Para essa série foram determinados valor de potencia de inibição (IC50) e

seletividade (S), os quais estão apresentados na Tabela 19:
O valor de potência para esta série foi de 23 para a catepsina L e 52 para a
catepsina V; a variação entre os valores de IC50 encontrados está na faixa entre 2,1
e 26,2 µM para a catepsina L e 0,96 e 25,2 µM para a catepsina V.
Dentre os ácidos N-aril antranílicos o composto mais potente foi o composto
A_11, com valor de potência de 0,96 µM, configurando-se um inibidor cerca de três
vezes mais seletivo frente à catepsina V. No geral, esta série de compostos
demonstrou comportamento mais seletivo frente a catepsina V, como pôde ser
verificado para os compostos A_08, A_13, A_14, A_15, A_16 e A_17.
Uma comparação detalhada entre as estruturas dos compostos A_1 e A_2,
entre A_3 e A_4 e entre A_6 e A_7 e suas respectivas potências permitem concluir
que há grande relação estrutura e atividade para estes pares de compostos pois a
adição de uma metoxila em R-3 leva a diminuição da potência por um fator acima de
cinqüenta vezes.
A presença do grupo nitro em R-1 acarreta um aumento na potência inibitória
dos compostos A_6 e A_8 em comparação com seus respectivos compostos
análogos A_3 e A_5, nos quais há presença de uma metoxila em R-1.
Para os compostos A_13 e A_14, a substituição do grupo benzílico de R-2
para R-1, em comparação com os seus respectivos análogos, demonstrou que a
presença de BnO em R-2 levou à maior potência e seletividade deste composto
frente a catepsina L. No caso composto A_14, onde o substituinte BnO localiza-se
em R-1, verifica-se o oposto, ou seja, maior potência e seletividade para a catepsina
V.
100

Os compostos A_10 e A_11 apresentam anel aromático adicional e diferem
pela presença dos substituintes nitro e metoxil em R-1. Esta diferença estrutural
acarretou pequena diferenciação no valor de potência para a catepsina L; também
foi observado que a presença do grupo nitro em R-1 possibilitou maior seletividade
deste inibidor frente a catepsina V.
Tabela 19. Valores de potência e de seletividade dos ácidos N-aril antranílicos frente
às catepsinas L e V.
ESTRUTRURA Seletividade
Catepsina L Catepsina V (S)
Inibidor
IC50 (µM) IC50 (µM)

A_01 3,2 ± 0,4 6,9 ± 0,1 0,5

N
H
CO2H

O O
A_02 > 50 > 50 ‐

N
H
CO2H

A_03 26 ± 0,3 25 ± 0,3 1,0

O N
H
CO2H

O O
A_04 > 50 > 50 ‐

O N
H
CO2H

101

F
O F
A_05 11 ± 0,3 9 ± 0,4 1,2

O N
H
CO2H

A_06 5,7 ± 0,1 6,8 ± 0,2 0,9

O2 N N
H
CO2H

O O
A_07 > 50 > 50 ‐

O2N N
H
CO2H

F
O F
A_08 7,2 ± 0,2 3,5 ± 0,02 2,0

O2N N
H
CO2H

O
O O O
A_09 18,2 ± 0,04 12,3 ± 1,3 1,5

O2 N N
H
CO2H

A_10 O N
2,1 ± 0,005 1,8 ± 0,01 1,2
H
CO2H

102

O
A_11 2,9 ± 0,3 1 ± 0.06 3,0

O2 N N
H
CO2H

O NO2
A_12 > 50 > 50 ‐

N
H
CO2H

NO2
A_13 O N 2,5 ± 0,05 1,5 ± 0,04 1,7

H
CO2H

A_14 O N 7,9 ± 0.23 2,1 ± 0,2 3,8

H
CO2H

NO2
A_15 43 ± 0,2 10 ± 0,8 4,4

N
H
CO2H

O NO2
A_16 45 ± 0.04 15 ± 0,5 3,1

N
H
CO2H

O
A_17 > 50 > 50 ‐

N
H
CO2H

103

4.6.2 Produtos sintéticos: alcalóides acridônicos
Os ácidos N-aril antranílicos foram submetidos à ciclização, dando origem a

10 alcalóides acridônicos. Estes compostos foram avaliados frente a catepsina L e
catepsina V. Determinadou-se a potencia de inibição (IC50) e a seletividade (S); os
dados obtidos estão apresentados na Tabela 20:
A faixa de potência varia entre 0,46 – 19,3 µM para a catepsina L e entre
1,65 – 17,9 µM para a catepsina V; os fatores de potência são de aproximadamente
42 e 11, respectivamente. Estes dados, juntamente com a pequena seletividade
verificada, reforçam o potencial da classe como inibidores não seletivos da catepsina
L e V.
Nesta série avaliada os compostos mais potentes frente a catepsina L foram o
composto AC_05, apresentando valor de IC50 de 0,46 µM, e o composto AC_06,
com valor de IC50 de 1,06 µM; comparando-se as estruturas destes dois compostos
percebe-se a ausência do grupo nitro na posição 6 e o acréscimo de um grupo
metoxila na posição 2. Ambos compostos apresentaram maior seletividade frente a
catepsina L.
Para a realização do estudo da relação entre estrutura e atividade (SAR) é
necessário grande número de compostos; a série de alcalóides acridônicos
corresponde a uma pequena coleção, porém, várias considerações podem ser
extraídas e utilizadas para o desenho de novas estruturas que sejam mais potentes
inibidoras das catepsinas.
Os compostos AC_03 e AC_04 apresentam dois átomos de flúor nas
posições 6 e 7 e diferem pela presença de um grupo metoxila na posição 2, o que
acarretou diminuição no valor de potência de inibição por um fator de cerca de vinte
vezes.
A mudança do substituinte benzílico no composto AC_02 em relação ao
AC_05 não acarretou aumento proporcional no desempenho de potência,
demonstrando assim a importância da localização espacial deste substituinte, o qual
possivelmente acomoda-se no sítio da enzima de forma mais efetiva e interage de
maneira mais eficiente com resíduos de aminoácidos.
104

Tabela 20. Valores de potência e de seletividade dos alcalóides acridônicos
sintéticos frente a catepsinca L e V.

Catepsina L Catepsina V Seletividade
Inibidor ESTRUTRURA
IC50 (µM) IC50 (µM) (S)

O
AC_01 3,9 ± 0,1 3,6 ± 0.1 1,1

O N
H

O
NO2
AC_02 13 ± 0,1 8,2 ± 0,2 1,5

O N
H

O
O F
AC_03 1,5 ± 0,1 4,9 ± 0,3 0,3
N F
H

O
O F
AC_04 19 ± 0,1 18 ± 0,2 1,1

O N F
H

O
O NO2
AC‐05 0,5 ± 0,01 1,7± 0,08 0,3
N
H

O
AC_06 1,1 ± 0,02 1,7 ± 0,09 0,7

O N
H

105

O
O2 N
AC_07 6,8 ± 0,08 7,2 ± 0,08 0,9

N
H
CO2H

O
O NO2
AC_08 1,6 ± 0.005 2,0 ± 0,02 0,8
N
H

O
O
AC_09 ND* ND ‐
N
H

O
AC_10 ND ND ‐

N
H
O

( * ) ND = não determinado
106

4.6.3 Produtos sintéticos: alcalóides 4-quinolínicos-2-substituídos
Uma série com 14 alcalóides 4-quinolínicos-2-substituídos foi ensaiada e

avaliada em relação a seu potencial como inibidores das catepsinas L e V; os
resultados obtidos para os valores de potência de inibição (IC50) e seletividade (S)
encontram-se descritos na Tabela 21:
Tabela 21. Valores de potência e de seletividade dos alcalóides sintéticos 4-

quinolínicos-2-substituídos sintéticos frente a catepsina L e V.
Catepsina L Catepsina V Seletividade

Inibidor ESTRUTRURA
IC50 (µM) IC50 (µM) (S)

O
Q_01 2,6 ± 0,1 4,7 ± 0,1 0,6

N
H

O
Q_02 15 ± 1,2 5,0 ± 0,9 3,0

N
H

O
Q_03 16 ± 0,3 16 ± 1,5 1,0

N
H

O
Q_04
1,6 ± 0,2 5,2 ± 0,1 0,3
N
H
107

O

6,8 ± 0,6 12 ± 0,9 0,6
Q_05 N
H
O
Q_06
9,0 ± 0,8 8,5 ± 0,7 1,0
N
H
(CH 2)5CH3

O
Q_07 8,6 ± 0,7 15 ± 1,1 0,6

N
H
O

O
Q_08
20 ± 0,8 20 ± 0,5 1,0
N
H
F

O
Q_09 15 ± 1,3 10 ± 1,1 1,5

CF3
N
H
F

O
Q_10 O
49 ± 1,4 62 ± 1,2 0,8
N O
H

108

O
O
Q_11 O
30 ± 2,3 18 ± 1,9 1,7
N O
H
O
Q_12 20 ± 2,1 18 ± 1,7 1,0

N OH
H

O
Q_13 2,9 ± 0,3 9,9 ± 0,2 0,3

N (CH2)10CH3
H

O
Q_14 2,6 ± 0,1 4,7 ± 0,1 0,6

O
N
H

Os fatores de potência desta série estudada são de aproximadamente 31
para a catepsina L e de 22 para a catepsina V, com faixas de potências variando
entre 1,6 – 49,1 µM para a catepsina L e 2,8 – 61,4 µM para a catepsina V. A
seletividade mostrada é pequena mas foi possível observar maior tendência seletiva
em relação à catepsina L.
Dentre os compostos avaliados nesta série de alcalóides 4-quinolínicos-2-
substituídos, o composto mais potente frente a catepsina L foi o composto Q_04,
apresentando valor de potência de 1,6 µM. Os compostos Q_01 e Q_14
apresentaram valores de IC50 de 4,7 µM e foram considerados os compostos mais
potentes frente a catepsina V.
No que diz respeito aos compostos Q_01 a Q_06, uma comparação
detalhada entre as estruturas avaliadas e suas respectivas potências demonstram
109

que a presença de grupos substituintes alquílicos no anel B influencia diretamente
na potência da séria avaliada.
O composto Q_04 apresenta valor de IC50 de 1,6 µM frente a catepsina L,
enquanto o composto Q_06 apresenta valor de IC50 de 9,0 µM, demonstrando assim
que há um número limite átomos de carbonos para o qual ocorre aumento de
desempenho de potência.
Ao compararmos os composto Q_04 e Q_07, podemos inferir que a presença
do átomo de oxigênio no composto Q_07 acarretou diminuição do valor da potência
por um fator de dez para ambas catepsinas.
Os compostos Q_08 e Q_09 também apresentam substituintes receptores de
elétrons quando comparados com composto Q_01; também é possível inferir que a
presença destes substituintes leva à diminuição do valor de potência frente às
catepsinas L e V.
Já os compostos Q_10 a Q_14, quando comparados estruturalmente com
outros da série, sofrem perda do anel B; esta perda do anel nos compostos Q_10 a
Q_12 provocou diminuição do valor de potência: a presença do grupamento hidroxila
em relação ao grupamento éster no composto Q_10 acarretou melhor desempenho
de potência em relação ao compostoQ_12.
O composto Q_13 possui uma cadeia alquílica com 11 átomos de carbono
enquanto no composto Q_14 há um anel furano; ambos substituintes acarretaram
melhor desempenho de potência frente às catepsinas em estudo, entretanto, a
presença do substituinte alquilico em Q_13 permitiu ainda melhores desempenhos
de potência e seletividade frente a catepsina L.

4.7 Determinação do mecanismo de inibição
Os inibidores enzimáticos atuam através de mecanismos que podem ser

irreversíveis ou reversíveis, para tal associam-se à enzima levando à formação do
complexo enzima-substrato que podem ser formados por ligações intermoleculares
não covalentes (E●I) ou covalentes (E-I). Os inibidores irreversíveis acarretam a
inativação da enzima enquanto que os reversíveis ligam se à enzima levando a uma
110

perda da atividade enzimática que pode ser recuperada com a remoção do inibidor.
(COPELAND, 2000).
Na busca de inibidores enzimáticos para o planejamento de fármacos é
desejável que o inibidor se ligue à enzima de forma não covalente, rapidamente e
reversível, sem alterar a estrutura da enzima, levando à formação do complexo
(E●I). Os inibidores reversíveis podem ser classificados em três tipos: 1)
competitivos; 2) não competivos e 3) incompetitivos.
Dentre os compostos avaliados foram selecionados para a determinação do
mecanismo de inibição em Os inibidores enzimáticos atuam através de mecanismos
que podem ser reversíveis ou irreversíveis; nestes mecanismos os inibidores
enzimáticos associam-se à enzima, levando à formação do complexo enzima-
substrato, o qual pode ser formado por ligações inter-moleculares não covalentes
(E●I) ou covalentes (E-I).
Os inibidores irreversíveis provocam a inativação da enzima enquanto que os
reversíveis ligam-se à enzima, ocasionando perda de atividade enzimática que pode
ser recuperada com a remoção do inibidor. (COPELAND, 2000).
Na busca por inibidores enzimáticos úteis ao planejamento de fármacos é
desejável que o inibidor ligue-se à enzima de forma não covalente, rápida e
reversível, sem provocar alteração estrutural da enzima e levando à formação do
complexo (E●I).
Os inibidores reversíveis podem ser classificados em três tipos:
1) competitivos;
2) não competivos;
3) incompetitivos.
Para a determinação do mecanismo de inibição em relação ao substrato Z-

FR-MCA foram selecionados, dentre os compostos avaliados em relação às
catepsinas L e V, os seguintes compostos:
a) Alcalóides naturais: PN_AC_01 e PN_AC_03

b) Ácidos N-aril antranílicos: A_10 e A_11
c) Alcalóides sintéticos: AC_01 e AC_05
111

A determinação do mecanismo de inibição deu-se a partir de procedimento
cinético que gera um gráfico de duplo recíproco para cada inibidor, conhecido como
gráfico de Lineweaver-Burk, a partir do qual obtem-se um perfil que possibilita
especificar o tipo de inibição existente.
Neste trabalho acadêmico os alcalóides naturais e sintéticos apresentaram
mecanismo de inibição competitivo em relação ao substrato Z-FR-MCA tanto para as
catepsinas L quanto V, como pode ser observado nas Figura 63 até Erro! Fonte de
referência não encontrada., nas quais é apresentado o perfil gráfico característico para
um inibidor competitivo:
6
[PN_AC_01] 0.0 µM
5
[PN_AC_01] 1.0 µM
1/V (µM MCA/min) -1)
[PN_AC_01] 3.0 µM
[PN_AC_01] 5.0 µM
4
0
-0.2 0.0 0.2 0.4 0.6
-1
1/ [ZRFMCA] (µM )

Figura 63. Gráfico de Lineawaver-Burk do composto PN_AC_01 frente à catepsina L.
8
[PN_AC_03] 0.0 µM
6
[PN_AC_03] 1.0 µM
[PN_AC_03] 3.0 µM
[PN_AC_03] 5.0 µM
0
-0.2 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8
-1
1/ [ZRFMCA] (µM )
112

Figura 64. Gráfico de Lineawaver-Burk do composto PN_AC_03 frente à catepsina L.
2.0
1.8
[AC_01] 0.0 µM
[AC_01] 1.0 µM
1.6 [AC_01] 3.0 µM
1/V (µM MCA/min) )

-1
[AC_01] 5.0 µM
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
-0.2 -0.1 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4
-1
1/ [ZRFMCA] (µM )
Figura 65. Gráfico de Lineawaver-Burk do composto AC_01 frente a catepsina L.
3,5
[AC_03] 0.0 µM
3,0 [AC_03] 3.0 µM
[AC_03] 5.0 µM
)
-1
[AC_03] 9.0 µM
1/V (µM MCA/min)
2,5
1/V (µM MCA/min) )
-1
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
-0,3 -0,2 -0,1 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4
1/ [ZRFMCA] (µM-1)
Figura 66. Gráfico de Lineawaver-Burk do composto AC_05 frente a catepsina L.
113

8
[PN_AC_01] 0.0 µM
[PN_AC_01[ 3.0 µM
7 [PN_AC_01] 5.0 µM
[PN_AC_01] 7.0 µM
1/V (µM MCA/min) )

-1
5
0
-0.4 -0.2 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8
-1
1/ [ZRFMCA] (µM )
Figura 67. Gráfico de Lineawaver-Burk do composto PN_AC_01 frente a catepsina V.
3.5
[PN_AC_03] 0.0 µM
[PN_AC_03] 1.0 µM
3.0 [PN_AC_03] 3.0 µM
[PN_AC_03] 5.0 µM
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
-0.3 -0.2 -0.1 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4
-1
1/ [ZRFMCA] (µM )
Figura 68. Gráfico de Lineawaver-Burk do composto PN_AC_03 frente a catepsina V.

114

[AC_01] 0.0 µM
[AC_01] 1.0 µM
3 [AC_01] 3.0 µM
[AC_01] 5.0 µM

2
0
-0.2 -0.1 0.0 0.1 0.2
-1
1/ [ZRFMCA] (µM )
Figura 69. Gráfico de Lineawaver-Burk do composto AC_01 frente a catepsina V.
[AC_03] 0.0 µM
[AC_03] 1.0 µM
4 [AC_03] 3.0 µM
1/V (µM MCA/min) )
-1
[AC_03] 5.0 µM
0
-0,10 -0,05 0,00 0,05 0,10 0,15 0,20
1/ [ZRFMCA] (µM-1)
Figura 70. Gráfico de Lineawaver-Burk do composto AC_05 frente a catepsina V.
De acordo com o gráfico da Figura 74, as intersecções com o eixo y fornecem

valores de recíproco da velocidade máxima (1/Vmax) os quais não são alterados em
115

presença do inibidor competitivo. Por outro lado, as intersecções com o eixo x
fornecem valores de recíproco do Km aparente (-1/Km), que aumentam com o
aumento da concentração de um inibidor competitivo por um fator igual a (1+[I]/Ki).
O valor de Vmax é constante para todas as concentrações de inibidor, porém,
o valor de Vmax aparente, o qual é definido como Km ( 1 + [ I ] / Ki ), aumenta com o
aumento da concentração do inibidor. Esse efeito característico do modo de ação
dos inibidores competitivos ocorre pois mais substrato é requerido para manter a
metade do valor de Vmax; os valores de Vmax permanecem inalterados devido à
capacidade do substrato de deslocar totalmente o equilíbrio em condições de
saturação, uma vez que competem pelo mesmo sítio da enzima. COPELAND.
Os inibidores e o substrato podem ligar-se separadamente aos sítios da
enzima, com concorrência direta dos dois ligantes pelo sítio ativo em comum. Este
tipo de mecanismo de alguma maneira pode exercer uma regulação negativa de um
para com o outro como, por exemplo, através de uma interação alostérica negativa,
a qual pode ser guiada por uma ligação induzida e provocar mudança na
conformação.
Este tipo de regulação negativa, via comunicação alostérica e possível
mudança de conformação, pode levar à interações do inibidor indiretamente ao sítio
ativo. Assim, não se pode presumir que devido ao fato de um inibidor exibir a
assinatura cinética de um inibidor competitivo, o mesmo se ligará ao sítio ativo da
enzima; entretanto, experimentos de cristalografia de muitos inibidores competitivos
em uso clínico têm demonstrado sua ligação direta ao sítio ativo da enzima alvo.
Atualmente, grande número de fármacos atuam sobre um mecanismo de
inibição competitivo, dentre os quais podemos citar Lovastatin, que atua na redução
do colesterol tendo como enzima alvo a HMG-CoA redutase, Saquinavir, indinavir e
ritonavir, que atuam sobre HIV protease, captopril e enalapril que atuam sobre a
enzima de conversâo da angiotensina I para a angiotensina II a qual provoca
aumento na pressão sanguínea e leva à problemas de hipertensão.
Os ácidos N-aril antranílicos apresentaram um mecanismo incompetitivo em
relação ao substrato Z-FR-MCA para ambas catepsinas, como apresentado nas
Figura 71 à Figura 74:
116

2,0
1,8
[A_10] 0.0 µM
1,6 [A_10] 1.0 µM
[A_10] 3.0 µM
1/V (µM MCA/min) )

-1
[A_10] 5.0 µM
1,4
1,2
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
-0,1 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4
-1
1/ [ZRFMCA] (µM )

Figura 71. Gráfico de Lineawaver-Burk do composto A_10 frente a catepsina L.
8
[AC_11] 0.0 µM
[AC_11] 1.0 µM
[AC_11] 5.0 µM
[AC_11] 9.0 µM
6
1/V (µM MCA/min) )
-1
0
-0,5 0,0 0,5 1,0 1,5
-1
1/ [ZRFMCA] (µM )
Figura 72. Gráfico de Lineawaver-Burk do composto A_11 frente a catepsina L.
117

16
[A_10] 0.0 µM
14 [A_10] 3.0 µM
[A_10] 5.0 µM
[A_10] 7.0 µM
1/V (µM MCA/min)-1)

12
10
0
-0,3 -0,2 -0,1 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4
-1
1/ [ZRFMCA] (µM )
Figura 73. Gráfico de Lineawaver-Burk do composto A_10 frente a catepsina V.
18 [A_11] 0.0 µM
[A_11] 3.0 µM
[A_11] 5.0 µM
16
1/V (µM MCA/min) )
-1
[A_11] 7.0 µM
14
12
10
0
-0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4
1/ [ZRFMCA] (µM-1)
Figura 74. Gráfico de Lineawaver-Burk do composto A_11 frente a catepsina V.

118

Nestes gráficos podemos observar o perfil gráfico para este tipo de inibidor,
no qual o duplo recíproco é composto por linhas paralelas.
A afinidade dos inibidores incompetitivos é alta em condições de saturação do
substrato, bem como para os inibidores não competitivos. Desta forma, dependendo
das condições fisiológicas experimentais, esta incapacidade dos inibidores não
competitivos e incompetitivos de não vencer as altas concentrações de substrato
pode oferecer algumas vantagens clínicas em relação aos outros inibidores.
Dentre alguns fármacos que possuem valor comercial e atuam sobre um
mecanismo de inibição incompetitiva podemos citar Metotrexato, utilizado nos
tratamentos de câncer e infecções bacterianas e Camptotecin, indicado para o
tratamento de câncer, utilizando a enzima topoisomerase. como enzima alvo.
Um fármaco muito conhecido que também atua sob mecanismo de inibição
incompetitivo é a finasterida, bem como seus similares epristerida e dudasterida.
Estes fármacos atuam sobre a enzima esteróide 5α-redutase; o fármaco epristerida,
por exemplo, liga-se a enzima esteróide 5α-redutase, conectando o cofator NADPH
a seu sítio ativo; este, por sua vez, conecta-se ao hormônio masculino testoterona,
dando origem ao complexo terciário enzima-NADPH-testosterona.
Um intermediário enolato da testosterona é formado pela transferência
estereoespecífica de um próton do NADPH para o carbono beta a dupla ligação da
estrututa da testosterona. Este intermediário enolato é estabilizado pela interação
entre um grupo ácido de dentro do sítio ativo que ao doar um próton ao carbono alfa
do enolato permite a formação do produto dihidrotestosterona (DHP). DHP e NADP+
são liberados, completando o ciclo.
Este inididor, o epristerida, foi mimitizado a partir do intermediário enolato,
proveniente do hormônio natural testosterona e apresenta-se como um inibidor
incompetitivo, ligando-se a enzima somente após a formação do complexo binário
enzima_NADPH, e como inibidor competitivo em relação à testosterona.
Os resultados obtidos de experimentos de duplo reciploco, além de
possibilitarem a verificação gráfica do tipo de mecanismo de inibição, também
permitem extrair informações referentes aos valores de Km e Vmax. O gráfico da
razão Vmax/ Km versus [ I ], como descrito na Figura 75, leva a obtenção do valor de
Ki que representa a intersecção da reta ao eixo x:
119

16
14
12
│-x │ = Ki
Kmapp/Vmaxapp
10
0
1 0 1 2 3 4 5 6
[inibidor]
Figura 75. Gráfico padrão para determinação do valor de Ki

Desta forma, os valores da constante de dissociação do complexo EI (Ki) para

os inibidores competivos e incompetitivos foram determinados graficamente e seus
respectivos valores estão apresentados na Tabela 22.
Tabela 22. Valores de dissociação do complexo EI (Ki).

Substância Ki (uM)
Catepsina L Catepsina V
PN_AC_01 1,31 0,49
PN_AC_03 1,32 1,10
AC_01 0,90 1,26
AC_05 0,18 0,40
A_10 1,86 0,85
A_11 1,94 1,09

A busca de inibidores com finalidade terapêutica representa um caminho
científico de grande importância, pois cerca de 50% de todos os medicamentos
atualmente comercializados atuam sob mecanismo de inibição. É difícil saber qual
modalidade de inibidor se mostra mais eficiente in vivo, porém, diversas
modalidades de inibidores têm sido desenvolvidas e encontram-se em diferentes
programas na busca por novas drogas.

120

4.8 Estudos de docagem modelagem e modelos de interação.

A docagem molecular (do inglês, molecular docking), também conhecida como
docagem ou ancoramento (do inglês, docking) é um dos principais métodos de
planejamento baseado na estrutura do receptor (SBDD, structure-based drug design)
empregados em estudos de química medicinal. A técnica consiste em prever a
conformação biotiva de uma pequena molécula (ligante) dentro do sítio de ligação de
uma macromolécula (enzima, DNA ou RNA), seguido de avaliação (pontuação) e
classificação do modo de ligação proposto (GUIDO 2008).
Nas últimas décadas, a junção entre técnicas experimentais e computacionais
assumiram grande importância no processo de planejamento de novos fármacos
sendo que a determinação do mecanismo enzimático experimental permite o
estabelecimento racional de estudos de modelagem molecular a partir de técnicas
avançadas de docagem molecular.
Estudos anteriores levaram a criação de um modelo farmacofórico para a
catepsina V (SEVERINO, 2008), obtido a partir de dados cristalográficos da
catepsina K em bancos de dados de proteínas (PDB). O modelo gerado foi utilizado
para auxiliar na identificação das conformações biotivas dos alcalóides acridônicos
naturais PN_AC_01 a PN_AC_09, apresentando bom posicionamento no modelo
farmacofórico sugerido, com a existência de interações intermoleculares importantes
para o reconhecimento molecular. Além disto, foi verificado que estes compostos se
apresentam com os anéis aromáticos A e B localizados em regiões hidrofóbicas, e
sugerem que interações hidrofóbicas e de van der Waals são componentes
importantes no reconhecimento e potencia destes compostos.
Desta forma, foi selecionado o alcalóide mais potente da série, o AC_05. Os
experimentos de determinação do tipo do mecanismo de inibição reafirmaram os
alcalóides acridônicos como inibidores do tipo competitivo. Baseado nesta valiosa
informação foi possível modelar o modo de ligação do inibidor AC_05 no sítio
catalítico das enzimas alvo, a catepsina L e a catepsina V.
A modelagem molecular foi realizada utilizando-se programa FlexX, enquanto
que as docagens foram realizadas utilizando-se estruturas cristalográficas de alta
resolução depositadas no PDB; a estrutura da catepsina L utilizada foi a de código
121

3H8B, com resolução de 1.8 A, e a estrutura escolhida para a catepsina V foi a
codificada como 1FH0, com resolução de 1.6 A.
A análise de docagem molecular com o alcalóide acridônico AC_05 frente à
catepsina V sugere as interações apresentadas na Figura 76 em que a atividade
deste composto pode estar associada a interações de hidrogênio com o resíduo
Phe69, Gly67 e do resíduo Leu161.
As interações do alcalóide AC_05 frente à catepsina L se apresentam na
Figura 77 em que a maior inibição deste composto pode estar relacionada as
interações de ligação de hidrogênio do grupo nitro como os resíduos Cys25 e Gln19,
resíduos referentes ao sítio ativo da enzima. O resíduo Gln19 tem uma função
biológica importante, pois supostamente este resíduo estabiliza o intermediário de
transição do processo catalítico e, portanto, moléculas que interagem com ele
influenciam significativamente na atividade biológica da enzima.
O modo de ligação sugerido indica que o inibidor representativo da série,
AC_05, ocupa a região central do sítio de ambas as isoformas, localizando-se
próximo dos resíduos catalíticos Cys25 e His163. Esses resultados estão de acordo
com os dados experimentais de cinética enzimática que mostraram que este inibidor
interage com as enzimas através de um mecanismo reversível ligando-se de modo
mútuo e exclusivamente ao sítio ativo como o substrato natural.
Os estudos de modelagem molecular são preliminares, assim este trabalho
poderá servir como auxilio para a realização de estudos mais abrangentes do modo
de interação dos alcalóides acridônicos no sítio ativo das catepsinas, principalmente
a catespina L.

122

Figura 76. Modoo de intera
ação propoosto por docagem
d m
molecular com o prrograma
FlexX para
p o substância AC
C_05 frente
e a catepsina L
Figura 77. Modoo de intera

ação propoosto por docagem
d m
molecular com o prrograma
FlexX para o su
ubstância AC_055 frente a catepsina V
123

Conclusões

5 Conclusões, Perspectivas e Considerações finais

A metodologia de triagem de extratos de plantas mostrou-se eficiente na

otimização e seleção de um extrato alvo; isto, juntamente com a metodologia de
monitoramento através de ensaios fluorimétricos por apagamento intramolecular e
cromatografia líquida de alta eficiência, levaram a determinação de nova classe de
compostos alvos com potencial inibidor das catepsinas L e V, as cumarinas O-
geraniladas.
A triagem de verificação de potência e a busca por seletividade dos alcalóides
acridônicos naturais, dos alcalóides acridônicos sintéticos, dos ácidos N-aril
antranílicos e dos alcalóides quinolínicos-4-substituídos frente a catepsina L e V
mostrou valores de potências na ordem de concentração de inibição em micro-molar
e baixa seletividade frente as duas isoformas. O composto mais potente de todas as
séries avaliadas foi o AC_05, com valor de potência de 0,5 µM frente à catepsina L.
Este trabalho permitiu confirmar os alcalóides acridônicos como alvos
importantes na ação inibidora das catepsinas L e V; assim, levando-se em
consideração os resultados aqui obtidos com produtos naturais e sintéticos a partir
de rota sintética não guiada, o estudo de estrutura versus atividade (SAR) pode ser
realizado visando a potencialização destes compostos e até mesmo verificação de
sua seletividade frente as isoformas. Para tanto seria primordial a síntese de
compostos visando o acréscimo de grupos doadores, receptores e também capazes
de realizar ligação de hidrogênio.
Um estudo interdisciplinar partindo dos resultados obtidos com os produtos
naturais entre a síntese orgânica e a física molecular, estudos de dosagem e
cristalografia de proteínas podem levar a um entendimento muito amplo e real sobre
o modo de interações destes compostos, bem como a uma entidade química com
alto potencial para o desenvolvimento de um fármaco.
Outras informações interessantes extraídas deste trabalho acadêmico são os
dados de potência obtidos para alcalóides quinolínicos, uma vez que o alcalóide sem
substituinte nos anéis A e C apresentou valor de potência na ordem de concentração
micro-molar. Este alcalóide apresenta potencial como alvo relevante para a
realização de SAR e possível potencialização e seletividade desta classe frente as
catepsinas L e V.

Finalmente, os dados obtidos de potência, seletividade, afinidade e
mecanismos de ação determinados complementam e dão origem a uma base de
dados cinéticos que podem servir para delinear futuros estudos

.
Referências

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO CARLOS

CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E DE TECNOLOGIA

“ESTUDO DE PRODUTOS NATURAIS E DERIVADOS SINTÉTICOS

Emerson Finco Marques*

Dissertação apresentada como parte

Orientador: Dr. Paulo Cezar Vieira

Marques, Emerson Finco.

Dissertação (Mestrado) -- Universidade Federal de São

1. Produtos naturais. 2. Catepsinas lisossomais. 3.

CDD: 547.3 (20a)

A certeza de que estamos começando,

Fazer da interrupção um caminho novo,

E assim terá valido a pena existir!

Aos meus pais, que venceram na vida juntos com

À professora Dra. Maria Fátima Graças Fernandes da Silva pelos ensinamentos e

Aos demais professores do DQ-UFSCar pelos ensinamentos e contribuição na

À professora Dra. Richele Priscila Severino por ter me acompanhado desde a

Aos meus amigos da Turma de 2004 de Química Licenciatura , Thales, Barbie,

A Ariani, pela competência e auxilio neste trabalho.

Ao professor Massuo Jorge Kato e Professor Paolo Di Mascio do Instituto de

A Giovana Cássia Freitas e ao Thiago Sevilhano pela amizade, pelo compareirismo

Aos funcionários do DQ e técnicos, em especial a Luciana, ao Waldir e ao Ademir.

À vida, pelos caminhos traçados e alcançados, pelas oportunidades e aprendizados

A todos que direta ou indiretamente contribuíram na realização deste trabalho.

A FAPESP pela bolsa concedida.

Tabela 1. Fármacos que atuam por mecanismo inibição enzimática .......................................... 8

Figura 1. Estruturas de alguns dos Produtos Naturais utilizados como fármacos. .................... 3

Fluxograma 1. Metodologia para a preparação dos extratos ...................................................... 28

3.8.3 Determinação da potência dos inibidores (IC50) 37

3.8.4 Determinação da seletividade (S) 38

3.8.5 Determinação do Mecanismo de Ação 38

3.8.6 Modelagem Molecular dos inibidores frente a catepsina L e V 39

4 RESULTADOS E DISCUSSÕES 41

4.1 Atividade enzimática 43

4.1.1 Biomotoramento dos extratos de Zanthoxylum 43

4.2 Perfil cromatográfico dos extratos brutos/frações 49

4.3 Substâncias identificadas 54

4.4 Determinação estrutural 57

4.4.1 Triterpeno 57

4.4.2 Cumarinas 59

4.4.2 Alcalóides 81

4.5 Estudo de produtos naturais na busca por inibidores 94

4.5.1 Produtos naturais isolados de Zanthoxylum acuminatum 94

4.5.2 Produtos naturais isolados de Swinglea glutinosa 95

4.6 Estudo de produtos sintéticos na busca de inibidores 99

4.6.1 Produtos sintéticos: ácidos N-aril antranílicos 99

4.6.2 Produtos sintéticos: alcalóides acridônicos 104

4.6.3 Produtos sintéticos: alcalóides 4-quinolínicos-2-substituídos 107

4.7 Determinação do mecanismo de inibição 110

4.8 Estudos de docagem modelagem e modelos de interação. 121

5 Conclusões, Perspectivas e Considerações finais 124

1.1 Produtos naturais como precursores de fármacos

Desde os primórdios da civilização humana faz-se o uso de substâncias

 Apresentam alta diversidade estrutural e biológica;

Diferentes produtos naturais foram descobertos e utilizados no tratamento

(1) (2) OH (3)

Figura 1. Estruturas de alguns dos Produtos Naturais utilizados como fármacos.

Figura 2. Diferentes fontes terapêuticas (N = 1184).

Um dos grandes desafios atuais para os grupos de pesquisa em produtos

A descoberta de novos fármacos é um caminho que desprende longo tempo

1.3 Gênero Zanthoxylum

Figura 3. Substâncias isoladas do gênero Zanthoxylum

1.4 Enzimas como alvo terapêutico.

Apresentam alta diversidade estrutural e biológica;

Catepsina L e V são enzimas recombinantes humanas e foram cedidas pelo

Extratos e frações foram evaporados em evaporadores do tipo Büchi

Na fração 2 verificou-se a presença de um sólido branco e identificado como